JP4839143B2 - Recombinant microorganism - Google Patents

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Description

本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。   The present invention relates to a recombinant microorganism used for producing a useful protein or polypeptide, and a method for producing a protein or polypeptide.

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。   The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, pharmaceuticals, detergents, daily necessaries such as cosmetics to various chemical raw materials.

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicumATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。 In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues, and breeding of produced bacteria by genetic techniques such as mutation has been performed as a technique. Particularly recently, with the development of microbial genetics and biotechnology, more efficient breeding of production bacteria using genetic recombination techniques has been carried out. Furthermore, in response to the rapid development of genome analysis technology in recent years, attempts have been made to decode genome information of target microorganisms and actively apply them to industry. Industrially useful host microorganisms whose genome information has been disclosed include Bacillus subtilis Marburg No. 168 (Non-patent Document 1), Escherichia coli K-12 MG1655 (Non-patent Document 2), Corynebacterium Corynebacterium glutamicum ATCC132032 and the like are mentioned, and strains with improved information have been developed using these genomic information. However, despite the above efforts, the production efficiency has not always been satisfactory.

prsA遺伝子は、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質をコードする遺伝子として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。そして、自身のプロモーター領域を含む枯草菌のprsA遺伝子を挿入したプラスミドを導入し、微生物中に複数のprsA遺伝子を持たせることにより、目的タンパク質の生産性が２〜６倍に向上した微生物が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、かかる微生物では、１菌体当たりに導入される複数個のプラスミドの個数を制御するのが困難であり、また生産培養中にプラスミドの脱落がしばしば起こるという問題があり、実用的ではない。更に前記報告において、prsA遺伝子断片を挿入したクローニングベクターpHP13は枯草菌プラスミドpTA1060の複製機能を含んでおり（Mol. Gene. Genet., 209:335 (1987)）、pTA1060の枯草菌1ゲノム当たり、すなわち1菌体当たりにおけるコピー数は平均5.2であることが報告されている（Plasmid, 18:8 (1987)）。すなわち、前記報告における目的タンパク質の増加量は野生株の生産量の１〜５倍であることから、導入したprsA遺伝子1個あたりの生産増加量は野生株生産量の約０．２〜１倍であり、充分な効果が得られているとは言えない。 The prsA gene was found in Bacillus subtilis as a gene encoding a protein involved in the protein secretion process. Previous studies have shown that PrsA facilitates protein folding after it has been transported out of the cytoplasm across the cell membrane. It is speculated to have a chaperone-like function. In addition, by introducing a plasmid into which a Bacillus subtilis prsA gene containing its own promoter region is inserted, and having a plurality of prsA genes in the microorganism, a microorganism whose target protein productivity has been improved 2 to 6 times has been reported. (Non-Patent Document 3). However, such a microorganism is not practical because it is difficult to control the number of a plurality of plasmids introduced per cell, and the plasmids are often dropped during production culture. Furthermore, in the above report, the cloning vector pHP13 into which the prsA gene fragment has been inserted contains the replication function of the Bacillus subtilis plasmid pTA1060 (Mol. Gene. Genet., 209: 335 (1987)). That is, it is reported that the average number of copies per cell is 5.2 (Plasmid, 18: 8 (1987)). That is, since the increase in the target protein in the above report is 1 to 5 times the production of the wild strain, the increase in production per introduced prsA gene is about 0.2 to 1 times the production of the wild strain. Therefore, it cannot be said that a sufficient effect is obtained.

一方、spoVG遺伝子がコードするSpoVGは、胞子のコルテックス合成に関与するタンパク質である。spoVG遺伝子の転写は胞子形成シグマ因子であるシグマＨの調節を受けており、spoVG遺伝子は胞子形成期にて顕著な発現上昇を示すことが知られている（非特許文献４）。しかしながら、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域やリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子の上流に連結した微生物は知られていない。
Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997 Mol. Microbiology, 8,:727 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83,:9438 (1986) On the other hand, SpoVG encoded by the spoVG gene is a protein involved in spore cortex synthesis. Transcription of spoVG gene has received regulatory sigma H spore formation sigma factors, spoVG gene is known to exhibit significant increased expression in sporulation (Non-Patent Document 4). However, microorganisms transcriptional initiation regulatory region or the ribosome binding site of the spoVG gene of B. subtilis was ligated upstream of the Bacillus subtilis prsA gene is not known.
Nature, 390,249,1997 Science, 277,1453,1997 Mol. Microbiology, 8,: 727 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,: 9438 (1986)

本発明は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高い微生物を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the microorganism with high productivity of the target protein or target polypeptide.

本発明者らは、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を導入して枯草菌prsA遺伝子を強化し、枯草菌PrsAを過剰に発現させることにより、目的タンパク質の生産性が著しく向上することを見出した。 The present inventors have introduced the transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis or the transcription initiation control region and the ribosome binding site to enhance the Bacillus subtilis prsA gene and to overexpress Bacillus subtilis PrsA, thereby obtaining the target protein. It has been found that the productivity is significantly improved.

すなわち本発明は、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入してなる微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。 That is, the present invention is a Bacillus subtilis spoVG gene transcription initiation control region or transcription initiation control region and a ribosome binding site introduced upstream of the Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene upstream, or The target protein or poly of the transcription initiation regulatory region of the spoVG gene of Bacillus subtilis or the microorganism obtained by introducing a gene fragment in which the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site are linked upstream of the Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene. The present invention provides a recombinant microorganism into which a gene encoding a peptide is introduced.

また、本発明は、上記の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。   The present invention also provides a method for producing a protein or polypeptide using the above-described recombinant microorganism.

本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。   The recombinant microorganism of the present invention has high productivity of the target protein or polypeptide. Therefore, when the target protein or target polypeptide is produced using this, the time and cost required for production of the substance can be reduced.

この明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。   In this specification, the identity of amino acid sequences and base sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Specifically, it is calculated by performing an analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).

本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。   In the present specification, the transcription initiation control region is a region including a promoter and a transcription initiation point, and the ribosome binding site is a Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc. Natl. Acad) that forms a translation initiation control region together with the initiation codon. Sci. USA 74, 5463 (1974)).

本発明の組換え微生物の宿主となる微生物としては、特に限定されず、野生型のものでも変異を施したものでものよく、具体的には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点や、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。 The microorganisms to be the host of the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited, and those of the wild type may also were subjected to mutation, specifically, Bacillus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) (Bacillus) bacteria and Clostridium (Clostridium) bacteria, or yeast, and among them B. (Bacillus) bacteria are preferred. Furthermore, Bacillus subtilis is particularly preferable from the viewpoint that whole genome information has been clarified and genetic engineering and genome engineering techniques have been established, and that it has the ability to secrete and produce proteins outside the cells.

本発明の枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられ、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子等が含まれる。
（１）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン***DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる枯草菌PrsAタンパク質と同等の活性又は機能を有するタンパク質をいう。 The Bacillus subtilis prsA gene of the present invention refers to a gene having a base sequence represented by base numbers 811 to 1689 of SEQ ID NO: 1. Examples of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene include any of the following genes (1) to (4), and a gene having substantially the same function as the Bacillus subtilis prsA gene, for example, Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis) ), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacillus cereus (Bacillus cereus), Bacillus thuringiensis Jen cis (Bacillus thuringiensis), or in O-Sha Roh Bacillus Iheenshisu (Oceanobacillus iheyensis), etc., each prsA gene or the like which is identified mainly by genome analysis included.
(1) A nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 811 to 1689 of SEQ ID NO: 1, and a Bacillus subtilis PrsA protein A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
(2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 811 to 1689 of SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein A gene consisting of DNA that encodes. Here, examples of the “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. Examples include conditions of constant temperature for 8 to 16 hours for hybridization.
(3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and functionally equivalent to Bacillus subtilis PrsA protein A gene consisting of DNA encoding.
(4) From an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and encoding a protein functionally equivalent to Bacillus subtilis PrsA protein The gene that becomes. Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
The protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein is a protein having the same activity or function as the Bacillus subtilis PrsA protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

本発明の微生物においてprsA遺伝子の上流に導入される枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示された遺伝子spoVGを制御する領域が挙げられる。より具体的には、配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、配列番号９の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。 As a transcription initiation regulatory region of the spoVG gene of Bacillus subtilis introduced upstream of the prsA gene in the microorganism of the present invention, JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) published on the Internet (http: //bacillus.genome .ad.jp /, updated on March 10, 2004), a region that controls the gene spoVG disclosed as gene number BG101126 can be mentioned. More specifically, a DNA comprising the base sequence represented by base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9 or a DNA comprising a base sequence homologous to the sequence and having a function as a transcription initiation control region of Bacillus subtilis spoVG gene Can be mentioned. The transcription initiation control region and the ribosome binding site of the spoVG gene of Bacillus subtilis are DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 9, or a base sequence homologous to the sequence, and Bacillus subtilis spoVG. Examples thereof include DNA having functions as a transcription initiation control region of a gene and a ribosome binding site.

配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列や塩基番号38〜230で示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号９の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。 Examples of the base sequence represented by base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9 and the base sequence homologous to the base sequence represented by base numbers 38 to 230 include (A) base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9 or base numbers A base sequence comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by 38 to 230, (B) base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9 or base numbers 38 to Examples thereof include a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence shown by 230.
Here, examples of the “stringent conditions” include the same conditions as described above.

また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するとは、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に導入した際に、prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の発現が強化され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に導入した時と同等に向上するものをいう。 Furthermore, transcriptional initiation regulatory region of the spoVG gene of B. subtilis or a has a function as a ribosome binding site and a transcription initiation control region, when it is introduced upstream of the gene corresponding to prsA gene or the gene of Bacillus subtilis, The expression of the prsA gene or the gene corresponding to the gene is enhanced, the productivity of the target protein or polypeptide is improved, and the degree of improvement is the transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis or the transcription initiation control. It means that the region and the ribosome binding site are improved in the same manner as when the prsA gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene is introduced upstream.

本発明におけるspoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上の上流への導入には、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。 Transcriptional initiation regulatory region of the spoVG gene in the present invention, or the introduction into the upstream of the genome of the corresponding genes in prsA gene or the gene of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site, the prsA gene or the gene of Bacillus subtilis In addition to the original transcription initiation control region of the corresponding gene, or those that replace part or all of the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the original transcription initiation control region or the transcription initiation control region and the ribosome binding site remain. Includes what you insert as is.

当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位がspoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のprsA遺伝子上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol.Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5’側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3’側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。 Substitution of the transcription initiation control region of the spoVG gene or a transcription initiation control region and a ribosome binding site can be performed using, for example, a known method by homologous recombination. That is, first, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene and a drug resistance gene fragment upstream of the transcription initiation control region or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, , Downstream of the prsA gene translation initiation control region and part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene , 77, 61, 1989). In this way, the original DNA fragment containing the upstream region of the transcription initiation regulatory region, a drug resistance gene fragment, a DNA fragment containing the transcription initiation regulatory region of the spoVG gene, or a transcriptional initiation regulatory region and the ribosome binding site of prsA gene, A DNA fragment is obtained in which the translation initiation control region of the prsA gene and a part or all of the structural gene region, or the DNA fragment containing a part or all of the structural gene region of the prsA gene are joined in this order. Next, by incorporating such a DNA fragment into the parent microbial cell by a known method, the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene of the parent microbial genome, and the translation initiation control region and structural gene of the prsA gene Double crossover homologous recombination occurs in two places of the region including part or all of the region or part or all of the structural gene region of the prsA gene. As a result, the original transcription initiation control region, or the transformant in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are replaced with the transcription initiation control region of the spoVG gene, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, Can be separated as an index. Thereby, the transcription initiation control region introduced upstream of the prsA gene on the genome, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are genetically stably maintained. Specifically, known methods for introducing a DNA fragment for introduction into a host microorganism include competent cell transformation methods (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), protoplast transformation methods (Mol. Gen. Genet 168, 111 (1979)) or electroporation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)), etc., and competent cell transformation methods are particularly preferred. Further, in the present specification, upstream and downstream of a gene is not a position from the replication start point, and upstream indicates a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target, while downstream is The region following the 3 'side of the gene or region captured as the target is shown.
In particular, when Bacillus subtilis is used as the host of the microorganism of the present invention, the transcription initiation control region of the spoVG gene, or the transcription initiation control region and the ribosome from the transcription initiation control region of the prsA gene, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site. Substitution by homologous recombination to the binding site can be performed using the method described in Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, or the like.

また、spoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域とspoVG遺伝子の転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。 In addition, insert the transcription initiation control region or the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site appropriately into the transcription initiation control region or the DNA fragment sequence to be added to both ends of the transcription initiation control region and the ribosome binding site. If selected, it can be carried out by a method similar to the above-described replacement method. For example, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region and a drug resistance gene fragment are linked upstream of the transcription initiation control region, and a DNA containing a part or all of the original transcription initiation control region downstream. Combine the fragments. In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region, a drug resistance gene fragment, a transcription start control region of the spoVG gene, and a DNA fragment containing a part or all of the original transcription start control region are combined in this order. DNA fragment is obtained. Next, after inserting such a DNA fragment into a host microorganism, a transformant can be isolated using a drug resistance gene as an index. On the genome of the transformant thus isolated, the original transcription start control region and the transcription start control region of the spoVG gene are stably maintained in a state where they are adjacent to each other with no gap .

本発明において枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。 In the present invention, the transcription initiation control region of the Bacillus subtilis spoVG gene or the upstream of the transcription initiation control region and the genome into which the ribosome binding site is introduced is not particularly limited as long as it is upstream of the start codon of the prsA gene, but adjacent to it. A region within 2000 base pairs is preferred, a region within 500 base pairs is more preferred, a region within 100 base pairs is more preferred, and a region within 50 base pairs is particularly preferred.

本発明におけるspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の導入は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得たspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、prsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結して得た遺伝子断片を用いて行うことができる。かかる断片は、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。
導入するprsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列は、prsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列である限り、その微生物が本来有するprsA遺伝子、及びspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列と一致しないものであってもよい。核酸断片の宿主への導入方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり１コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合にも、生産培養中のプラスミド脱落の影響を受け難い。 Introducing the transcription initiation control region of the spoVG gene in the present invention, or the gene fragment in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene is a known method such as PCR using the genome of Bacillus subtilis or other microorganisms as a template. Based on the transcription initiation control region of the spoVG gene obtained by the cloning method of the above , or the transcription initiation control region and ribosome binding site fragment, prsA gene fragment, restriction enzyme method or SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) and the like can be performed using a gene fragment obtained by ligation by a known method. Such a fragment can be introduced onto the chromosome by homologous recombination between the nucleic acid fragment introduced into the cell and a chromosome by a known transformation method.
PrsA gene to be introduced, and a transcription initiation regulatory region of the spoVG gene, or transcription initiation regulatory region and the nucleotide sequence of the ribosome binding site, prsA gene, and a transcription initiation regulatory region of the spoVG gene, or transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site unless the base is an array, prsA gene the microorganism inherent, and transcriptional initiation regulatory region of the spoVG gene, or may be one that does not match the transcriptional initiation regulatory region and the ribosome binding site of the nucleotide sequence. Examples of the method for introducing a nucleic acid fragment into a host include a competent cell transformation method, a protoplast transformation method, an electroporation method, and the like, and a competent cell transformation method is particularly preferable.
Such a fragment can be introduced into the cytoplasm by a vector such as a plasmid. As shown in the Examples below, such a fragment exhibits a sufficient effect on the production of the target protein or polypeptide by introducing one copy per cell, so that even when introduced by a plasmid, the production culture Less susceptible to plasmid loss.

なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いたspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による宿主のゲノム上への導入方法について説明するが、本発明に於ける導入方法は下記に限定されるものではない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（２））の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に（５）断片の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加された断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加された断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。
ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。 The chromosomal region to be introduced in the host is preferably a non-essential gene or a non-essential gene non-gene region upstream, for example, aprE gene, sacB gene, nprE gene, amyE gene, ybxG gene internal, or while the interior of the non-gene region of the gene upstream and the like, inside the amyE gene, or the interior of the non-gene region of ybxG gene upstream preferred. Here, a non-essential gene means a gene that allows a host to survive at least under certain conditions even if it is destroyed. In addition, no problem arises even when a part or all of a non-essential gene upstream or a non-gene region upstream of a non-essential gene is involved in introduction.
More specifically, the transcription initiation control region of the spoVG gene using a DNA fragment prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), or the transcription initiation control region and ribosome binding A method for introducing a gene fragment having a site linked upstream of the prsA gene into a host genome by double crossing will be described. However, the method for introducing the present invention is not limited to the following.
The DNA fragment for introduction used in the present method is about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (1)) adjacent to the upstream of the introduction site on the genome of the host, and about 0.1 adjacent to the downstream. Between 3 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (2)), a transcription initiation control region of the spoVG gene, or a fragment comprising a transcription initiation control region and a ribosome binding site (hereinafter referred to as fragment (3) ), PrsA gene fragment (hereinafter referred to as fragment (4)), and drug resistance marker gene fragment (hereinafter referred to as fragment (5)) such as chloramphenicol resistance gene. First, five fragments of fragment (1) to fragment (5) are prepared by the first PCR. At this time, for example, the upstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the downstream end of fragment (1), and the downstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the upstream end of fragment (4) Designed so that 10-30 base pair sequence upstream of fragment (5) is added to the downstream end of (4), and 10-30 base pair sequences downstream of fragment (2) are added upstream of fragment (2). Were used (FIG. 1).
Next, the second PCR is carried out using the five types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of fragment (1) and the downstream primer of fragment (2). This causes annealing with the fragment (3) in the sequence of the fragment (3) added to the downstream end of the fragment (1), and similarly, the fragment (3) added to the upstream end of the fragment (4). ) In the sequence of the fragment (3), an anneal with the fragment (5) in the sequence of the fragment (5) added to the downstream end of the fragment (4), and the fragment (2). In the sequence of fragment (5) added upstream of fragment (5), annealing with fragment (5) occurs, and as a result of PCR amplification, five fragments from fragment (1) to fragment (5) are (1) (3) (4) DNA fragments bound in the order of (5) and (2) can be obtained (FIG. 1).
The PCR reaction performed here uses the primer set shown in Table 1 and a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo), etc. (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite). , Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) and the like.
When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent method or the like, genetic recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the introduction site on the same genome, and spoVG A cell into which a transcription initiation control region of a gene or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene is introduced can be isolated by selection with a drug resistance marker. Selection with a drug resistance marker is, for example, selecting a colony that grows on an agar medium containing chloramphenicol and then confirming its introduction into the genome by PCR using the genome as a template. It may be performed by. The drug resistance marker gene is not particularly limited as long as it can be used for selection using commonly used antibiotics. In addition to the chloramphenicol resistance gene, the erythromycin resistance gene, neomycin resistance And drug resistance marker genes such as genes, spectinomycin resistance genes, tetracycline resistance genes and blasticidin S resistance genes.

本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。   The microorganism of the present invention can be produced by introducing a gene encoding a target protein or polypeptide into the microorganism thus prepared. Here, the “target protein or polypeptide” refers to a protein or polypeptide whose production or purification is one of the purposes. In addition, in the “microorganism having a gene encoding the target protein or polypeptide”, the gene includes not only a gene originally possessed by the microorganism but also a gene that the microorganism originally does not have, that is, a foreign gene. is there.

目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来、より好ましくはBacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。Bacillus sp. KSM-K38株由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４のアミノ酸番号1〜480のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号８のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。また、プロテアーゼとしては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。 The target protein or target polypeptide is not particularly limited, and includes, for example, various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medical treatments, and diagnostics, and bioactive peptides. Industrial enzymes are preferred. In addition, the functions of industrial enzymes are classified into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase / Synthetase). ) And the like, preferably hydrolyzing enzymes such as cellulase, α-amylase and protease. Examples of α-amylase include α-amylases derived from microorganisms, preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus , more preferably derived from Bacillus sp. KSM-K38. More specific examples of α-amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain include alkaline amylase derived from Bacillus genus bacteria consisting of amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 480 of SEQ ID NO: 4, and 70% An amylase having an amino acid sequence having an identity of preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more. Examples of cellulases include cellulases belonging to Family 5 in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309, 1991). Among them, cellulases derived from microorganisms, particularly Bacillus bacteria are mentioned. Examples include alkaline cellulases derived from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and Bacillus sp. KSM-64 strain (FERM BP-2886), and more preferred examples. As an alkaline cellulase derived from a Bacillus bacterium comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 795 of SEQ ID NO: 6, or an alkaline cellulase derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus comprising an amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 793 of SEQ ID NO: 8, or A cellulase comprising an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more identity with an amino acid sequence can be mentioned. Examples of proteases include serine proteases and metalloproteases derived from microorganisms, in particular from Bacillus bacteria.

本発明の微生物に導入されるべき目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。 The target protein or target polypeptide gene to be introduced into the microorganism of the present invention is upstream of the control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, the transcription initiation control region including the promoter and transcription start site, ribosome It is desirable that at least one region selected from a translation initiation control region including a binding site and an initiation codon and a secretory signal peptide region be bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a Bacillus bacterium, and the transcription initiation control region In addition, it is desirable that the translation initiation control region in the 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene is appropriately bound to the target protein or polypeptide gene. For example, the bacterium belonging to the genus Bacillus described in JP 2000-210081, JP 4-190793, etc., that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP-2886) It is desirable that the cellulase gene and the transcription initiation control region, translation initiation control region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene are appropriately combined with the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, or 70 relative to the base sequence % Or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more. It is desirable that a DNA fragment consisting of a base sequence in which a portion is deleted, substituted or added is appropriately bound to the structural gene of the target protein or polypeptide. Here, a DNA fragment consisting of a base sequence in which a part of the base sequence is deleted, substituted or added is a part of the base sequence deleted, substituted or added, but the gene transcription, This means a DNA fragment that retains functions related to translation and secretion.

このような目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。   Such a gene encoding a target protein or polypeptide can be introduced by, for example, (1) introduction by a vector and (2) insertion into a genome. (1) When introduced by a vector, upstream of it, “a transcription initiation, including a control region related to transcription, translation and secretion of the gene, ie, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site and an initiation codon” Competent cell transformation method, protoplast transformation method, vector containing gene encoding target protein or target polypeptide to which one or more regions selected from control region and secretory signal peptide region are appropriately linked Alternatively, it may be introduced by an appropriate transformation method such as electroporation. Here, the vector is not particularly limited as long as it is an appropriate carrier nucleic acid molecule for introducing a target gene into a host, allowing it to proliferate and express, and not only a plasmid but also an artificial such as YAC or BAC. Examples include vectors using chromosome and transposon, and cosmids. Examples of plasmids include pUB110 and pHY300PLK.

また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。   In addition, (2) for insertion into the genome, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a DNA fragment in which a part of a chromosomal region that causes introduction into a gene encoding a target protein or polypeptide is combined is taken into a microbial cell, and homologous recombination occurs in a part of the chromosomal region. Can be integrated into the genome. Here, the chromosomal region causing the introduction is not particularly limited, but a non-essential gene region or a non-gene region upstream of the non-essential gene region is preferable.

かくして作製された微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。かかる効果は、細胞外へ輸送されたタンパク質の折りたたみ効率が向上したことにもとづくと推測される。   The microorganism thus prepared has high productivity of the target protein or target polypeptide. This effect is presumed to be based on the improved folding efficiency of the protein transported out of the cell.

本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。   For production of the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention, the strain is inoculated into a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components, and cultured by an ordinary microorganism culture method. Then, after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified.

以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。   For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.

また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。   Further, in the following examples, upstream and downstream of a gene are not positions from the replication start point, but upstream is a region continuing on the 5 ′ side of the start codon of the gene that is regarded as a target in each operation / step. On the other hand, “downstream” indicates a region continuing 3 ′ of the stop codon of the gene taken as a target in each operation / step.

また、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。   Further, Bacillus subtilis was transformed as follows. That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared. Next, 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) is added to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), and after shaking culture at 37 ° C. for 1 hour, an appropriate drug is obtained. LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing the whole amount was smeared. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.

培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。   Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used for measuring the amylase activity in the culture supernatant. In other words, 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1% NaCl-1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries) was added to 100 μL of R1 and R2 mixture (R1 (coupling enzyme): R2 (amylase substrate) ) = 5: 1 (Vol.)) Was added and mixed, and the amount of p-nitrophenol released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance (OD405 nm) at 405 nm. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.

実施例１ prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した1.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した1.8kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた3.8kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とprsA/Cm-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.1kb及び2.7kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Kc株と命名した。 Example 1 Construction of a prsA gene expression-enhanced strain A mutant strain with enhanced prsA gene expression was constructed as follows (see FIG. 2). Using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, transcription initiation control of the spoVG gene using the PVG-FW and PVG-R, and prsA / PVG-F and prsA / Cm-R primer sets shown in Table 1 A 0.2 kb fragment (A) containing the region and the ribosome binding site and a 0.9 kb fragment (B) containing the prsA gene were amplified by PCR. A 0.9 kb fragment containing the chloramphenicol (Cm) resistance gene using the plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) as a template and the catf and catr primer sets shown in Table 1 (C) was amplified by PCR. Next, the 3 fragments obtained by mixing the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments as a template and performing SOE-PCR using the PVG-FW2 and catr2 primer sets shown in Table 1 were obtained. (a) (B) bonded to as made in the order of (C), the start codon of prsA gene at the position of initiation codon of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene is linked upstream of prsA gene (spoVG gene And a 1.8 kb DNA fragment (D) with a Cm resistance gene bound downstream thereof was obtained. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, using the amyEfw2 and amyE / PVG2-R and amyE / Cm2-F and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 5 'region of the amyE gene was identified. The 1.0 kb fragment containing (E) and the 1.0 kb fragment containing the 3 ′ region of the amyE gene (F) were amplified by PCR. Next, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain the 3 fragments (E ) (D) (F), 1.8 kb in which the transcription initiation control region of the spoVG gene and the prsA gene are linked downstream of the ribosome binding site, and the chloramphenicol resistance gene is further linked downstream A DNA fragment (G) having a total base length of 3.8 kb in which the DNA fragment was inserted in the center of the amyE gene was obtained. The resulting 3.8 kb DNA fragment (G) was used to transform Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method, and colonies grown on LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) were transformed. Separated as a body. By using the genomic DNA extracted from the resulting transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of amyEfw2 and prsA / Cm-R and prsA / PVG-F and amyErv2 shown in Table 1 to achieve 2.1 kb and 2.7 to confirm amplification of the kb of DNA fragments, DNA fragments prsA gene are linked downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome was confirmed to be inserted . The strain thus obtained was named prsA-Kc strain.

実施例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−１
実施例１にて得られたprsA-Kc株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｉ）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。 Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-1
Evaluation of heterologous protein productivity of the prsA-Kc strain obtained in Example 1 was carried out as follows using the productivity of alkaline amylase derived from Bacillus bacteria consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as an index.
Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, using the primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 1 PCR is performed to amplify a 1.5 kb DNA fragment (H) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 encoding alkaline amylase (JP 2000-184882, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) did. Using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, the S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 1 were used. PCR was performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment (I) containing a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a region encoding a secretory signal sequence of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081). Next, the obtained 2 fragments of (H) (I) are mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 1 is performed. As a result, a 2.1 kb DNA fragment (J) in which the alkaline amylase gene was ligated downstream of the transcription initiation regulatory region, translation initiation regulatory region, and secretory signal sequence encoding the alkaline cellulase gene was obtained. The obtained 2.2 kb DNA fragment (J) was inserted into the Bam HI- Xba I restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).

実施例１にて得られたprsA-Kc株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表２に示した様に、宿主としてprsA-Kc株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して非常に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはprsA-Kc株にてprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。 A plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating alkaline amylase productivity was introduced into the prsA-Kc strain obtained in Example 1 and Bacillus subtilis 168 strain as a control by the protoplast transformation method. The resulting strain was shaken and cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture solution was added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% Maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 2, when the prsA-Kc strain was used as the host, an extremely high production of alkaline amylase was observed as compared with the control 168 strain (wild type). It was speculated that this was because the prsA-Kc strain had higher prsA gene expression than the wild strain and the amount of PrsA protein on the cell membrane increased, resulting in improved protein secretion efficiency.

実施例３ prsA遺伝子発現強化株の構築−２
実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位及びybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の２箇所にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-KcII株を作成した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表１に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したybdOfwとybdO/PVGr、及びybxG/Em2fとybxGrvのプライマーセットを用いてybdO遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びybxG遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したybdOfw2とybxGrv2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がybxG遺伝子上流の非遺伝子領域内部に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.4kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すybdOfwとprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとybxGrvのプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.1kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。以上の様にしてprsA-KcII株を構築した。 Example 3 Construction of prsA gene expression enhanced strain-2
At a manner similar to that of Example 1, prsA gene downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene in two places of the non-gene region of the amyE gene site and ybxG gene upstream of the Bacillus subtilis 168 strain genome A prsA-KcII strain into which a DNA fragment ligated was inserted was prepared. That is, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, transcription of the spoVG gene using the PVG-FW and PVG-R and prsA / PVG-F and prsA / Em2-R primer sets shown in Table 1 A 0.2 kb fragment (A) containing the initiation regulatory region and ribosome binding site and a 0.9 kb fragment (B) containing the prsA gene were amplified by PCR. A 1.3 kb fragment (C) containing the erythromycin (Em) resistance gene was amplified by PCR using plasmid pMUTIN4 (Microbiology. 144, 3097 (1998)) as a template and using the primer set of emf2 and emr2 shown in Table 1. . Next, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the PVG-FW2 and emr2 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain 3 fragments. (a) (B) bonded to as made in the order of (C), the start codon of prsA gene at the position of initiation codon of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene is linked upstream of prsA gene (spoVG gene And a 2.4 kb DNA fragment (D) with an Em resistance gene bound downstream thereof was obtained. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, a 1.0 kb fragment containing the 3 'region of the ybdO gene using the ybdOfw and ybdO / PVGr and ybxG / Em2f and ybxGrv primer sets shown in Table 1 A 1.0 kb fragment (F) containing (E) and the 5 ′ region of the ybxG gene was amplified by PCR. Subsequently, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to serve as a template, and SOE-PCR using the ybdOfw2 and ybxGrv2 primer sets shown in Table 1 was performed, whereby the 3 fragments were (E ) (D) (F), a 2.4 kb DNA fragment in which the transcription start control region of the spoVG gene and the prsA gene are linked downstream of the ribosome binding site and the Em resistance gene is further linked downstream Obtained a DNA fragment (G) having a total base length of 4.4 kb inserted in the non-gene region upstream of the ybxG gene. The obtained 4.4 kb DNA fragment (G) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method and grown on LB agar medium containing erythromycin (1 μg / mL) and lincomycin (25 μg / mL). Colonies were isolated as transformants. By using the genomic DNA extracted from the obtained transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of ybdOfw and prsA / Em2-R and prsA / PVG-F and ybxGrv shown in Table 1 to achieve 2.1 kb and 3.3 kb. to confirm amplification of the kb of DNA fragments, DNA fragments prsA gene are linked downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome was confirmed to be inserted . The prsA-KcII strain was constructed as described above.

実施例４ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−２
実施例１で作成したprsA-Kc株と実施例３で作成したprsA-KcII株及び、対照として枯草菌１６８株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価を実施例２と同様の方法で行った。その結果、表３に示すようにprsA-Kc株及びprsA-KcII株とも対象の枯草菌１６８株に比較して６倍近く生産性が向上したが、ゲノム上にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結した遺伝子を１つ含むprsA-Kc株に比べて、２つ含有するprsA-KcII株の生産性の向上率は小さかった。このことから、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に結合させた場合、１コピーの導入で十分な生産性の向上効果が得られたことが示唆された。 Example 4 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-2
Alkaline amylase secretion production evaluation of the prsA-Kc strain prepared in Example 1, the prsA-KcII strain prepared in Example 3 and the Bacillus subtilis 168 strain as a control was performed in the same manner as in Example 2. As a result, almost 6 times the productivity compared to the prsA-Kc strain and prsA-KcII strains with Bacillus subtilis 168 strain of interest as shown in Table 3 is improved, and the transcription initiation regulatory region of the spoVG gene on the genome The productivity improvement rate of the prsA-KcII strain containing two prsA-KcII strains was smaller than that of the prsA-Kc strain containing one gene linked to the prsA gene downstream of the ribosome binding site. From this, it was suggested that when the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site were linked upstream of the prsA gene, a sufficient productivity improvement effect was obtained by introducing one copy.

比較例１ ゲノム中prsA遺伝子上流へのPspac転写開始制御領域の導入
図３に示される模式図に基づいて、ゲノム中prsA遺伝子上流へPspac転写開始制御領域の導入を行った。
なお、Pspac転写開始制御領域は枯草菌において、誘導物質にて制御が可能なプロモータとして開発された。lacリプレッサー遺伝子を共存させると、リプレッサーによりPspacプロモーターの発現は抑制されるが、誘導物質であるIPTG（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を添加することによりリプレッサーが外れ、プロモーターが活性化することが知られているものである（Yansura, D. G. and D. J. Henner, Genetics and Biotechnology of Bacilli (1984) Development of an inducible promoter for controlled gene expression in Bacillus subtilis）。
すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したprsAUfHin及びprsAUrBamのプライマーセットを用いて、ゲノム中のprsA遺伝子の-30bp〜290bp領域（配列番号１の781〜1100）断片をPCRにより増幅した。尚、それぞれのプライマーの5’末端側には、HindIII及びBamHIの各制限酵素認識配列が付加されている。得られた断片をHindIII及びBamHI処理し、プラスミドｐMUTIN4（Microbiology, 144, 3097, (1998) ）のHindIII及びBamHI制限酵素切断点に挿入した。この結果得られた組換えプラスミドDNAを用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによって、図３に示す様な一重交差の相同組換えが起こったことによると考えられるゲノム中prsA遺伝子上流へのPspac転写開始制御領域の導入を確認した。構築された菌株はprsA-P株と命名した。 Based on the schematic diagram shown in introducing Figure 3 Pspac transcriptional initiation regulatory region of the Comparative Example 1 genome prsA gene upstream, installs a Pspac transcriptional initiation regulatory region into the genome prsA gene upstream.
The Pspac transcription initiation control region was developed as a promoter that can be controlled by an inducer in Bacillus subtilis. When the lac repressor gene is present, the expression of the Pspac promoter is suppressed by the repressor, but the repressor is removed and the promoter is activated by adding the inducer IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside). (Yansura, DG and DJ Henner, Genetics and Biotechnology of Bacilli (1984) Development of an inducible promoter for controlled gene expression in Bacillus subtilis ).
That is, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template and using the primer set of prsAUfHin and prsAUrBam shown in Table 1, the -30 bp to 290 bp region of the prsA gene in the genome (781 to 1100 of SEQ ID NO: 1) The fragment was amplified by PCR. Note that the 5 'end of each primer, each restriction enzyme recognition sequence of Hin dIII and Bam HI are added. The resulting fragment was treated Hin dIII and Bam HI, and plasmid pMUTIN4 (Microbiology, 144, 3097, (1998)) was inserted into the Hin dIII and Bam HI restriction enzyme cleavage point of. The resulting recombinant plasmid DNA was used to transform Bacillus subtilis 168 by competent method, and colonies grown on LB agar medium containing erythromycin (1 μg / mL) and lincomycin (25 μg / mL) Was isolated as a transformant. The genome of the obtained transformant is extracted, and the Pspac transcription initiation control region is introduced upstream of the prsA gene in the genome, which is thought to be caused by single-crossing homologous recombination as shown in FIG. confirmed. The constructed strain was named prsA-P strain.

比較例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−３
比較例１にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。尚、Pspac転写開始制御領域を誘導状態にする為、使用した2xL−マルトース培地にはIPTG（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）を終濃度が1mMとなる様に添加した。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Kc株についても評価を行った。表４に示した様に、ゲノム中prsA遺伝子上流へPspac転写開始制御領域を導入したprsA-P株におけるアミラーゼ生産性は野生株と同等であった。Pspac転写開始制御領域を利用してprsA遺伝子の発現を行う方法は、J. Biol. Chem., 279, 19302, (2004)等で用いられている方法であり、その有用性が報告されているが、本検討により、従来のprsA遺伝子発現方法と比べ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を利用したprsA遺伝子発現方法が、極めて優れていることが明らかとなった。 Comparative Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-3
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Comparative Example 1 was performed in the same manner as in Example 2. In order to bring the Pspac transcription initiation control region into an induced state, IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) was added to the used 2 × L-maltose medium to a final concentration of 1 mM. As controls, Bacillus subtilis 168 strain and prsA-Kc strain constructed in Example 1 were also evaluated. As shown in Table 4, the amylase productivity in the prsA-P strain in which the Pspac transcription initiation control region was introduced upstream of the prsA gene in the genome was equivalent to that in the wild strain. The method of expressing the prsA gene using the Pspac transcription initiation regulatory region is the method used in J. Biol. Chem., 279, 19302, (2004) etc., and its usefulness has been reported. However, this study revealed that the prsA gene expression method using the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site is extremely superior to the conventional prsA gene expression method.

比較例３ 転写開始制御領域の違いによるprsA遺伝子発現強化効果の検証
実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、Pspac転写開始制御領域の下流に本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-Kspac株を構築した。すなわち、プラスミドpMUTIN4を鋳型とし、表５に示したPspac-FとPspac-Rのプライマーセットを用いてPspac転写開始制御領域を含む0.2kb断片（Ａ）をPCRにより増幅し、また枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とamyE/Pspac-R2、及びprsA/Pspac-F とprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｂ）、及び本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。更に実施例１にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したcatfとamyErv2のプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｄ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）4断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、4断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、Pspac転写開始制御領域の下流に本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｅ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｅ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-Kspac株を構築した。
また枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、本来の転写開始制御領域及びリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が挿入されたprsA-Kori株を以下の様に構築した。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とamyE/prsAUP-R、及びprsAUP-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）、及び本来の転写開始制御領域及びリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む1.7kb断片（Ｇ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｆ）（Ｇ）及び上記（Ｄ）の3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｆ）（Ｇ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、本来の転写開始制御領域と本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子がその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｈ）を得た。得られた4.4kbDNA断片（Ｈ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-Kori株を構築した。
更に、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位に、spoVG 遺伝子転写開始制御領域の下流に本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたprsA-KVG株を構築した。すなわち、実施例１にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したamyEfw2とPVG2-Rのプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域が連結した1.2kb断片（Ｉ）をPCRにより増幅した。また枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１又は表５に示したprsA/PVG2-FとprsA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、本来のリボソーム結合部位を伴うprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｊ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｉ）（Ｊ）及び上記（Ｄ）の3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｉ）（Ｊ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子転写開始制御領域の下流に本来のリボゾーム結合部位を伴うprsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｋ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｋ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsA-KVG株を構築した。構築したprsA-Kspac株、prsA-Kori株、及びprsA-KVG株の3株は、導入したprsA遺伝子の転写に関わる転写開始制御領域に違いがある他は、導入した位置、リボソーム結合部位、及び薬剤耐性遺伝子について全く同一である。
構築した上記3株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表６に示すようにprsA-Kori株とprsA-KVG株において分泌生産の向上が認められたが、prsA遺伝子本来の転写開始制御領域を利用したprsA-Kori株に比べspoVG遺伝子転写開始制御領域を利用したprsA-KVG株における生産量は顕著に高く、分泌生産向上効果としては約3倍であった。尚。Pspac転写開始制御領域を利用したprsA-Kspac株において分泌生産向上は認められなかった。すなわち、prsA遺伝子の強化にはspoVG遺伝子転写開始制御領域の利用が極めて有効であることが明らかとなった。 Comparative Example 3 Verification of the effect of enhancing prsA gene expression by the difference in transcription initiation control region In the same manner as in Example 1, the amyE gene site on the genome of Bacillus subtilis 168 was originally located downstream of the Pspac transcription initiation control region. A prsA-Kspac strain into which a DNA fragment linked with the prsA gene with a ribosome binding site was inserted was constructed. That is, a plasmid pMUTIN4 was used as a template, a 0.2 kb fragment (A) containing the Pspac transcription initiation control region was amplified by PCR using the Pspac-F and Pspac-R primer sets shown in Table 5, and 168 strains of Bacillus subtilis. 5 'side of the amyE gene using the amyEfw2 and amyE / Pspac-R2 and prsA / Pspac-F and prsA / Cm-R primer sets shown in Table 1 or 5 as a template. A 1.0 kb fragment (B) containing the region and a 0.9 kb fragment (C) containing the prsA gene with the original ribosome binding site were amplified by PCR. Furthermore, using the genomic DNA extracted from the prsA-Kc strain constructed in Example 1 as a template, using the catf and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 3 ′ side of the amyE gene downstream of the chloramphenicol resistance gene A 1.9 kb fragment (D) to which the regions were ligated was amplified by PCR. Next, the 4 fragments obtained by mixing the obtained (A), (B), (C), and (D) 4 fragments as a template and performing SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 were obtained. Are bound in the order of (B), (A), (C), and (D), and the prsA gene with the original ribosome-binding site is linked downstream of the Pspac transcription initiation regulatory region, and further downstream is chloramphenicol. A DNA fragment (E) having a total base length of 3.8 kb in which the gene fragment to which the resistance gene was bound was inserted in the center of the amyE gene was obtained. The obtained 3.8 kb DNA fragment (E) was used to transform Bacillus subtilis 168 strain to construct prsA-Kspac strain.
Also amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome, the prsA-Kori strain prsA gene inserted with the original transcription initiation regulatory region and ribosome binding site was constructed as follows. That is, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template and using the amyEfw2 and amyE / prsAUP-R and prsAUP-F and prsA / Cm-R primer sets shown in Table 1 or Table 5, the amyE gene A 1.0 kb fragment (F) containing the 5′-side region and a 1.7 kb fragment (G) containing the original transcription initiation regulatory region and the prsA gene with a ribosome binding site were amplified by PCR. Next, the 3 fragments of (F) (G) and (D) obtained above were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed. (F), (G) and (D) are combined in order, and the prsA gene with the original transcription initiation control region and the original ribosome binding site is linked downstream of the chloramphenicol resistance gene. A DNA fragment (H) having a total base length of 4.4 kb inserted in the center of the amyE gene was obtained. The obtained 4.4 kb DNA fragment (H) was used to transform Bacillus subtilis 168 strain to construct prsA-Kori strain.
Furthermore, a prsA-KVG strain was constructed in which a DNA fragment in which the prsA gene with the original ribosome binding site was linked downstream of the spoVG gene transcription initiation regulatory region was inserted into the amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 genome. That is, using the genomic DNA extracted from the prsA-Kc strain constructed in Example 1 as a template and using the amyEfw2 and PVG2-R primer sets shown in Table 1 or Table 5, the 5 ′ region of the amyE gene A 1.2 kb fragment (I) with a spoVG gene transcription initiation control region linked downstream was amplified by PCR. In addition, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, and using the prsA / PVG2-F and prsA / Cm-R primer sets shown in Table 1 or Table 5, the prsA gene with the original ribosome binding site The containing 0.9 kb fragment (J) was amplified by PCR. Next, the 3 fragments of (I) (J) and (D) obtained above were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain 3 fragments. Are combined in the order of (I), (J) and (D), and the prsA gene with the original ribosome binding site is linked downstream of the transcriptional initiation control region of the spoVG gene, and further downstream of the chloramphenicol resistance gene A DNA fragment (K) having a total base length of 3.8 kb was obtained in which the gene fragment to which was attached was inserted in the center of the amyE gene. The obtained 3.8 kb DNA fragment (K) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain to construct prsA-KVG strain. The constructed prsA-Kspac strain, prsA-Kori strain, and prsA-KVG strain are different in the transcription initiation control region involved in the transcription of the introduced prsA gene, the introduced position, the ribosome binding site, and It is exactly the same for drug resistance genes.
About the constructed 3 strains, alkaline amylase secretion production was evaluated in the same manner as in Example 2. As a control, 168 strains of Bacillus subtilis were also evaluated. As a result, improvement of secretion productivity was observed in prsA-Kori strain and prsA-KVG strain as shown in Table 6, starting spoVG gene transcription compared to prsA-Kori strain using prsA gene inherent transcription initiation regulatory region The production amount of the prsA-KVG strain using the control region was remarkably high, and the effect of improving secretory production was about 3 times. still. Secretory production was not improved in the prsA-Kspac strain using the Pspac transcription initiation regulatory region. That is, the enhancement of prsA gene was revealed that use of spoVG gene transcription initiation regulatory region is extremely effective.

実施例５ バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化株の構築
バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号４８）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例１の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表５に示したBce/PVG-FとBce/catf-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したamyEfw2とPVG-R、及びcatfとamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片（Ｂ）、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｄ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。その結果、表７に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。 EXAMPLE 5 Bacillus cereus (Bacillus cereus) Construction B. cereus (Bacillus cereus) from prsA gene expression-enhanced strain from the prsA gene (SEQ ID NO: 48) is a gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene. In the same manner as in Example 1, a mutant strain with enhanced expression of the Bacillus cereus- derived prsA gene was constructed. That is, it contains the prsA gene derived from Bacillus cereus using the Bce / PVG-F and Bce / catf-R primer sets shown in Table 5 using the genomic DNA extracted from Bacillus cereus as a template. A 0.9 kb fragment (A) was amplified by PCR. In addition, using the genomic DNA extracted from the prsA-Kc strain constructed in the above comparative example as a template, and using the amyEfw2 and PVG-R and catf and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 5 'region of the amyE gene A 1.2 kb fragment (B) in which the spoVG gene transcription initiation regulatory region and the region containing the ribosome binding site are linked downstream of the 1.9 kb fragment (3) of the amyE gene linked to the downstream of the chloramphenicol resistance gene ( C) was amplified by PCR. Subsequently, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed. ) (a) (binding was as made in the order of C), Bacillus cereus (Bacillus cereus downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene) derived prsA gene is linked further chloramphenicol downstream thereof A DNA fragment (D) having a total base length of 3.8 kb was obtained in which the gene fragment to which the resistance gene was bound was inserted in the center of the amyE gene. The resulting 3.8 kb DNA fragment (D) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain to construct prsAbc-K strain.
The constructed prsAbc-K strain was evaluated for alkaline amylase secretion production in the same manner as in Example 2. As a control, 168 strains of Bacillus subtilis were also evaluated. As a result, as shown in Table 7, the prsAbc-K strain showed secretion production significantly exceeding 168 strains. That is, the use of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene, it was confirmed that the effectiveness of the same in the case of using the Bacillus subtilis prsA gene is obtained.

spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。 An example of SOE-PCR preparation of a DNA fragment for gene introduction in which the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding region are linked, and a method for introducing the gene into the chromosome using the DNA fragment are schematically shown. FIG. spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。 An example of SOE-PCR preparation of a DNA fragment for gene introduction in which the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding region are linked, and a method for introducing the gene into the chromosome using the DNA fragment are schematically shown. FIG. 一重交差の相同組換えにより、lacリプレッサー遺伝子とPspac転写開始制御領域をprsA遺伝子上流の染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。It is the figure which showed typically an example of the method of introduce | transducing a lac repressor gene and a Pspac transcription start control region into the chromosome upstream of a prsA gene by single crossover homologous recombination.

Claims (9)

枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片をゲノム上に導入してなる微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、且つ当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した組換え微生物であって、分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、前記組換え微生物。 The transcription initiation control region of the Bacillus subtilis spoVG gene or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are introduced upstream of the Bacillus subtilis prsA gene or the gene corresponding to the gene, or the spoVG gene of Bacillus subtilis The target protein or polypeptide is introduced into a microorganism obtained by introducing a transcription initiation control region or a transcription initiation control region and a ribosome binding site upstream of the Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene into the genome. A recombinant microorganism in which a coding gene is introduced , and three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are linked upstream of the gene encoding the target protein or polypeptide, Secretion signal region is derived from the cellulase gene of Bacillus bacteria, and transcription initiation control Frequency and translational initiation regulatory region is derived from upstream 0.6~1kb region of the cellulase gene, the recombinant microorganism. 枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を、微生物のゲノム上に導入してなるものである請求項１記載の組換え微生物。   The transcription initiation control region of the Bacillus subtilis spoVG gene or the transcription initiation control region and the ribosome binding site introduced into the genome of a microorganism by linking the Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene upstream. The recombinant microorganism according to claim 1, wherein 枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域が、配列番号９の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、若しくは当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAであり、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、配列番号９の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、若しくは当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAである請求項１又は２記載の組換え微生物。   As a transcription initiation control region of Bacillus subtilis spoVG gene, the transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis is composed of DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9 or a base sequence homologous to the sequence. A DNA comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 9, or a nucleotide sequence homologous to the DNA sequence, wherein the transcription initiation control region and ribosome binding site of the spoVG gene of Bacillus subtilis The recombinant microorganism according to claim 1 or 2, which is a DNA comprising a transcription initiation control region of Bacillus subtilis spoVG gene and a function as a ribosome binding site. 枯草菌のprsA遺伝子が、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
（１）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（２）配列番号１の塩基番号811〜1689で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子 The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the prsA gene of Bacillus subtilis is the gene according to any one of the following (1) to (4).
(1) A gene comprising a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 811 to 1689 of SEQ ID NO: 1 and encoding a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein (2) A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 811 to 1689 of SEQ ID NO: 1 and encodes a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein (3) a gene consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and consisting of a DNA encoding a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein (4) SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence shown in one or several amino acids is deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and Bacillus subtilis PrsA protein Gene consisting of a DNA encoding a functionally equivalent protein 微生物がバチルス属細菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え微生物。   The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 4, wherein the microorganism is a Bacillus bacterium. 微生物が枯草菌である請求項５記載の組換え微生物。   The recombinant microorganism according to claim 5, wherein the microorganism is Bacillus subtilis. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜696の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと90％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項１〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。 Three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region and a secretion signal region are derived from the base sequence of base numbers 1 to 659 of the cellulase gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 7. recombinant according to any one of claims 1 to 6 which is a DNA fragment comprising a nucleotide sequence having any 90% identity or more nucleotide sequences or the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 696 of cellulase gene of Microorganisms. 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が以下の（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAからなる遺伝子である請求項１〜７のいずれか1項記載の組換え微生物。
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするDNA
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有し、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 7 , wherein the gene encoding the target protein or polypeptide is a gene comprising the DNA according to any one of (1) to (3) below.
(1) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
(2) DNA encoding a protein having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having amylase activity
(3) DNA encoding a protein in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 have been deleted, substituted or added and have amylase activity 請求項１〜８のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。 A method for producing a protein or polypeptide using the recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 8 .
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