JP2008308407A - Method for inhibiting cell migration and cell migration inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。 The present invention relates to a cell migration inhibition method and migration inhibitor, a migration inhibition method or a cancer metastasis suppression method using the migration inhibitor, a cancer metastasis inhibitor containing the migration inhibitor, an angiogenesis inhibition method and angiogenesis. Relates to inhibitors.
より詳しくは、本発明はＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。さらに、本発明は、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、並びに該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤に関する。 More specifically, the present invention relates to a cell migration inhibition method and a migration inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of MAST205 (microtubule associated tests specific ST protein kinase-205 kDa), and angiogenesis suppression method and blood vessel It relates to an angiogenesis inhibitor. Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting migration or the method for inhibiting cancer metastasis using the migration inhibitor, and the cancer metastasis inhibitor comprising the migration inhibitor.
本発明はまた、前記方法および前記阻害剤に用いる化合物の同定方法、並びに試薬キットに関する。 The present invention also relates to a method for identifying a compound used in the method and the inhibitor, and a reagent kit.
ＭＡＳＴ２０５は、キナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持するセリンスレオニンキナーゼである。ＭＡＳＴ２０５には、スプライシングバリアントと考えられる数種の変異体が知られている。具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）、ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）、およびＢＡＢ４０７７８（１７３４アミノ酸残基）として開示されている各蛋白質が、ＭＡＳＴ２０５として知られている。ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）は、ＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第１２２４番目と第１２２５番目のアミノ酸残基の間にセリン残基が挿入されていることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。ＢＡＢ４０７７８（１７３４アミノ酸残基）は、ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第３８８番目、第６５９番目および第１５５０番目のアミノ酸残基がそれぞれグルタミン酸残基、メチオニン残基およびグリシン残基に置換し、かつ第１６８８番目以降の領域がフレームシフトしていることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。 MAST205 is a serine threonine kinase that retains a kinase domain and a PDZ domain. In MAST205, several types of mutants that are considered splicing variants are known. Specifically, each protein disclosed in the NCBI database as accession numbers AAH65499 (1797 amino acid residues), CAH73244 (1798 amino acid residues), and BAB40778 (1734 amino acid residues) is known as MAST205. . CAH73244 (1798 amino acid residues) is different from the amino acid sequence of AAH65499 (1797 amino acid residues) except that a serine residue is inserted between the 1224th and 1225th amino acid residues. Have the same amino acid sequence. BAB40778 (1734 amino acid residues) is different from the amino acid sequence of CAH73244 (1798 amino acid residues) in that the 388th, 659th and 1550th amino acid residues are a glutamic acid residue, a methionine residue and a glycine residue, respectively. It has the same amino acid sequence except that it is substituted with a residue and the 1688th and subsequent regions are frame-shifted.
ＭＡＳＴ２０５は１９９３年、ワルデン（Ｗａｌｄｅｎ）らによって、微小管結合蛋白質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と複合体を形成するリン酸化酵素として最初にクローニングされ、精巣に分布することが報告された（非特許文献１）。また、ＭＡＳＴ２０５の発現がほとんどすべての正常組織で普遍的に認められるという報告がある（非特許文献２）。一方で、ＭＡＳＴ２０５の発現は、***で、それも発達分化中の***で最も高いという報告（非特許文献３）や、心臓で高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。 MAST205 was first cloned by Walden et al. In 1993 as a phosphorylating enzyme that forms a complex with microtubule-associated proteins and was reported to be distributed in the testis (Non-Patent Literature). 1). There is a report that the expression of MAST205 is universally recognized in almost all normal tissues (Non-patent Document 2). On the other hand, there are reports that the expression of MAST205 is highest in sperm, which is also the highest in developmentally differentiated sperm (Non-patent Document 3), and a report that high expression is recognized in the heart (Non-patent Document 2).
ＭＡＳＴ２０５と相互作用する蛋白質が現在までにいくつか報告されている。例えば、神経筋接合部ではＭＡＳＴ２０５はＰＤＺドメインを介してβ２−シントロフィンと結合することが知られている（非特許文献２）。このようなＰＤＺドメインを介したＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合は他にも知られており、プロトカドヘリン ＬＫＣやＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）がＭＡＳＴ２０５と結合すると報告されている（それぞれ非特許文献４並びに非特許文献５および６）。ＰＴＥＮは腫瘍抑制ホスファターゼとして知られており、細胞増殖やアポトーシスに関連すると考えられている。ＰＴＥＮについては、ＭＡＳＴ２０５によるリン酸化も報告されており、ＭＡＳＴ２０５による機能的制御の可能性も示唆される（非特許文献６）。また、腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーター（ｔｙｐｅ ＩＩａ Ｎａ／Ｐｉ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）とＭＡＳＴ２０５の結合が報告されており（非特許文献７）、このトランスポーターもＰＤＺドメインを保持していることから、該結合はＰＤＺドメインを介した結合であると考えられる。 Several proteins that interact with MAST205 have been reported to date. For example, it is known that MAST205 binds to β2-syntrophin through the PDZ domain at the neuromuscular junction (Non-patent Document 2). Such binding between MAST205 and other proteins via the PDZ domain is also known, and it is reported that protocadherin LKC and PTEN (phosphate and tenon homologue deleted on chromosome ten) bind to MAST205 ( Non-Patent Document 4 and Non-Patent Documents 5 and 6), respectively. PTEN is known as a tumor suppressor phosphatase and is thought to be associated with cell proliferation and apoptosis. Regarding PTEN, phosphorylation by MAST205 has also been reported, suggesting the possibility of functional control by MAST205 (Non-Patent Document 6). In addition, binding of kidney type IIa sodium / linkotransporter (type IIa Na / Picotransporter) and MAST205 has been reported (Non-patent Document 7), and this transporter also has a PDZ domain. The bond is considered to be a bond through the PDZ domain.
ＭＡＳＴ２０５の機能については、ＭＡＳＴ２０５の不活性体をトランスフェクションした細胞でリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下、ＬＰＳと略称する）刺激に対するインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と略称する）産生が抑制されていることが報告（非特許文献８）されている。また、ＭＡＳＴ２０５は、マクロファージをペプチドグリカンによるＴＬＲ−２（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）刺激やＬＰＳによるＴＬＲ−４刺激により活性化したときのＩＬ−１２産生において必須の蛋白質であること（非特許文献８）、マクロファージにおけるＦｃγ受容体ＩＩＡ（ＦｃγＲ ＩＩＡ）刺激によってユビキチン化を受けプロテアソーム媒介型の分解を受けることが報告されている（非特許文献８）。さらに、ＭＡＳＴ２０５は、ユビキチンリガーゼとして機能するＴＲＡＦ２（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）やＴＲＡＦ６と結合すること等も報告されている（非特許文献９）。 Regarding the function of MAST205, production of interleukin 12 (hereinafter abbreviated as IL-12) in response to stimulation with lipopolysaccharide (hereinafter abbreviated as LPS) was suppressed in cells transfected with an inactive form of MAST205. It has been reported (Non-patent Document 8). MAST205 is an essential protein for IL-12 production when macrophages are activated by TLR-2 (toll-like receptor-2) stimulation with peptidoglycan or TLR-4 stimulation with LPS (Non-patent Document 8). ), And ubiquitination by Fcγ receptor IIA (FcγR IIA) stimulation in macrophages has been reported to undergo proteasome-mediated degradation (Non-patent Document 8). Furthermore, it has been reported that MAST205 binds to TRAF2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2), which functions as a ubiquitin ligase, and TRAF6 (Non-patent Document 9).
さらに、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いてＭＡＳＴ２０５の発現をノックダウンすることにより癌細胞の増殖が阻害されたことが開示されている（特許文献１）。 Furthermore, it is disclosed that the growth of cancer cells was inhibited by knocking down the expression of MAST205 using siRNA (small interfering RNA) against MAST205 (Patent Document 1).
ＭＡＳＴ２０５はセリンスレオニンキナーゼであり、様々な蛋白質と結合すること、また、刺激を受けたマクロファージにおけるＩＬ−１２産生や癌細胞の増殖に関与することが知られている。ＭＡＳＴ２０５と結合する新たな蛋白質を見出し、ＭＡＳＴ２０５の機能を明らかにすることにより、ＭＡＳＴ２０５の発現や機能の異常に起因する疾患を防止および／または治療できる。 MAST205 is a serine threonine kinase and is known to bind to various proteins and to participate in IL-12 production and cancer cell proliferation in stimulated macrophages. By finding a new protein that binds to MAST205 and clarifying the function of MAST205, diseases caused by abnormal expression or function of MAST205 can be prevented and / or treated.
本発明の課題は、ＭＡＳＴ２０５と相互作用してその作用を調節する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、ＭＡＳＴ２０５の作用を調節する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、ＭＡＳＴ２０５の異常に起因する疾患の防止および／または治療に有用な手段を提供することが含まれる。 An object of the present invention is to find and provide a protein that interacts with MAST205 and regulates its action. The subject of the present invention also includes providing means for adjusting the action of MAST205. Furthermore, the subject of this invention includes providing a useful means for the prevention and / or treatment of the disease resulting from abnormality of MAST205.
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）およびＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）それぞれと結合すること、さらにＤＣＴＮ１をリン酸化することを見出した。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＭＫＫ６（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ６）／ＭＫＫ３（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ３）、およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化が阻害されることを見出した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made intensive efforts and found that MAST205 binds to DCTN1 (dynactin 1) and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1), respectively, and further phosphorylates DCTN1. It was. In addition, in cells transfected with siRNA against MAST205, p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase), MKK6 (MAPK kinase 6) / MKK3 (MAPK kinase 3), and JNK (c-Jun N-term N-term). It was found that oxidation is inhibited.
さらに本発明者らは、ＭＡＳＴ２０５が、ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ７）、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれと結合することを見出した。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ＭＫＫ４のリン酸化が阻害されることを見出した。 Furthermore, the present inventors have found that MAST205 binds to MLK3 (mixed linage kinase 3), MKK3, MKK4 (MAPK kinase 4), MKK6, MKK7 (MAPK kinase 7), and p38 MAPK, respectively. In addition, it was found that phosphorylation of MKK4 is inhibited in cells transfected with siRNA against MAST205.
ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。 DCTN1 and TIAM1 have been implicated in the signal transduction pathway via p38 MAPK or its upstream MKK6 / MKK3.
ｐ３８ ＭＡＰＫは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼキナーゼやＭＡＰＫキナーゼを介したキナーゼカスケードにより活性化される。ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化には、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４およびＭＫＫ６が関与することが知られている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を、ＭＬＫ３がＭＫＫ３を介して促進することが知られている。 p38 MAPK is known to be involved in cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses. P38 MAPK is activated by a kinase cascade via MAPK kinase kinase or MAPK kinase. It is known that MKK3, MKK4 and MKK6 are involved in the activation of p38 MAPK. It is also known that MLK3 promotes the activation of p38 MAPK via MKK3.
ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されている。 JNK is known to be involved in cell proliferation, cell death or immune inflammatory response, and its function is regulated by phosphorylation by MKK7 / MKK4.
これらから発明者らは、ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ６等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると考えている。またＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。 From these, the inventors found that MAST205 promotes phosphorylation of p38 MAPK by binding to proteins such as DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, and MKK6, respectively, and promoting information transmission involving these proteins. As a result, it is believed to be actively involved in cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses. MAST205 is also involved in phosphorylation of JNK by binding to proteins such as DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK4, and MKK7, and promoting information transmission involving these proteins, resulting in cancer metastasis. The inventors believe that they are involved in angiogenesis, cell proliferation and cell death or immune inflammatory responses.
本発明においてはさらに、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した。細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、ＭＡＳＴ２０５は癌の転移に関与すると発明者らは考えている。 In the present invention, it has further been found that cell migration and invasion are remarkably suppressed by inhibiting the expression of MAST205. Since cell migration and invasion are indicators of cancer metastatic potential, the inventors believe that MAST205 is involved in cancer metastasis.
上記のようにＭＡＳＴ２０５が、細胞の遊走および浸潤、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。 By inhibiting MAST205 expression and / or function, MAST205 is thought to be involved in cell migration and invasion, cancer metastasis, angiogenesis, cell proliferation and cell death, and immune inflammatory responses as described above. The inventors believe that cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses can be suppressed.
本発明は、これら知見により完成した。 The present invention has been completed based on these findings.
すなわち本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法に関する。 That is, the present invention relates to a method for inhibiting cell migration, which comprises inhibiting MAST205 expression and / or function.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記細胞遊走阻害方法に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
The present invention also relates to the method for inhibiting cell migration, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1
(2) Binding of MAST205 and TIAM1
(3) Binding of MAST205 and MLK3,
(4) Binding of MAST205 and MKK3,
(5) Binding of MAST205 and MKK4,
(6) Binding of MAST205 and MKK6,
(7) Binding of MAST205 and MKK7,
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK,
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting cell migration, wherein the serine threonine kinase activity of MAST205 is serine threonine kinase activity against DCTN1 and / or TIAM1.
さらにまた本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting cell migration, wherein the cell is a cancer cell.
また本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。 The present invention also relates to the method for inhibiting cell migration, wherein the cell is an endothelial cell.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する前記細胞遊走阻害方法に関する。 Furthermore, this invention relates to the said cell migration inhibition method which inhibits the expression and / or function of MAST205 by RNA interference with respect to MAST205.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である前記細胞遊走阻害方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting cell migration, wherein RNA interference with MAST205 is RNA interference performed using a short double-stranded oligonucleotide against MAST205.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。 In the present invention, the short double-stranded oligonucleotide for MAST205 comprises a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and an oligonucleotide comprising the complementary base sequence of the base sequence. It is related with the said cell migration inhibition method which is a heavy chain oligonucleotide.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。 Further, according to the present invention, the short double-stranded oligonucleotide for MAST205 is an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and the oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. The present invention relates to the method for inhibiting cell migration, which is a short double-stranded oligonucleotide comprising nucleotides.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to a cell migration inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of MAST205.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記細胞遊走阻害剤に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
The present invention also relates to the cell migration inhibitor, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1
(2) Binding of MAST205 and TIAM1
(3) Binding of MAST205 and MLK3,
(4) Binding of MAST205 and MKK3,
(5) Binding of MAST205 and MKK4,
(6) Binding of MAST205 and MKK6,
(7) Binding of MAST205 and MKK7,
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK,
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害剤に関する。 The present invention further relates to the cell migration inhibitor, wherein the serine threonine kinase activity of MAST205 is serine threonine kinase activity against DCTN1 and / or TIAM1.
さらに本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to the cell migration inhibitor, wherein the cell is a cancer cell.
さらにまた本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to the cell migration inhibitor, wherein the cell is an endothelial cell.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記細胞遊走阻害剤に関する。 The present invention also relates to the cell migration inhibitor comprising, as an active ingredient, a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference effect on MAST205.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action against MAST205, an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing and an oligonucleotide comprising the complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence The cell migration inhibitor is a short double-stranded oligonucleotide consisting of
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。 Further, the present invention provides an oligonucleotide in which a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action against MAST205 is represented by the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. It is related with the said cell migration inhibitor which is a short double-stranded oligonucleotide consisting of the oligonucleotide represented by these.
さらに本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害方法を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing cancer metastasis, characterized by using any one of the cell migration inhibition methods described above.
さらにまた本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害剤を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing cancer metastasis, characterized by using any of the cell migration inhibitors described above.
また本発明は、前記いずれかの細胞の遊走阻害剤を含んでなる癌の転移抑制剤に関する。 The present invention also relates to a cancer metastasis inhibitor comprising any of the aforementioned cell migration inhibitors.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing angiogenesis, which comprises inhibiting the expression and / or function of MAST205.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記血管新生の抑制方法に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting angiogenesis, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1
(2) Binding of MAST205 and TIAM1
(3) Binding of MAST205 and MLK3,
(4) Binding of MAST205 and MKK3,
(5) Binding of MAST205 and MKK4,
(6) Binding of MAST205 and MKK6,
(7) Binding of MAST205 and MKK7,
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK,
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制方法に関する。 The present invention also relates to the method for inhibiting angiogenesis, wherein the serine threonine kinase activity of MAST205 is serine threonine kinase activity against DCTN1 and / or TIAM1.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する前記血管新生の抑制方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for suppressing angiogenesis, wherein the expression and / or function of MAST205 is inhibited by RNA interference with MAST205.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である前記血管新生の抑制方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to the method for inhibiting angiogenesis, wherein RNA interference with MAST205 is RNA interference performed using a short double-stranded oligonucleotide against MAST205.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。 In the present invention, the short double-stranded oligonucleotide for MAST205 comprises a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and an oligonucleotide comprising the complementary base sequence of the base sequence. The present invention relates to a method for inhibiting angiogenesis, which is a heavy chain oligonucleotide.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。 Further, according to the present invention, the short double-stranded oligonucleotide for MAST205 is an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and the oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. The present invention relates to a method for inhibiting angiogenesis, which is a nucleotide.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to an angiogenesis inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of MAST205.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記血管新生の抑制剤に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
The present invention also relates to the angiogenesis inhibitor wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1
(2) Binding of MAST205 and TIAM1
(3) Binding of MAST205 and MLK3,
(4) Binding of MAST205 and MKK3,
(5) Binding of MAST205 and MKK4,
(6) Binding of MAST205 and MKK6,
(7) Binding of MAST205 and MKK7,
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK,
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to the aforementioned angiogenesis inhibitor wherein the serine threonine kinase activity of MAST205 is serine threonine kinase activity against DCTN1 and / or TIAM1.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記血管新生の抑制剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to the angiogenesis inhibitor comprising a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action against MAST205 as an active ingredient.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。 The present invention also provides a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action against MAST205, an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and an oligonucleotide containing a complementary base sequence of the base sequence; The angiogenesis inhibitor is a short double-stranded oligonucleotide comprising:
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。 Furthermore, the present invention provides an oligonucleotide in which a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action on MAST205 is represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. The angiogenesis inhibitor is a short double-stranded oligonucleotide comprising the oligonucleotide represented by
さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／または下記の群から選択される１つ以上の蛋白質とある化合物（以下、被検化合物と称する）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する：
（ｉ）ＤＣＴＮ１、
（ｉｉ）ＴＩＡＭ１、
（ｉｉｉ）ＭＬＫ３、
（ｉｖ）ＭＫＫ３、
（ｖ）ＭＫＫ４、
（ｖｉ）ＭＫＫ６、
（ｖｉｉ）ＭＫＫ７、
および
（ｖｉｉｉ）ｐ３８ ＭＡＰＫ。
Furthermore, the present invention is a method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration, which comprises MAST205 and / or one or more proteins selected from the following group (hereinafter referred to as a test compound). And a system using a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and the protein, and detecting the presence, absence or change of this signal and / or marker, Relates to an identification method comprising determining whether or not inhibits binding of MAST205 to the protein:
(I) DCTN1,
(Ii) TIAM1,
(Iii) MLK3,
(Iv) MKK3,
(V) MKK4,
(Vi) MKK6,
(Vii) MKK7,
And (viii) p38 MAPK.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 The present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and DCTN1, using MAST205 and / or DCTN1 in contact with a test compound, and using a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and DCTN1. The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and DCTN1 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1, using MAST205 and / or TIAM1 and a test compound, and using a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and TIAM1 The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and TIAM1 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＬＫ３と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MLK3, comprising contacting a signal with MAST205 and / or MLK3 with a test compound, and detecting a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and MLK3. The present invention relates to an identification method including determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and MLK3 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using the system to be used.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ３と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 The present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK3, wherein MAST205 and / or MKK3 is contacted with a test compound, and a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and MKK3 is used. The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and MKK3 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ４と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK4, using MAST205 and / or MKK4 and a test compound, and using a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and MKK4 The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and MKK4 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ６と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK6, comprising contacting a signal with MAST205 and / or MKK6 with a test compound, and detecting a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and MKK6. The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and MKK6 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using the system to be used.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ７と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 The present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK7, wherein MAST205 and / or MKK7 is contacted with a test compound, and a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and MKK7 is used. The present invention relates to an identification method comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and MKK7 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはｐ３８ ＭＡＰＫと被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention provides a method for identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to p38 MAPK, comprising contacting MAST205 and / or p38 MAPK with a test compound, and detecting a signal for detecting the binding of MAST205 to p38 MAPK and / or Identification comprising determining whether a test compound inhibits the binding of MAST205 and p38 MAPK by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using a system using a marker Regarding the method.
さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration, comprising contacting a MAST205 with a test compound and using a signal and / or marker for detecting the phosphorylation activity of MAST205. To determine whether the test compound inhibits the phosphorylation activity of MAST205 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker.
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 The present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205, comprising contacting MAST205 and / or DCTN1 with a test compound, and detecting a signal and / or marker for detecting phosphorylation of DCTN1 by MAST205. An identification method comprising determining whether a test compound inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using a system using About.
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a compound that inhibits phosphorylation of TIAM1 by MAST205, comprising contacting MAST205 and / or TIAM1 with a test compound, and detecting a signal and / or marker for detecting TIAM1 phosphorylation by MAST205 An identification method comprising determining whether a test compound inhibits phosphorylation of TIAM1 by MAST205 by detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker using a system using About.
さらにまた本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｅ）ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｆ）上記（ｅ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）上記（ｆ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｈ）上記（ｇ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
Furthermore, the present invention relates to a reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205,
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(E) any one protein selected from DCTN1 and TIAM1;
(F) a polynucleotide encoding the protein of (e) above,
(G) a recombinant vector containing the polynucleotide of (f) above, and (h) a transformant containing the recombinant vector of (g) above,
Consists of.
また本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｉ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｊ）上記（ｉ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｋ）上記（ｊ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｌ）上記（ｋ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
The present invention also relates to a reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205,
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(I) any one protein selected from MLK3, MKK3, MKK4, MKK6 and p38 MAPK;
(J) a polynucleotide encoding the protein of (i) above,
(K) a recombinant vector containing the polynucleotide of (j) above, and (1) a transformant containing the recombinant vector of (k) above,
Consists of.
さらに本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｍ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＪＮＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｎ）上記（ｍ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｏ）上記（ｎ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｐ）上記（ｏ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
Furthermore, the present invention relates to a reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205,
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(M) any one protein selected from MLK3, MKK4, MKK7 and JNK;
(N) a polynucleotide encoding the protein of (m) above,
(O) a recombinant vector containing the polynucleotide of (n) above, and (p) a transformant containing the recombinant vector of (o) above,
Consists of.
本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a cell migration inhibition method and a migration inhibitor that inhibit the expression and / or function of MAST205. Specifically, according to the present invention, the expression of MAST205, the binding of MAST205 and DCTN1, the binding of MAST205 and TIAM1, the binding of MAST205 and MLK3, the binding of MAST205 and MKK3, the binding of MAST205 and MKK4, the binding of MAST205 and MKK6, It is possible to provide a cell migration inhibition method and a migration inhibitor characterized by inhibiting at least one selected from the binding of MKK7, the binding of MAST205 and p38 MAPK, and the serine threonine kinase activity of MAST205.
ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫ等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。またＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。 MAST205 binds to proteins such as DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, and p38 MAPK, and promotes signal transduction involving these proteins, thereby promoting phosphorylation of p38 MAPK. The inventors believe that they are actively involved in cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses. MAST205 is also involved in phosphorylation of JNK by binding to proteins such as DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK4, and MKK7, and promoting information transmission involving these proteins. The inventors believe that they are involved in cell death or immune inflammatory responses.
実際に、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを本発明において見出した。したがって、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、癌の転移や免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。 In fact, it has been found in the present invention that cell migration and invasion are remarkably suppressed by inhibiting the expression of MAST205. Therefore, the inventors believe that inhibiting metastasis and / or function of MAST205 can suppress cancer metastasis and immune inflammatory response.
このように本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する癌の転移抑制方法および転移抑制剤を提供できる。 Thus, according to the present invention, a method for suppressing metastasis of cancer and a metastasis suppressor that inhibit the expression and / or function of MAST205 can be provided.
ＭＡＳＴ２０５がｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化の促進に関与することを本発明において見出し、また、ｐ３８ ＭＡＰＫが血管新生に関与することが知られていることから、本発明によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する血管新生抑制用法および血管新生抑制剤を提供できる。 It is found in the present invention that MAST205 is involved in the promotion of phosphorylation of p38 MAPK, and since p38 MAPK is known to be involved in angiogenesis, the present invention inhibits the expression and / or function of MAST205. An angiogenesis inhibiting method and an angiogenesis inhibitor can be provided.
さらに本発明により、前記阻害方法、前記阻害剤、前記抑制方法および前記抑制剤に用いる化合物の同定方法を提供できる。具体的には例えば、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法を提供できる。また、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化、およびＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化から選ばれる少なくとも１を阻害する化合物の同定方法を提供できる。 Furthermore, the present invention can provide the inhibition method, the inhibitor, the suppression method, and a method for identifying a compound used for the inhibitor. Specifically, for example, a method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration can be provided. Also, expression of MAST205, binding of MAST205 and DCTN1, binding of MAST205 and TIAM1, binding of MAST205 and MLK3, binding of MAST205 and MKK3, binding of MAST205 and MKK6, binding of MAST205 and MKK6, binding of MAST205 and MKK7, A method of identifying a compound that inhibits at least one selected from the binding of p38 MAPK, phosphorylation of DCTN1 by MAST205, and phosphorylation of TIAM1 by MAST205 can be provided.
また本発明により、（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つの成分と、（Ｂ）ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫから選ばれるいずれか１つの蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つの成分とを有してなる試薬キットを提供できる。 According to the present invention, (A) any one component selected from the group consisting of MAST205, a polynucleotide encoding MAST205, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a transformant containing the recombinant vector; ) Any one protein selected from DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, a polynucleotide encoding the protein, a recombinant vector containing the polynucleotide, and the recombinant vector A reagent kit comprising any one component selected from the group consisting of transformants contained therein can be provided.
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
As used herein, “protein” is a generic term that refers to an isolated or synthetic full-length protein; an isolated or synthetic full-length polypeptide; or an isolated or synthetic full-length oligopeptide. The term is sometimes used. Here, the protein, polypeptide or oligopeptide includes two or more amino acids linked to each other by peptide bonds or modified peptide bonds. Hereinafter, when an amino acid is represented, it may be represented by one letter or three letters.
（細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、癌の転移抑制方法および転移抑制剤、並びに血管新生の抑制方法および抑制剤）
本発明の一態様は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤に関する。
(Cell migration inhibiting method and migration inhibitor, cancer metastasis inhibiting method and metastasis inhibiting agent, and angiogenesis inhibiting method and inhibitor)
One embodiment of the present invention relates to a method for inhibiting cell migration and a migration inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of MAST205.
本発明の一態様はまた、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする癌の転移抑制方法および転移抑制剤に関する。 One embodiment of the present invention also relates to a cancer metastasis suppression method and a metastasis inhibitor characterized by inhibiting the expression and / or function of MAST205.
本発明の一態様はまた、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法および抑制剤に関する。 One embodiment of the present invention also relates to a method for suppressing angiogenesis and an inhibitor, which inhibit the expression and / or function of MAST205.
「ＭＡＳＴ２０５」は、セリンスレオニンキナーゼであり、ほとんどすべての正常組織において普遍的に発現が認められている（非特許文献２）。一方、***に、それも発達分化中の***において最も発現が高いという報告（非特許文献３）や、心臓において高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。 “MAST205” is a serine threonine kinase, and its expression is universally recognized in almost all normal tissues (Non-patent Document 2). On the other hand, there are reports that sperm has the highest expression in sperm that is also developing and differentiated (Non-patent Document 3) and reports that high expression is recognized in the heart (Non-Patent Document 2).
ＭＡＳＴ２０５として、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を好ましく例示できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質は、本発明において汎用の遺伝子工学的手法により取得した遺伝子によりコードされる１７９７アミノ酸残基からなる蛋白質であり、キナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持する。本蛋白質は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）として開示されているＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列と比較して、第３８８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基に置換していることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。本蛋白質が、公知ＭＡＳＴ２０５と著しく高い相同性を有し、公知ＭＡＳＴ２０５が有するキナーゼドメインおよびＰＤＺドメインと同一のアミノ酸配列からなるキナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持することから、本蛋白質は、ＭＡＳＴ２０５であると考えることができる。後述するように、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質が、ＤＣＴＮ１をリン酸化したこと（実施例２参照）から、機能の観点からも、本蛋白質はセリンスレオニンキナーゼであるＭＡＳＴ２０５であると考えることができる。 A preferable example of MAST205 is a human-derived protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The human-derived protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a protein consisting of 1797 amino acid residues encoded by a gene obtained by a general genetic engineering technique in the present invention, and includes a kinase domain and a PDZ domain Hold. Compared to the amino acid sequence of MAST205 disclosed in the NCBI database as accession number AAH65499 (1797 amino acid residues), this protein has the exception that the 388th amino acid residue is substituted with a glutamic acid residue. Have the same amino acid sequence. Since this protein has a remarkably high homology with known MAST205 and retains the kinase domain and PDZ domain consisting of the same amino acid sequence as the kinase domain and PDZ domain possessed by known MAST205, this protein is MAST205. Can think. As will be described later, since the human-derived protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 phosphorylated DCTN1 (see Example 2), from the viewpoint of function, this protein is serine threonine kinase. A MAST 205 can be considered.
ＭＡＳＴ２０５は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質に制限されず、該蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。また、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドに制限されず、該ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴や生物学的機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいていずれのポリヌクレオチドも包含される。 MAST205 is not limited to the human-derived protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, has sequence homology with the protein, and has the same structural features and biological functions as the protein. Any protein is included as long as it is a protein. The gene encoding MAST205 is not limited to the polynucleotide encoding the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and has a sequence homology with the polynucleotide and is encoded by the polynucleotide. Any polynucleotide is included as long as it is a polynucleotide that encodes a protein having the same structural characteristics and biological functions as the protein.
配列相同性は、通常、アミノ酸配列または塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。 It is appropriate that the sequence homology is usually 50% or more, preferably at least 70% in the whole amino acid sequence or base sequence. More preferably it is 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、該アミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドと配列相同性を有するポリヌクレオチドには、該ポリヌクレオチドの塩基配列において、１個以上、例えば１〜３００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質あるいは該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。 The protein having the sequence homology with the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is one or more, for example 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 1 in the amino acid sequence. A protein represented by an amino acid sequence having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of 20 amino acids, more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to several amino acids is included. In addition, the polynucleotide having the sequence homology with the polynucleotide encoding the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably one or more, for example, 1 to 300, preferably in the nucleotide sequence of the polynucleotide. Is represented by a base sequence having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of 1 to 90, more preferably 1 to 60, still more preferably 1 to 30, particularly preferably 1 to several nucleotides. Polynucleotides are included. The degree of mutation and the position thereof are the same as the structural characteristics and organisms of the protein having the mutation or the protein encoded by the polynucleotide having the mutation as the protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. There is no particular limitation as long as it has a scientific function. Proteins and polynucleotides having mutations may exist naturally, or may be artificially introduced with mutations.
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴は、酵素活性に関与するキナーゼドメイン、および同種または別種の蛋白質との結合に関与するＰＤＺドメインを例示できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、そのアミノ酸配列の第５１２番目から７８５番目のアミノ酸領域にキナーゼドメインを、第１１０５番目から１１８６番目のアミノ酸領域にＰＤＺドメインを保持する。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴とは、該蛋白質に存在する上記ドメインと配列相同性を有しかつ同様の機能を有するドメインを意味する。ドメインの配列相同性は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。 Examples of the structural features of the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include a kinase domain involved in enzyme activity and a PDZ domain involved in binding to the same or different protein. The protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 has a kinase domain in the amino acid region from the 512th to the 785th amino acid sequence and a PDZ domain in the amino acid region from the 1105th to the 1186th amino acid sequence. The structural features similar to the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 mean a domain having sequence homology with the domain present in the protein and having the same function. The sequence homology of the domain is preferably at least 70%, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. .
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能として、セリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。「セリンスレオニンキナーゼ活性」とは、本蛋白質が、基質となる他の蛋白質（以下、基質蛋白質と称することがある）と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および／またはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のγ−リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する機能を意味する。「基質」とは、酵素によって触媒作用を受ける化合物または分子を意味する。本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される基質蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、およびＰＴＥＮを好ましく例示できる。本蛋白質の基質蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。 Examples of the biological function of the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include serine threonine kinase activity. The “serine threonine kinase activity” means that the present protein binds to another protein serving as a substrate (hereinafter sometimes referred to as a substrate protein), and the hydroxyl of the serine residue and / or threonine residue of the substrate protein. It means the function of phosphorylating the substrate protein by catalyzing the reaction of transferring the γ-phosphate group of adenosine triphosphate (ATP) to the group. “Substrate” means a compound or molecule that is catalyzed by an enzyme. Preferred examples of substrate proteins that are phosphorylated by the serine threonine kinase activity of this protein include DCTN1, TIAM1, and PTEN. The substrate protein of this protein is not limited to these exemplified proteins, and can be any protein as long as it is a protein that is phosphorylated by the serine threonine kinase activity of this protein.
本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定は、基質蛋白質のリン酸化を指標にして実施できる。本蛋白質による基質蛋白質のリン酸化は、自体公知の蛋白質リン酸化測定方法を用いて、本蛋白質と基質蛋白質とを共存させてリン酸化反応を行った後にリン酸化基質蛋白質を測定することにより実施できる。このような方法として、本蛋白質と基質蛋白質とをインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で共存させる方法、および本蛋白質と基質蛋白質とを細胞で発現させて両蛋白質をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で共存させる方法のいずれも利用できる。リン酸化された基質蛋白質の検出は、例えば、リン酸化基質蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施できる。また、リン酸化された基質蛋白質の検出は、リン酸化反応に放射性同位体標識したＡＴＰ、例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、リン酸化反応により基質蛋白質に転移された［γ−３２Ｐ］の放射活性を測定することにより実施できる。具体的には、本実施例２を参照して本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定を実施できる。 The serine threonine kinase activity of this protein can be measured using phosphorylation of the substrate protein as an index. Phosphorylation of a substrate protein by this protein can be carried out by measuring the phosphorylated substrate protein after performing a phosphorylation reaction in the presence of this protein and the substrate protein using a known method for measuring protein phosphorylation. . As such a method, either a method in which the present protein and the substrate protein are allowed to coexist in vitro, or a method in which the present protein and the substrate protein are expressed in a cell so that the both proteins are allowed to coexist in vivo (in vivo). Can also be used. The phosphorylated substrate protein can be detected, for example, by Western blotting using an antibody against the phosphorylated substrate protein. In addition, the phosphorylated substrate protein can be detected by using a radioisotope-labeled ATP for the phosphorylation reaction, for example, [γ- 32 P] ATP, and [γ- 32 P transferred to the substrate protein by the phosphorylation reaction. ] By measuring the radioactivity. Specifically, the serine threonine kinase activity of this protein can be measured with reference to this Example 2.
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能としてまた、他の蛋白質との結合を例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、β２−シントロフィン、プロトカドヘリン ＬＫＣ、および腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーターを例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質と結合する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。「本蛋白質と他の蛋白質の結合」とは、本蛋白質と他の蛋白質とが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、本蛋白質と他の蛋白質がその一部分において結合すれば足りる。例えば、本蛋白質または他の蛋白質を構成するアミノ酸の中に、両蛋白質の結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。また、本蛋白質と他の蛋白質により形成される複合体には、これら蛋白質とは別種の蛋白質が含まれていてもよい。本蛋白質と他の蛋白質との結合の測定は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより実施できる。 Examples of the biological function of the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include binding to other proteins. The proteins that bind to this protein include DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, PTEN, TRAF2, TRAF6, β2-syntrophin, protocadherin LKC, and type IIa sodium / phosphor transporter Can be illustrated. The protein that binds to the present protein is not limited to these exemplified proteins, and can be any protein as long as it is a protein that binds to the present protein. "Binding of this protein and other proteins" means that this protein and other proteins interact with each other by non-covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic bonds, or electrostatic interactions so as to form a complex. Means that. In this case, the binding is sufficient if the present protein and another protein are bound in part. For example, amino acids that do not participate in the binding of both proteins may be included in the amino acids constituting the present protein or other proteins. In addition, the complex formed by the present protein and other proteins may contain a protein different from these proteins. The measurement of the binding between the present protein and other proteins can be carried out by a method known per se such as Western blotting, immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, fluorescence resonance energy transfer method, or a combination of these methods.
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９、ＣＡＨ７３２４４、ＢＡＢ４０７７８、およびＢＡＡ３４５２７として開示されている各蛋白質を例示できる。これら蛋白質は配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と比較して、ＰＤＺドメインのアミノ酸配列が同一であること、さらに、キナーゼドメインのアミノ酸配列が同一または１塩基置換の他は同一であることから、いずれも本蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有すると考えることができる。 Examples of the protein having sequence homology with the protein represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the proteins disclosed in the NCBI database as accession numbers AAH65499, CAH73244, BAB40778, and BAA34527. Compared with the protein represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, these proteins have the same amino acid sequence in the PDZ domain, and the same amino acid sequence in the kinase domain or the same except for one base substitution. Therefore, it can be considered that all have the same structural characteristics and biological functions as the present protein.
「ＭＡＳＴ２０５の発現」とは、ＭＡＳＴ２０５をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＭＡＳＴ２０５）のアミノ酸配列として翻訳されることをいう。 “Expression of MAST205” means that gene information of DNA encoding MAST205 is transcribed into mRNA, or is transcribed into mRNA and translated as an amino acid sequence of a protein (MAST205).
「ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する」とは、ＭＡＳＴ２０５をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写される過程、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＭＡＳＴ２０５）のアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも１つを妨げることにより、ＭＡＳＴ２０５遺伝子の転写・翻訳によるＭＡＳＴ２０５の生成を妨げることを意味する。 “Inhibiting the expression of MAST205” means various processes that occur in the process in which genetic information of DNA encoding MAST205 is transcribed into mRNA, or in the process of being transcribed into mRNA and translated as the amino acid sequence of protein (MAST205). By preventing at least one of these reactions, it means preventing the generation of MAST205 by transcription and translation of the MAST205 gene.
ＭＡＳＴ２０５の発現の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくはＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害する化合物、より好ましくはＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害する低分子量化合物を挙げることができる。ＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害するとは、当該発現を強く阻害するが、他の蛋白質の発現は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。低分子量化合物とは、ペプチド、ペプチド様物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機化合物、および無機化合物が含まれ、その分子量が好ましくは１００００以下、より好ましくは５０００以下、さらに好ましくは１０００以下、さらにより好ましくは５００以下の化合物を意味する。ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。 Inhibition of MAST205 expression can be carried out using a compound that inhibits MAST205 expression. As such a compound, a compound that specifically inhibits the expression of MAST205, preferably a low molecular weight compound that specifically inhibits the expression of MAST205 can be mentioned. Specifically inhibiting the expression of MAST205 means strongly inhibiting the expression but not inhibiting or weakly inhibiting the expression of other proteins. Low molecular weight compounds include peptides, peptide-like substances, polypeptides, polynucleotides, organic compounds, and inorganic compounds, and the molecular weight is preferably 10,000 or less, more preferably 5000 or less, even more preferably 1000 or less, and even more Preferably, it means 500 or less compounds. A compound that inhibits the expression of MAST205 can be obtained using the compound identification method described below.
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を例示できる（エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８；およびパディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。 Examples of the compound that inhibits the expression of MAST205 include siRNA (small interfering RNA) that can reduce or eliminate the expression of MAST205 by RNA interference techniques (Elbashir SM, et al., “Nature”, 2001, 411, p.494-498; and Paddison PJ et al., “Jeans and Development”, 2002, 16, 948-958).
ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡは、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの部分配列からなるＲＮＡ（センスＲＮＡ）と該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）とを、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより製造できる。ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、それぞれ数個ないし１０数個程度のヌクレオチドからなることが好ましい。また、それぞれ、その３´末端に、オーバーハング配列と呼ばれる１個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として用いる。オーバーハング配列は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのそれぞれの３´末端のリボース３´水酸基部位にジエステル結合により結合させる。 SiRNA for MAST205 is designed based on the sequence of MAST205 mRNA, RNA (sense RNA) consisting of a partial sequence of MAST205 mRNA and RNA (antisense RNA) consisting of a base sequence complementary to the base sequence of the RNA, It can be produced by synthesizing by a known chemical synthesis method and hybridizing the obtained RNAs. Each of the sense RNA and antisense RNA constituting the siRNA is preferably composed of several to about 10 or more nucleotides. In addition, it is preferable that a nucleotide consisting of one to several base sequences called an overhang sequence is bound to the 3 ′ end of each. The overhang sequence has the effect of protecting RNA from nucleases. The overhang sequence is not particularly limited as long as it does not inhibit the RNA interference effect of the RNA, preferably any one consisting of 1 to 10, more preferably 1 to 4, and even more preferably 2 nucleotides. Can also be used. Specifically, sequences such as a sequence composed of deoxythymidylic acid (for example, TT), a sequence composed of uridylic acid (for example, UU), and a sequence in which any nucleotide is bound following deoxythymidylic acid (for example, TN) can be exemplified. More preferably, a sequence composed of two deoxythymidylic acids is used as an overhang sequence because synthesis can be performed at low cost and nuclease resistance is higher. The overhang sequence is bonded to the ribose 3 ′ hydroxyl site at the 3 ′ end of each of the sense RNA and the antisense RNA by a diester bond.
ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡは上記例示したものに制限されず、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。 Examples of siRNA for MAST205 include short double-stranded oligonucleotides comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and an oligonucleotide comprising a complementary base sequence of the base sequence. As a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing and an oligonucleotide comprising a complementary base sequence of the base sequence, specifically, described in SEQ ID NO: 3 And a short double-stranded oligonucleotide consisting of the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence and the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. The oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has two deoxythymidylates at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence consisting of (TT) is bound. The siRNA for MAST205 is not limited to those exemplified above, and any can be used as long as the expression of MAST205 can be reduced or eliminated by an RNA interference technique.
蛋白質の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡとしてまた、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を例示できる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖ＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡと同様、ＲＮＡ干渉により遺伝子の発現を抑制する（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡに加え、これら２つのＲＮＡを連結しかつループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡを、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの塩基配列に基づいて設計して、自体公知の方法により製造することができる。好ましくは、センスＲＮＡの３´末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの５´末端とが結合し、さらにループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの３´末端とアンチセンスＲＮＡの５´末端とが結合したオリゴヌクレオチドであることが望ましい。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの間に存在して両ＲＮＡを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。このようなオリゴヌクレオチドの設計は、文献（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）の記載を参考にして実施できる。好ましくは４個ないし２３個、より好ましくは４個ないし８個のヌクレオチドからなるものが望ましい。例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社製）、ＡＡＣＧＴＴ、ＴＴＡＡ、ＣＡＡＧＣＴＴＣ等の配列を挙げることができる。ヘアピン構造を有する二重鎖の形成は、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分とを慣用の方法でアニーリングすることにより実施できる。 Examples of siRNA that can reduce or eliminate protein expression by RNA interference techniques include shRNA (short hairpin RNA). shRNA is a short double-stranded RNA having a hairpin structure and, like siRNA, suppresses gene expression by RNA interference (Paddison PJ et al., “Genes and Development”). 2002, volume 16, pages 948-958). The shRNA has a hairpin-like structure because the sense RNA and the antisense RNA are linked by, for example, an oligonucleotide, and the sense RNA-derived portion and the antisense RNA-derived portion form a double strand. shRNA is a method known per se by designing RNA containing oligonucleotides that link these two RNAs and form a loop structure in addition to sense RNA and antisense RNA based on the base sequence of MAST205 mRNA. Can be manufactured. Preferably, the 3 ′ end of the sense RNA is bonded to the 5 ′ end of the oligonucleotide forming the loop structure, and the 3 ′ end of the oligonucleotide forming the loop structure is bonded to the 5 ′ end of the antisense RNA. An oligonucleotide is preferred. The oligonucleotide that forms a loop structure means an oligonucleotide that exists between a sense RNA and an antisense RNA and that can link both RNAs and itself forms a loop structure. The design of such oligonucleotides is based on the description in the literature (Paddison PJ, et al., “Jeans and Development”, 2002, Vol. 16, pp. 948-958). Can be implemented. Preferably, it consists of 4 to 23 nucleotides, more preferably 4 to 8 nucleotides. For example, sequences such as TTCAAGAGA (Ambion or Oligoengine), AACGTT, TTAA, CAAGCTTC and the like can be mentioned. Formation of a duplex having a hairpin structure can be carried out by annealing a sense RNA-derived portion and an antisense RNA-derived portion by a conventional method.
また、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。 An example of a compound that inhibits the expression of MAST205 is an antisense oligonucleotide of the MAST205 gene.
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドの選択は、適当な細胞にＭＡＳＴ２０５遺伝子とｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドのいずれか１つとをコトランスフェクション（共遺伝子導入）し、ＭＡＳＴ２０５の発現をウエスタンブロッティング等の自体公知の方法により検出し、ＭＡＳＴ２０５の発現が阻害されるか否かを確認することにより実施できる。 The selection of siRNA, shRNA, and antisense polynucleotide having the function of inhibiting the expression of MAST205 is carried out by cotransfecting appropriate cells with any one of MAST205 gene and siRNA, shRNA, and antisense polynucleotide (co-gene). Introduction), and the expression of MAST205 is detected by a method known per se such as Western blotting, and it is confirmed whether or not the expression of MAST205 is inhibited.
内在性のＭＡＳＴ２０５の発現の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドを、適当な遺伝子工学的手法、例えばリポフェクションにより細胞内に導入することにより達成できる。 Inhibition of endogenous MAST205 expression can be achieved by introducing siRNA, shRNA, and antisense polynucleotides having a function of inhibiting MAST205 expression into cells by an appropriate genetic engineering technique such as lipofection.
ここでは、阻害効果を有する化合物（例えば競合阻害効果を有する低分子化合物等）を阻害剤と称する。 Here, a compound having an inhibitory effect (for example, a low molecular compound having a competitive inhibitory effect) is referred to as an inhibitor.
「ＭＡＳＴ２０５の機能」とは、ＭＡＳＴ２０５が備えている働きを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能として、上述したように、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を例示できる。ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、β２−シントロフィン、プロトカドヘリン ＬＫＣ、および腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーターを好ましく例示できる。 “Function of MAST 205” means a function of MAST 205. Examples of the function of MAST205 include serine threonine kinase activity of MAST205 and binding of MAST205 to other proteins as described above. As proteins to which MAST205 binds, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, PTEN, TRAF2, TRAF6, β2-syntrophin, protocadherin LKC, and type IIa sodium / phosphorus transporter Preferred examples can be given.
ＭＡＳＴ２０５の機能としてより具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性とは、ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のセリン残基および／またはスレオニン残基をリン酸化する活性を意味する。 More specifically, the functions of MAST205 include the coupling of MAST205 and DCTN1, the coupling of MAST205 and TIAM1, the coupling of MAST205 and MLK3, the coupling of MAST205 and MKK3, the coupling of MAST205 and MKK4, the coupling of MAST205 and MKK6, and the coupling of MAST205 and MKK7. Examples include binding, binding of MAST205 to p38 MAPK, and serine threonine kinase activity of MAST205 on DCTN1 and / or TIAM1. The serine threonine kinase activity of MAST205 with respect to DCTN1 and / or TIAM1 means the activity that MAST205 phosphorylates the serine residue and / or threonine residue of DCTN1 and / or TIAM1.
「ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する」とは、ＭＡＳＴ２０５が備えている働きを低減させるまたは消失させることを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害することとして、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害することを例示できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害することとして、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することを例示できる。 “Inhibiting the function of MAST205” means reducing or eliminating the function of MAST205. Inhibiting the function of MAST205 can be exemplified by inhibiting at least one of the serine threonine kinase activity of MAST205 and the binding of MAST205 to other proteins. More specifically, inhibition of the function of MAST205 includes binding of MAST205 and DCTN1, binding of MAST205 and TIAM1, binding of MAST205 and MLK3, binding of MAST205 and MKK3, binding of MAST205 and MKK4, binding of MAST205 and MKK6 Inhibiting at least one of MAST205 and MKK7 binding, MAST205 and p38 MAPK binding, and MAST205 serine threonine kinase activity against DCTN1 and / or TIAM1.
ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくはＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害する化合物、より好ましくはＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害する低分子量化合物を挙げることができる。ＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害するとは、当該機能を強く阻害するが、他の蛋白質の機能は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。 Inhibition of the function of MAST205 can be carried out using a compound that inhibits the function of MAST205. As such a compound, a compound that specifically inhibits the function of MAST205, preferably a low molecular weight compound that specifically inhibits the function of MAST205 can be mentioned. To specifically inhibit the function of MAST205 means to strongly inhibit the function but not to inhibit the function of other proteins or weakly. A compound that inhibits the function of MAST205 can be obtained using the compound identification method described below.
ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、具体的には、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害する化合物により実施できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を用いて実施できる。 Specifically, inhibition of the function of MAST205 can be carried out by a compound that inhibits at least one of the serine threonine kinase activity of MAST205 and the binding of MAST205 to other proteins. More specifically, inhibition of the function of MAST205 includes binding of MAST205 and DCTN1, binding of MAST205 and TIAM1, binding of MAST205 and MLK3, binding of MAST205 and MKK3, binding of MAST205 and MKK4, binding of MAST205 and MKK6, MAST205. And MKK7 binding, binding of MAST205 to p38 MAPK, and a compound that inhibits at least one of serine threonine kinase activities of DCT1 and / or TIAM1 of MAST205.
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害する化合物のうち、ＭＡＳＴ２０５と基質蛋白質の結合を阻害する化合物は、該結合を阻害する結果、ＭＡＳＴ２０５の該基質蛋白質への作用を阻害するため、例えば、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性による該基質蛋白質のリン酸化を阻害する。具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１への作用を阻害するため、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する。また、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１への作用を阻害するため、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する。 Among the compounds that inhibit the binding between MAST205 and other proteins, the compounds that inhibit the binding between MAST205 and the substrate protein inhibit the action of MAST205 on the substrate protein. Inhibits phosphorylation of the substrate protein by serine threonine kinase activity. Specifically, since a compound that inhibits the binding of MAST205 to DCTN1 inhibits the action of MAST205 on DCTN1, it inhibits the phosphorylation of DCTN1 by the serine threonine kinase activity of MAST205. In addition, a compound that inhibits the binding of MAST205 to TIAM1 inhibits TIAM1 phosphorylation by MAST205 serine threonine kinase activity in order to inhibit the action of MAST205 on TIAM1.
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５の不活性変異体（以下、不活性型ＭＡＳＴ２０５と称することがある）を例示できる。「ＭＡＳＴ２０５の不活性変異体」とは、ＭＡＳＴ２０５の変異体であって、セリンスレオニンキナーゼ活性がＭＡＳＴ２０５と比較して減弱したまたは消失したＭＡＳＴ２０５変異体を意味する。好ましい不活性型ＭＡＳＴ２０５として、ＭＡＳＴ２０５にアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたＭＡＳＴ２０５変異体であって、ＭＡＳＴ２０５が結合する他の蛋白質との結合能を有するが、セリンスレオニンキナーゼ活性を有さないＭＡＳＴ２０５変異体を例示できる。このような不活性型ＭＡＳＴ２０５は、野生型のＭＡＳＴ２０５と拮抗して他の蛋白質と結合することにより、該蛋白質に対するＭＡＳＴ２０５の作用を阻害できる。不活性型ＭＡＳＴ２０５は、天然に存在するものであってもよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。不活性型ＭＡＳＴ２０５における変異部位として、ＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列においてＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性に必要な部位を例示できる。不活性型ＭＡＳＴ２０５は、ＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列に基づいて所望の蛋白質を設計して公知の方法で製造し、取得した蛋白質の中からＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害するものを、後述する化合物の同定方法に記載の方法を用いて選別することにより取得できる。 Examples of compounds that inhibit the binding of MAST205 to other proteins include inactive mutants of MAST205 (hereinafter sometimes referred to as inactive MAST205). By “inactive mutant of MAST205” is meant a mutant of MAST205, wherein the serine threonine kinase activity is attenuated or eliminated compared to MAST205. A preferred inactive MAST205 is a MAST205 mutant in which a mutation such as an amino acid deletion, substitution, addition or insertion is introduced into MAST205, and has a binding ability to other proteins to which MAST205 binds, but serine threonine A MAST205 mutant having no kinase activity can be exemplified. Such inactive MAST205 can inhibit the action of MAST205 on the protein by antagonizing wild type MAST205 and binding to other proteins. The inactive MAST 205 may be naturally occurring or artificially introduced with mutations. Examples of the mutation site in inactive MAST205 include a site necessary for serine threonine kinase activity of MAST205 in the amino acid sequence of MAST205. Inactive MAST205 is a compound that is prepared by designing a desired protein based on the amino acid sequence of MAST205 and producing the protein by a known method, and inhibiting the binding of MAST205 to other proteins from the obtained proteins. It can be obtained by sorting using the method described in the identification method.
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質とが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害することができる。このようなポリペプチドは、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。これらポリペプチドは、後述する一般的な製造方法により取得できる。 Examples of the compound that inhibits the binding of MAST205 to other proteins include a polypeptide comprising an amino acid sequence at a site where MAST205 binds to other proteins. Such a polypeptide can competitively inhibit binding between proteins. Such a polypeptide is designed from the amino acid sequence of MAST205 or a protein that binds to MAST205 and synthesized by a peptide synthesis method known per se, by selecting one that inhibits the binding of MAST205 to the other protein. You can get it. A polypeptide in which mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids are introduced into the thus identified polypeptide is also encompassed in the scope of the present invention. The polypeptide into which such a mutation is introduced is preferably a polypeptide that inhibits the binding between MAST205 and the other protein. The polypeptide having a mutation may be a naturally occurring polypeptide, or may be an artificially introduced mutation. These polypeptides can be obtained by a general production method described later.
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質を認識する抗体であって、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害する抗体およびそのフラグメントを例示できる。かかる抗体は、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質自体、またはこれらの断片、好ましくはＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。 Examples of compounds that inhibit the binding of MAST205 to other proteins include antibodies that recognize MAST205 or a protein that binds to MAST205, and antibodies that inhibit the binding of MAST205 to the other proteins and fragments thereof. Such an antibody can be obtained by an antibody production method known per se using MAST205 or the protein itself binding to MAST205, or a fragment thereof, preferably a polypeptide comprising the amino acid sequence of the site where MAST205 binds to the other protein as an antigen.
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてさらにまた、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質を特異的に認識するアプタマーであって、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するアプタマーを例示できる。アプタマーは、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーのいずれであってもよい。かかるアプタマーは、公知の方法（例えば、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ Ｔ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８７巻、第５４５４号、ｐ．８２０−８２５；バーグスタラー（Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ Ｐ．）ら、「カレント オピニオン イン ドラッグ ディスカバリー アンド ディベロプメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第５巻、第５号、ｐ．６９０−７００；およびホップ−セイラー（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ．）ら、２００２年、「カレント モレキュラー メディシン（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００４年、第４巻、第５号、ｐ．５２９−５３８）に記載された方法）を用いて取得することができる。 Examples of compounds that inhibit the binding of MAST205 to other proteins include aptamers that specifically recognize MAST205 or a protein that binds to MAST205, and that inhibit the binding of MAST205 to the other proteins. The aptamer may be either a nucleic acid aptamer or a peptide aptamer. Such aptamers can be prepared by known methods (eg, Hermann T. et al., “Science”, 2000, 287, 5454, p. 820-825; Burgstaller P. et al., “Current Opinion in Drug Discovery and Development”, 2002, Vol. 5, No. 5, p. 690-700; and Hoppe-Seyler F. et al., 2 Year, “Current Molecular Medicine”, 2004, Vol. 4, No. 5, pp. 529-538). It can be obtained using the method).
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、基質蛋白質と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および／またはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のγ−リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。例えば、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１と結合し、ＤＣＴＮ１をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。また、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、ＴＩＡＭ１と結合し、ＴＩＡＭ１をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。 A compound that inhibits the serine threonine kinase activity of MAST205 is that MAST205 binds to a substrate protein, and the γ-phosphorus of adenosine triphosphate (ATP) is bound to the hydroxyl group of a serine residue and / or threonine residue of the substrate protein. It can be a compound that inhibits at least one of various reactions that occur in a series of reactions that phosphorylate the substrate protein by catalyzing a reaction of transferring an acid group. For example, a compound that inhibits serine threonine kinase activity of MAST205 on DCTN1 may be a compound that inhibits at least one of various reactions that occur in a series of reactions in which MAST205 binds to DCTN1 and phosphorylates DCTN1. . In addition, the compound that inhibits the serine threonine kinase activity of MAST205 on TIAM1 may be a compound that inhibits at least one of various reactions that occur in a series of reactions in which MAST205 binds to TIAM1 and phosphorylates TIAM1. .
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５に特異的に結合しそのセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する抗体またはそのフラグメントを例示できる。また、ＭＡＳＴ２０５に特異的に結合しそのセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有するアプタマーを例示できる。抗体あるいはアプタマーは上述の方法で取得でき、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性に対するこれらの阻害活性を後述する化合物の同定方法に記載の方法で測定することにより、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する抗体あるいはアプタマーを取得できる。 Examples of the compound that inhibits the serine threonine kinase activity of MAST205 include an antibody or a fragment thereof that specifically binds to MAST205 and inhibits its serine threonine kinase activity. Moreover, the aptamer which has the activity which specifically couple | bonds with MAST205 and inhibits the serine threonine kinase activity can be illustrated. The antibody or aptamer can be obtained by the above-described method, and by measuring the inhibitory activity of MAST205 on serine threonine kinase activity by the method described in the method for identifying a compound described later, the activity of inhibiting MAST205 serine threonine kinase activity can be obtained. Antibody or aptamer can be obtained.
本発明においては、ＭＡＳＴ２０５として配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を用い、該蛋白質が、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１それぞれと結合すること、さらにＤＣＴＮ１をリン酸化することを見出した（実施例１および２参照）。また、該蛋白質に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６／ＭＫＫ３、およびＪＮＫのリン酸化が阻害されることを見出した（実施例３参照）。 In the present invention, a human-derived protein represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was used as MAST205, and it was found that the protein binds to DCTN1 and TIAM1, respectively, and further phosphorylates DCTN1 ( See Examples 1 and 2.) In addition, it was found that phosphorylation of p38 MAPK, MKK6 / MKK3, and JNK was inhibited in cells transfected with siRNA against the protein (see Example 3).
さらに本発明において、ＭＡＳＴ２０５が、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれと結合することを見出した（実施例６参照）。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ＭＫＫ４のリン酸化が阻害されることを見出した（実施例７参照）。 Furthermore, in the present invention, it was found that MAST205 binds to MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, and p38 MAPK, respectively (see Example 6). Further, it was found that phosphorylation of MKK4 is inhibited in cells transfected with siRNA against MAST205 (see Example 7).
ＤＣＴＮ１は、１０〜１１個のサブユニット（それぞれ２２〜１５０ｋＤのサイズ）からなる巨大分子であるダイナクチンの最大サブユニットであり、１２７８アミノ酸残基からなる。本蛋白質は、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化にＭＫＫ３あるいはＭＫＫ６の活性化を介して関与している（チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ Ｐ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００４年、第２７９巻、第４４号、ｐ．４５３０８−４５３１１）。 DCTN1 is the largest subunit of Dynactin, which is a macromolecule consisting of 10 to 11 subunits (each having a size of 22 to 150 kD), and consists of 1278 amino acid residues. This protein is involved in stress stimulation, for example, phosphorylation of p38 MAPK by stimulation with sorbitol via the activation of MKK3 or MKK6 (Cheung P. et al., “The Journal of Biological Chemistry (The Journal of Biological Chemistry). Biological Chemistry), 2004, 279, 44, p. 45308-45311).
ＴＩＡＭ１は、１５９１アミノ酸残基からなる蛋白質であり、ＰＤＺドメインを有し、グアニン二リン酸−グアニン三リン酸（ＧＤＰ−ＧＴＰ）交換因子活性を示す。本蛋白質は、Ｔ細胞腫の浸潤、転移に関与することが知られている。その他、本蛋白質は神経細胞分化にも関与することが知られている。本蛋白質は急性骨髄性白血病を発症したダウン症の子供の骨髄で過剰発現している。本蛋白質はＭＫＫ３を介してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化に関与している（バックスバウム（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ Ｒ．Ｊ．）ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２２巻、第１２号、ｐ．４０７３−４０８５）。 TIAM1 is a protein consisting of 1591 amino acid residues, has a PDZ domain, and exhibits guanine diphosphate-guanine triphosphate (GDP-GTP) exchange factor activity. This protein is known to be involved in T cell tumor invasion and metastasis. In addition, this protein is known to be involved in neuronal differentiation. This protein is overexpressed in the bone marrow of children with Down syndrome who have developed acute myeloid leukemia. This protein is involved in phosphorylation of p38 MAPK through MKK3 (Buchsbaum RJ et al., “Molecular and Cellular Biology”, 2002, Vol. 22, No. 12, p. 4073-4085).
ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。 DCTN1 and TIAM1 have been implicated in the signal transduction pathway via p38 MAPK or its upstream MKK6 / MKK3.
ｐ３８ ＭＡＰＫおよびＪＮＫは、ＭＡＰキナーゼ（以下、ＭＡＰＫと略称することがある）ファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼである。 p38 MAPK and JNK are serine threonine kinases belonging to the MAP kinase (hereinafter sometimes abbreviated as MAPK) family.
ＭＡＰキナーゼは細胞内情報伝達系において重要な役割を果たすプロテインキナーゼの一つであり、関連する一連のプロテインキナーゼとともに連鎖的に活性化することによって、細胞膜表面のシグナルを核内に伝達する働きをしている。ＭＡＰＫが関与する細胞内情報伝達経路（以下、ＭＡＰキナーゼ経路と称することがある）には、キナーゼカスケードが存在し、該キナーゼカスケードにおいて、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫＫまたはＭＡＰ３Ｋと略称することがある）によりＭＡＰキナーゼキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫまたはＭＡＰ２Ｋと略称することがある）がリン酸化されて活性化され、次いでＭＡＰＫＫによりＭＡＰＫがリン酸化されて活性化する。ＭＡＰキナーゼカスケードにおいて活性化されたＭＡＰＫは数々の転写因子をリン酸化し、その結果、該転写因子により様々な遺伝子の転写が開始される。このＭＡＰキナーゼカスケードは、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達系で働いている。 MAP kinase is one of the protein kinases that play an important role in the intracellular signal transduction system. By linking it together with a series of related protein kinases, it functions to transmit cell membrane surface signals into the nucleus. is doing. Intracellular signal transduction pathways involving MAPK (hereinafter sometimes referred to as MAP kinase pathway) include a kinase cascade, and in the kinase cascade, MAP kinase kinase kinase (hereinafter abbreviated as MAPKKKK or MAP3K). MAP kinase kinase (hereinafter sometimes abbreviated as MAPKK or MAP2K) is phosphorylated and activated, and then MAPKK is phosphorylated and activated by MAPKK. MAPK activated in the MAP kinase cascade phosphorylates a number of transcription factors, and as a result, transcription of various genes is initiated by the transcription factor. This MAP kinase cascade works in various intracellular signal transduction systems generated by various stimuli such as cell proliferation stimulation and stress stimulation.
ＭＡＰ３Ｋ、ＭＡＰ２Ｋ、およびＭＡＰＫには多くのファミリー蛋白質が知られている。例えば、ＭＡＰ３Ｋファミリー蛋白質として、ＭＬＫ、ＭＥＫＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、およびＡＳＫ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）等の蛋白質が知られている。また、ＭＡＰＫＫファミリー蛋白質として、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびＭＫＫ７等の蛋白質が知られている。ＭＡＰＫファミリー蛋白質として、ｐ３８ ＭＡＰＫ（α／β／γ／δ）、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３等）、およびＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ：ＥＲＫ２、ＥＲＫ３等）等が知られている。 Many family proteins are known for MAP3K, MAP2K, and MAPK. For example, proteins such as MLK, MEKK (MAPK / ERK kinase kinase), and ASK1 (Apoptosis signal-regulating kinase 1) are known as MAP3K family proteins. Moreover, proteins such as MKK3, MKK4, MKK6, and MKK7 are known as MAPKK family proteins. As MAPK family proteins, p38 MAPK (α / β / γ / δ), JNK (JNK1, JNK2, and JNK3 etc.), ERK (Extracellular signal-regulated kinase: ERK2, ERK3 etc.) and the like are known.
ＭＬＫ３は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ １１とも呼称され、ＭＡＰ３Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼである。ＭＬＫ３は、８４７アミノ酸残基からなる蛋白質であり、分子内にＳＨ３ドメインやロイシンジッパーモチーフを有する。活性ループ内のセリン・スレオニン残基、特にアミノ酸配列中第２７７番目のスレオニン残基（Ｔｈｒ２７７）は自己リン酸化する。また、アミノ酸配列中第５５５番目および第５５６番目のセリン残基（Ｓｅｒ５５５およびＳｅｒ５５６）のリン酸化はＣＤＣ４２により誘導される。ＭＬＫ３はＭＡＰＫ８／ＪＮＫ１を活性化し、ＪＮＫシグナル伝達経路の促進的調節因子として機能することや、ＭＫＫ３を介してｐ３８の活性化を促進することなどが知られている。またＭＬＫ３は、ＩκＢキナーゼαとβを直接リン酸化することができ、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼやＣＤＣ４２を介したＮＦ−κＢの活性への関与も示唆されている。 MLK3, also called MAP kinase kinase kinase 11, is a serine threonine kinase that belongs to the MAP3K family. MLK3 is a protein consisting of 847 amino acid residues, and has an SH3 domain and a leucine zipper motif in the molecule. The serine / threonine residue in the active loop, particularly the 277th threonine residue (Thr277) in the amino acid sequence is autophosphorylated. In addition, phosphorylation of the 555th and 556th serine residues (Ser555 and Ser556) in the amino acid sequence is induced by CDC42. It is known that MLK3 activates MAPK8 / JNK1, functions as a promoter of the JNK signaling pathway, and promotes p38 activation via MKK3. In addition, MLK3 can directly phosphorylate IκB kinase α and β, and it has been suggested to be involved in the activity of NF-κB via Rho family GTPase and CDC42.
ＭＫＫ３は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３４７アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ３はサイトカインや環境ストレスにより活性化され、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基をリン酸化することが知られている。 MKK3 is a serine threonine kinase belonging to the MAP2K family and consists of 347 amino acid residues. It is known that MKK3 is activated by cytokines and environmental stresses and phosphorylates threonine and tyrosine residues of p38 MAPK.
ＭＫＫ４は、ＳＥＫ１とも称され、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３９９アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ４はサイトカインや環境ストレスにより活性化される。また、ＭＡＰキナーゼ経路においてＪＮＫ１／ＭＡＰＫ８、ＪＮＫ２／ＭＡＰＫ９およびｐ３８ ＭＡＰＫを活性化するが、ＥＲＫ２／ＭＡＰＫ１やＥＲＫ３／ＭＡＰＫ３は活性化しないことが知られている。 MKK4, also referred to as SEK1, is a serine threonine kinase belonging to the MAP2K family and consists of 399 amino acid residues. MKK4 is activated by cytokines and environmental stress. Further, it is known that JNK1 / MAPK8, JNK2 / MAPK9 and p38 MAPK are activated in the MAP kinase pathway, but ERK2 / MAPK1 and ERK3 / MAPK3 are not activated.
ＭＫＫ６は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３３４アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ６は、サイトカインや環境ストレスにより活性化され、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基をリン酸化することが知られている。また、ＭＫＫ６は、ストレスにより誘発される細胞周期停止、転写の活性化およびアポトーシスに関与している。 MKK6 is a serine threonine kinase belonging to the MAP2K family and consists of 334 amino acid residues. It is known that MKK6 is activated by cytokines and environmental stresses and phosphorylates threonine and tyrosine residues of p38 MAPK. MKK6 is also involved in cell cycle arrest, transcriptional activation and apoptosis induced by stress.
ＭＫＫ７は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、４１９アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ７はサイトカインや環境ストレスにより活性化され、ＪＮＫ１やＪＮＫ２を活性化することが知られている。また、ＭＫＫ７は、ＭＡＰ３Ｋ１／ＭＥＫＫ１、ＭＡＰ３Ｋ２／ＭＥＫＫ２、ＭＡＰ３Ｋ３／ＭＥＫＫ５等のＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼやＭＡＰ４Ｋ２／ＧＣＫによりリン酸化され活性化する。 MKK7 is a serine threonine kinase belonging to the MAP2K family and consists of 419 amino acid residues. It is known that MKK7 is activated by cytokines and environmental stress and activates JNK1 and JNK2. MKK7 is phosphorylated and activated by MAP kinase kinase kinase such as MAP3K1 / MEKK1, MAP3K2 / MEKK2, and MAP3K3 / MEKK5 and MAP4K2 / GCK.
ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３６０アミノ酸残基からなる。ｐ３８ ＭＡＰＫは、細胞内でのシグナル伝達経路で重要な働きをしており、環境ストレス、炎症性サイトカインおよびＬＰＳにより活性化され、インターロイキン６（ＩＬ−６）等のサイトカイン産生や細胞増殖、分化、転写調節等に関与し、ストレス応答やアポトーシスといった様々な細胞の応答を制御している。ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫＫＫファミリーやＭＡＰＫＫファミリーに属するキナーゼを介したキナーゼカスケードによって活性化される。ｐ３８ ＭＡＰＫは、基質としてＥＬＫ１やＡＴＦ２のような多くの転写因子をリン酸化して転写を促進する。また、ＭＡＰキナーゼ経路において下流に位置するＭＡＰＫＡＰＫ２やＭＡＰＫＡＰＫ５のようなキナーゼのリン酸化を介してシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）やサイトカインのｍＲＮＡを安定化させてプロスタグランジン産生やサイトカインを介した炎症反応を誘導したり、サイクリンＤ１をリン酸化して分解を促進し、細胞周期を停止させる等、転写因子以外の経路を制御する例も報告されている。 p38 MAPK is a serine threonine kinase belonging to the MAPK family and consists of 360 amino acid residues. p38 MAPK plays an important role in intracellular signal transduction pathways and is activated by environmental stress, inflammatory cytokines and LPS, and produces cytokines such as interleukin 6 (IL-6), cell proliferation and differentiation. It is involved in transcriptional regulation and controls various cellular responses such as stress response and apoptosis. p38 MAPK is activated by a kinase cascade via a kinase belonging to the MAPKKKK family or MAPKK family. p38 MAPK promotes transcription by phosphorylating many transcription factors such as ELK1 and ATF2 as substrates. In addition, the mRNA of cyclooxygenase-2 (COX-2) and cytokines is stabilized through phosphorylation of kinases such as MAPKAPK2 and MAPKAPK5 located downstream in the MAP kinase pathway to produce prostaglandin and inflammation via cytokines. Examples of controlling pathways other than transcription factors have been reported, such as inducing a reaction, phosphorylating cyclin D1 to promote degradation, and stopping the cell cycle.
ｐ３８ ＭＡＰＫは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている（ラフェリエール（Ｌａｆｅｒｒｉｅｒｅ Ｊ．）ら、「アナルズ オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイエンシズ（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第９７３巻、ｐ．５６２−５７２；ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）。また、ｐ３８ ＭＡＰＫが、血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦと略称する）により誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生において重要な役割を果たしていることが報告されている（ルソー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｓ．）ら、「トレンズ イン カルディオバスキュラー メディシン（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第１０巻、第８号、ｐ．３２１−３２７）。 p38 MAPK is known to be involved in cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses (Laferriere J. et al., “Anals of the New York of Sciences”. Academy of Sciences ", 2002, 973, p.562-572; Dong et al.," Annual Review of Immunology ", 2002, 20, p.55. -72). It has also been reported that p38 MAPK plays an important role in endothelial cell migration and proliferation induced by vascular endothelial growth factor (hereinafter abbreviated as VEGF) and angiogenesis (Rousseau S. et al. , Et al., "Trends in Cardiovascular Medicine", 2000, Vol. 10, No. 8, pp.321-327).
ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されている（ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）。 JNK is known to be involved in cell proliferation, cell death or an immune inflammatory response, and its function is regulated by phosphorylation by MKK7 / MKK4 (Dong C. et al., “Annual Review of Immunology ", 2002, Volume 20, pages 55-72).
ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質のうちＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ＭＡＳＴ２０５の基質蛋白質であり、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される。ＰＴＥＮについても、ＭＡＳＴ２０５によりリン酸化されると報告されている。ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。 Among the proteins to which MAST205 binds, DCTN1 and TIAM1 are substrate proteins of MAST205 and are phosphorylated by the serine threonine kinase activity of MAST205. PTEN has also been reported to be phosphorylated by MAST205. DCTN1 and TIAM1 have been implicated in the signal transduction pathway via p38 MAPK or its upstream MKK6 / MKK3.
これらから、ＭＡＳＴ２０５は、直接的および／または間接的にＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合してリン酸化し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路に促進的に作用すると考えることができる。 From these, MAST205 binds and phosphorylates directly and / or indirectly to DCTN1 and / or TIAM1, and thus promotes signaling pathways via p38 MAPK or its upstream MKK6 / MKK3. Then you can think.
ｐ３８ ＭＡＰＫが癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることから、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合することによりＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介してｐ３８ ＭＡＰＫをリン酸化し、その結果、癌の転移および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫがＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生に重要な役割を果たすことから、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合することによりＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介したｐ３８ ＭＡＰＫをリン酸化し、その結果、内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生を促進すると考えることができる。 Since p38 MAPK is involved in cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses, MAST205 phosphorylates p38 MAPK via MKK6 / MKK3 by binding to DCTN1 and / or TIAM1, resulting in: The inventors believe that they are actively involved in cancer metastasis and immune inflammatory responses. In addition, since p38 MAPK plays an important role in endothelial cell migration and proliferation and angiogenesis induced by VEGF, MAST205 binds to DCTN1 and / or TIAM1 to thereby bind p38 MAPK via MKK6 / MKK3. It can be considered to oxidize and consequently promote endothelial cell migration and proliferation as well as angiogenesis.
またＭＡＳＴ２０５は、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合したこと、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害によりＪＮＫのリン酸化が阻害されたこと、並びにＪＮＫの機能はＭＫＫ７／ＭＫＫ４によるリン酸化により調節されていること（ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）から、ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１との結合によりＭＫＫ７／ＭＫＫ４を介してＪＮＫのリン酸化に関与していると発明者らは考えている。 The inventors believe that MAST205 is also involved in phosphorylation of JNK, and as a result, is involved in cell proliferation, cell death or an immune inflammatory response. MAST205 was bound to DCTN1 and / or TIAM1, JNK phosphorylation was inhibited by inhibition of MAST205 expression, and the function of JNK was regulated by phosphorylation by MKK7 / MKK4 (Dong C. ) Et al., “Annual Review of Immunology”, 2002, Vol. 20, p. 55-72), MAST205 is coupled to DCTN1 and / or TIAM1 via MKK7 / MKK4 via JNK. The inventors believe that it is involved in the phosphorylation of.
ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質のうちＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫはＭＡＰキナーゼカスケードを構成する蛋白質である。また、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ストレス刺激によるＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３および７参照）。したがって、ＭＡＳＴ２０５はこれら蛋白質と結合することにより、該蛋白質のリン酸化に関与し、ひいては該蛋白質が関与する情報伝達を促進すると考えることができる。 Among the proteins to which MAST205 binds, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7 and p38 MAPK are proteins constituting the MAP kinase cascade. In addition, inhibition of MAST205 expression inhibited phosphorylation of MKK3, MKK4, MKK6, p38MAPK, and JNK by stress stimulation (see Examples 3 and 7). Therefore, it can be considered that MAST205 participates in phosphorylation of the protein by binding to these proteins, and thus promotes information transmission involving the protein.
ＭＡＰキナーゼ経路の機構として、足場蛋白質（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）によるＭＡＰＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＭＡＰ３Ｋの集積が示唆されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８；ホイットマーシュ（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ Ａ．Ｊ．）ら、「トレンズ イン バイオケミカル サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８年、第２３巻、ｐ．４８１−４８５）。 As a mechanism of the MAP kinase pathway, accumulation of MAPK, MAP2K, and MAP3K by scaffold proteins has been suggested (Morrison DK, et al., “Annual Review of Cell and Developmental Biology (Annual). Review of Cell and Developmental Biology ", 2003, Vol. 19, p. 91-118; Whitmarsh AJ et al.," Trends in Biochemical Science, 1998 ", 19th. 23, p. 481-485).
「足場蛋白質」とは、特定の同一の情報伝達経路に寄与する複数の特定分子を結合して会合させる機能を有する蛋白質を意味する。より詳しくは、足場蛋白質は情報伝達経路に寄与する複数の特定分子と結合することにより複合体を形成し、該分子間の選択的な反応を促進する機能を有する蛋白質を意味する。足場蛋白質との複合体形成により、情報伝達経路に寄与する特定の分子間の反応が促進されるため、該情報伝達経路が関与する特定の情報伝達が促進される。 “Scaffold protein” means a protein having a function of binding and associating a plurality of specific molecules contributing to a specific identical signal transduction pathway. More specifically, a scaffold protein means a protein having a function of forming a complex by binding to a plurality of specific molecules that contribute to a signal transduction pathway and promoting a selective reaction between the molecules. Since the complex formation with the scaffold protein promotes the reaction between specific molecules contributing to the information transmission pathway, the specific information transmission involving the information transmission pathway is promoted.
ＭＡＰキナーゼ経路において、足場蛋白質にＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋが集積することにより、ＭＡＰ３ＫによるＭＡＰ２Ｋのリン酸化および活性化、リン酸化ＭＡＰ２ＫによるＭＡＰＫのリン酸化および活性化が促進され、その結果、ＭＡＰキナーゼが関与する情報伝達が促進される。ＭＡＰキナーゼ経路に関与する足場蛋白質として、いくつかの蛋白質が報告されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８）。足場蛋白質の種類により結合する蛋白質が異なることから、足場蛋白質の種類とＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋそれぞれのファミリーに属する蛋白質の種類との間に、組み合わせが存在すると考えられる。ＭＡＰキナーゼ経路は、ＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋそれぞれのファミリーに属する蛋白質や足場蛋白質の多様性、およびそれらの組み合わせにより、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達を担っていると考えられる。 In the MAP kinase pathway, accumulation of MAPK, MAP2K and MAP3K in the scaffold protein promotes phosphorylation and activation of MAP2K by MAP3K, phosphorylation and activation of MAPK by phosphorylated MAP2K, and as a result, MAP kinase Involved communication is promoted. Several proteins have been reported as scaffold proteins involved in the MAP kinase pathway (Morrison DK, et al., “Annual Review of Cell and Development Biology”). ", 2003, Vol. 19, pp. 91-118). Since the proteins to be bound differ depending on the type of the scaffold protein, it is considered that a combination exists between the type of the scaffold protein and the types of proteins belonging to the respective families of MAPK, MAP2K, and MAP3K. The MAP kinase pathway is responsible for various intracellular signal transductions generated by various stimuli such as cell proliferation stimulation and stress stimulation by the diversity of proteins and scaffold proteins belonging to MAPK, MAP2K and MAP3K families, and combinations thereof. It is thought to be responsible.
一方、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４およびＭＫＫ６により、ｐ３８ ＭＡＰＫが活性化されること、およびＭＫＫ４およびＭＫＫ７によりＪＮＫが活性化することが報告されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８）。 On the other hand, it is reported that p38 MAPK is activated by MKK3, MKK4 and MKK6, and that JNK is activated by MKK4 and MKK7 (Morrison DK et al., “Annual Review of Cell. And Annual Development of Cell and Developmental Biology ", 2003, Vol. 19, p. 91-118).
また、ＭＬＫ３がＭＫＫ４をリン酸化すること（デイビス（Ｄａｖｉｓ Ｒ．Ｊ．）、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２０００年、第１０３巻、ｐ．２３９−２５２；ティブルス（Ｔｉｂｂｌｅｓ Ｌ．Ａ．）ら、「ザ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９６年、第１５巻、第２４巻ｐ．７０２６−７０３５）、およびＭＬＫ３がＭＫＫ７をリン酸化すること（メリット（Ｍｅｒｒｉｔｔ Ｓ．Ｅ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、第１５号、ｐ．１０１９５−１０２０２）が報告されている。 In addition, MLK3 phosphorylates MKK4 (Davis R. J., “Cell”, 2000, Vol. 103, p. 239-252; Tibbles LA, et al., “The EMBO Journal”, 1996, Vol. 15, Vol. 24, p. 7026-7035), and MLK3 phosphorylates MKK7 (Merritt SE, et al., “The The Journal of Biological Chemistry (1999, Vol. 27, No. 15, p. 10195-10202) has been reported.
さらに、ＭＬＫ３とＭＫＫ３の共発現がＭＫＫ３のリン酸化を誘導すること、およびＭＬＫ３とＭＫＫ６が共沈降することが実証され、それにより、哺乳動物や酵母におけるＭＡＰキナーゼ経路の機構の一部として、ＭＬＫ３によるＭＫＫ３／ＭＫＫ６の活性化とそれに続くｐ３８ ＭＡＰＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ３／ＭＫＫ６→ｐ３８ ＭＡＰＫ）という機構が提唱されている（ティブルス（Ｔｉｂｂｌｅｓ Ｌ．Ａ．）ら、「ザ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９６年、第１５巻、第２４巻ｐ．７０２６−７０３５）。 Furthermore, it has been demonstrated that co-expression of MLK3 and MKK3 induces phosphorylation of MKK3, and that MLK3 and MKK6 co-precipitate, thereby as a part of the mechanism of the MAP kinase pathway in mammals and yeast. The mechanism of activation of MKK3 / MKK6 and subsequent activation of p38 MAPK (MLK3 → MKK3 / MKK6 → p38 MAPK) has been proposed (Timbles LA, et al., “The EMBO Journal (The EMBO Journal)”. Journal) ", 1996, Vol. 15, Vol. 24, p. 7026-7035).
本発明における実証データおよび上記知見から本発明者らは、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路にはＭＬＫ３によるＭＫＫ３／ＭＫＫ４／ＭＫＫ６の活性化とそれに続くｐ３８ ＭＡＰＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ３／ＭＫＫ４／ＭＫＫ６→ｐ３８ ＭＡＰＫ）という機構が存在し、ＭＡＳＴ２０５は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。 From the empirical data in the present invention and the above findings, the present inventors have shown that the signaling pathways involved in p38 MAPK include activation of MKK3 / MKK4 / MKK6 by MLK3 and subsequent activation of p38 MAPK (MLK3 → MKK3 / MKK4 / MKK6 → p38 MAPK) exists, and MAST205 is considered to act as a scaffold protein in this mechanism. That is, MAST205 binds to MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, and p38 MAPK to form a complex and promote protein-protein interaction, and as a result, promotes a signal transduction pathway involving p38 MAPK. be able to.
さらに本発明者らは、ＪＮＫが関与する情報伝達経路にはＭＬＫ３によるＭＫＫ４／ＭＫＫ７の活性化とそれに続くＪＮＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ４／ＭＫＫ７→ＪＮＫ）という機構が存在し、ＭＡＳＴ２０５は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、およびＪＮＫと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、ＪＮＫが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。 Furthermore, the present inventors have a mechanism of MNK3 activation of MKK4 / MKK7 and subsequent JNK activation (MLK3 → MKK4 / MKK7 → JNK) in the signal transduction pathway involving JNK. It is thought to act as a scaffold protein. That is, it can be considered that MAST205 binds to MLK3, MKK4, MKK7, and JNK to form a complex and promote protein-protein interaction, and as a result, promotes a signal transduction pathway involving JNK.
ＭＡＳＴ２０５はＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫと結合して足場を提供することによりｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫炎症応答、並びにＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生（フワン（Ｈｕａｎｇ Ｃ．）ら、「ジャーナル オブ セル サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００４年、第１１７巻、ｐ．４６１９−４６２８）に促進的に関与すると発明者らは考えている。 MAST205 promotes a signaling pathway involving p38 MAPK by binding to MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, and p38 MAPK to provide a scaffold, and as a result, functions and responses of cells and organisms involving p38 MAPK. For example, cancer metastasis and immune inflammatory response, and VEGF-induced endothelial cell migration and proliferation and angiogenesis (Huang C. et al., "Journal of Cell Science", 2004, Inventors believe that they are actively involved in Vol. 117, pp. 4619-4628).
ＪＮＫはＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されていることが知られており、さらに、ＪＮＫ活性化は、細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移、血管新生との関連が示唆されている。具体的には、ＪＮＫの作用を阻害し得る化合物が、血管新生抑制を誘導することが報告されている。 JNK is known to have its function regulated by phosphorylation by MKK7 / MKK4. Furthermore, JNK activation is associated with cell and biological functions and responses such as cancer metastasis and angiogenesis. An association has been suggested. Specifically, it has been reported that a compound capable of inhibiting the action of JNK induces angiogenesis suppression.
このことから、ＭＡＳＴ２０５はＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７と結合して足場を提供することにより、ＭＬＫ３によるＭＫＫ４／ＭＫＫ７のリン酸化および活性化を促進し、さらにはＪＮＫが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、ＪＮＫが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫応答、内皮細胞の遊走や増殖、並びに血管新生に促進的に関与すると発明者らは考えている。 Thus, MAST205 binds to MLK3, MKK4, and MKK7 to provide a scaffold, thereby promoting MKK4 phosphorylation and activation by MLK3, and further promoting a signaling pathway involving JNK. As a result, the inventors believe that JNK is actively involved in the functions and responses of cells and organisms involved, such as cancer metastasis and immune response, endothelial cell migration and proliferation, and angiogenesis.
ＭＡＳＴ２０５が、このように、細胞の遊走および浸潤、血管新生、癌の転移、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、並びにＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。 By inhibiting MAST205 expression and / or function, MAST205 is thus thought to be involved in cell migration and invasion, angiogenesis, cancer metastasis, cell proliferation and death, and immune inflammatory responses. The inventors believe that cell migration and / or invasion can be inhibited, resulting in suppression of cancer metastasis, cell proliferation and cell death, angiogenesis and immune inflammatory responses. For example, cell migration and / or invasion can be inhibited by inhibiting at least one of the expression of MAST205, the binding of MAST205 to other proteins such as substrate proteins, and the serine threonine kinase activity of MAST205, and as a result It can be considered that cancer metastasis, cell proliferation and cell death, angiogenesis and immune inflammatory response can be suppressed. More specifically, expression of MAST205, binding of MAST205 and DCTN1, binding of MAST205 and TIAM1, binding of MAST205 and MLK3, binding of MAST205 and MKK3, binding of MAST205 and MKK4, binding of MAST205 and MKK6, binding of MAST205 and MKK7 Inhibition of cell migration and / or invasion by inhibiting at least one of binding, binding of MAST205 and p38 MAPK, and serine threonine kinase activity of MAST205 to DCTN1 and / or TIAM1, can result in metastasis of cancer. It can be considered that cell proliferation and cell death, angiogenesis and immune inflammatory response can be suppressed.
実際、本発明において、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した（実施例４および５参照）。 In fact, in the present invention, it has been found that by inhibiting the expression of MAST205, cell migration and invasion are remarkably suppressed (see Examples 4 and 5).
「細胞の遊走」とは、細胞がその運動能により元の位置から別の位置へと動くことを意味する。一般的に細胞の遊走は、遊走因子に対し濃度依存的な方向性を示す。細胞の方向性を持った遊走は、炎症性細胞の炎症部位への移動、癌細胞の浸潤および転移、血管新生のみならず、個体発生や器官の形成にも必須で重要な生理現象である。 “Cell migration” means that a cell moves from its original position to another position due to its motility. In general, cell migration exhibits a concentration-dependent direction with respect to the migration factor. Cell-oriented migration is an essential and important physiological phenomenon not only for migration of inflammatory cells to inflammatory sites, invasion and metastasis of cancer cells, and angiogenesis, but also for ontogeny and organ formation.
「細胞の遊走阻害」とは、細胞の元の位置から別の位置への移動を低減すること、または移動させないことを意味する。具体的には、移動する細胞の数および／または細胞の移動距離を低減させることを意味する。 “Inhibition of cell migration” means to reduce or not move a cell from its original position to another position. Specifically, it means reducing the number of moving cells and / or the moving distance of the cells.
「細胞の浸潤」とは、細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を破壊し、ＥＣＭが形成するバリアーを通過して、ＥＣＭ自体や周囲の組織に侵入することを意味する。例えば、癌細胞の浸潤とは、癌細胞が基底膜を破壊し、上皮下組織や周囲の他臓器に侵入することを意味する。「細胞外マトリックス（ＥＣＭ）」とは、動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物である。ＥＣＭは細胞により合成され、細胞外に分泌・蓄積された生体高分子の複雑な会合体であり、細胞膜成分は含まない。その主要な構成成分は、繊維状蛋白質（コラーゲン、エラスチン、フィブリリン等）、ムコ多糖類（プロテオグリカン、グリコサミノグリカン等）、および糖蛋白質（フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等）である。ＥＣＭは、細胞接着、細胞移動、細胞の分化・増殖、細胞骨格の配向、細胞形態形成、および細胞代謝等に重要な役割を果たしている。 “Cell invasion” means that cells destroy the extracellular matrix (ECM) and pass through the barrier formed by the ECM to enter the ECM itself and surrounding tissues. For example, invasion of cancer cells means that cancer cells destroy the basement membrane and invade the subepithelial tissue or other surrounding organs. An “extracellular matrix (ECM)” is a stable anatomy that exists outside the cells in animal tissue. ECM is a complex association of biopolymers synthesized by cells and secreted / accumulated extracellularly, and does not contain cell membrane components. The main components are fibrous proteins (collagen, elastin, fibrillin, etc.), mucopolysaccharides (proteoglycan, glycosaminoglycan, etc.), and glycoproteins (fibronectin, laminin, vitronectin, etc.). ECM plays an important role in cell adhesion, cell migration, cell differentiation / proliferation, cytoskeletal orientation, cell morphogenesis, cell metabolism, and the like.
「癌の転移」とは、癌が原発巣から分離して、別の組織や臓器に移行し、そこで増殖することを意味する。 “Cancer metastasis” means that the cancer has separated from the primary focus, migrated to another tissue or organ, and proliferated there.
「癌の転移抑制」とは、癌の原発巣からの分離、別の組織や臓器への移行、移行先における増殖を低減させることを意味する。 “Inhibition of metastasis of cancer” means that cancer is separated from the primary lesion, transferred to another tissue or organ, and reduced in the growth destination.
「細胞増殖」とは、***により細胞の数が増すことを意味し、炎症性刺激に対する反応としての細胞増殖並びに腫瘍性増殖等を含む。 “Cell proliferation” means that the number of cells increases due to division, and includes cell proliferation as a response to inflammatory stimuli as well as neoplastic proliferation.
「細胞死」とは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の死を意味する。 “Cell death” refers to cell death in vivo and in vitro.
「血管新生」とは、新たな血管の形成を意味する。癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチのような疾患には過剰に血管が形成されるという特徴がある。癌においては、癌細胞が産生する血管新生誘導物質により活性化された血管内皮細胞が誘導物質に向かって遊走し、かつ組織内に浸潤して増殖し、新たな血管を形成する。新生血管は癌細胞の増殖を促進し、さらに新しい転移巣の形成に関与する。 “Angiogenesis” means the formation of new blood vessels. Diseases such as cancer, diabetic retinopathy and rheumatoid arthritis are characterized by excessive blood vessel formation. In cancer, vascular endothelial cells activated by angiogenesis-inducing substances produced by cancer cells migrate toward the inducing substance and infiltrate into the tissue to proliferate to form new blood vessels. Neovascularization promotes the growth of cancer cells and is also involved in the formation of new metastases.
「血管新生の抑制」とは、新たな血管の形成を低減させることを意味する。 “Inhibition of angiogenesis” means reducing the formation of new blood vessels.
「免疫炎症応答」とは、生体組織の傷害において、生体組織に対して何らかの有害な刺激を起こす物質（起炎物質）が作用したときに生体が示す局所の反応を意味する。組織傷害の原因として、細菌感染、外傷、熱・放射線・電気等の物理的刺激、および化学物質を例示できる。炎症部位では血管内皮細胞表面の接着分子の発現、血管内皮へのリンパ球・好中球・単球の接着と血管外への遊走、血管透過性の亢進が認められる。炎症のメディエーターとして、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジン、ロイコトリエンや、各種サイトカイン等の生理活性物質が関与している。免疫炎症応答に関与するサイトカインとして、単球やマクロファージ等から産生されるインターロイキン１（以下、ＩＬ−１と略称する）、細胞性免疫に関与するヘルパーＴ１細胞の分化や活性化に関与するＩＬ−１２・インターフェロンγ・腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、また、液性免疫に関与するヘルパーＴ２細胞の分化や活性化に関与するＩＬ−４・ＩＬ−５・ＩＬ−１０を例示できる。 “Immune inflammation response” means a local reaction exhibited by a living body when a substance (flame-causing substance) that causes some harmful stimulation to the living tissue acts upon injury of the living tissue. Examples of the cause of tissue injury include bacterial infection, trauma, physical stimulation such as heat, radiation, electricity, and chemical substances. Expression of adhesion molecules on the surface of vascular endothelial cells, adhesion of lymphocytes / neutrophils / monocytes to the vascular endothelium and migration to the outside of the blood vessel, and increased vascular permeability are observed at the inflammatory site. Physiologically active substances such as histamine, serotonin, prostaglandins, leukotrienes and various cytokines are involved as mediators of inflammation. As cytokines involved in immune inflammatory responses, interleukin 1 (hereinafter abbreviated as IL-1) produced from monocytes, macrophages and the like, IL involved in differentiation and activation of helper T1 cells involved in cellular immunity Examples include -12, interferon γ, tumor necrosis factor α (TNF-α), and IL-4, IL-5, and IL-10 involved in the differentiation and activation of helper T2 cells involved in humoral immunity.
細胞の遊走および浸潤の検出は、例えば、市販の細胞遊走測定システムまたは細胞浸潤測定システムを用いて実施できる。 Detection of cell migration and invasion can be performed using, for example, a commercially available cell migration measurement system or cell invasion measurement system.
細胞遊走測定システムとして、具体的には、セルカルチャーインサートとコンパニオンプレートから構成される細胞遊走測定チャンバー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を例示できる。セルカルチャーインサートは、細孔を有するＰＥＴメンブレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）をその底に保持する。セルカルチャーインサートはコンパニオンプレートの上部にセットして用いる。セルカルチャーインサートに添加された遊走性細胞は、ＰＥＴメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパニオンプレート側）に移動する。しかし、非遊走性細胞は、ＰＥＴメンブレンの表面（セルカルチャーインサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞遊走を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、簡便には、それぞれの細胞を計数することにより実施できる。細胞の計数は、細胞を回収して、その数を実際に計数することにより実施できる。または、上記のようなシステムを用いたときには、移動しない細胞を除去した後に、メンブレンの裏面の細胞を適当な細胞染色剤で染色し、数箇所の領域の顕微鏡写真を撮影して細胞数を算定することができる。また、予め細胞を蛍光標識して用い、移動した細胞のみを回収してその蛍光を測定することにより細胞の定量を実施できる。細胞染色剤として蛍光色素を用いる場合、また、予め細胞を蛍光標識して用いる場合は、セルカルチャーインサートとして、フルオロブロック セルカルチャーインサート（Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ，ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いることにより、より簡便にメンブレンの裏面に移動した細胞の定量を実施できる。 Specific examples of the cell migration measurement system include a cell migration measurement chamber (BD Falcon) composed of a cell culture insert and a companion plate. The cell culture insert holds a PET membrane (polyethylene phthalate membrane) having pores at the bottom thereof. The cell culture insert is set on the top of the companion plate. The migratory cells added to the cell culture insert move to the back surface (companion plate side) of the membrane through the pores present in the PET membrane. However, non-migrating cells remain on the surface of the PET membrane (cell culture insert side). Therefore, cell migration can be detected by measuring the cells present on the back surface of the membrane. The quantification of the migrated cells and non-migrated cells can be carried out simply by counting the respective cells. Cell counting can be performed by collecting the cells and actually counting the number. Or, when using a system like the one above, after removing non-migrating cells, stain the cells on the back of the membrane with an appropriate cell stain and take micrographs of several areas to calculate the number of cells. can do. In addition, the cells can be quantified by fluorescently labeling cells in advance, collecting only the migrated cells, and measuring the fluorescence. When a fluorescent dye is used as a cell stain, or when cells are fluorescently labeled in advance, by using a fluoroblock cell culture insert (manufactured by BD Falcon) as a cell culture insert, Quantification of cells that have moved to the back of the membrane can be performed easily.
細胞浸潤測定システムとして、具体的には、上記セルカルチャーインサートにＥＣＭを塗布したものとコンパニオンプレートから構成される細胞浸潤測定チャンバーを例示できる。ＥＣＭとして、マトリゲル（ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ ＲＥＤＵＣＥＤ ＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＭＡＴＲＩＸ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を例示できる。また、細胞浸潤測定システムとして、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のバイオコートＴＭマトリゲルＴＭ（ＢｉｏＣｏａｔＴＭｍａｔｒｉｇｅｌＴＭ） インベージョンチャンバーを例示できる。バイオコートＴＭマトリゲルＴＭ インベージョンチャンバーは細胞の浸潤特性試験用インビトロシステムであり、再構成したＥＣＭが予め塗布された細孔を有するＰＥＴメンブレンを保持するセルカルチャーインサートとコンパニオンプレートから構成されている。ＥＣＭが塗布されたセルカルチャーインサートはコンパニオンプレートの上部にセットして用いる。該セルカルチャーインサートに添加された浸潤性細胞は、ＥＣＭが塗布されたＰＥＴメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパニオンプレート側）に移動する。しかし、非浸潤性細胞はＥＣＭが形成するバリアーを通過できないため、メンブレンの表面（セルカルチャーインサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞浸潤を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、上記した方法と同じ方法により実施できる。 As a cell infiltration measurement system, specifically, a cell infiltration measurement chamber composed of a cell culture insert coated with ECM and a companion plate can be exemplified. An example of the ECM is Matrigel (GROWTH FACTOR REDUCED BD MATRIGEL MATRIX, manufactured by BD Biosciences). Further, as cell infiltration measurement system can be exemplified by bio-coating TM Matrigel TM (BioCoat TM matrigel TM) invasion chamber manufactured by BD Falcon Corporation. Biocoat TM Matrigel TM invasion chamber is in vitro system for invasive properties test cell, and a cell culture insert and the companion plate for holding a PET membrane with pores reconstituted ECM is previously applied . The cell culture insert coated with ECM is used by setting it on the top of the companion plate. The infiltrating cells added to the cell culture insert move to the back surface (companion plate side) of the membrane through the pores present in the PET membrane coated with ECM. However, since non-invasive cells cannot pass through the barrier formed by the ECM, they remain on the membrane surface (cell culture insert side). Therefore, cell infiltration can be detected by measuring the cells present on the back surface of the membrane. Quantification of migrated cells and non-migrated cells can be performed by the same method as described above.
本発明に係る細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤により遊走が阻害される細胞として、ＭＡＳＴ２０５の発現が亢進しており、ＭＡＳＴ２０５による遊走や浸潤が認められる細胞を挙げることができる。具体的には、癌細胞や内皮細胞を例示できる。 Examples of the cells whose migration is inhibited by the cell migration inhibition method and the migration inhibitor according to the present invention include cells in which MAST205 expression is enhanced and migration and invasion by MAST205 are observed. Specifically, cancer cells and endothelial cells can be exemplified.
ＭＡＳＴ２０５の発現は、ほとんどすべての正常組織において普遍的に認められるという報告がある（非特許文献２）。一方、***に、それも発達分化中の***において最も発現が高いという報告（非特許文献３）や、心臓において高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。 There is a report that the expression of MAST205 is universally recognized in almost all normal tissues (Non-patent Document 2). On the other hand, there are reports that sperm has the highest expression in sperm that is also developing and differentiated (Non-patent Document 3) and reports that high expression is recognized in the heart (Non-Patent Document 2).
ＭＡＳＴ２０５の発現は、癌組織において正常組織と比較して亢進が認められる。例えば、肺平滑筋肉腫（ｌｕｎｇ ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）や小細胞肺癌（ｌｕｎｇ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、および骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）等の癌組織において、ＭＡＳＴ２０５の発現亢進が認められる。これらの腫瘍はいずれも転移能が高いことが知られている。これらの腫瘍ではＭＡＳＴ２０５の発現が亢進しているため、腫瘍細胞の遊走や浸潤が促進され、その結果、転移能が高くなると考えられる。 Increased expression of MAST205 is observed in cancer tissues compared to normal tissues. For example, increased expression of MAST205 is observed in cancer tissues such as lung leiomyosarcoma, small cell cell carcinoma, medulloblastoma, and osteosarcoma. All of these tumors are known to have high metastatic potential. In these tumors, the expression of MAST205 is enhanced, so that the migration and invasion of tumor cells are promoted, and as a result, the metastatic ability is considered to increase.
本発明に係る細胞の遊走阻害剤および血管新生抑制剤は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を有効成分として含む。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を有効成分として含む。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、並びにＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を有効成分として含む。 The cell migration inhibitor and the angiogenesis inhibitor according to the present invention contain a compound that inhibits the expression and / or function of MAST205 as an active ingredient. For example, a compound that inhibits at least one of the expression of MAST205, the binding of MAST205 to another protein such as a substrate protein, and the serine threonine kinase activity of MAST205 is included as an active ingredient. More specifically, expression of MAST205, binding of MAST205 and DCTN1, binding of MAST205 and TIAM1, binding of MAST205 and MLK3, binding of MAST205 and MKK3, binding of MAST205 and MKK4, binding of MAST205 and MKK6, binding of MAST205 and MKK7 A compound that inhibits at least one of the binding, the binding of MAST205 and p38 MAPK, and serine threonine kinase activity of DCT1 and / or TIAM1 of MAST205 is included as an active ingredient.
ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を有効成分として、具体的には、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＭＡＳＴ２０５の発現量を減少させるまたは消失させることができるため、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を低減または消失させることができ、その結果、ＭＡＳＴ２０５の該蛋白質への作用、例えばセリンスレオニンキナーゼ活性を低減または消失させることができる。 A compound that inhibits the expression and / or function of MAST205 can be exemplified as a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference action on MAST205. Since a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference effect on MAST205 can reduce or eliminate the expression level of MAST205 by inhibiting the expression of MAST205, MAST205 and other proteins such as substrate protein Can be reduced or eliminated, and as a result, the action of MAST205 on the protein, such as serine threonine kinase activity, can be reduced or eliminated.
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドは上記例示したものに制限されず、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。 As a short double-stranded oligonucleotide having an RNA interference effect on MAST205, a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and an oligonucleotide comprising a complementary base sequence of the base sequence A heavy chain oligonucleotide can be preferably exemplified. As a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing and an oligonucleotide comprising a complementary base sequence of the base sequence, specifically, described in SEQ ID NO: 3 And a short double-stranded oligonucleotide consisting of the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence and the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. The oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has two deoxythymidylates at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence consisting of (TT) is bound. The short double-stranded oligonucleotide having RNA interference action on MAST205 is not limited to those exemplified above, and any can be used as long as the expression of MAST205 can be reduced or eliminated by the technique of RNA interference.
本発明に係る細胞の遊走阻害剤は、細胞の遊走阻害方法の実施に用いることができる。 The cell migration inhibitor according to the present invention can be used for carrying out a cell migration inhibition method.
細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、細胞の遊走および浸潤を阻害することにより、癌の転移を抑制することができると考えることができる。したがって、本発明に係る細胞の遊走阻害剤および遊走阻害方法を用いることにより、癌の転移抑制方法を実施できる。また、本発明に係る細胞の遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤を提供することができる。 Since cell migration and invasion are indicators of the metastatic potential of cancer, it can be considered that metastasis of cancer can be suppressed by inhibiting cell migration and invasion. Therefore, by using the cell migration inhibitor and the migration inhibition method according to the present invention, a cancer metastasis suppression method can be carried out. Moreover, the metastasis inhibitor of cancer containing the cell migration inhibitor which concerns on this invention can be provided.
本発明に係る血管新生阻害剤は、血管新生の阻害方法の実施に用いることができる。 The angiogenesis inhibitor according to the present invention can be used in the implementation of a method for inhibiting angiogenesis.
本発明に係る細胞の遊走阻害剤、癌の転移抑制剤、および血管新生の抑制剤は、医薬組成物として調製することができる。この場合、通常、有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。 The cell migration inhibitor, cancer metastasis inhibitor, and angiogenesis inhibitor according to the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition. In this case, it is usually preferable to produce a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical carriers in addition to the active ingredient.
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。 The amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation according to the present invention is appropriately selected from a wide range. Usually, it is appropriate that the amount is in the range of about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight.
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。 Examples of the pharmaceutical carrier include fillers, fillers, binders, wetting agents, disintegrating agents, lubricants, diluents and excipients that are generally used depending on the form of use of the preparation. These are appropriately selected and used depending on the administration form of the resulting preparation.
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。 More specifically, water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, Examples include gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose. These may be used singly or in combination of two or more according to the dosage form of the pharmaceutical composition.
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。 If desired, various components that can be used in normal protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, tonicity agents, chelating agents, surfactants, pH adjusters, and the like can be used as appropriate. .
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。 Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L-amino acids, sugars, and cellulose derivatives. These can be used alone or in combination with a surfactant or the like. In particular, according to this combination, the stability of the active ingredient may be further improved. The L-amino acid is not particularly limited, and may be any of glycine, cysteine, glutamic acid and the like. Sugars are not particularly limited, for example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol, xylitol, disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate, Any of polysaccharides such as hyaluronic acid, and derivatives thereof may be used. The cellulose derivative is not particularly limited, and may be any of methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium and the like.
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。 There is no particular limitation on the surfactant, and either an ionic surfactant or a nonionic surfactant can be used. Examples of the surfactant include polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, sorbitan monoacyl ester, and fatty acid glyceride.
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。 Buffers include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ε-aminocaproic acid, glutamic acid and / or their corresponding salts (for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts thereof, An alkaline earth metal salt).
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。 Examples of the isotonic agent include sodium chloride, potassium chloride, saccharides and glycerin.
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。 Examples of the chelating agent include sodium edetate and citric acid.
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。 The medicament and pharmaceutical composition according to the present invention can be used as a solution preparation, and after lyophilized and stored, the medicine and pharmaceutical composition are dissolved in a buffer solution containing water, physiological saline, etc. at the time of use. It can also be used after adjusting to an appropriate concentration.
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。 The dose range of the medicine and the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, the administration form, the administration route, the type of the disease, the nature of the subject (weight, age, medical condition, presence or absence of other medicines, etc.) ) And the judgment of the doctor in charge, etc. In general, an appropriate dose is, for example, about 0.01 μg to 100 mg, preferably about 0.1 μg to 1 mg, per 1 kg body weight of the subject. However, these dose modifications can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art. The above dosage can be administered once to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every several days or weeks.
本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬や抗炎症用医薬の有効成分等を配合してもよい。 When administering the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with other compounds or medicines necessary for the prevention and / or treatment of the target disease. For example, you may mix | blend the active ingredient of the medicine for other anti-tumors, and the medicine for anti-inflammation.
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することができる。 As the administration route, either systemic administration or local administration can be selected. In this case, an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like. For example, examples of parenteral routes include normal intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous, intradermal, intramuscular administration, and the like. Alternatively, it can be administered by the oral route. Furthermore, transmucosal administration or transdermal administration is also possible. When used for cancer diseases, it can be administered directly to the tumor by injection or the like.
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。 Various forms can be selected according to the purpose. Typical examples are solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, aqueous preparations, ethanol solution preparations, suspensions, fat emulsions, liposome preparations, Inclusion bodies such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir are included. Depending on the route of administration, these may be oral, parenteral (instillation, injection), nasal, inhalation, vaginal, suppository, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, creams And can be prepared, molded and prepared according to ordinary methods.
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法、およびＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物の同定方法に関する。
(Compound identification method)
One embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration and a method for identifying a compound that inhibits the function of MAST205.
本発明においては、細胞の遊走および／または浸潤の阻害を、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより達成できることを見出した（実施例４および５参照）。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を用いることにより、細胞の遊走および／または浸潤の阻害を達成できる。すなわち、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物は、細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物であるということができる。したがって、細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物を、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する活性を指標にして同定することができる。 In the present invention, it has been found that inhibition of cell migration and / or invasion can be achieved by inhibiting the expression and / or function of MAST205 (see Examples 4 and 5). For example, inhibition of cell migration and / or invasion can be achieved by using compounds that inhibit MAST205 expression and / or function. That is, it can be said that a compound that inhibits the expression and / or function of MAST205 is a compound having an activity of suppressing cell migration and / or invasion. Therefore, a compound having an activity of suppressing cell migration and / or invasion can be identified using the activity of inhibiting the expression and / or function of MAST205 as an index.
ＭＡＳＴ２０５の機能として、上述したように、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を例示できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性によりＤＣＴＮ１がリン酸化され、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性により、ＴＩＡＭ１がリン酸化される。ただし、ＭＡＳＴ２０５の機能であるセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１に対するリン酸化活性に留まらないことはいうまでもない。例えば、当該同定方法を実施する場合、セリンスレオニンキナーゼの一般的な基質として当業者に知られている適当な基質を用いたり、市販のキットを使用したりして実施することができる。 As described above, examples of the function of MAST205 include serine threonine kinase activity of MAST205 and the binding of MAST205 to other proteins such as substrate proteins. More specifically, the functions of MAST205 include MAST205 and DCTN1, MAST205 and TIAM1, MAST205 and MLK3, MAST205 and MKK3, MAST205 and MKK4, MAST205 and MKK6, MAST205 and MKK7. And the binding of MAST205 to p38 MAPK, and the serine threonine kinase activity of MAST205 on DCTN1 and / or TIAM1. DCTN1 is phosphorylated by the serine threonine kinase activity of MAST205 on DCTN1, and TIAM1 is phosphorylated by the serine threonine kinase activity of MAST205 on TIAM1. However, it goes without saying that serine threonine kinase activity, which is a function of MAST205, is not limited to phosphorylation activity for DCTN1 and TIAM1. For example, the identification method can be carried out by using an appropriate substrate known to those skilled in the art as a general substrate of serine threonine kinase, or using a commercially available kit.
この知見に基づき、本発明において、細胞の遊走および／または浸潤を阻害する活性を有する化合物の同定方法、並びにＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物の同定方法を提供できる。より具体的には、細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、またはＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供できる。 Based on this finding, the present invention can provide a method for identifying a compound having an activity that inhibits cell migration and / or invasion, and a method for identifying a compound that inhibits the expression and / or function of MAST205. More specifically, a method for identifying a compound having an activity that inhibits cell migration, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1, and a method for identifying MAST205 and MLK3 Method for identifying compound that inhibits binding, method for identifying compound that inhibits binding between MAST205 and MKK3, method for identifying compound that inhibits binding between MAST205 and MKK4, method for identifying compound that inhibits binding between MAST205 and MKK6, and MAST205 A method for identifying a compound that inhibits the binding of MKK7, a method for identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 and p38 MAPK, a method for identifying a compound that inhibits the method of identifying a compound that inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205, or a TI by MAST205 Method of identifying a compound that inhibits the M1 phosphorylation can provide.
細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する活性を指標にして同定することができることから、該化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物の同定方法により実施することができる。 Since a compound having an activity of suppressing cell migration and / or invasion can be identified using an activity that inhibits the expression and / or function of MAST205 as an index, the method for identifying the compound includes the expression of MAST205 and / or Or it can implement by the identification method of the compound which inhibits a function.
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、例えば、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、またはＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法により実施することができる。 Methods for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration include, for example, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1, and a binding between MAST205 and MLK3 For identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to MKK3, a method for identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to MKK4, a method of identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to MKK6, and the binding of MAST205 to MKK7 For identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to p38 MAPK, for identifying a compound that inhibits the phosphorylation of DCTN1 by MAST205, or for identifying TIAM1 by MAST205 It can be carried out by methods of identifying a compound that inhibits the phosphorylation.
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、具体的には次に示す実験系を用いて実施できる：ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群より選択された１つ以上の蛋白質とＭＡＳＴ２０５とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ある化合物（以下、被検化合物と称する）と該蛋白質および／またはＭＡＳＴ２０５を接触させ、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定することにより、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration can be specifically carried out using the following experimental system: DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7 and p38 MAPK It can be carried out using an experimental system in which one or more selected proteins and MAST 205 are allowed to coexist and MAST 205 is bound to the protein. In such an experimental system, a certain compound (hereinafter referred to as a test compound) is brought into contact with the protein and / or MAST 205, and a signal and / or marker capable of detecting the binding between MAST 205 and the protein is used. Using this system, the presence or absence or change of this signal and / or marker is detected, and cell migration is suppressed by determining whether the test compound inhibits the binding of MAST205 to the protein. Can be identified.
被検化合物はＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群より選択された１つ以上の蛋白質とＭＡＳＴ２０５との結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め該蛋白質および／またはＭＡＳＴ２０５と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５と該蛋白質の結合反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制すると判定できる。 The test compound can coexist in the binding reaction between one or more proteins selected from the group consisting of DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7 and p38 MAPK and MAST205. The protein and / or MAST205 may be contacted in advance, and then the binding reaction between MAST205 and the protein may be performed. When the signal or binding marker generated by the binding of MAST205 to the protein shows a change such as a decrease or disappearance when the test compound is brought into contact with MAST205 as compared to when the test compound is not brought into contact It can be determined that the test compound inhibits the binding between MAST205 and the protein, and as a result, suppresses cell migration.
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法はまた、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５によりＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１をリン酸化させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５を接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration can also be carried out using an experimental system in which MAST205 and DCTN1 and / or TIAM1 coexist, and DCTN1 and / or TIAM1 is phosphorylated by MAST205. In such an experimental system, the test compound and MAST205 are contacted, and this signal and / or using a signal and / or a marker that can detect phosphorylation of DCTN1 and / or TIAM1 by MAST205. Inhibits DCTN1 and / or TIAM1 phosphorylation by MAST205 by detecting the presence or absence or alteration of the marker and determining whether the test compound inhibits DCTN1 and / or TIAM1 phosphorylation by MAST205 As a result, a compound that suppresses cell migration can be identified.
被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化により生じるシグナルまたはリン酸化のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制すると判定できる。 The test compound can coexist in the phosphorylation reaction of DCTN1 and / or TIAM1 by MAST205, or the test compound can be brought into contact with MAST205 in advance, followed by the phosphorylation reaction of DCTN1 and / or TIAM1 by MAST205. it can. Signals or phosphorylation markers generated by phosphorylation of DCTN1 and / or TIAM1 by MAST205 are reduced or disappeared when a test compound is brought into contact with MAST205 compared to when the test compound is not brought into contact, etc. When the test compound shows a change, it can be determined that the test compound inhibits phosphorylation of DCTN1 and / or TIAM1 by MAST205, and as a result, suppresses cell migration.
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 and DCTN1 can be performed using an experimental system in which MAST205 and DCTN1 are allowed to coexist in the presence of MAST205 and DCTN1. In such an experimental system, the test compound is brought into contact with MAST205 and / or DCTN1, and this signal and / or using a signal and / or marker capable of detecting the binding of MAST205 and DCTN1 is used. A compound that inhibits the binding of MAST205 to DCTN1 can be identified by detecting the presence or absence or change of the marker and determining whether the test compound inhibits the binding of MAST205 to DCTN1.
被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。 The test compound can be allowed to coexist in the binding reaction of MAST205 and DCTN1, or the test compound can be brought into contact with MAST205 and / or DCTN1 in advance, and then the binding reaction of MAST205 and DCTN1 can be performed. Changes such as decrease or disappearance of the signal or binding marker generated by the binding of MAST205 and DCTN1 when the test compound is brought into contact with MAST205 and / or DCTN1 compared to when the test compound is not brought into contact Can be determined to inhibit the binding of MAST205 and DCTN1.
このような実験系は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれの条件においても実施できる。 Such an experimental system can be carried out under both in vivo and in vitro conditions.
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系は、蛋白質の結合阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に用いられている同定方法を参考にして実施できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とをｉｎ ｖｉｔｒｏで反応させて、ウエスタンブロッティングやプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系を例示できる。 The in vitro experimental system can be carried out with reference to identification methods generally used in screening for protein binding inhibitors. As an in vitro experimental system, an experimental system in which MAST205 and DCTN1 are reacted in vitro and the binding of both proteins is detected by Western blotting or pull-down method can be exemplified.
ｉｎ ｖｉｖｏの実験系として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共に発現している真核細胞または培養細胞株を用いた実験系が好ましく例示できる。また、ＭＡＳＴ２０５やＤＣＴＮ１を発現させた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。細胞におけるこれら蛋白質の発現は、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよび／またはＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。 As an in vivo experimental system, an experimental system using eukaryotic cells or cultured cell lines expressing both MAST205 and DCTN1 can be preferably exemplified. In addition, eukaryotic cells or cultured cell lines expressing MAST205 or DCTN1 can be used. Expression of these proteins in the cells can be accomplished by transfection of these vectors into cells using conventional genetic engineering techniques using appropriate vectors containing a polynucleotide encoding MAST205 and / or appropriate vectors containing a polynucleotide encoding DCTN1. This can be achieved.
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えば免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウェスタンブロッティングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の方法またはこれらの方法を組合わせて、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成される複合体を検出することにより実施できる。ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成される複合体の検出を容易にするために、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１は、適当な標識物質により標識されたものを用いることが好ましい。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。 The detection of the binding between MAST205 and DCTN1 is performed by a known protein detection method such as immunoprecipitation method, pull-down method, two-hybrid method, Western blotting and fluorescence resonance energy transfer method, or a combination of these methods. And detecting the complex formed by DCTN1. In order to facilitate detection of the complex formed by MAST205 and DCTN1, it is preferable to use MAST205 and / or DCTN1 labeled with an appropriate labeling substance. Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as FLAG-tag, Myc-tag and HA-tag. The labeling substance can be detected using a detection method known per se. For example, tag peptides can be detected by anti-tag peptide antibodies. At this time, detection can be performed more easily by using an antibody labeled with an enzyme such as HRP or ALP, a radioisotope, a fluorescent substance, or biotin as an anti-tag peptide antibody. Alternatively, a secondary antibody labeled with the above enzyme, radioisotope, fluorescent substance, biotin or the like may be used.
具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法は、例えば、Ｍｙｃ−ｔａｇが付加されたＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよびＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたＤＣＴＮ１をコードする遺伝子を含む適当なベクターをトランスフェクションした細胞（実施例１参照）を用いて実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれるＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成された複合体を検出する。細胞溶解物中に含まれる該複合体の測定は、一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いた免疫沈降の後に、もう一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより実施できる。被検化合物で処理したときに検出されるＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成された複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される複合体の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。 Specifically, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and DCTN1 encodes, for example, an appropriate vector containing a gene encoding MAST205 to which Myc-tag is added and DCTN1 to which FLAG-tag is added. This can be performed using cells transfected with an appropriate vector containing the gene (see Example 1). After the cells are treated with a test compound, the cells are collected, and the cells are lysed by an appropriate method to prepare a cell lysate. A complex formed by MAST205 and DCTN1 contained in the cell lysate Is detected. The complex contained in the cell lysate is measured by Western blotting using an antibody against the tag peptide added to the other protein after immunoprecipitation using the antibody against the tag peptide added to one protein. It can be implemented by performing. When the amount of the complex formed by MAST205 and DCTN1 detected when treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the amount of the complex detected when the cells are not treated with the test compound On the other hand, it can be determined that the test compound inhibits the binding of MAST205 and DCTN1.
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施できる。例えば、ＭＡＳＴ２０５とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＤＣＴＮ１と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等の細胞に導入し、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。 A method for identifying a compound that inhibits the binding of MAST205 to DCTN1 can also be performed using a known two-hybrid method. For example, a plasmid that expresses MAST205 and a DNA binding protein as a fusion protein, a plasmid that expresses DCTN1 and a transcriptional activation protein as a fusion protein, and a plasmid containing a reporter gene such as lacZ connected to an appropriate promoter gene are used in yeast or eukaryotic cells. The expression level of the reporter gene when the cell is introduced into a cell or the like and the cell is treated with the test compound is compared with the expression level of the reporter gene when the cell is not treated with the test compound. When the expression level of the reporter gene of the cell treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the expression level of the reporter gene of the cell not treated with the test compound, the test compound binds to MAST205 and DCTN1. Can be determined to inhibit.
上記同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物である。 The compound identified by the above identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and DCTN1.
上記同定方法において、ＤＣＴＮ１の代わりにＴＩＡＭ１を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＬＫ３を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ３を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ４を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ６を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ７を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにｐ３８ ＭＡＰＫを用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物である。 In the above identification method, by using TIAM1 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1. By using MLK3 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MLK3 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and MLK3. By using MKK3 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK3 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK3. By using MKK4 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK4 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK4. By using MKK6 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK6 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK6. By using MKK7 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK7 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and MKK7. By using p38 MAPK instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits the binding between MAST205 and p38 MAPK can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and p38 MAPK.
ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５によりＤＣＴＮ１をリン酸化させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。 A method for identifying a compound that inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205 can be carried out using an experimental system in which MAST205 and DCTN1 coexist and DCTN1 is phosphorylated by MAST205. In such an experimental system, a test compound is brought into contact with MAST205 and / or DCTN1, and this signal and / or a system using a signal and / or marker capable of detecting phosphorylation of DCTN1 by MAST205 is used. Alternatively, a compound that inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205 can be identified by detecting the presence or absence or change of the marker and determining whether the test compound inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205.
被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化により生じるシグナルまたはリン酸化のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害すると判定できる。 The test compound can coexist in the phosphorylation reaction of DCTN1 by MAST205, or the test compound can be brought into contact with MAST205 and / or DCTN1 in advance, and then the phosphorylation reaction of DCTN1 by MAST205 can be performed. A signal or phosphorylation marker generated by phosphorylation of DCTN1 by MAST205 decreases or disappears when a test compound is brought into contact with MAST205 and / or DCTN1 compared to when the test compound is not brought into contact, etc. When this change is shown, it can be determined that the test compound inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205.
このような実験系は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれの条件においても実施できる。好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系を用いることが適当である。 Such an experimental system can be carried out under both in vivo and in vitro conditions. It is preferable to use an in vitro experimental system.
リン酸化された蛋白質の検出は、例えば、リン酸化された蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施できる。また、リン酸化された蛋白質の検出は、リン酸化反応に放射性同位体標識したＡＴＰ、例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、リン酸化された蛋白質に転移された［γ−３２Ｐ］の放射活性を測定することにより実施できる（実施例２を参照）。あるいは、ペプチドアレイを用いた表面プラズモン共鳴イメージング法により蛋白質のリン酸化を検出できる。 The phosphorylated protein can be detected, for example, by Western blotting using an antibody against the phosphorylated protein. In addition, the phosphorylated protein can be detected by using ATP labeled with a radioisotope for the phosphorylation reaction, for example, [γ- 32 P] ATP, and transferring the [γ- 32 P] transferred to the phosphorylated protein. This can be done by measuring the radioactivity (see Example 2). Alternatively, protein phosphorylation can be detected by surface plasmon resonance imaging using a peptide array.
上記同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物である。このような化合物には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物や、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。 The compound identified by the above identification method is a compound that inhibits phosphorylation of DCTN1 by MAST205. Such compounds include compounds that inhibit the binding of MAST205 and DCTN1, and compounds that inhibit the serine threonine kinase activity of MAST205.
上記同定方法において、ＤＣＴＮ１の代わりにＴＩＡＭ１を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物である。このような化合物には、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物や、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。 In the above identification method, by using TIAM1 instead of DCTN1, a method for identifying a compound that inhibits phosphorylation of TIAM1 by MAST205 can be carried out. The compound identified by the identification method is a compound that inhibits the binding between MAST205 and TIAM1. Such compounds include compounds that inhibit the binding of MAST205 and TIAM1, and compounds that inhibit the serine threonine kinase activity of MAST205.
本発明においてはまた、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子と被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物を同定できる。 In the present invention, a method for identifying a compound that inhibits the expression of MAST205 can also be carried out. A method for identifying a compound that inhibits the expression of MAST205 can be carried out using an experimental system that can measure the expression of MAST205. In such an experimental system, a gene encoding MAST205 and a test compound are allowed to coexist and the expression thereof is measured, and then the expression change (reduction or reduction) in comparison with the measurement result in the absence of the test compound. By detecting (disappearance), a compound that inhibits the expression of MAST205 can be identified.
ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系として、具体的には、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞を用いてＭＡＳＴ２０５を発現させる実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれるＭＡＳＴ２０５を検出する。細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＭＡＳＴ２０５の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出されるＭＡＳＴ２０５の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＭＡＳＴ２０５の発現を阻害すると判定できる。 As an experimental system that can measure the expression of MAST205, specifically, an experimental system in which MAST205 is expressed using cells transfected with an expression vector containing a gene encoding MAST205 can be exemplified. In such an experimental system, after the cells are treated with a test compound, the cells are collected, lysed by an appropriate method to prepare a cell lysate, and MAST205 contained in the cell lysate is added. To detect. If the amount of MAST 205 detected when the cells are treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the amount of MAST 205 detected when the cells are not treated with the test compound, the test compound is It can be determined that the expression of MAST205 is inhibited.
ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウェスタンブロッティング等の方法により、ＭＡＳＴ２０５を直接的に検出することにより実施できる。また、発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、ＭＡＳＴ２０５の測定を容易に実施できる。発現の指標となるシグナルとして、例えば、標識物質を例示できる。標識物質でＭＡＳＴ２０５を標識し、該標識物質を測定することにより、ＭＡＳＴ２０５の測定を容易に実施できる。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。 The expression of MAST205 can be measured by directly detecting MAST205 by a known protein detection method such as Western blotting. Further, MAST205 can be easily measured by introducing a signal serving as an expression index into an experimental system and detecting the signal. As a signal serving as an expression index, for example, a labeling substance can be exemplified. By labeling MAST205 with a labeling substance and measuring the labeling substance, MAST205 can be easily measured. Preferred examples of the labeling substance include tag peptides such as FLAG-tag, Myc-tag and HA-tag. The labeling substance can be detected using a detection method known per se. For example, tag peptides can be detected by anti-tag peptide antibodies. At this time, detection can be performed more easily by using an antibody labeled with an enzyme such as HRP or ALP, a radioisotope, a fluorescent substance, or biotin as an anti-tag peptide antibody. Alternatively, a secondary antibody labeled with the above enzyme, radioisotope, fluorescent substance, biotin or the like may be used.
ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系としてまた、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等を用いた実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＭＡＳＴ２０５の発現を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素をコードする遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。 As an experimental system that can measure the expression of MAST205, a vector in which a reporter gene is linked in place of the gene is prepared downstream of the promoter region of the gene encoding MAST205, and a cell into which the vector is introduced, such as a eukaryotic cell, etc. An experimental system using can be illustrated. In such an experimental system, the expression level of the reporter gene when the cells are treated with the test compound is compared with the expression level of the reporter gene when the cells are not treated with the test compound. When the expression level of the reporter gene in the cells treated with the test compound is reduced or eliminated compared to the expression level of the reporter gene in the cells not treated with the test compound, the test compound inhibits the expression of MAST205. Then it can be determined. As the reporter gene, a gene generally used in reporter assays can be used, and examples include genes encoding enzymes such as luciferase, β-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase. The expression of the reporter gene can be detected by detecting the activity of the gene product, for example, the enzyme activity in the case of the reporter gene exemplified above.
被検化合物は、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を挙げることができる。あるいは、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合部位またはＭＡＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。 Examples of the test compound include compounds derived from chemical libraries and natural products, or compounds obtained by drug design based on the primary structure and three-dimensional structure of MAST205, DCTN1 and TIAM1. Alternatively, a compound obtained by drug design based on the structure of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the binding site of MAST205 and DCTN1 or the binding site of MAT205 and TIAM1 is also suitable as the test compound.
本発明に係る細胞遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、上記同定方法によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、細胞遊走を抑制し得るか否かを測定する工程をさらに含む同定方法であり得る。 In the method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration according to the present invention, can a test compound that has been shown to inhibit the expression and / or function of MAST205 by the above-described identification method suppress cell migration? The identification method may further include a step of measuring whether or not.
細胞遊走の抑制を測定できる実験系として、例えば上記細胞遊走測定システムまたは上記細胞浸潤測定システムを使用できる。このようなシステムを用いて、細胞の遊走または浸潤を被検化合物で処理した細胞と被検化合物で処理していない細胞の間で比較検討し、前者の遊走または浸潤が、後者のものと比較して抑制された場合には、被検化合物は細胞遊走を抑制する活性を有すると判定できる。 As an experimental system capable of measuring suppression of cell migration, for example, the above-mentioned cell migration measurement system or the above-mentioned cell invasion measurement system can be used. Using such a system, cell migration or invasion is compared between cells treated with the test compound and cells not treated with the test compound, and the former migration or invasion is compared with the latter. When it is suppressed, the test compound can be determined to have an activity of suppressing cell migration.
（試薬キット）
本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＤＣＴＮ１、ＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分、または、ＴＩＡＭ１、ＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチド、ＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、およびＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。
(Reagent kit)
One embodiment of the present invention relates to a reagent kit. The reagent kit may be a reagent kit having the following components: (A) MAST205, a polynucleotide encoding MAST205, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a transformant containing the recombinant vector. One or more components selected from the group consisting of; and (B) 1 selected from the group consisting of DCTN1, a polynucleotide encoding DCTN1, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a transformant containing the recombinant vector TIAM1, a polynucleotide encoding TIAM1, a recombinant vector containing a polynucleotide encoding TIAM1, and a transformant containing a recombinant vector containing a polynucleotide encoding TIAM1 One or more components selected from.
また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。 The reagent kit may be a reagent kit having the following components: (A) MAST205, a polynucleotide encoding MAST205, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a transformation containing the recombinant vector One or more components selected from the group consisting of a body; and (B) any one protein selected from MLK3, MKK3, MKK4, MKK6 and p38 MAPK, a polynucleotide encoding the protein, and encoding the polynucleotide One or more components selected from the group consisting of a recombinant vector and a transformant containing the recombinant vector.
また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＪＮＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。 The reagent kit may also be a reagent kit having the following components: (A) MAST205, a polynucleotide encoding MAST205, a recombinant vector containing the polynucleotide, and a transformation containing the recombinant vector One or more components selected from the group consisting of body; and (B) any one protein selected from MLK3, MKK4, MKK7 and JNK, a polynucleotide encoding the protein, a recombinant vector encoding the polynucleotide, One or more components selected from the group consisting of transformants containing the recombinant vector.
本発明に係る試薬キットは、上記同定方法において用いるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。 The reagent kit according to the present invention can contain required substances such as signals and / or markers, buffers, and salts used in the identification method. Furthermore, substances such as stabilizers and / or preservatives may be included. In formulating, formulation means corresponding to each substance to be used may be introduced.
本発明に係る試薬キットは、例えば本発明に係る化合物の同定方法に使用できる。 The reagent kit according to the present invention can be used, for example, for the method for identifying a compound according to the present invention.
（ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫの取得）
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはヒト由来の蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する蛋白質であることができる。また、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子は、ヒト由来の遺伝子であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有しかつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子であれば、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する遺伝子であることができる。ＭＡＳＴ２０５の性質や機能として、例えば、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれとの結合や、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を挙げることができる。ＤＣＴＮ１の性質や機能として、例えば、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化へのＭＫＫ３あるいはＭＫＫ６の活性化を介した関与を挙げることができる。ＴＩＡＭ１の性質や機能として、例えば、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換因子活性や、ＭＫＫ３を介したｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を挙げることができる。ＭＬＫ３の性質や機能として、例えば、ＩκＢキナーゼαとβの直接的なリン酸化とそれによる活性化を挙げることができる。ＭＫＫ３の性質や機能として、例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基のリン酸化を挙げることができる。ＭＫＫ４の性質や機能として、例えば、ＪＮＫ１／ＭＡＰＫ８やＪＮＫ２／ＭＡＰＫ９およびｐ３８ ＭＡＰＫの活性化が挙げられる。ＭＫＫ６の性質や機能として、例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基のリン酸化を挙げることができる。ＭＫＫ７の性質や機能として、例えば、ＪＮＫ１やＪＮＫ２の活性化を挙げることができる。ｐ３８ ＭＡＰＫの性質や機能として、例えば、ＥＬＫ１やＡＴＦ２のような転写因子のリン酸化を挙げることができる。ＪＮＫの性質や機能として、例えば、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を挙げることができる。
(Acquisition of MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK)
MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK are preferably human-derived proteins, and have the same functions and structural homology as the human-derived proteins. It can be a protein derived from a mammal having sex, for example, a protein derived from mouse, horse, sheep, cow, dog, monkey, cat, rat or rabbit. Further, the genes encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK are preferably human-derived genes, but the functions of the same quality as the human-derived proteins And a gene encoding a protein derived from a mammal having structural homology, for example, it may be a gene derived from mouse, horse, sheep, cow, dog, monkey, cat, rat, rabbit or the like it can. Examples of the properties and functions of MAST205 include binding to DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, and p38 MAPK, and serine threonine kinase activity against DCTN1 and TIAM1. Examples of the nature and function of DCTN1 include involvement through activation of MKK3 or MKK6 in phosphorylation of p38 MAPK by stress stimulation, for example, sorbitol stimulation. Examples of the properties and functions of TIAM1 include GDP-GTP exchange factor activity and phosphorylation of p38 MAPK via MKK3. Examples of the properties and functions of MLK3 include direct phosphorylation and activation by IκB kinase α and β. Examples of the properties and functions of MKK3 include phosphorylation of threonine and tyrosine residues of p38 MAPK. Examples of the properties and functions of MKK4 include activation of JNK1 / MAPK8, JNK2 / MAPK9, and p38 MAPK. Examples of the properties and functions of MKK6 include phosphorylation of threonine and tyrosine residues of p38 MAPK. Examples of the properties and functions of MKK7 include activation of JNK1 and JNK2. Examples of the properties and functions of p38 MAPK include phosphorylation of transcription factors such as ELK1 and ATF2. Examples of JNK properties and functions include c-Jun phosphorylation.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのうち少なくとも１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別種の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。別種の蛋白質やポリペプチドとして、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類を例示できる。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK are prepared from cells or biological samples in which these are expressed by genetic engineering techniques, cell-free synthetic products or chemical synthesis It may be a product or may be further purified from these. Alternatively, a cell in which at least one of MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK is expressed by a genetic engineering technique can be used. MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK have different types of proteins and polypeptides on the N-terminal side and C-terminal side as long as their properties and functions are not affected. It may be added directly or indirectly via a linker peptide or the like using a genetic engineering technique or the like. Other types of proteins and polypeptides include enzymes such as glutathione S-transferase (GST), β-galactosidase, HRP or ALP, His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag, Xpress-tag, etc. Tag peptides can be exemplified.
遺伝子工学的手法として、公知の方法がいずれも使用できる。公知の方法として、成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）を例示できる。 Any known method can be used as a genetic engineering technique. As a publicly known method, the method described in the book (edited by Sambrook et al., “Molecular Cloning, Laboratory Manual Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory; 1988, Maruzen Co., Ltd .; Ulmer, KM, “Science”, 1983, Vol. 219, pp. 666-671; Ehrlich, HA, edited by Ehrlich, HA. "PCR technology, principle and application of DNA amplification", see 1989, Stockton Press, etc.).
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得できる。これら遺伝子の起源として、該遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。ＭＡＳＴ２０５遺伝子は様々な組織で普遍的に発現しているが、高発現が認められる組織として、例えば、ヒトの癌組織、具体的には肺平滑筋肉腫や小細胞肺癌、脳髄芽腫、および骨肉腫を挙げることができる。ＤＣＴＮ１遺伝子の起源として、脳組織を例示できる。ＴＩＡＭ１遺伝子の起源として、小脳組織、ヒト白血病細胞を例示できる。ＭＬＫ３遺伝子、ＭＫＫ３遺伝子、ＭＫＫ４遺伝子、ＭＫＫ６遺伝子、ＭＫＫ７遺伝子、ｐ３８ ＭＡＰＫ遺伝子、およびＪＮＫ遺伝子は、様々な組織や細胞で普遍的に発現している。ＭＬＫ３遺伝子が発現している組織として脾臓、リンパ節が例示できる。ＭＫＫ３遺伝子が発現している組織として、脾臓、前立腺、卵巣、小腸、白血球、骨格筋等が例示できる。ＭＫＫ４遺伝子が発現している組織として脳組織が例示できる。ＭＫＫ６遺伝子が発現している組織として骨格筋、心臓、肝臓、膵臓が例示できる。ＭＫＫ７遺伝子が発現している組織として骨格筋、心臓、脳、精巣が例示できる。ｐ３８ ＭＡＰＫ遺伝子が発現している組織として骨格筋、骨髄、リンパ節が例示できる。ＪＮＫ遺伝子が発現している組織として心臓、骨格筋、脳が例示できる。 For genes encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, for example, a cloning method known per se is used from an appropriate origin where the expression of each gene is observed. Can be acquired easily. Examples of the origin of these genes include various cells and tissues in which the expression of the gene has been confirmed, or cultured cells derived therefrom. The MAST205 gene is ubiquitously expressed in various tissues. Examples of tissues in which high expression is observed include human cancer tissues such as lung leiomyosarcoma, small cell lung cancer, brain medulloblastoma, and bone A sarcoma can be mentioned. Examples of the origin of the DCTN1 gene include brain tissue. Examples of the origin of the TIAM1 gene include cerebellar tissue and human leukemia cells. The MLK3 gene, MKK3 gene, MKK4 gene, MKK6 gene, MKK7 gene, p38 MAPK gene, and JNK gene are universally expressed in various tissues and cells. Examples of tissues in which the MLK3 gene is expressed include spleen and lymph nodes. Examples of tissues in which the MKK3 gene is expressed include spleen, prostate, ovary, small intestine, leukocytes, and skeletal muscle. A brain tissue can be exemplified as a tissue in which the MKK4 gene is expressed. Examples of tissues in which the MKK6 gene is expressed include skeletal muscle, heart, liver, and pancreas. Examples of tissues in which the MKK7 gene is expressed include skeletal muscle, heart, brain, and testis. Examples of tissues in which the p38 MAPK gene is expressed include skeletal muscle, bone marrow, and lymph node. Examples of tissues in which the JNK gene is expressed include heart, skeletal muscle, and brain.
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法を挙げることができる。ここで用いるプローブとして、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、該遺伝子の塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。 Isolation of total RNA from origin, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can all be performed according to conventional methods. Commercially available cDNA libraries can also be used. The method for selecting a desired clone from a cDNA library is not particularly limited, and a conventional method can be used. Examples thereof include a plaque hybridization method using a probe that selectively binds to a target DNA sequence, a colony hybridization method, and the like, and a combination of these methods. As the probe used here, DNA chemically synthesized based on information on the base sequences of genes encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK is generally used. Can be used. In addition, sense primers and antisense primers designed based on the base sequence information of the gene can be used as such probes. Selection of the target clone from the cDNA library can be performed, for example, by confirming the expressed protein for each clone using a known protein expression system and using the biological function as an index.
遺伝子の取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。 In addition to gene acquisition, PCR (Ulmer, KM, Science, 1983, Vol. 219, p. 666-671; edited by Ehrlich, HA,) “PCR Technology, Principles and Applications of DNA Amplification”, 1989, Stockton Press; Saiki RK, et al., “Science”, 1985, Vol. 230, pp. 1350-1354)) The DNA / RNA amplification method can be suitably used. When it is difficult to obtain a full-length cDNA from a cDNA library, the RACE method (“Experimental Medicine”, 1994, Vol. 12, No. 6, p. 35-), particularly the 5′-RACE method (flow Frohman MA, et al., "Proceedings of the National Academy of the United States, 1985", Proceedings of the National Academy of the United States, 1985, Proceedings of the National Academy of the United States. 23, p.8998-9002) and the like are suitable. Primers used for PCR can be appropriately designed based on DNA base sequence information, and can be obtained by synthesis according to conventional methods. Isolation and purification of the amplified DNA / RNA fragment can be performed by a conventional method. For example, DNA / RNA fragments can be isolated and purified by gel electrophoresis or the like.
遺伝子は、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。 A gene has an enzyme such as GST, β-galactosidase, HRP or ALP on the 5 ′ end side or 3 ′ end side as long as the function thereof, for example, the expression of the encoded protein or the function of the expressed protein is not inhibited. , His-tag, Myc-tag, or a tag peptide such as HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag can be added with one or more genes. The addition of these genes can be performed by a conventional genetic engineering technique.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを構築し、該組み換えベクターを用いて適当な宿主細胞で該遺伝子を発現させることにより、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得できる。また、該細胞から、公知の方法でＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫを調製することができる。 A recombinant vector containing genes encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, respectively, is constructed, and the gene is expressed in an appropriate host cell using the recombinant vector. Thus, cells that express at least one of these genes can be obtained. MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK can be prepared from the cells by a known method.
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれを用いることもできる。 The vector DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and is appropriately selected depending on the type of host and intended use. The vector DNA may be one in which a part of the DNA other than the part necessary for replication is missing, in addition to one extracted from a naturally occurring one. Representative examples include plasmid, bacteriophage and virus-derived vector DNA. Examples of plasmid DNA include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, and plasmids derived from yeast. An example of bacteriophage DNA is λ phage. Examples of the virus-derived vector DNA include vectors derived from animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, papova virus, SV40, fowlpox virus, and pseudorabies virus, or vectors derived from insect viruses such as baculovirus. In addition, vector DNA derived from a transposon, an insertion element, or a yeast chromosome element can be exemplified. Alternatively, vector DNA prepared by combining these, for example, vector DNA (cosmid, phagemid, etc.) prepared by combining genetic elements of plasmid and bacteriophage can be exemplified. Any expression vector or cloning vector may be used depending on the purpose.
ベクターＤＮＡには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を例示できる。 It is necessary to incorporate the gene into the vector DNA so that the function of the target gene is exhibited, and at least the target gene sequence and the promoter are constituent elements. In addition to these elements, a gene sequence carrying information on replication and control, if desired, for example, a ribosome binding sequence, a terminator, a signal sequence, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a selection marker, and the like. Alternatively, a plurality of gene sequences can be combined into a vector DNA by a method known per se. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, and neomycin resistance gene.
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組み換えベクターが得られる。 As a method for incorporating the target gene sequence into the vector DNA, a method known per se can be applied. For example, a method is used in which a target gene sequence is treated with an appropriate restriction enzyme, cleaved at a specific site, then mixed with a similarly treated vector DNA, and religated by ligase. Alternatively, a desired recombinant vector can also be obtained by ligating a suitable linker to the gene sequence of interest and inserting it into a multicloning site of a vector suitable for the purpose.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得でき、さらに該細胞用いて公知の方法によりＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫを製造できる。該形質転換体には、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。 A transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing genes encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, respectively, into the host. If an expression vector is used as the vector DNA, cells expressing at least one of these genes can be obtained, and MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 can be obtained using the cells by known methods. MAPK and JNK can be manufactured. The transformant includes one or two vector DNAs incorporating a desired gene other than those encoding MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, respectively. The above can be further introduced.
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。 Either prokaryotic or eukaryotic organisms can be used as the host. Examples of prokaryotes include, for example, Escherichia such as Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas genus, and Rhizobium merilloti Examples of the bacteria to which it belongs. Examples of eukaryotes include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, insect cells such as Sf9 and Sf21, monkey kidney-derived cells (COS cells, Vero ham cells) Examples include animal cells such as (CHO cells), mouse L cells, rat GH3 cells, and human HEK293T cells. Preferably animal cells are used.
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を挙げることができるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染を例示できる。 Introducing vector DNA into a host cell can be carried out by a method known per se, for example, a standard method described in a book (Sambrook et al., “Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition”). , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). As a more preferable method, an integration method into a chromosome can be mentioned if gene stability is taken into account, but an autonomous replication system using an extranuclear gene can be used conveniently. Specific methods include calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction and infection. Can be illustrated.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK are prepared from cells or biological samples in which genes encoding these proteins are expressed by genetic engineering techniques. It may be a system synthesis product or a chemical synthesis product, or may be further purified from these. In addition, the present protein can be expressed in a cell containing a gene encoding the present protein. The cell may be a transformant obtained by transfecting a vector containing a gene encoding this protein.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチンを例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に用いる物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK are further modified unless their functional amino group or carboxyl group, for example, is modified by amidation. Can be modified. Further, it may be labeled by adding another protein or the like to the N-terminal side or C-terminal side directly or indirectly using a genetic engineering technique or the like via a linker peptide or the like. . Preferably, labeling so that the basic properties of the protein are not inhibited is desirable. Examples of proteins to be added include enzymes such as GST, β-galactosidase, HRP or ALP, tag peptides such as His-tag, Myc-tag, HA-tag, FLAG-tag or Xpress-tag, fluorescein isothiocyanate (fluorescein) Illustrative examples include, but are not limited to, fluorescent dyes such as isothiocyanate or phycoerythrin, maltose-binding protein, Fc fragment of immunoglobulin or biotin. It can also be labeled with a radioisotope. One or a combination of two or more substances used for labeling can be added. By measuring the substance itself used for labeling or its function, the present protein can be easily detected or purified, and for example, the interaction between the present protein and other proteins can be detected.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、具体的には例えば、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK, specifically, for example, are obtained by culturing a transformant transfected with a vector DNA containing a gene encoding each of these proteins. Subsequently, the target protein can be recovered from the obtained culture. The transformant can be cultured by culture conditions and culture methods known per se optimal for each host. The culture can be performed using the present protein expressed by the transformant itself or its function as an index. Alternatively, the present protein produced in or outside the host or the amount of the protein may be used as an indicator, or subculture or batch culture may be performed using the amount of transformant in the medium as an indicator. .
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。 When the target protein is expressed in the cell or on the cell membrane of the transformant, the target protein is extracted by crushing the transformant. In addition, when the target protein is secreted outside the transformant, the culture solution is used as it is or a culture solution from which the transformant has been removed by centrifugation or the like is used.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年および「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法により、これら蛋白質を製造できるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法を例示できる。また、市販のアミノ酸合成装置を用いてペプチドを製造することができる。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, and JNK can also be produced by general chemical synthesis methods. For example, these proteins can be obtained by the method described in the book (“Peptide Synthesis”, Maruzen Co., Ltd., 1975 and “Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1996). Although it can manufacture, not only these but a well-known method can be utilized widely. As a protein chemical synthesis method, a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, and the like are known, and any of them can be used. More specifically, such a protein synthesis method includes a so-called stepwise elongation method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend a chain based on amino acid sequence information, and a fragment consisting of several amino acids. This method includes a fragment condensation method in which each fragment is subjected to a coupling reaction in advance, and the protein can be synthesized by any of them. Condensation methods used in the protein synthesis can also follow conventional methods, such as azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1 -Hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc.) method and Woodward method. Moreover, a peptide can be manufactured using a commercially available amino acid synthesizer.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはＪＮＫに、変異が導入されたものも本発明において使用できる。蛋白質、ポリペプチドおよびポリペプチドに変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することができる。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, or JNK with a mutation introduced can also be used in the present invention. Proteins, polypeptides, and means for introducing mutations into polypeptides are known per se, such as Ulmer's technique (KM Ulmer, Science, 1983, 219, p. 666). -671). For example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilicity) from the viewpoint of not changing the basic properties (physical properties, functions, immunological activities, etc.) of such mutations. Mutual substitution between amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is readily envisioned. Furthermore, these usable polypeptides can be modified to such an extent that the structural amino group or carboxyl group or the like is not significantly changed in function, for example, by amidation modification.
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはＪＮＫは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。 MAST205, DCTN1, TIAM1, MLK3, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, p38 MAPK, or JNK can be purified and / or separated as desired by various separation operation methods utilizing their physical properties, chemical properties, and the like. Separation and / or purification can be performed using the function of the protein as an index. As the separation operation method, for example, ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, dialysis method and the like can be used alone or in appropriate combination. Preferably, based on the amino acid sequence information of this protein, a specific antibody against them is prepared and specifically adsorbed using the antibody, for example, affinity chromatography using a column to which the antibody is bound is used. Is recommended.
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to the following Example.
（ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１との結合解析）
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１との結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。
(Analysis of binding of MAST205 to DCTN1 and TIAM1)
The binding of MAST205 to DCTN1 and TIAM1 was examined by immunoprecipitation using a transient co-expression system in human cultured cells.
細胞数５．０×１０５／５ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇと、ＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクター ４μｇとを、１５μＬのリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ｔａｇで標識されたＭＡＳＴ２０５（以下、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５と称する）、ＦＬＡＧ−ｔａｇで標識されたＤＣＴＮ１（以下、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１と称する）、ＦＬＡＧ−ｔａｇで標識されたＴＩＡＭ１（以下、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１と称する）が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクターの代わりにＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいはＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターの代わりにＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターを、同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。トランスフェクションして４８時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）で２回洗浄し、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を５００μＬ添加した。氷上で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシー プラス−２００ プロテインアッセイ試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解液サンプルと称する）。細胞から抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした２０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフロー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に１μｇの抗体を加え、４℃で一晩回転させて攪拌した。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした６０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後に、２×ＳＤＳ サンプルバッファーをレジンと等量（３０μＬ）加え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた（以下、免疫沈降サンプルと称する）。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製に用いた抗体および１次抗体として、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。 The HEK293T cells of the cell number 5.0 × 10 5 / 5ml medium were seeded in 6cm dish, 24 hours of culture under the condition of 5% CO 2/95% air at 37 ° C., pCI / Myc incorporating MAST205 gene 4 μg of the expression vector and 4 μg of the pCI / FLAG expression vector incorporating the DCTN1 gene or the TIAM1 gene were transfected into the cells using 15 μL of Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000, manufactured by Invitrogen). By these vectors, MAST205 labeled with Myc-tag (hereinafter referred to as Myc-MAST205), DCTN1 labeled with FLAG-tag (hereinafter referred to as FLAG-DCTN1), TIAM1 labeled with FLAG-tag (hereinafter referred to as FLAG-tag) Hereinafter referred to as FLAG-TIAM1) is expressed in cells. As a control, a pCI / Myc expression vector not incorporating the MAST205 gene instead of the pCI / Myc expression vector incorporating the MAST205 gene, or a DCTN1 gene or TIAM1 gene instead of the pCI / FLAG expression vector incorporating the DCTN1 gene or TIAM1 gene Cells transfected with a pCI / FLAG expression vector not incorporating E. coli in the same manner were prepared. After transfection and culturing for 48 hours, the culture supernatant is removed, the cells are washed twice with cold phosphate buffered saline (hereinafter abbreviated as PBS), and a protease inhibition cocktail is added to a volume of 0.01. 500 μL of 1 × cell lysis buffer (manufactured by Cell Signaling) supplemented with (protease inhibitor cocktail, manufactured by Sigma) was added. After standing for 15 minutes on ice, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as a cell lysate. The protein concentration of the cell lysate was quantified using Coomassie Plus-200 protein assay reagent (Coomassie Plus-200 Protein Assay Reagent, manufactured by Pierce). Some cell lysates were heat denatured by adding 2 × SDS sample buffer (hereinafter referred to as cell lysate samples). The cell lysate extracted from the cells had the same protein mass in each sample and was blocked with 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 20 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, manufactured by Amersham Biosciences) was added and rotated at 4 ° C. for 1 hour and stirred. Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was collected. 1 μg of antibody was added to the collected supernatant, and the mixture was rotated overnight at 4 ° C. and stirred. Then, 60 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow blocked with 0.1% BSA was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 2 hours. Subsequently, it was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. 500 μL of 1 × cell lysis buffer was added and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. After repeating this washing operation three times, 2 × SDS sample buffer was added in an equal amount (30 μL) to the resin, and the adsorbed protein was extracted and heat denatured (hereinafter referred to as immunoprecipitation sample). Cell lysate samples and immunoprecipitation samples were separated by 5-20% SDS-PAGE, stained with primary antibody and secondary antibody, and then ECL reagent (Amersham Biosciences) or ECL Plus reagent (Amersham Biosciences) was used. The protein was detected. Mouse anti-FLAG monoclonal antibody (manufactured by Sigma) and mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (manufactured by Santa Cruz) were used as the antibodies and primary antibodies used for the preparation of immunoprecipitation samples, and HRP-conjugated goat anti-mouse was used as the secondary antibody. An IgG polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling) was used.
図１に、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合解析の結果を示す。図１の中パネルおよび右パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）およびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）においてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５非発現細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の結合を示すものと判定した。また、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１非発現細胞（レーン３）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１非発現細胞（レーン４）から同様に調製した免疫沈降サンプルでもＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現、およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１発現細胞から調製したサンプルにおけるＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の発現は、いずれも同程度であった（図１の左パネル）。 FIG. 1 shows the result of the binding analysis between MAST205 and DCTN1. As shown in the middle panel and the right panel of FIG. 1, immunoprecipitation samples prepared using mouse anti-c-Myc monoclonal antibody from cells co-expressing Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 (lane 1) (in the figure) , IP: Myc) and coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 (shown by arrows in the figure) only in immunoprecipitation samples treated with mouse anti-FLAG monoclonal antibody (shown in the figure as IP: FLAG) Was detected. On the other hand, coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 was not detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells not expressing Myc-MAST205 (lane 2). From this, it was determined that this coprecipitation was not due to non-specific adsorption of FLAG-DCTN1 to the resin, but showed binding of Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1. In addition, coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 was also detected in immunoprecipitation samples prepared in the same manner from FLAG-DCTN1 non-expressing cells (lane 3) and Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 non-expressing cells (lane 4). There wasn't. The expression of Myc-MAST205 in the sample prepared from the cells expressing Myc-MAST205 and the expression of FLAG-DCTN1 in the sample prepared from the cells expressing FLAG-DCTN1 were almost the same (left panel in FIG. 1).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン１）において、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン３）ではＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドのみが検出され、ＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。 Specifically, in an immunoprecipitation sample obtained by treating a cell lysate of cells coexpressed with Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 with a mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (middle panel in FIG. 1, lane 1), FLAG- A band indicating DCTN1 (indicated by an arrow in the figure) and a band indicating Myc-MAST205 were detected. On the other hand, in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and FLAG-DCTN1 (the middle panel of FIG. 1, lane 2), both bands indicating FLAG-DCTN1 and Myc-MAST205 were detected. Was not. In addition, in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from the cells in which Myc-MAST205 and FLAG were co-expressed (the middle panel in FIG. 1, lane 3), only the band showing Myc-MAST205 was detected, and Myc and FLAG were co-expressed. None of the bands were detected in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from the cultured cells (FIG. 1, middle panel, lane 4).
また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン１）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンドのみが検出された。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン３）およびＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。 In addition, in an immunoprecipitation sample (right panel in FIG. 1, lane 1) obtained by treating a cell lysate of cells co-expressing Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1, a band indicating Myc-MAST205 (lane 1) (FIG. 1). A band indicating FLAG-DCTN1 was detected). On the other hand, only the band indicating FLAG-DCTN1 was detected in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from the cells in which Myc and FLAG-DCTN1 were co-expressed (right panel in FIG. 1, lane 2). In addition, an immunoprecipitation sample prepared from cells co-expressed with Myc-MAST205 and FLAG (right panel of FIG. 1, lane 3) and an immunoprecipitation sample prepared similarly from cells co-expressed with Myc and FLAG ( In the right panel of FIG. 1, lane 4), no band was detected.
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１が細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it was revealed that MAST205 and DCTN1 bind in cells.
図２に、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合解析の結果を示す。図２の中パネルおよび右パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）およびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）においてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５非発現細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の結合を示すものと判定した。また、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１非発現細胞（レーン３）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１非発現細胞（レーン４）から同様に調製した免疫沈降サンプルでもＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現、およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１発現細胞から調製したサンプルにおけるＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の発現は、いずれも同程度であった（図２の左パネル）。 FIG. 2 shows the result of the binding analysis between MAST205 and TIAM1. As shown in the middle panel and right panel of FIG. 2, immunoprecipitation samples prepared using mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (lane 1) from cells co-expressing Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 (lane 1). , IP: Myc) and coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 (indicated by arrows in the figure) only in immunoprecipitation samples treated with mouse anti-FLAG monoclonal antibody (indicated as IP: FLAG in the figure) Was detected. On the other hand, coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 was not detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells not expressing Myc-MAST205 (lane 2). From this, it was determined that this coprecipitation was not due to non-specific adsorption of FLAG-TIAM1 to the resin, but showed binding of Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1. In addition, coprecipitation of Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 was also detected in immunoprecipitation samples prepared similarly from FLAG-TIAM1 non-expressing cells (lane 3), and Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 non-expressing cells (lane 4). There wasn't. The expression of Myc-MAST205 in samples prepared from Myc-MAST205-expressing cells and the expression of FLAG-TIAM1 in samples prepared from FLAG-TIAM1-expressing cells were both comparable (left panel in FIG. 2).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン１）において、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン３）ではＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドのみが検出され、ＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。 Specifically, in an immunoprecipitation sample obtained by treating a cell lysate of cells co-expressing Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 with a mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (FIG. 2, middle panel, lane 1), FLAG- A band indicating TIAM1 (indicated by an arrow in the figure) and a band indicating Myc-MAST205 were detected. On the other hand, in the immunoprecipitation sample similarly prepared from the cells in which Myc and FLAG-TIAM1 were co-expressed (the middle panel of FIG. 2, lane 2), both bands indicating FLAG-TIAM1 and Myc-MAST205 were detected. Was not. In addition, in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc-MAST205 and FLAG (the middle panel in FIG. 2, lane 3), only the band showing Myc-MAST205 was detected, and Myc and FLAG were coexpressed. None of the bands were detected in immunoprecipitation samples prepared in the same way from the cells (middle panel of FIG. 2, lane 4).
また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン１）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンドのみが検出された。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン３）およびＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。 In addition, in an immunoprecipitation sample (right panel in FIG. 2, lane 1) obtained by treating a cell lysate of cells in which Myc-MAST205 and FLAG-TIAM1 were co-expressed with a mouse anti-FLAG monoclonal antibody, a band indicating Myc-MAST205 ( A band indicating FLAG-TIAM1 was detected). In contrast, in the immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and FLAG-TIAM1 (right panel in FIG. 2, lane 2), only a band indicating FLAG-TIAM1 was detected. In addition, an immunoprecipitation sample prepared from cells co-expressed with Myc-MAST205 and FLAG (right panel of FIG. 2, lane 3) and an immunoprecipitation sample prepared similarly from cells co-expressed with Myc and FLAG ( In the right panel of FIG. 2, lane 4), no band was detected.
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１が細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it was revealed that MAST205 and TIAM1 bind in cells.
（ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化解析）
ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化をｉｎ ｖｉｔｒｏで解析した。
(Phosphorylation analysis of DCTN1 by MAST205)
The phosphorylation of DCTN1 by MAST205 was analyzed in vitro.
リン酸化試験に用いたＭＡＳＴ２０５およびＤＣＴＮ１は以下のようにして調製した。細胞数１０×１０５／１０ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇ、またはＤＣＴＮ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクター ４μｇを、３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいはＤＣＴＮ１遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。各蛋白質はトランスフェクションの４８時間後に抽出した。具体的には、上記細胞をＰＢＳで洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を添加し、氷上で３５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液の蛋白質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。細胞溶解液（０．２ｍＬ〜０．５ｍＬ）に０．１％ ＢＳＡでブロッキングした２０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に抗体を２μｇ添加し、４℃で一晩回転させて攪拌した。抗体は、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いた。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした６６μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この操作を３回繰り返した。次に５００μＬのキナーゼバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ））を加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理後、上清を除去した。この操作を３回繰り返した。最後に、３３μＬの割合でキナーゼバッファーを加え、使用時まで−８０℃で保存した。 MAST205 and DCTN1 used for the phosphorylation test were prepared as follows. The HEK293T cells of the cell number 10 × 10 5 / 10ml medium were seeded in 10cm dish, 24 hours of culture under the condition of 5% CO 2/95% air at 37 ° C., pCI / Myc expression vectors incorporating MAST205 gene 4 μg or 4 μg of a pCI / FLAG expression vector incorporating the DCTN1 gene was transfected into cells using 30 μL of Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen). By these vectors, Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 are expressed in cells, respectively. As a control, cells transfected with a pCI / Myc expression vector not incorporating the MAST205 gene or a pCI / FLAG expression vector not incorporating the DCTN1 gene were prepared in the same manner. Each protein was extracted 48 hours after transfection. Specifically, after washing the cells with PBS, 1 × cell lysis buffer (Cell Signaling) to which a protease inhibition cocktail (Sigma) was added to a volume of 0.01 was added, and 35 ml on ice. After being allowed to stand for 1 minute, it was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was used as a cell lysate. The protein concentration of the cell lysate was quantified using Coomassie Plus-200 Protein Assay Reagent (Pierce). 20 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) blocked with 0.1% BSA was added to the cell lysate (0.2 mL to 0.5 mL) for 1 hour at 4 ° C. Rotated and stirred. Subsequently, it was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was recovered. 2 μg of antibody was added to the collected supernatant, and the mixture was rotated at 4 ° C. overnight and stirred. As the antibody, mouse anti-FLAG monoclonal antibody (manufactured by Sigma) and mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (manufactured by Santa Cruz) were used. Then, 66 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow blocked with 0.1% BSA was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 2 hours. Subsequently, it was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. 500 μL of 1 × cell lysis buffer was added and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. This operation was repeated three times. Next, 500 μL of kinase buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM MgCl 2 , 2 mM dithiothreitol (DTT)) was added, and after centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., the supernatant was removed. This operation was repeated three times. Finally, kinase buffer was added at a rate of 33 μL and stored at −80 ° C. until use.
リン酸化試験には上記調製したＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を６μＬ（５０％ ｖ／ｖ）およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を１３μＬ（５０％ ｖ／ｖ）使用した。これらを混合し、ＡＴＰミクスチャーを６μＬ加えて（ＡＴＰ終濃度２００μＭ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ ２．５μＣｉ／ｓａｍｐｌｅ）、３０℃で１５分間反応させた。５×ＳＤＳサンプルバッファーを６．２５μＬ／ｓａｍｐｌｅ加え、熱変性させ、これを５％あるいは５−２０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１０μＬ／ｌａｎｅ）し、ゲルドライヤーでゲルを乾燥後、イメージングプレートに露出、ＦＬＡ３０００（富士フィルム社製）にて解析した。 For the phosphorylation test, 6 μL (50% v / v) of Myc-MAST205 prepared above and 13 μL (50% v / v) of FLAG-DCTN1 were used. These were mixed, 6 μL of ATP mixture was added (ATP final concentration 200 μM, [γ- 32 P] ATP 2.5 μCi / sample), and reacted at 30 ° C. for 15 minutes. 5.25 μL / sample of 5 × SDS sample buffer was added, heat-denatured, this was electrophoresed on a 5% or 5-20% acrylamide gel (10 μL / lane), dried on a gel dryer, and then exposed to the imaging plate. And FLA3000 (manufactured by Fuji Film).
図３に示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を反応させたときに、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のリン酸化を示すバンドが検出された（レーン１）。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を反応させたときにはこのようなバンドはほとんど検出されなかった（レーン２）。また、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の代わりにＦＬＡＧを用いて同様の反応を行ったときには、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のリン酸化を示すバンドは検出されなかった（レーン３および４）。 As shown in FIG. 3, when Myc-MAST205 and FLAG-DCTN1 were reacted, a band indicating phosphorylation of FLAG-DCTN1 was detected (lane 1). On the other hand, when Myc and FLAG-DCTN1 were reacted, such a band was hardly detected (lane 2). In addition, when the same reaction was performed using FLAG instead of FLAG-DCTN1, no band indicating FLAG-DCTN1 phosphorylation was detected (lanes 3 and 4).
この結果から、ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１をリン酸化することが明らかになった。 From this result, it became clear that MAST205 phosphorylates DCTN1.
（ＭＡＳＴ２０５発現阻害によるｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＭＫＫ６のリン酸化阻害）
ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１と結合してこれをリン酸化する（実施例２参照）。ＤＣＴＮ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路に関与することが知られている（チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ Ｐ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００４年、第２７９巻、第４４号、ｐ．４５３０８−４５３１１）。
(Inhibition of p38 MAPK, JNK, MKK6 phosphorylation by inhibition of MAST205 expression)
MAST205 binds to and phosphorylates DCTN1 (see Example 2). DCTN1 is known to be involved in the signaling pathway via p38 MAPK or its upstream MKK6 / MKK3 (Cheung P. et al., “The Journal of Biological Chemistry”). 2004, 279, 44, p. 45308-45311).
そこで、ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ）あるいはＭＡＰＫが関与する情報伝達経路へのＭＡＳＴ２０５の影響を解析するため、ストレス刺激により活性化されるＭＡＰＫＫおよびその下流に位置する蛋白質のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。 Therefore, in order to analyze the influence of MAST205 on MAPKK (MAPK kinase) or the signal transduction pathway involving MAPK, the expression of MAST205 is inhibited by phosphorylation of MAPKK activated by stress stimulation and the protein located downstream thereof. The cells were compared with cells that did not inhibit the expression.
細胞は、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚部癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害は、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡ（以下、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡと称する）を用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。 As the cells, HeLa cells (human cervical cancer cell line) were used. Inhibition of MAST205 expression in cells was performed using siRNA against MAST205 (hereinafter referred to as MAST205 siRNA). The MAST205 siRNA used here is a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. (Manufacturing consignment to Dharmacon). The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. The oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has two deoxythymidylates at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence consisting of (TT) is bound. As a control, non-specific control duplex VIII (manufactured by Dharmacon) was used. Non-specific control duplex VIII is a short double-stranded oligonucleotide consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence ( Hereinafter, it may be referred to as control siRNA).
蛋白質リン酸化の検討は、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ＪＮＫ、およびＥＲＫ１／２について行った。 Protein phosphorylation was examined for p38 MAPK, MKK6, MKK3, JNK, and ERK1 / 2.
具体的には、２×１０５／１ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＨｅＬａ細胞を１２ウエルプレートの各ウエルに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。次いで、３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、１００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、２等分にして１２ウエルプレートにまきなおし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で培養した。次いで、細胞を０．４Ｍ ソルビトールで２０分間刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて２回洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）、およびそれぞれ終濃度で１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ フッ化ナトリウム、１μＭ パラニトロフェニルホスフェート、２μＭ ＤＴＴ、０．５μＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、氷上で２０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、５×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて検出した。各蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＫＫ３ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＫＫ６ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ウサギ抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ｐ４４／４２ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、およびウサギ抗ＭＡＳＴ２０５ポリクローナル抗体を用いた。リン酸化蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗リン酸化ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗リン酸化ＭＫＫ３／ＭＫＫ６（Ｓｅｒ１８９／２０７）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗リン酸化ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、およびウサギ抗リン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。２次抗体として、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。 Specifically, the HeLa cell of 2 × 10 5 / 1mL medium were seeded in each well of 12-well plates and cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2/95% air at 37 ° C.. Subsequently, 3 μL of Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) was used to transfect the cells with 100 pmol of MAST205 siRNA or control siRNA (5 μL of 20 μM siRNA), and further 5 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% air The culture was performed under the following conditions. Thereafter, the cells were collected, re-divided into 12-well plates, and further cultured for 24 hours at 37 ° C. under conditions of 5% CO 2 /95% air. The cells were then stimulated with 0.4 M sorbitol for 20 minutes. After stimulation, the culture supernatant was removed, washed twice with cold Tris-buffered saline (TBS), and then protease inhibitor cocktail (Sigma) so as to be 0.01 volume. 1 × cell lysis buffer (manufactured by Cell Signaling) supplemented with 5 mM MgCl 2 , 10 μM sodium fluoride, 1 μM paranitrophenyl phosphate, 2 μM DTT, 0.5 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) was added, and 100 μL / well was added. After leaving on ice for 20 minutes, it was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was used as a cell lysate. The cell lysate was quantified using Coomassie Plus-200 Protein Assay Reagent (Pierce). Some cell lysates were heat denatured by adding 5 × SDS sample buffer (hereinafter referred to as cell lysate samples). These samples were separated by 5-20% SDS-PAGE, stained with primary antibody and secondary antibody, and then detected using ECL reagent (Amersham Biosciences) or ECL Plus reagent (Amersham Biosciences). As primary antibodies for detecting each protein, rabbit anti-p38 MAP Kinase polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling), rabbit anti-MKK3 polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling), rabbit anti-MKK6 polyclonal antibody (manufactured by R & D Systems), Rabbit anti-SAPK / JNK polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling), rabbit anti-p44 / 42 MAP Kinase polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling), and rabbit anti-MAST205 polyclonal antibody were used. As primary antibodies for detecting phosphorylated proteins, rabbit anti-phosphorylated p38 MAP Kinase (Thr180 / Tyr182) polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling), rabbit anti-phosphorylated MKK3 / MKK6 (Ser189 / 207) polyclonal antibody (Cell) Signaling), rabbit anti-phosphorylated SAPK / JNK (Thr183 / Tyr185) polyclonal antibody (Cell Signaling), and rabbit anti-phosphorylated p44 / 42 MAP Kinase (Thr202 / Tyr204) polyclonal antibody (Cell Signaling) Using. As a secondary antibody, an HRP-conjugated donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Amersham Biosciences) was used.
図４の左パネルに各蛋白質の検出結果を示す。ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激の有無に関わらず、ＭＡＳＴ２０５が検出されなかった。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５が検出され、該細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現量はソルビトール刺激の有無に関わらず同程度であった。ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ＪＮＫ、およびＥＲＫ１／２の発現量は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ソルビトール刺激の有無に関わらず、ほぼ同程度であった。 The detection result of each protein is shown in the left panel of FIG. In cells transfected with MAST205 siRNA, MAST205 was not detected regardless of the presence or absence of sorbitol stimulation. MAST205 was detected in the cells transfected with the control siRNA, and the expression level of MAST205 in the cells was almost the same regardless of the presence or absence of sorbitol stimulation. The expression levels of p38 MAPK, MKK6, MKK3, JNK, and ERK1 / 2 were almost the same in the cells transfected with the control siRNA and the cells transfected with MAST siRNA regardless of the presence or absence of sorbitol stimulation.
この結果から、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、ＭＡＳＴ２０５の発現が阻害されることが確認できた。 From this result, it was confirmed that MAST205 expression was inhibited by transfection with MAST205 siRNA.
図４の右パネルにリン酸化蛋白質の検出結果を示す。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激をしないときには、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＪＮＫのリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激により、これら蛋白質のリン酸化が検出された。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激によっても、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６およびＪＮＫのリン酸化は検出されないか、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較してその程度が低かった。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、ソルビトール刺激の有無に関わらず、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても検出された。 The detection result of phosphorylated protein is shown in the right panel of FIG. In cells transfected with control siRNA, phosphorylation of p38 MAPK, MKK3, MKK6, and JNK was not detected when sorbitol was not stimulated, but phosphorylation of these proteins was detected by sorbitol stimulation. On the other hand, in cells transfected with MAST205 siRNA, phosphorylation of p38 MAPK, MKK3, MKK6 and JNK was not detected even by sorbitol stimulation, or the level was lower than that in cells transfected with control siRNA. ERK1 / 2 phosphorylation was detected in both control siRNA transfected cells and MAST205 siRNA transfected cells with or without sorbitol stimulation.
ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＪＮＫのリン酸化が著しく低減したことから、ＭＡＳＴ２０５がｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６およびＪＮＫのリン酸化に関与することが明らかになった。一方、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＡＰＫＫが関与する情報伝達経路のうちＭＥＫ１およびＭＥＫ２の下流に位置するＥＲＫ１／２のリン酸化に関与しなかった。このように、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１と結合することにより、ＭＫＫ３およびＭＫＫ６のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置するｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化に関与すると発明者らは考えている。ＭＡＳＴ２０５が関与するＪＮＫのリン酸化過程は明らかではないが、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１との結合によりＭＫＫ７／ＭＫＫ４を介してＪＮＫのリン酸化に関与しているかもしれない。 Inhibition of MAST205 expression significantly reduced sorbitol-stimulated phosphorylation of p38 MAPK, MKK3, MKK6, and JNK, indicating that MAST205 is involved in phosphorylation of p38 MAPK, MKK3, MKK6, and JNK . On the other hand, MAST205 was not involved in phosphorylation of ERK1 / 2 located downstream of MEK1 and MEK2 in the information transmission pathway involving MAPKK. Thus, the inventors consider that MAST205 is involved in phosphorylation of MKK3 and MKK6 by binding to DCTN1, and further, phosphorylation of p38 MAPK located downstream thereof. Although the phosphorylation process of JNK involving MAST205 is not clear, it may be involved in phosphorylation of JNK via MKK7 / MKK4 by binding to DCTN1 and / or TIAM1.
（細胞遊走試験）
細胞の遊走へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
(Cell migration test)
The effect of MAST205 on cell migration was compared using cells that inhibited MAST205 expression and cells that did not inhibit the expression.
細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害はＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドコントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。 As the cells, MDA-MB-231 cells (human breast cancer cell line) were used. Inhibition of MAST205 expression in cells was performed using MAST205 siRNA. The MAST205 siRNA used here is a short chain consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. It is a heavy chain oligonucleotide (manufactured by Dharmacon). The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. Non-specific control duplex VIII (manufactured by Dharmacon) was used as an oligonucleotide control represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 5. Non-specific control duplex VIII is a short double-stranded oligonucleotide consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence ( Hereinafter, it may be referred to as control siRNA).
細胞遊走試験は、セルカルチャーインサート（上層）をコンパニオンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバー（以下、細胞遊走試験用チャンバーと称することがある）を用いて実施した。セルカルチャーインサート（上層）には０．１％ ＢＳＡを含む培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した細胞溶液を添加し、コンパニオンプレート（下層）には１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培養培地を添加した。セルカルチャーインサート（上層）に添加された細胞は、コンパニオンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる１０％ ＦＢＳにより遊走が誘導されると、該セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞遊走のバックグラウンドとして、１０％ ＦＢＳ含む培養培地の代わりに０．１％ ＢＳＡを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞遊走試験を実施した。 The cell migration test was performed using a chamber (hereinafter sometimes referred to as a cell migration test chamber) constituted by placing a cell culture insert (upper layer) on a companion plate (lower layer). A cell culture insert (upper layer) is added with a cell solution suspended in a culture medium (medium) containing 0.1% BSA, and a companion plate (lower layer) is added with a culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). Added. The cells added to the cell culture insert (upper layer) pass through the pores of the cell culture insert membrane when migration is induced by 10% FBS contained in the culture medium added to the companion plate (lower layer). And move to the back of it. A cell migration test was performed in the same manner using a culture medium containing 0.1% BSA instead of a culture medium containing 10% FBS as the background of cell migration.
細胞遊走の判定は、セルカルチャーインサートとして、フルオロブロック セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用い、セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞を蛍光色素染色し、次いで蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、フルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。 Cell migration is determined using fluoroblock cell culture insert (manufactured by BD Falcon) as the cell culture insert, staining cells that have migrated from the upper layer on the back of the cell culture insert membrane, and then measuring the fluorescence intensity. Was carried out. The fluorescence intensity reflects the number of cells that have migrated from the top layer to the back of the membrane of the fluoroblock cell culture insert.
細胞遊走へのＭＡＳＴ２０５の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数１×１０６／５ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。培養培地は、１０％ ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。次いで、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、５００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを２５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに４８時間、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭに再懸濁して細胞数２×１０５／ｍＬに調整した。細胞遊走試験用チャンバーの上層であるフルオロブロック セルカルチャーインサートに細胞懸濁液を２５０μＬずつ添加し、該チャンバーの下層である２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭあるいは０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭを７５０μＬ添加した。３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下でさらに６時間培養した後、フルオロブロック セルカルチャーインサートを２ｍＭ カルセイン−ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３７℃にて１時間染色し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＥｘ４８５／Ｅｍ５３０の波長で蛍光を測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして培養した細胞の一部は、６ｃｍ ディッシュに播種し、ＭＡＳＴ２０５の発現の測定に用いた。ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより実施した。細胞からの蛋白質の抽出およびウエスタンブロッティングは実施例１に記載の方法と同様の方法で実施した。 Specifically, the influence of MAST205 on cell migration was performed as follows. First, seeded MDA-MB-231 cells of cell number 1 × 10 6 / 5mL medium in 6cm dish, and cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2/95% air at 37 ° C.. As the culture medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% FBS was used. Then, using 15 μL of Lipofectamine 2000 (Invitrogen), cells were transfected with 500 pmol of MAST205 siRNA or control siRNA (25 μL of 20 μM siRNA) and further 48 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% air. The culture was performed under the following conditions. Thereafter, the cells were collected and resuspended in 0.1% BSA / DMEM to adjust the cell number to 2 × 10 5 / mL. 250 μL of the cell suspension was added to each of the fluoroblock cell culture insert, which is the upper layer of the cell migration test chamber, and 10% FBS / DMEM or 0.1% was added to the 24-well plate (BD Falcon), which is the lower layer of the chamber. 750 μL of% BSA / DMEM was added. Hank's buffered balanced salt solution containing 2 mM calcein-AM (Calcein-AM, manufactured by Molecular Probes) after further culturing at 37 ° C. under conditions of 5% CO 2 /95% air. (HBSS) was stained at 37 ° C. for 1 hour, and fluorescence was measured at a wavelength of Ex485 / Em530 using FlexStation II (Molecular Devices). A part of cells cultured by transfection with siRNA was seeded in a 6 cm dish and used for measurement of MAST205 expression. MAST205 expression was measured by extracting proteins from the cells and western blotting. Extraction of proteins from cells and Western blotting were performed in the same manner as described in Example 1.
図５に示すように、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の高い発現が認められたが、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど認められなかった。 As shown in FIG. 5, the fluorescence intensity when using cells transfected with MAST205 siRNA was significantly lower than that when using cells transfected with control siRNA. In cells transfected with control siRNA, high expression of MAST205 was observed, but in cells transfected with MAST205 siRNA, almost no expression of MAST205 was observed.
蛍光強度は、フルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に遊走した細胞の数を反映する。すなわち、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞の遊走は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現が著しく阻害されていることが分かった。 The fluorescence intensity reflects the number of cells that have migrated to the back of the membrane of the fluoroblock cell culture insert. That is, it was found that the migration of cells transfected with MAST205 siRNA was significantly reduced compared to cells transfected with control siRNA. It was also found that the expression of MAST205 was remarkably inhibited in the cells transfected with MAST205 siRNA.
このように、ＭＡＳＴ２０５を阻害することにより、細胞の遊走が抑制されることが明らかになった。 Thus, it became clear that inhibition of MAST205 suppresses cell migration.
（細胞浸潤試験）
細胞の浸潤へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
(Cell infiltration test)
The effect of MAST205 on cell infiltration was compared using cells that inhibited MAST205 expression and cells that did not inhibit the expression.
細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害はＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。 As the cells, MDA-MB-231 cells (human breast cancer cell line) were used. Inhibition of MAST205 expression in cells was performed using MAST205 siRNA. The MAST205 siRNA used here is a short duplex consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. Strand oligonucleotide (manufactured by Dharmacon). The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. The oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has two deoxythymidylates at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence consisting of (TT) is bound. As a control, non-specific control duplex VIII (manufactured by Dharmacon) was used. Non-specific control duplex VIII is a short double-stranded oligonucleotide consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence ( Hereinafter, it may be referred to as control siRNA).
細胞浸潤試験は、マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）をコンパニオンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバー（以下、細胞浸潤試験用チャンバーと称することがある）を用いて実施した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）には０．１％ ＢＳＡを含む培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した細胞溶液を添加し、コンパニオンプレート（下層）には１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培養培地を添加した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）に添加された細胞は、コンパニオンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる１０％ ＦＢＳにより浸潤が誘導されると、セルカルチャーインサートに被覆されたマトリゲルに浸潤し、セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞浸潤のバックグラウンドとして、１０％ ＦＢＳ含む培養培地の代わりに０．１％ ＢＳＡを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞浸潤試験を実施した。 The cell invasion test was performed using a chamber (hereinafter sometimes referred to as a cell invasion test chamber) constituted by placing a cell culture insert (upper layer) coated with Matrigel on a companion plate (lower layer). To the cell culture insert (upper layer) coated with Matrigel, a cell solution suspended in a culture medium (medium) containing 0.1% BSA is added, and 10% fetal bovine serum (FBS) is added to the companion plate (lower layer). A culture medium containing was added. The cells added to the cell culture insert (upper layer) coated with Matrigel were covered with the cell culture insert when invasion was induced by 10% FBS contained in the culture medium added to the companion plate (lower layer). It invades Matrigel, passes through the pores of the cell culture insert membrane, and moves to the back surface. A cell infiltration test was performed in the same manner using a culture medium containing 0.1% BSA instead of a culture medium containing 10% FBS as a background of cell infiltration.
細胞浸潤の判定は、セルカルチャーインサートとして、１００μｇ／ｃｍ２でマトリゲル（ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ ＲＥＤＵＣＥＤ ＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＭＡＴＲＩＸ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を被覆したフルオロブロック セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用い、該セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞を蛍光色素染色し、次いで蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、マトリゲルが被覆されたフルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。 The determination of cell invasion was carried out using a fluoroblock cell culture insert (manufactured by BD Falcon) coated with Matrigel (GROWTH FACTOR REDUCED BD MATRIGEL MATRIX, manufactured by BD Biosciences) at 100 μg / cm 2 as a cell culture insert. The cells migrated from the upper layer to the back surface of the membrane of the insert were stained with fluorescent dye, and then the fluorescence intensity was measured. The fluorescence intensity reflects the number of cells that have migrated from the top layer to the back of the membrane of the fluoroblock cell culture insert coated with Matrigel.
細胞浸潤へのＭＡＳＴ２０５の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数１×１０６／５ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。培養培地は、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。次いで、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、５００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを２５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに４８時間、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭに再懸濁して細胞数８×１０５／ｍＬに調整した。細胞浸潤試験用チャンバーの上層であるマトリゲルが被覆されたフルオロブロック セルカルチャーインサートに細胞懸濁液を２５０μＬずつ添加し、該チャンバーの下層である２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭあるいは０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭを７５０μＬ添加した。３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下でさらに２４時間培養した後、フルオロブロック セルカルチャーインサートを２ｍＭ カルセイン−ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３７℃にて１時間染色し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＥｘ４８５／Ｅｍ５３０の波長で蛍光を測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして培養した細胞の一部は、６ｃｍ ディッシュに播種し、ＭＡＳＴ２０５の発現の測定に用いた。ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより実施した。細胞からの蛋白質の抽出およびウエスタンブロッティングは実施例１に記載の方法と同様の方法で実施した。 Specifically, the examination of the influence of MAST205 on cell infiltration was performed as follows. First, seeded MDA-MB-231 cells of cell number 1 × 10 6 / 5mL medium in 6cm dish, and cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2/95% air at 37 ° C.. As the culture medium, DMEM containing 10% FBS was used. Then, using 15 μL of Lipofectamine 2000 (Invitrogen), cells were transfected with 500 pmol of MAST205 siRNA or control siRNA (25 μL of 20 μM siRNA) and further 48 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 /95% air. The culture was performed under the following conditions. Thereafter, the cells were collected and resuspended in 0.1% BSA / DMEM to adjust the cell number to 8 × 10 5 / mL. 250 μL of cell suspension was added to each of the fluoroblock cell culture inserts coated with Matrigel, which is the upper layer of the cell infiltration test chamber, and 10% FBS / plate was added to the 24-well plate (BD Falcon), which is the lower layer of the chamber. 750 μL of DMEM or 0.1% BSA / DMEM was added. Hank's buffered balanced salt solution containing 2 mM calcein-AM (Calcein-AM, manufactured by Molecular Probes) after further culturing at 37 ° C. under conditions of 5% CO 2 /95% air for 24 hours. (HBSS) was stained at 37 ° C. for 1 hour, and fluorescence was measured at a wavelength of Ex485 / Em530 using FlexStation II (Molecular Devices). A part of cells cultured by transfection with siRNA was seeded in a 6 cm dish and used for measurement of MAST205 expression. MAST205 expression was measured by extracting proteins from the cells and western blotting. Extraction of proteins from cells and Western blotting were performed in the same manner as described in Example 1.
図６−Ａに示すように、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の高い発現が認められたが、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど認められなかった（図６−Ｂ）。一方、β−チューブリンの発現量は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞とコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞でほぼ同程度であった。 As shown in FIG. 6-A, the fluorescence intensity when using cells transfected with MAST205 siRNA was significantly lower than that when using cells transfected with control siRNA. High expression of MAST205 was observed in cells transfected with control siRNA, but almost no expression of MAST205 was observed in cells transfected with MAST205 siRNA (FIG. 6B). On the other hand, the expression level of β-tubulin was almost the same in the cells transfected with MAST205 siRNA and the cells transfected with control siRNA.
蛍光強度は、マトリゲルを被覆したメンブレンの裏面に移動した細胞の数を反映する。すなわち、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のマトリゲルへの浸潤は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現が著しく阻害されていることが分かった。 The fluorescence intensity reflects the number of cells that have migrated to the backside of the matrigel-coated membrane. That is, it was found that the invasion of the cells transfected with MAST205 siRNA into Matrigel was significantly reduced as compared with the cells transfected with control siRNA. It was also found that the expression of MAST205 was remarkably inhibited in the cells transfected with MAST205 siRNA.
このように、ＭＡＳＴ２０５を阻害することにより、細胞の浸潤が抑制されることが明らかになった。 Thus, it became clear that inhibition of MAST205 suppresses cell infiltration.
（ＭＡＳＴ２０５とキナーゼとの結合解析）
ＭＡＳＴ２０５と６種類のキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびＭＬＫ３）それぞれとの結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。以下、各キナーゼを候補蛋白質と称することがある。
(Binding analysis of MAST205 and kinase)
The binding of MAST205 to each of six types of kinases (p38 MAPK, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7 and MLK3) was examined by immunoprecipitation using a transient co-expression system in human cultured cells. Hereinafter, each kinase may be referred to as a candidate protein.
細胞数５．０×１０５／５ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。その後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇと、候補蛋白質遺伝子を組み込んだｐＣＩ−ｎｅｏ／ＨＡ（ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＭＬＫ３）またはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクター（ＭＫＫ６） ０．５−４μｇとを、１５μＬのＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ｔａｇで標識されたＭＡＳＴ２０５（以下、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたｐ３８ ＭＡＰＫ（以下、ＨＡ−ｐ３８と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ３（以下、ＨＡ−ＭＫＫ３と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ４（以下、ＨＡ−ＭＫＫ４と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ７（以下、ＨＡ−ＭＫＫ７と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＬＫ３（以下、ＨＡ−ＭＬＫ３と称する）およびＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ６（以下、ＨＡ−ＭＫＫ６と称する）が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクターの代わりにＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいは候補蛋白質遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＨＡ発現ベクターまたはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクターの代わりに、候補蛋白質遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＨＡ発現ベクターまたはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクターを、同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。トランスフェクションして４８時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を５００μＬ添加した。氷上で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシー プラス−２００ プロテインアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。細胞から抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした８０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した細胞溶解液の一部は、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解液サンプルと称する）。回収した上清に１μｇの抗体を加え、４℃で一晩回転させて攪拌した。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした８０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフローを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後に、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを５０μＬ加え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた（以下、免疫沈降サンプルと称する）。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製および各種蛋白質の検出には、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体（Ａ１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０、ウェスタンブロッティングに１：１０００倍希釈して使用、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）マウス抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５、ウェスタンブロッティングに１：１０００倍希釈して使用、Ｒｏｃｈｅ社製）、およびＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ウェスタンブロッティングに１：２０００倍希釈して使用、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。 The HEK293T cells of the cell number 5.0 × 10 5 / 5ml medium and seeded into 6cm dishes and cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2/95% air at 37 ° C.. Thereafter, 4 μg of pCI / Myc expression vector incorporating the MAST205 gene and pCI-neo / HA (p38 MAPK, MKK3, MKK4, MKK7 and MLK3) or pCMV / HA expression vector (MKK6) containing the candidate protein gene 0.5 -4 μg was transfected into the cells using 15 μL FuGENE (Roche). By these vectors, MAST205 labeled with Myc-tag (hereinafter referred to as Myc-MAST205), p38 MAPK labeled with HA-tag (hereinafter referred to as HA-p38), and MKK3 labeled with HA-tag. (Hereinafter referred to as HA-MKK3), MKK4 labeled with HA-tag (hereinafter referred to as HA-MKK4), MKK7 labeled with HA-tag (hereinafter referred to as HA-MKK7), and HA-tag Labeled MLK3 (hereinafter referred to as HA-MLK3) and HAKK-labeled MKK6 (hereinafter referred to as HA-MKK6) are expressed intracellularly. As a control, instead of the pCI / Myc expression vector incorporating the MAST205 gene, the pCI / Myc expression vector not incorporating the MAST205 gene, or the pCI / HA expression vector or the pCMV / HA expression vector incorporating the candidate protein gene, Cells transfected with a pCI / HA expression vector or a pCMV / HA expression vector not incorporating a candidate protein gene were prepared in the same manner. After transfection and culturing for 48 hours, the culture supernatant was removed, the cells were washed twice with cold PBS, and 1 × cell lysis buffer with protease inhibitor cocktail (Sigma) added to a volume of 0.01 500 μL of Cell Signaling (manufactured by Cell Signaling) was added. After standing for 15 minutes on ice, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as a cell lysate. The protein concentration of the cell lysate was quantified using Coomassie Plus-200 protein assay reagent (Pierce). The cell lysate extracted from the cells was added with 80 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) blocked with 0.1% BSA, with the same protein mass between samples. The mixture was stirred at 4 ° C. for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was collected. A part of the collected cell lysate was heat denatured by adding 2 × SDS sample buffer (hereinafter referred to as cell lysate sample). 1 μg of antibody was added to the collected supernatant, and the mixture was rotated overnight at 4 ° C. and stirred. Thereafter, 80 μL (50% v / v) Protein G Sepharose 4 Fast Flow blocked with 0.1% BSA was added, and the mixture was rotated at 4 ° C. for 2 hours and stirred. Subsequently, it was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. 500 μL of 1 × cell lysis buffer was added and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute at 4 ° C., and the supernatant was removed. After repeating this washing operation three times, 50 μL of 2 × SDS sample buffer was added, and the adsorbed protein was extracted and heat denatured (hereinafter referred to as immunoprecipitation sample). Cell lysate samples and immunoprecipitation samples were separated by 5-20% SDS-PAGE, stained with primary antibody and secondary antibody, and then ECL reagent (Amersham Biosciences) or ECL Plus reagent (Amersham Biosciences) was used. The protein was detected. For preparation of immunoprecipitation samples and detection of various proteins, rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody (A14, manufactured by Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-c-Myc monoclonal antibody (9E10, diluted 1: 1000 to Western blotting) Used, Santa Cruz) Mouse anti-HA monoclonal antibody (12CA5, diluted 1: 1000 for Western blotting, Roche), and HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polyclonal antibody (1: 2000 diluted for Western blotting) Used, Cell Signaling).
図７に、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＬＫ３またはＭＫＫ６との結合解析の結果を示す。図７の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞（レーン４、６および８）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞（レーン３、５または７）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６それぞれとの結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のいずれをも発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のいずれをも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図７の右下パネルおよび左下パネル：レーン２、４、６および８）。また、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を発現させた細胞における各蛋白質の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図７の左上パネル：レーン３−８）。 FIG. 7 shows the results of binding analysis between MAST205 and p38 MAPK, MLK3 or MKK6. As shown in the upper right panel of FIG. 7, from a cell co-expressed with Myc-MAST205 and HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 (lanes 4, 6 and 8), a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody was obtained. Coprecipitation of Myc-MAST205 with HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 (indicated by an arrow in the figure) was detected in the immunoprecipitation sample prepared in the above (indicated as IP: Myc in the figure) . On the other hand, in the case of an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 (lanes 3, 5 or 7), Myc-MAS205, HA-p38, HA- No co-precipitation of MLK3 or HA-MKK6 was detected. From this, this coprecipitation is not due to non-specific adsorption of HA-p38, HA-MLK3 and HA-MKK6 to the resin, but Myc-MAST205 and HA-p38, HA-MLK3 and HA-MKK6, respectively. It was determined to indicate binding. In addition, cells expressing Myc-MAST205 but not expressing HA-p38, HA-MLK3, and HA-MKK6 (lane 2), and Myc-MAST205, HA-p38, HA-MLK3, and HA- No coprecipitation as described above was detected in immunoprecipitation samples prepared in the same manner from cells not expressing any of MKK6 (lane 1). Expression of Myc-MAST205 in a sample prepared from Myc-MAST205-expressing cells could be confirmed by Western blotting (lower right panel and lower left panel of FIG. 7: lanes 2, 4, 6 and 8). In addition, the expression of each protein in cells expressing HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 could also be confirmed by Western blotting (upper left panel in FIG. 7: lanes 3-8).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン４、６および８）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン３、５および７）では、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。 Specifically, an immunoprecipitation sample obtained by treating a cell lysate of cells co-expressed with Myc-MAST205 and HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 with a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody (upper right of FIG. 7). Panel: Lanes 4, 6 and 8) were subjected to Western blotting using a mouse anti-HA monoclonal antibody, and as a result, a band indicating HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 (indicated by an arrow in the figure) was detected. It was done. In contrast, in the immunoprecipitation samples similarly prepared from cells co-expressed with Myc and HA-p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 (upper right panel of FIG. 7: lanes 3, 5 and 7), HA No bands representing -p38, HA-MLK3 or HA-MKK6 were detected. In addition, an immunoprecipitation sample similarly prepared from cells co-expressed with Myc-MAST205 and HA (upper right panel of FIG. 7: lane 2), and an immunoprecipitation sample similarly prepared from cells co-expressed with Myc and HA In the upper right panel of FIG. 7 (lane 1), only a band indicating HA was detected.
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＬＫ３およびＭＫＫ６それぞれとが細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it became clear that MAST205 and p38 MAPK, MLK3 and MKK6 each bind in cells.
図８に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３との結合解析の結果を示す。図８の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞（レーン３）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ３のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ＭＫＫ３を発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ３をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図８の右下パネルおよび左下パネル：レーン２および４）。また、ＨＡ−ＭＫＫ３を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ３の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図８の左上パネル：レーン３および４）。 FIG. 8 shows the result of the binding analysis between MAST205 and MKK3. As shown in the upper right panel of FIG. 8, an immunoprecipitation sample prepared using a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody from cells co-expressing Myc-MAST205 and HA-MKK3 (lane 4) (IP: (Denoted by Myc), coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK3 (indicated by arrows in the figure) was detected. On the other hand, coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK3 was not detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and HA-MKK3 (lane 3). From this, it was determined that this coprecipitation was not due to non-specific adsorption of HA-MKK3 to the resin, but showed binding between Myc-MAST205 and HA-MKK3. Immunity similarly prepared from cells that expressed Myc-MAST205 but not HA-MKK3 (lane 2), and cells that did not express Myc-MAST205 and HA-MKK3 (lane 1) The coprecipitation as described above was not detected in the sedimented sample. Expression of Myc-MAST205 in samples prepared from Myc-MAST205-expressing cells could be confirmed by Western blotting (lower right panel and lower left panel in FIG. 8: lanes 2 and 4). Moreover, the expression of HA-MKK3 in cells expressing HA-MKK3 could also be confirmed by Western blotting (upper left panel of FIG. 8: lanes 3 and 4).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン４）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ３を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン３）では、ＨＡ−ＭＫＫ３を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。 Specifically, for an immunoprecipitation sample obtained by treating a cell lysate of cells in which Myc-MAST205 and HA-MKK3 were co-expressed with a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody (upper right panel in FIG. 8: lane 4), As a result of Western blotting using the HA monoclonal antibody, a band (indicated by an arrow in the figure) indicating HA-MKK3 was detected. In contrast, no band indicating HA-MKK3 was detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressed with Myc and HA-MKK3 (upper right panel: lane 3 in FIG. 8). Moreover, the immunoprecipitation sample similarly prepared from the cell which co-expressed Myc-MAST205 and HA (the upper right panel of FIG. 8: Lane 2), and the immunoprecipitation sample similarly prepared from the cell co-expressed Myc and HA In the upper right panel of FIG. 8 (lane 1), only a band indicating HA was detected.
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３が細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it was revealed that MAST205 and MKK3 bind in cells.
図９に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４との結合解析の結果を示す。図９の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞（レーン３）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ４のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ３をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図９の右下パネルおよび左下パネル：レーン１および３）。また、ＨＡ−ＭＫＫ４を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ４の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図９の左上パネル：レーン２および３）。 FIG. 9 shows the result of the binding analysis between MAST205 and MKK4. As shown in the upper right panel of FIG. 9, an immunoprecipitation sample prepared from a cell co-expressing Myc-MAST205 and HA-MKK4 (lane 3) using a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody (IP: (Denoted by Myc), coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK3 (indicated by arrows in the figure) was detected. On the other hand, coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK3 was not detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and HA-MKK4 (lane 2). From this, it was determined that this coprecipitation was not due to non-specific adsorption of HA-MKK4 to the resin, but showed binding of Myc-MAST205 and HA-MKK4. In addition, no coprecipitation as described above was detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells (lane 1) in which neither Myc-MAST205 nor HA-MKK3 was expressed. Expression of Myc-MAST205 in a sample prepared from Myc-MAST205-expressing cells could be confirmed by Western blotting (lower right panel and lower left panel in FIG. 9: lanes 1 and 3). Moreover, the expression of HA-MKK4 in cells expressing HA-MKK4 could also be confirmed by Western blotting (upper left panel of FIG. 9: lanes 2 and 3).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン３）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ４を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン２）では、ＨＡ−ＭＫＫ４を示すバンドは検出されなかった。また、ＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。 Specifically, for an immunoprecipitation sample (upper right panel: lane 3 in FIG. 9) obtained by treating a cell lysate of cells co-expressed with Myc-MAST205 and HA-MKK4 with a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody, As a result of Western blotting using the HA monoclonal antibody, a band (indicated by an arrow in the figure) indicating HA-MKK4 was detected. In contrast, no band indicating HA-MKK4 was detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressed with Myc and HA-MKK4 (upper right panel of FIG. 9: lane 2). Moreover, only the band which shows HA was detected in the immunoprecipitation sample similarly prepared from the cell which co-expressed Myc and HA (FIG. 9, upper right panel: lane 1).
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４が細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it was revealed that MAST205 and MKK4 bind in cells.
図１０に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７との結合解析の結果を示す。図１０の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞（レーン３）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ７のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ＭＫＫ７を発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ７をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図１０の右下パネルおよび左下パネル：レーン２および４）。また、ＨＡ−ＭＫＫ７を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ７の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図１０の左上パネル：レーン３および４）。 FIG. 10 shows the result of the binding analysis between MAST205 and MKK7. As shown in the upper right panel of FIG. 10, immunoprecipitation samples (IP: in the figure: IP) prepared from a cell co-expressed with Myc-MAST205 and HA-MKK7 (lane 4) using a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody. (Denoted by Myc), coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK7 (indicated by arrows in the figure) was detected. On the other hand, coprecipitation of Myc-MAST205 and HA-MKK7 was not detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressing Myc and HA-MKK7 (lane 3). From this, it was determined that this coprecipitation was not due to non-specific adsorption of HA-MKK7 to the resin, but showed binding between Myc-MAST205 and HA-MKK7. Immunity similarly prepared from cells that expressed Myc-MAST205 but not HA-MKK7 (lane 2), and cells that did not express Myc-MAST205 and HA-MKK7 (lane 1) The coprecipitation as described above was not detected in the sedimented sample. Expression of Myc-MAST205 in a sample prepared from Myc-MAST205-expressing cells could be confirmed by Western blotting (lower right panel and lower left panel in FIG. 10: lanes 2 and 4). Moreover, the expression of HA-MKK7 in cells expressing HA-MKK7 could also be confirmed by Western blotting (upper left panel of FIG. 10: lanes 3 and 4).
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン４）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ７を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン３）では、ＨＡ−ＭＫＫ７を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。 Specifically, for an immunoprecipitation sample obtained by treating a cell lysate of cells co-expressing Myc-MAST205 and HA-MKK7 with a rabbit anti-c-Myc polyclonal antibody (upper right panel of FIG. 10: lane 4), As a result of Western blotting using the HA monoclonal antibody, a band (indicated by an arrow in the figure) indicating HA-MKK7 was detected. In contrast, no band indicating HA-MKK7 was detected in an immunoprecipitation sample prepared in the same manner from cells co-expressed with Myc and HA-MKK7 (upper right panel of FIG. 10: lane 3). In addition, an immunoprecipitation sample similarly prepared from cells co-expressed with Myc-MAST205 and HA (upper right panel of FIG. 10: lane 2), and an immunoprecipitation sample similarly prepared from cells co-expressed with Myc and HA In the upper right panel of FIG. 10 (lane 1), only a band indicating HA was detected.
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７が細胞内で結合することが明らかになった。 From the above results, it was revealed that MAST205 and MKK7 bind in cells.
（ＭＡＳＴ２０５発現阻害によるＭＫＫ４のリン酸化阻害）
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３参照）。ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によってリン酸化されることによりその機能が調節されている。
(Inhibition of MKK4 phosphorylation by inhibiting MAST205 expression)
By inhibiting the expression of MAST205, phosphorylation of JNK was inhibited (see Example 3). JNK is known to be involved in cell proliferation, cell death or immune inflammatory response, and its function is regulated by phosphorylation by MKK7 / MKK4.
そこで、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害によるＪＮＫのリン酸化阻害が、ＭＡＳＴ２０５によるＭＫＫ４の機能阻害に起因するか否かを解析した。ＭＫＫ４は、ストレス刺激によりリン酸化されて活性化する。ストレス刺激によるＭＫＫ４のリン酸化を、ＭＫＫ４の機能の指標として測定した。具体的には、ストレス刺激によるＭＫＫ４のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。 Therefore, it was analyzed whether inhibition of JNK phosphorylation by inhibition of MAST205 expression was due to inhibition of MKK4 function by MAST205. MKK4 is phosphorylated and activated by stress stimulation. The phosphorylation of MKK4 by stress stimulation was measured as an index of the function of MKK4. Specifically, phosphorylation of MKK4 by stress stimulation was compared using cells that inhibited MAST205 expression and cells that did not inhibit the expression.
細胞は、ＨｅＬａ細胞を用いた。ＨｅＬａ細胞は、４０μｍ メッシュによりろ過してから用いた。 As the cells, HeLa cells were used. HeLa cells were used after being filtered through a 40 μm mesh.
細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。 Inhibition of MAST205 expression in cells was performed using MAST205 siRNA. The MAST205 siRNA used here is a short double-stranded oligonucleotide comprising an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by the complementary base sequence of the base sequence (Manufacturing consignment to Dharmacon). The oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 consists of two deoxythymidylates (TT) at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence is bound. The oligonucleotide represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 has two deoxythymidylates at the 3 ′ end of the oligonucleotide represented by the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is an oligonucleotide to which an overhang sequence consisting of (TT) is bound. As a control, non-specific control duplex VIII (manufactured by Dharmacon) was used. Non-specific control duplex VIII is a short double-stranded oligonucleotide consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide represented by a complementary base sequence of the base sequence ( Hereinafter, it may be referred to as control siRNA).
具体的には、５×１０５／１ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＨｅＬａ細胞を６ウエルプレートの各ウエルに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。次いで、７．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、２５０ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションした（最終液量は３ｍＬ）。３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、細胞を回収し、４等分にして１２ウエルプレートにまきなおし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ２／９５％ エアの条件下で培養した。次いで、０．４Ｍ ソルビトールで２０分間、または、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１で１５分間、細胞を刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷ＴＢＳにて２回洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）、およびそれぞれ終濃度で１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ フッ化ナトリウム、１μＭ パラニトロフェニルホスフェート、２μＭ ＤＴＴ、０．５μＭ ＰＭＳＦを加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、氷上で２０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とて用いた。細胞溶解液はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、５×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて検出した。蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗ＳＥＫ１／ＭＫＫ４ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：５００希釈して用いた、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＡＳＴ２０５ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：１０００希釈して用いた、スクラム社へ製造委託）、およびウサギ抗β−チューブリンポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：３００希釈して用いた、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いた。リン酸化蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗リン酸化ＳＥＫ１／ＭＫＫ４（Ｔｈｒ２６１）ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：５００希釈して用いた、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。２次抗体として、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：２０００希釈して用いた、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。 Specifically, the HeLa cell of 5 × 10 5 / 1mL medium were seeded in each well of 6-well plates and cultured for 24 hours under the conditions of 5% CO 2/95% air at 37 ° C.. Subsequently, cells were transfected with 250 pmol of MAST205 siRNA or control siRNA using 7.5 μL of Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen) (final solution volume was 3 mL). After culturing under conditions of 5% CO 2 /95% air at 37 ° C. for 24 hours, the cells were recovered, aliquoted into 12-well plates in 4 equal portions, and further 5 hours at 37 ° C. with 5% CO 2. / 95% air was cultured. Cells were then stimulated with 0.4 M sorbitol for 20 minutes or 20 ng / mL IL-1 for 15 minutes. After stimulation, the culture supernatant was removed, washed twice with cold TBS, and protease inhibitor cocktail (Sigma) to 0.01 volume, and final concentrations of 1.5 mM MgCl 2 , 10 μM fluoride 100 μL / well of 1 × cell lysis buffer (manufactured by Cell Signaling) supplemented with sodium, 1 μM paranitrophenyl phosphate, 2 μM DTT, and 0.5 μM PMSF was added, left on ice for 20 minutes, and then 4 times at 15,000 rpm. Centrifugation was performed at 0 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was used as a cell lysate. The cell lysate was quantified using Coomassie Plus-200 Protein Assay Reagent (Pierce). Some cell lysates were heat denatured by adding 5 × SDS sample buffer (hereinafter referred to as cell lysate samples). These samples were separated by 5-20% SDS-PAGE, stained with primary antibody and secondary antibody, and then detected using ECL reagent (Amersham Biosciences) or ECL Plus reagent (Amersham Biosciences). As primary antibodies for detecting proteins, rabbit anti-SEK1 / MKK4 polyclonal antibody (Cell Signaling, diluted 1: 500 used for Western blotting), rabbit anti-MAST205 polyclonal antibody (1: 1000 diluted for Western blotting) And a rabbit anti-β-tubulin polyclonal antibody (manufactured by Santa Cruz, diluted 1: 300 for Western blotting). As a primary antibody for detecting the phosphorylated protein, a rabbit anti-phosphorylated SEK1 / MKK4 (Thr261) polyclonal antibody (manufactured by Cell Signaling, diluted 1: 500 for Western blotting) was used. As a secondary antibody, an HRP-conjugated donkey anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Amersham Biosciences, diluted 1: 2000 for Western blotting) was used.
図１１の各パネルにそれぞれ、ＭＡＳＴ２０５、リン酸化ＭＫＫ４（図中、Ｐ−ＭＫＫ４と示す）ＭＫＫ４、およびβ−チューブリン（図中、β−ｔｕｂｕｌｉｎと示す）をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す。 Each panel of FIG. 11 shows the results of detecting Western blotting of MAST205, phosphorylated MKK4 (shown as P-MKK4 in the figure), and β-tubulin (shown as β-tubulin in the figure).
リン酸化ＭＫＫ４（図１１、左から２番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションし且つソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激した細胞で検出された（レーン２および３）。それに対し、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激やＩＬ−１刺激を行っても、リン酸化ＭＫＫ４が検出されなかった（レーン５および６）。ソルビトール刺激やＩＬ−１刺激を行わない場合は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの有無に関らず、リン酸化ＭＫＫ４は検出されなかった（レーン１および４）。 Phosphorylated MKK4 (indicated by the arrow in FIG. 11, second panel from the left) was detected in cells transfected with control siRNA and stimulated with sorbitol or IL-1 (lanes 2 and 3). In contrast, phosphorylated MKK4 was not detected in cells transfected with MAST205 siRNA even after sorbitol stimulation or IL-1 stimulation (lanes 5 and 6). When sorbitol stimulation or IL-1 stimulation was not performed, phosphorylated MKK4 was not detected regardless of the presence or absence of MAST205 siRNA transfection (lanes 1 and 4).
ＭＡＳＴ２０５の発現（図１１、左パネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞において検出され、その発現量はソルビトール刺激やＩＬ−１刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった（レーン１−３）。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど検出されなかった（レーン４−６）。ＭＫＫ４の発現（図１１、左から３番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても検出され、その発現量はソルビトール刺激やＩＬ−１刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった。また、内因性蛋白質であるβ−チューブリンの発現量が、用いたいずれの細胞溶解液においてもほぼ同程度であることから、ウェスタンブロッティングに用いた細胞溶解液中の蛋白質量は、いずれのレーンにおいてもほぼ同程度であることが明らかである。 MAST205 expression (indicated by arrows in FIG. 11, left panel) was detected in cells transfected with control siRNA, and the expression level was almost the same regardless of the presence or absence of sorbitol stimulation or IL-1 stimulation. (Lanes 1-3). On the other hand, almost no MAST205 expression was detected in cells transfected with MAST205 siRNA (lanes 4-6). Expression of MKK4 (shown by an arrow in the third panel from the left in FIG. 11) was detected in both cells transfected with control siRNA and cells transfected with MAST205 siRNA. The level was almost the same regardless of the presence or absence of IL-1 stimulation. Moreover, since the expression level of β-tubulin, which is an endogenous protein, is almost the same in any cell lysate used, the amount of protein in the cell lysate used for Western blotting is the same in any lane. It is clear that the level is almost the same.
ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激によるＭＫＫ４のリン酸化が著しく低減したことから、ＭＡＳＴ２０５がＭＫＫ４のリン酸化に関与することが明らかになった。一方、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３参照）。また、ＭＡＳＴ２０５はＭＫＫ４と結合した（実施例６）。したがって、ＭＡＳＴ２０５はＭＫＫ４と結合することにより、ＭＫＫ４のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置するＪＮＫ３のリン酸化に関与すると発明者らは考えている。 Inhibition of MAST205 expression significantly reduced MKK4 phosphorylation by sorbitol-stimulated or IL-1-stimulated, indicating that MAST205 is involved in MKK4 phosphorylation. On the other hand, phosphorylation of JNK was inhibited by inhibiting the expression of MAST205 (see Example 3). MAST205 bound to MKK4 (Example 6). Therefore, the inventors consider that MAST205 is involved in phosphorylation of MKK4 by binding to MKK4, and further, phosphorylation of JNK3 located downstream of these.
本発明によれば、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、癌転移、血管新生、および免疫炎症応答の抑制を実施できると発明者らは考えている。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell migration inhibition method and migration inhibitor which inhibit the expression and / or function of MAST205 can be provided. Specifically, according to the present invention, the expression of MAST205, the binding of MAST205 and DCTN1, the binding of MAST205 and TIAM1, the binding of MAST205 and MLK3, the binding of MAST205 and MKK3, the binding of MAST205 and MKK4, the binding of MAST205 and MKK6, It is possible to provide a cell migration inhibition method and a migration inhibitor characterized by inhibiting at least one selected from the binding of MKK7, the binding of MAST205 and p38 MAPK, and the serine threonine kinase activity of MAST205. Inventors believe that inhibition of MAST205 expression and / or function can effect suppression of cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory responses.
本発明は、細胞の遊走および浸潤、癌転移、血管新生、並びに免疫炎症応答に関する基礎的研究直に有用である。さらに、癌転移、血管新生を伴う疾患、炎症性疾患の防止および／または治療に有用である。 The present invention is useful in basic research directly on cell migration and invasion, cancer metastasis, angiogenesis, and immune inflammatory response. Furthermore, it is useful for the prevention and / or treatment of cancer metastasis, diseases involving angiogenesis, and inflammatory diseases.
配列番号１：ＭＡＳＴ２０５。
配列番号１：（５１２）：（７８５）キナーゼドメイン。
配列番号１：（１１０５）：（１１８６）ＰＤＺドメイン。
配列番号２：ＭＡＳＴ２０５遺伝子の発現を阻害するために該遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたＲＮＡ。
配列番号３：配列番号２に記載の塩基配列を有し、その３´末端にｄＴｄＴを有する設計されたＲＮＡ／ＤＮＡ。
配列番号４：非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩを構成するセンスＲＮＡ。
配列番号５：配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、その３´末端にｄＴｄＴを有する設計されたＲＮＡ／ＤＮＡ。
SEQ ID NO: 1 MAST205.
SEQ ID NO: 1: (512): (785) Kinase domain.
SEQ ID NO: 1: (1105): (1186) PDZ domain.
SEQ ID NO: 2: RNA designed based on the base sequence of the MAST205 gene to inhibit the expression
SEQ ID NO: 3: Designed RNA / DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 and having dTdT at its 3 ′ end.
SEQ ID NO: 4: Non-specific control Sense RNA constituting duplex VIII.
SEQ ID NO: 5: designed RNA / DNA having a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and having dTdT at its 3 ′ end
Claims (48)
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。 The method for inhibiting cell migration according to claim 1, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1 (dynactin 1),
(2) binding of MAST205 and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(3) Binding of MAST205 and MLK3 (mixed linage kinase 3),
(4) Binding of MAST205 and MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3),
(5) Binding of MAST205 and MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4)
(6) Binding of MAST205 and MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase 6)
(7) Binding of MAST205 and MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7)
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase),
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。 The cell migration inhibitor according to claim 10, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1 (dynactin 1),
(2) binding of MAST205 and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(3) Binding of MAST205 and MLK3 (mixed linage kinase 3),
(4) Binding of MAST205 and MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3),
(5) Binding of MAST205 and MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4)
(6) Binding of MAST205 and MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase 6)
(7) Binding of MAST205 and MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7)
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase),
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。 The method of inhibiting angiogenesis according to claim 21, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1 (dynactin 1),
(2) binding of MAST205 and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(3) Binding of MAST205 and MLK3 (mixed linage kinase 3),
(4) Binding of MAST205 and MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3),
(5) Binding of MAST205 and MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4)
(6) Binding of MAST205 and MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase 6)
(7) Binding of MAST205 and MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7)
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase),
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。 The angiogenesis inhibitor according to claim 28, wherein the function of MAST205 is one or more functions selected from the following group:
(1) Binding of MAST205 and DCTN1 (dynactin 1),
(2) binding of MAST205 and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(3) Binding of MAST205 and MLK3 (mixed linage kinase 3),
(4) Binding of MAST205 and MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3),
(5) Binding of MAST205 and MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4)
(6) Binding of MAST205 and MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase 6)
(7) Binding of MAST205 and MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7)
(8) Binding of MAST205 and p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase),
And (9) Serine threonine kinase activity of MAST205.
（ｉ）ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）、
（ｉｉ）ＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）、
（ｉｉｉ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、
（ｉｖ）ＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、
（ｖ）ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、
（ｖｉ）ＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）、
（ｖｉｉ）ＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）、
および
（ｖｉｉｉ）ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）。 A method for identifying a compound having an activity of suppressing cell migration, comprising MAST205 (microtubule associated testis specific ST protein kinase-205 kDa) and / or one or more compounds selected from the following group (test) Compound) and a system using a signal and / or marker for detecting the binding between MAST205 and the protein, and detecting the presence or absence or change of this signal and / or marker, A method of identification comprising determining whether a compound inhibits binding of MAST205 to the protein:
(I) DCTN1 (dynactin 1),
(Ii) TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(Iii) MLK3 (mixed linage kinase 3),
(Iv) MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3),
(V) MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4),
(Vi) MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase 6),
(Vii) MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7),
And (viii) p38 MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase).
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｅ）ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）およびＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｆ）上記（ｅ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）上記（ｆ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｈ）上記（ｇ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。 Reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205 (microtube associated tests specific ST protein kinase-205 kDa),
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(E) any one protein selected from DCTN1 (dynactin 1) and TIAM1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1),
(F) a polynucleotide encoding the protein of (e) above,
(G) a recombinant vector containing the polynucleotide of (f) above, and (h) a transformant containing the recombinant vector of (g) above,
Consists of.
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｉ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）およびｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｊ）上記（ｉ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｋ）上記（ｊ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｌ）上記（ｋ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。 Reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205 (microtube associated tests specific ST protein kinase-205 kDa),
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(I) MLK3 (mixed lineage kinase 3), MKK3 (mitogen-activated protein kin kin kinase 3), MKK4 (mitogen-activated protein kin k 3) any one protein selected from activated protein kinase),
(J) a polynucleotide encoding the protein of (i) above,
(K) a recombinant vector containing the polynucleotide of (j) above, and (1) a transformant containing the recombinant vector of (k) above,
Consists of.
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｍ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｎ）上記（ｍ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｏ）上記（ｎ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｐ）上記（ｏ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。 Reagent kit comprising one or more components selected from the following group A and one or more components selected from the following group B:
Here, the A group is
(A) MAST205 (microtube associated tests specific ST protein kinase-205 kDa),
(B) a polynucleotide encoding MAST205;
(C) a recombinant vector containing the polynucleotide of (b) above, and (d) a transformant containing the recombinant vector of (c) above,
Consists of
Group B
(M) MLK3 (mixed linear kinase 3), MKK4 (mitogen-activated protein kinase 4), MKK7 (mitogen-activated protein kinase 7) -N protein,
(N) a polynucleotide encoding the protein of (m) above,
(O) a recombinant vector containing the polynucleotide of (n) above, and (p) a transformant containing the recombinant vector of (o) above,
Consists of.
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|---|---|---|---|---|
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| WO2021162126A1 (en) | 2020-02-13 | 2021-08-19 | シーシーアイホールディングス株式会社 | Inhibitor of aspartic acid synthesis in tumor cells, inhibitor of spheroid formation of tumor cells, inhibitor of tumor cell metastasis, activity enhancer of glycolytic inhibitor, and pharmaceutical composition for suppressing and/or preventing tumor metastasis |
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2006
- 2006-06-20 JP JP2006170284A patent/JP2008308407A/en not_active Withdrawn
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| EP4104823A4 (en) * | 2020-02-13 | 2024-05-01 | Cci Holdings Inc | Inhibitor of aspartic acid synthesis in tumor cells, inhibitor of spheroid formation of tumor cells, inhibitor of tumor cell metastasis, activity enhancer of glycolytic inhibitor, and pharmaceutical composition for suppressing and/or preventing tumor metastasis |
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