JP2009038985A - Microorganism and method for producing protein or polypeptide by using the same - Google Patents

Microorganism and method for producing protein or polypeptide by using the same Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To improve material productivity in a mutated microorganism having one or more multiply-deleted or inactivated proteases or a wild-type microorganism. <P>SOLUTION: The microorganism is obtained by deleting or inactivating htrA gene and/or htrB gene of Bacillus subtilis, or a gene corresponding to the gene. The gene corresponding to the gene signifies genes that include genes recognized to be functionally concordant with the htrA gene and/or the htrB gene of the Bacillus subtilis and originated from a microorganism except the Bacillus subtilis. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、プロテアーゼをコードする特定の遺伝子を欠失又は不活性化した微生物、当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。   The present invention relates to a microorganism in which a specific gene encoding a protease is deleted or inactivated, and a method for producing a protein or polypeptide using the microorganism.

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。   The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, medicines, daily necessaries such as detergents and cosmetics to various chemical raw materials.

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。   In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues, and breeding of produced bacteria by genetic techniques such as mutation has been performed as a technique. In recent years, the development of microbial genetics and biotechnology has led to more efficient breeding of production microorganisms using genetic recombination techniques, and the development of host microorganisms for genetic recombination has been promoted. It has been. For example, a strain obtained by further improving a microorganism strain recognized as safe and excellent as a host microorganism, such as Bacillus subtilis Marburg No.168 strain, has been developed.

しかしながら、微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質等の工業的生産においては、必ずしも効率的であるとは言えない状況であった。特に、微生物はタンパク質を分解して窒素及び炭素源として利用するために多種のタンパク質分解酵素を持っており、これらが目的のタンパク質等を分解し、外来タンパク質等の生産において大きな障害になっていた。   However, microorganisms originally have a wide variety of genes for coping with environmental changes in nature, and are necessarily efficient in industrial production of proteins and the like that use a limited production medium. It was a situation that could not be said. In particular, microorganisms have a variety of proteolytic enzymes to decompose proteins and use them as nitrogen and carbon sources, which decomposed the target proteins and became a major obstacle in the production of foreign proteins. .

こうしたタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼなど）の遺伝子を欠損させることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みは古くから行われており、特に枯草菌においては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE、或いは中性プロテアーゼであるNprEをコードする遺伝子、或いはそれら両遺伝子の欠損（非特許文献１、２及び３参照）を初めとして、計８種類（aprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子）の細胞外や細胞壁結合型のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子について遺伝子欠損微生物、更にはこれら８種類のプロテアーゼ、ペプチダーゼの遺伝子が全て欠損した枯草菌株の報告例も知られていた(非特許文献４参照）。また、特許文献１には、これら８種類のプロテアーゼ遺伝子の他にaprX遺伝子を更に欠失又は不活性化した微生物が開示され、当該微生物により有用酵素やタンパク質の分泌生産性が向上するといった技術が開示されていた。   Attempts to prevent degradation of the target protein produced by deleting the gene for such proteolytic enzymes (protease, peptidase, etc.) have been made for a long time, and in Bacillus subtilis, it is a major extracellular alkaline protease. A total of 8 types (aprE gene, nprB gene, nprE gene, bpr gene), including the gene encoding AprE or the neutral protease NprE, or the deficiency of both genes (see Non-Patent Documents 1, 2 and 3) , Vpr gene, mpr gene, epr gene, wprA gene and aprX gene) extracellular and cell wall-bound proteases, peptidase genes, gene-deficient microorganisms, and hay that lacks all of these eight protease and peptidase genes Reported examples of strains were also known (see Non-Patent Document 4). Patent Document 1 discloses a microorganism in which the aprX gene is further deleted or inactivated in addition to these eight types of protease genes, and a technique for improving the secretion productivity of useful enzymes and proteins by the microorganism. It was disclosed.

特開２００６−１７４７０７号公報JP 2006-174707 A J. Bacteriol., 158, 411, (1984)J. Bacteriol., 158, 411, (1984) J. Bacteriol., 160, 15, (1984)J. Bacteriol., 160, 15, (1984) J. Bacteriol., 160, 442, (1984)J. Bacteriol., 160, 442, (1984) Appl. Environ. Microbiol., 68, 3261, (2002)Appl. Environ. Microbiol., 68, 3261, (2002) Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)

しかしながら、複数のプロテアーゼ遺伝子を多重に欠失又は不活性させた変異微生物であっても、未だ十分な分泌生産性を達成できたとは言えず、また、当該変異微生物を用いても生産対象のタンパク質又ポリペプチドの種類によっては分泌生産性が向上したとは言えない状況であった。   However, even a mutant microorganism in which a plurality of protease genes have been deleted or inactivated in a multiple manner, it cannot be said that sufficient secretion productivity has been achieved. Moreover, it could not be said that the secretion productivity was improved depending on the type of polypeptide.

そこで、本発明者らは、上述したような実情に鑑み、１又は複数のプロテアーゼを多重に欠失又は不活性化した変異微生物若しくは野生型の微生物における物質生産性が向上した微生物及び当該微生物を用いた物質の生産方法を提供することを目的とする。   Therefore, in view of the above-described circumstances, the present inventors have identified a microorganism having improved substance productivity in a mutant microorganism or a wild-type microorganism in which one or a plurality of proteases have been deleted or inactivated, and the microorganism. It aims at providing the production method of the used substance.

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、枯草菌においてhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子を欠失又は不活性化したときに、タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, it has been found that the productivity of proteins or polypeptides is improved when the htrA gene and the htrB gene are deleted or inactivated in Bacillus subtilis. The present invention has been completed.

本発明に係る微生物は、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物である。ここで、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrA遺伝子と機能的に一致すると認められる、枯草菌以外の微生物由来の遺伝子を含む意味である。すなわち、本発明に係る微生物は、好ましくはバチルス属に属する微生物、特に枯草菌由来であることが望ましいが、これらに限定されるものではない。   The microorganism according to the present invention is a microorganism in which the htrA gene and htrB gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene is deleted or inactivated. Here, the gene corresponding to the said gene is meant to include genes derived from microorganisms other than Bacillus subtilis that are recognized to be functionally identical to the htrA gene and htrA gene of Bacillus subtilis. That is, the microorganism according to the present invention is preferably derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, particularly Bacillus subtilis, but is not limited thereto.

特に、本発明に係る微生物は、上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子（以下、他のプロテアーゼ遺伝子と称する）を更に欠失又は不活性化したものであることが好ましい。他のプロテアーゼ遺伝子としては、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子並びに当該各遺伝子に相当する遺伝子を挙げることができる。ここで、微生物が生育可能である限り、複数のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化していてもよい。特に、これら９種類の他のプロテアーゼ遺伝子全てが欠失又は不活性化していることが好ましい。   In particular, the microorganism according to the present invention contains one or more genes (hereinafter referred to as other protease genes) encoding a protease different from the protease encoded by the htrA gene, the htrB gene or a gene corresponding to the gene. Further, it is preferably deleted or inactivated. Examples of other protease genes include Bacillus subtilis aprE gene, nprB gene, nprE gene, bpr gene, vpr gene, mpr gene, epr gene, wprA gene and aprX gene, and genes corresponding to the respective genes. Here, as long as the microorganism can grow, a plurality of protease genes may be deleted or inactivated. In particular, it is preferable that all these nine other protease genes are deleted or inactivated.

さらに、本発明に係る微生物は、遺伝子産物を生産目的として、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することができる。このとき、導入される遺伝子は、本発明に係る微生物中で発現可能となるように導入される。例えば、上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域（好ましくは、３領域全て）を結合することができる。特に、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域としては、枯草菌由来のセルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kbに存在する領域を挙げることができる。また分泌シグナル領域としては、バチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来又はプロテアーゼ遺伝子由来の分泌シグナル領域を挙げることができる。   Furthermore, the microorganism according to the present invention can introduce a gene encoding a target protein or polypeptide for the purpose of producing a gene product. At this time, the introduced gene is introduced so that it can be expressed in the microorganism according to the present invention. For example, one or more regions (preferably all three regions) selected from a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region can be bound upstream of the gene encoding the protein or polypeptide. In particular, examples of the transcription initiation control region and the translation initiation control region include regions existing 0.6 to 1 kb upstream of the cellulase gene derived from Bacillus subtilis. Examples of the secretion signal region include a secretion signal region derived from a lipase gene of a Bacillus bacterium or a protease gene.

本発明に係る微生物を用いて生産するタンパク質又ポリペプチドとしては、何ら限定されないが、例えば、リパーゼ及びプロテアーゼを挙げることができる。より具体的には、本発明に係る微生物を用いることによって、枯草菌のLipA遺伝子によりコードされるリパーゼを製造することが好ましい。   Examples of the protein or polypeptide produced using the microorganism according to the present invention include, but are not limited to, lipase and protease. More specifically, it is preferable to produce a lipase encoded by the LipA gene of Bacillus subtilis by using the microorganism according to the present invention.

本発明に係る微生物によれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。また、本発明に係るタンパク質又ポリペプチドの製造方法によれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。   According to the microorganism of the present invention, the target protein or polypeptide can be prevented from being decomposed, and these can be efficiently produced in large quantities. Moreover, according to the method for producing a protein or polypeptide of the present invention, the target protein or polypeptide can be prevented from being decomposed, and these can be efficiently produced in large quantities.

以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物は、枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物である。ここで枯草菌のhtrA遺伝子とは、Noone D, Howell A, Devine KM (2000) Expression of ykdA, encoding a Bacillus subtilis homologue of HtrA, is heat shock inducible and negatively autoregulated. J Bacteriol 182:1592-9.に開示された、ヒートショック・セリンプロテアーゼをコードする遺伝子として知られている。枯草菌のhtrA遺伝子の塩基配列及びHtrAタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。一方、枯草菌のhtrB遺伝子とは、Darmon E, Noone D, Masson A, Bron S, Kuipers OP, Devine KM, van Dijl JM (2002) A novel class of heat and secretion stress-responsive genes is controlled by the autoregulated CssRS two-component system of Bacillus subtilis. J Bacteriol 184:5661-71.に開示された、htrA遺伝子に類似したセリンプロテアーゼをコードする遺伝子として知られている。枯草菌のhtrB遺伝子の塩基配列及びHtrBタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
The microorganism according to the present invention is a microorganism in which the htrA gene and htrB gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene is deleted or inactivated. Here, the htrA gene of Bacillus subtilis refers to Noone D, Howell A, Devine KM (2000) Expression of ykdA, encoding a Bacillus subtilis homologue of HtrA, is heat shock inducible and negatively autoregulated.J Bacteriol 182: 1592-9. It is known as a disclosed gene encoding a heat shock serine protease. The nucleotide sequence of the htrA gene of Bacillus subtilis and the amino acid sequence of the HtrA protein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. On the other hand, the htrB gene of Bacillus subtilis is Darmon E, Noone D, Masson A, Bron S, Kuipers OP, Devine KM, van Dijl JM (2002) A novel class of heat and secretion stress-responsive genes is controlled by the autoregulated. It is known as a gene encoding a serine protease similar to the htrA gene disclosed in CssRS two-component system of Bacillus subtilis. J Bacteriol 184: 5661-71. The nucleotide sequence of the htrB gene of Bacillus subtilis and the amino acid sequence of the HtrB protein are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.

これらhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子にコードされるHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質は、共通して膜貫通ドメインを有しており、枯草菌の細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼである。したがって、これらHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質は、分泌型タンパク質に対する分解活性を示すものである。   The HtrA protein and HtrB protein encoded by these htrA gene and htrB gene have a transmembrane domain in common, and are serine proteases of the type present in the cell wall of Bacillus subtilis. Therefore, these HtrA protein and HtrB protein exhibit degradation activity against secretory proteins.

本発明に係る微生物を枯草菌から作製する場合には、上述したように定義したhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子を欠失又は不活性化すればよい。しかしながら、本発明に係る微生物は、枯草菌から作製されたものに限定されず、枯草菌以外の如何なる微生物から作製してもよい。枯草菌以外の微生物から作製する場合には、対象とする微生物におけるhtrA遺伝子及び/又はhtrB遺伝子に相当する遺伝子（以下htrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子と称する）を特定し、特定されたhtrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子を当該微生物において欠失又は不活性化することで、本発明に係る微生物を作製することができる。   When the microorganism according to the present invention is produced from Bacillus subtilis, the htrA gene and the htrB gene defined as described above may be deleted or inactivated. However, the microorganism according to the present invention is not limited to those prepared from Bacillus subtilis, and may be prepared from any microorganism other than Bacillus subtilis. When producing from a microorganism other than Bacillus subtilis, the gene corresponding to the htrA gene and / or htrB gene in the target microorganism (hereinafter referred to as htrA homologous gene and htrB homologous gene) is identified, and the identified htrA homologous gene In addition, the microorganism according to the present invention can be produced by deleting or inactivating the htrB homologous gene in the microorganism.

ここで、htrA相同遺伝子とは、上述したように定義された枯草菌のhtrA遺伝子と機能的に一致する遺伝子であると定義することができる。より具体的にhtrA相同遺伝子としては、配列番号２に示すHtrAタンパク質のアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、８０％以上或いは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子と定義することができる。また、htrA相同遺伝子としては、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science,227, 1435, (1985))によって計算される値を意味する。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される値を意味する。   Here, the htrA homologous gene can be defined as a gene functionally identical to the htrA gene of Bacillus subtilis defined as described above. More specifically, the htrA homologous gene includes, for example, a gene encoding a protein having an amino acid sequence having 70% or more, 80% or more, or 90% or more identity to the amino acid sequence of the HtrA protein shown in SEQ ID NO: 2. Can be defined. The htrA homologous gene is preferably an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, more particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more. Mention may be made of genes encoding proteins. Here, the identity of amino acid sequences means a value calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). More specifically, it means a value calculated by performing an analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using the genetic homology analysis program (Geneticx-Win (software development)) To do.

これらhtrA相同遺伝子及びhtrB相同遺伝子は、htrAファミリーに属する一群の遺伝子として知られている。htrAファミリーは膜局在性ドメインをアミノ末端に持ち、ドデカマー形成に必要なPDZドメインと呼ばれる部位を有し、かつ、活性中心にセリンを有するタンパク質の総称である。HtrAファミリーは、マイコプラズマ以外の生物に広く見出されており、大腸菌においてはhhoA(degQ)遺伝子及びhhoB(degS)遺伝子、緑膿菌においてはmucD遺伝子及びalgW遺伝子が知られている。   These htrA homologous genes and htrB homologous genes are known as a group of genes belonging to the htrA family. The htrA family is a general term for proteins having a membrane localization domain at the amino terminus, a site called PDZ domain necessary for dodecamer formation, and serine at the active center. The HtrA family is widely found in organisms other than mycoplasma. The hhoA (degQ) and hhoB (degS) genes are known in E. coli, and the mucD and algW genes are known in Pseudomonas aeruginosa.

換言すると、本発明に係る微生物は、上述したようなhtrAファミリーに属するヒートショック・セリンプロテアーゼ遺伝子を有する微生物から作製することができる。但し、本発明に係る微生物は、htrAファミリーに属する遺伝子を有することが知られている微生物から作製されたものに限定されるものではない。つまり、本発明に係る微生物としては、上述したhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子の塩基配列又はHtrAタンパク質及びHtrBタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、遺伝子配列やタンパク質のアミノ酸配列を格納したデータベースから上述した同一性を基準としてhtrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を検索することで、htrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を有するものとして同定された微生物を用いてもよい。これら微生物としては、大腸菌やシュードモナス(Pseudomonas)属細菌以外にマイコバクテリウム(Mycobacterium)属細菌や、ヘルモフィルス(Haemophilus)属細菌、トレポネーマ(Treponema)属、が挙げられる。   In other words, the microorganism according to the present invention can be prepared from a microorganism having a heat shock serine protease gene belonging to the htrA family as described above. However, the microorganism according to the present invention is not limited to those prepared from microorganisms known to have genes belonging to the htrA family. That is, the microorganism according to the present invention has the above-described identity from the database storing the amino acid sequence of the gene sequence or protein based on the base sequence of the htrA gene and htrB gene or the amino acid sequence of HtrA protein and HtrB protein. A microorganism identified as having an htrA homologous gene or an htrB homologous gene by searching for an htrA homologous gene or an htrB homologous gene as a reference may be used. Examples of these microorganisms include bacteria of the genus Mycobacterium, bacteria of the genus Haemophilus, and the genus Treponema, in addition to E. coli and Pseudomonas bacteria.

なかでも本発明に係る微生物は、枯草菌などのバチルス(Bacillus)属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等から作製されることが好ましい。特に、バチルス属細菌から本発明に係る微生物を作製することが好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、本発明に係る微生物は特に枯草菌から作製することが好ましい。さらに、枯草菌としては、タンパク質又はポリペプチドを菌体外に分泌生産させる能力の向上が図られた枯草菌変異株を使用することが好ましい。当該枯草菌変異株としては、本来有している複数のプロテアーゼ遺伝子のうち１又は複数のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものを使用することが好ましい。枯草菌変異株としては、具体的に、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子より選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましい。特に、枯草菌変異株としては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼであるAprE及び中性プロテアーゼであるNprEをそれぞれコードするaprE及びnprE遺伝子又は当該遺伝子に相当する３種類の遺伝子を欠失又は不活性化させたものが好ましく、更にはaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する９種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させたものが特に好ましい。   Among them, the microorganism according to the present invention is preferably produced from Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Clostridium bacteria, yeast, or the like. In particular, it is preferable to produce the microorganism according to the present invention from a Bacillus bacterium. Furthermore, the microorganisms according to the present invention are particularly haygrass because the whole genome information has been clarified, genetic engineering and genomic engineering techniques have been established, and the ability to secrete and produce proteins or polypeptides outside the cells. It is preferable to prepare from bacteria. Further, as a Bacillus subtilis, it is preferable to use a Bacillus subtilis mutant that has been improved in its ability to secrete and produce a protein or polypeptide outside the cell. As the Bacillus subtilis mutant, it is preferable to use a mutant in which one or a plurality of protease genes are deleted or inactivated among a plurality of inherent protease genes. Specifically, Bacillus subtilis mutants lack one or more genes selected from each gene of aprE, nprB, nprE, bpr, vpr, mpr, epr, wprA and aprX or nine genes corresponding to the gene. Those which have been lost or inactivated are preferred. In particular, Bacillus subtilis mutants lack or inactivate the aprE and nprE genes encoding the major extracellular alkaline protease AprE and the neutral protease NprE, respectively, or three genes corresponding to the genes. Furthermore, all of aprE, nprB, nprE, bpr, vpr, mpr, epr, wprA and aprX genes, or all nine genes corresponding to the genes are deleted or inactivated. Those made are particularly preferred.

ここで、htrA遺伝子、htrB遺伝子、htrA相同遺伝子又はhtrB相同遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、特に限定されず、従来公知の如何なる手法を用いても良い。すなわち、所定の遺伝子を欠失させる方法としては、相同組換えを用いて欠失対象の遺伝子を染色体ゲノムから削除する方法、ランダムに突然変異を誘発した後に所定の遺伝子を欠失した株を選抜する方法を挙げることができる。また、所定の遺伝子を不活性化する方法としては、相同組換えを用いて所定の遺伝子のコーディング領域、転写制御領域又は翻訳制御領域にDNA断片を挿入する方法、相同組み換えを用いて所定の遺伝子の転写制御領域又は翻訳制御領域をゲノム染色体から欠失させる方法、ランダムに突然変異を誘発した後に所定の遺伝子の転写制御領域又は翻訳制御領域が欠失した株を選抜する方法等を挙げることができる。   Here, the method for deleting or inactivating the htrA gene, the htrB gene, the htrA homologous gene or the htrB homologous gene is not particularly limited, and any conventionally known method may be used. That is, as a method for deleting a predetermined gene, a method in which the gene to be deleted is deleted from the chromosome genome using homologous recombination, or a strain in which the predetermined gene has been deleted after random mutagenesis is selected. The method of doing can be mentioned. In addition, as a method of inactivating a predetermined gene, a method of inserting a DNA fragment into a coding region, transcription control region or translation control region of a predetermined gene using homologous recombination, or a predetermined gene using homologous recombination A method of deleting a transcription control region or a translation control region of the gene from a genome chromosome, a method of selecting a strain in which a transcription control region or a translation control region of a predetermined gene is deleted after random mutagenesis, etc. it can.

特に、本発明微生物を構築するための微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより所定の遺伝子を欠失又は不活性化させる方法については、Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990) 等を参照することができる。   In particular, when Bacillus subtilis is used as a microorganism for constructing the microorganism of the present invention, a method for deleting or inactivating a predetermined gene by homologous recombination is described in Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990). Etc. can be referred to.

以下、より具体的にSOE (splicing by overlap extension)-PCR法（Gene, 77, 61, (1989)）によって調製される欠失導入用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。   The following describes the deletion method by the double crossover method using a DNA fragment for deletion introduction prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, (1989)). However, the gene deletion method in the present invention is not limited to the following.

本方法で用いる欠失導入用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約0.2〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.2〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。   The deletion-introducing DNA fragment used in this method has a drug resistance marker gene fragment inserted between the approximately 0.2 to 3 kb fragment adjacent to the upstream of the gene to be deleted and the approximately 0.2 to 3 kb fragment adjacent to the downstream in the same manner. It is a fragment. First, an upstream fragment and a downstream fragment of a deletion target gene and three fragments of a drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR, and at this time, for example, upstream of the drug resistance marker gene at the downstream end of the upstream fragment. A primer designed so that a 10-30 base pair sequence on the side and, on the contrary, a 10-30 base pair sequence downstream of the drug resistance marker gene is added to the upstream end of the downstream fragment is used (FIG. 1).

次いで、１回目に調製した３種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。   Next, using the three types of PCR fragments prepared in the first round as a template, and performing the second round of PCR using the upstream primer of the upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment, the downstream end of the upstream fragment and the downstream fragment In the drug resistance marker gene sequence added to the upstream end, annealing with the drug resistance marker gene fragment occurs, and as a result of PCR amplification, a DNA fragment having the drug resistance marker gene inserted between the upstream fragment and the downstream fragment is obtained. (FIG. 1).

薬剤耐性マーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットと適当な鋳型DNAを用い、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press, pp251 (1993)、Gene, 77,61, (1989)等）に示される通常の条件によりSOE-PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失導入用DNA断片が得られる。   When using a spectinomycin resistance gene as a drug resistance marker gene, for example, using a primer set shown in Table 2 and an appropriate template DNA, using a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc. By performing SOE-PCR under the normal conditions shown in the book (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press, pp251 (1993), Gene, 77, 61, (1989), etc.) A DNA fragment for deletion introduction of each gene is obtained.

かくして得られた欠失導入用DNA断片を、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol.93, 1925 (1967)）等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。例えばスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて調製した欠失導入用DNA断片を導入した場合、スペクチノマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、目的の遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたPCR法などによって確認すれば良い。   When the DNA fragment for deletion introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent cell transformation method (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)) or the like, upstream and downstream of the identical deletion target gene. In the homologous region, cells in which gene recombination has occurred and the target gene has been replaced with a drug resistance gene can be isolated by selection with a drug resistance marker (FIG. 1). For example, when a deletion-introducing DNA fragment prepared using a spectinomycin-resistant gene is introduced, colonies that grow on an agar medium containing spectinomycin are isolated, and the target gene is deleted, resulting in spectinomycin-resistance. What is necessary is just to confirm that it has substituted by the gene by PCR method etc. which used the genome as a template.

また、所定の遺伝子の欠失方法としては、SOE-PCR法によって調製される欠失導入用DNA断片を挿入した欠失導入用プラスミドを用いた２段階の１重交差法を用いることもできる。
本方法については、特開２００６−１７４７０７号公報を参照にして実施することが可能である。 As a method for deleting a predetermined gene, a two-step single crossover method using a deletion-introducing plasmid into which a deletion-introducing DNA fragment prepared by the SOE-PCR method is inserted can also be used.
About this method, it is possible to implement with reference to Unexamined-Japanese-Patent No. 2006-174707.

以上の様な方法により構築された本発明に係る微生物に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、当該タンパク質又はポリペプチドを高生産する組換え微生物を得ることができる。   By introducing a gene encoding a target protein or polypeptide into the microorganism according to the present invention constructed by the method as described above, a recombinant microorganism that highly produces the protein or polypeptide can be obtained. .

本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断等の各種産業用酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素 (Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはプロテアーゼ及びリパーゼを挙げることができる。   Examples of the target protein or polypeptide produced using the microorganism of the present invention include proteins, polypeptides such as various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, diagnosis, and physiologically active factors. It is done. In addition, the functions of industrial enzymes are classified into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase / Synthetase). ) And the like, but preferably include protease and lipase.

特に、本発明に係る微生物は、枯草菌の細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼであるhtrA遺伝子或いはhtrA相同遺伝子及びhtrB遺伝子或いはhtrB相同遺伝子を欠失又は不活性化しているため、分泌型のタンパク質又はポリペプチドを生産することが好ましい。より詳細に本発明に係る微生物は、分泌型のタンパク質又はポリペプチドのなかでも、細胞壁に存在するタイプのセリンプロテアーゼによって分解されやすい分泌型のタンパク質又はポリペプチドの生産に使用することが好ましい。   In particular, since the microorganism according to the present invention has deleted or inactivated the htrA gene or htrA homologous gene and the htrB gene or htrB homologous gene which are serine proteases of the type present in the cell wall of Bacillus subtilis, it is a secreted protein. Alternatively, it is preferable to produce a polypeptide. More specifically, the microorganism according to the present invention is preferably used for the production of a secreted protein or polypeptide that is easily degraded by a serine protease of the type present in the cell wall, among secreted proteins or polypeptides.

具体的には、本発明に係る微生物を用いて分泌型のリパーゼを生産することが好ましい。特にリパーゼとしては、Jaegerらの分類（Biochem. J. 1999 343:177-183）に従いTrue lipaseに分類されるリパーゼ、GDSLファミリーに分類されるリパーゼ、HSLファミリーに分類されるリパーゼの他、フアミリーIIIからVIIIに分類されるリパーゼを生産対象のリパーゼとすることが好ましい。中でもリパーゼとしては、例えば枯草菌のLipA遺伝子によってコードされるLipAタンパク質や膜に局在することが知られているSerratia marcescens由来LipA（Journal of bioscience and bioengineering 2001 (4) 409-415）が挙げられる。   Specifically, it is preferable to produce a secretory lipase using the microorganism according to the present invention. In particular, lipases include lipases classified as true lipase, lipases classified as GDSL family, lipases classified as HSL family, and family III, according to the classification of Jaeger et al. (Biochem. J. 1999 343: 177-183). To VIII are preferably used as production lipases. Among them, examples of the lipase include LipA protein encoded by the LipA gene of Bacillus subtilis and LipA derived from Serratia marcescens (Journal of bioscience and bioengineering 2001 (4) 409-415). .

さらに生産対象のタンパク質としては、分泌型のプロテアーゼを挙げることができる。特に、プロテアーゼとしては、true subtilisin(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼ、Oxidatively Stable alkaline Proteases(OSPs)(Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000)に属するプロテアーゼ、high-alkaline protease(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼを生産対象のプロテアーゼとすることが好ましい。中でもプロテアーゼとしては、例えばバチルス・エスピーKSM-K16株（GenBank accession no. Q99405(:微工研条寄第3376号由来)）が分泌するM-protease（KAP）があげられる。その他にも生産対象のプロテアーゼとしてはtrue subtilisin(Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997)に分類されるプロテアーゼaprE(GenBank accession no. AAA22742（バチルス・エスピー168株由来）及びプロテアーゼKS(特開2004-313043号公報（バチルス・エスピーKSM-KP43株由来）、Oxidatively Stable alkaline Proteases(OSPs)(Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000)に属するプロテアーゼKP-43(国際公開第99/18218号パンフレット：GenBank accession no. AB051423(バチルス・エスピーKSM-KP43株（FERM BP-6532）由来))、プロテアーゼNP-1(国際公開第88/01293号パンフレット：GenBank accession no. AB046406(バチルス・エスピーNCIB 12KS9株由来))及びプロテアーゼE-1(特許公開昭49-071191号公報：Genbank accession no. AB046402（バチルス・エスピーD-6株(FERM P-1592)由来）)があげられる。さらに、本発明に係る微生物により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒトＣ型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメインPreS2などが挙げられる。   Furthermore, as a protein to be produced, a secreted protease can be mentioned. In particular, proteases are proteases classified as true subtilisin (Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997), Oxidatively Stable alkaline Proteases (OSPs) (Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 279, 313-319, 2000), proteases classified as high-alkaline protease (Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997) are preferably used as production target proteases. Among them, an example of the protease is M-protease (KAP) secreted by Bacillus sp. KSM-K16 strain (GenBank accession no. Q99405 (derived from Microtechnical Research Institute No. 3376)). Other proteases to be produced include protease aprE (GenBank accession no. AAA22742 (derived from Bacillus sp. 168 strain)) and protease KS, which are classified as true subtilisin (Siezen and Leunissen, Protein science, 6, 501-523, 1997). (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-313043 (derived from the Bacillus sp. KSM-KP43 strain), Oxidatively Stable alkaline Proteases (OSPs) (Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 279, 313-319, 2000) Protease KP-43 (International Publication No. 99/18218 pamphlet: GenBank accession no. AB051423 (derived from Bacillus sp. KSM-KP43 strain (FERM BP-6532))), Protease NP-1 (International Publication No. 88/01293) Brochure: GenBank accession no. AB046406 (from Bacillus sp. NCIB 12KS9 strain) and protease E-1 (Patent Publication No. 49-071191): Genbank accession no. AB046402 (Bacillus sp. D-6 strain (FERM P-1592) ) Origin)). Examples of proteins produced by living organisms include physiologically active proteins and enzymes derived from higher organisms such as humans, etc. Preferred examples include interferon α, interferon β, growth hormone, salivary gland amylase, etc. A part of the domain constituting the active protein and the like can also be expressed, and examples thereof include the antigen recognition domain PreS2 of human hepatitis C virus antibody.

また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、８０％以上または、９０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。なお、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。   In addition, the target protein or polypeptide gene is upstream of the regulatory region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, ie, the transcription initiation control region including the promoter and transcription initiation site, the ribosome binding site, and the initiation of translation including the initiation codon. It is desirable that at least one region selected from the region and the secretory signal peptide region is bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined, and the secretion signal peptide region is derived from a lipase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus, It is desirable that the translation initiation region is a 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene to be bound to the target protein or polypeptide gene in an appropriate form. For example, the bacterium belonging to the genus Bacillus described in JP 2000-210081, JP 4-190793, etc., that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP-2886) It is desirable that the transcription initiation regulatory region, translation initiation region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene are appropriately bound to the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the cellulase gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the base sequence Preferably, it has a homology of 70% or more, 80% or more, or 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, more particularly preferably 98%. As described above, most preferably, a DNA fragment comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity, or a DNA fragment comprising a nucleotide sequence from which any of the above nucleotide sequences has been deleted is a structural gene of the target protein or polypeptide. It is desirable that they are properly combined. Here, a DNA fragment consisting of a base sequence from which a part of the base sequence has been deleted is a part of the base sequence that has been deleted, but retains functions related to gene transcription, translation, and secretion. Means a DNA fragment.

上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明に係る微生物に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドを生産する組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に本発明に係る微生物のゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、ゲノムに直接組み込むことによっても当該組換え微生物を得ることができる。   By incorporating a recombinant plasmid in which a DNA fragment containing the above target protein or polypeptide gene and an appropriate plasmid vector are combined into the microorganism according to the present invention by a general transformation method, the target protein or polypeptide is obtained. Recombinant microorganisms to produce can be obtained. The recombinant microorganism can also be obtained by using a DNA fragment in which an appropriate homologous region with the genome of the microorganism according to the present invention is bound to the DNA fragment and directly integrating it into the genome.

組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培地の成分・組成などは特に限定されないが、好ましくは、炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が得られる。   For production of the target protein or polypeptide using recombinant microorganisms, the strain is inoculated into a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source, and other essential components, cultured by a conventional microorganism culture method, and the culture is completed. Thereafter, the protein or polypeptide may be collected and purified. The components and composition of the medium are not particularly limited, but preferably better results can be obtained by using a medium containing maltose or malto-oligosaccharide as a carbon source.

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.

以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。   For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.

また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。   Further, in the following examples, upstream and downstream of a gene are not positions from the replication start point, but upstream is a region continuing on the 5 ′ side of the start codon of the gene that is regarded as a target in each operation / step. On the other hand, “downstream” indicates a region continuing 3 ′ of the stop codon of the gene taken as a target in each operation / step.

さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。   Furthermore, the names of the genes and gene regions in the following examples are reported in Nature, 390, 249-256, (1997), and published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: //bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.

さらにまた、以下の実施例において、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。   Furthermore, in the following examples, Bacillus subtilis was transformed as follows. That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared.

次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液（SOE-PCRの反応液等）5μLを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。   Next, add 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), shake culture at 37 ° C. for 1 hour, The whole amount was smeared on a LB agar medium containing 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.

目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のいずれかによって行った。   Introduction of a gene encoding a target protein or polypeptide into a host microorganism can be accomplished by competent cell transformation (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)), electroporation (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135). (1990)) or protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)).

組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xYT培地（1.6％トリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）、2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）、或いはCSL発酵培地（2%酵母エキス、0.5%コーンスティープリカー（CSL）、0.05%塩化マグネシウム七水和物、0.6%尿素、0.2%L-トリプトファン、10%グルコース、0.15%リン酸二水素ナトリウム、0.35%リン酸水素二ナトリウム、pH7.2）を用いた。   LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl), 2xYT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl), 2xL-maltose medium for protein production by recombinant microorganisms (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5ppm manganese sulfate 4-5 hydrate), or CSL fermentation medium (2% yeast extract, 0.5% corn steep liquor (CSL), 0.05 % Magnesium chloride heptahydrate, 0.6% urea, 0.2% L-tryptophan, 10% glucose, 0.15% sodium dihydrogen phosphate, 0.35% disodium hydrogen phosphate, pH 7.2).

〔実施例１〕枯草菌ゲノム中htrA及びhtrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
本実施例では、図１に示したSOE-PCRを用いて枯草菌ゲノム中htrA及びhtrB遺伝子の薬剤耐性遺伝子にて置換することで、htrA遺伝子欠失株、htrB遺伝子欠失株及びhtrA/htrB遺伝子欠損株を構築した。なお、htrA及びhtrB遺伝子は枯草菌のhtrAプロテアーゼファミリーに属する分泌ストレス応答系細胞膜プロテアーゼをコードする遺伝子である（Molecular Microbiology 2001 42(5) 1159-1172）。 [Example 1] Replacement of htrA and htrB genes in the Bacillus subtilis genome with drug resistance genes In this example, replacement of the htrA and htrB genes in the Bacillus subtilis genome with drug resistance genes using SOE-PCR shown in FIG. Thus, an htrA gene deletion strain, an htrB gene deletion strain, and an htrA / htrB gene deletion strain were constructed. The htrA and htrB genes are genes encoding secretory stress response cell membrane proteases belonging to the htrA protease family of Bacillus subtilis (Molecular Microbiology 2001 42 (5) 1159-1172).

htrA遺伝子欠失用DNAは枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したhtrA/Cm-F及びhtrA-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrA遺伝子の上流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、htrA-FW及びhtrA/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrA遺伝子の下流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。   The htrA gene deletion DNA uses genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, and is adjacent to the htrA gene upstream in the genome using the htrA / Cm-F and htrA-RV primer sets shown in Table 1. A 1 kb fragment was amplified by PCR. In addition, a 1 kb fragment adjacent to the downstream of the htrA gene in the genome was amplified by PCR using the genomic DNA as a template and the htrA-FW and htrA / Cm-R primer sets.

htrB遺伝子欠失用DNAに関してもhtrAの場合と同様に、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表1に示したhtrB/SP-F及びhtrB-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrB遺伝子の上流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、htrB-F及びhtrB/Sp-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のhtrB遺伝子の下流に隣接する1kb断片をPCRにより増幅した。   Similarly to htrA, the DNA for htrB gene deletion is genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template, and using the htrB / SP-F and htrB-R primer sets shown in Table 1, A 1 kb fragment adjacent to the upstream of the htrB gene was amplified by PCR. In addition, a 1 kb fragment adjacent to the downstream of the htrB gene in the genome was amplified by PCR using the genomic DNA as a template and the htrB-F and htrB / Sp-R primer sets.

さらに、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を有するプラスミドpCBB31を鋳型とし、表１に示したCmF及びCmRのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子領域をPCRにより調製した。   Furthermore, the plasmid pCBB31 having the chloramphenicol (Cm) resistance gene of the plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) was used as a template, and the CmF and CmR primer sets shown in Table 1 were used. A chloramphenicol resistance gene region was prepared by PCR.

また、スペクチノマイシン（Sp）耐性遺伝子に関しても同様に、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpDG1727（Gene, 167, 335, (1995)）を鋳型とし、表１に示したSpF及びSpRのプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子領域をPCRにより調製した。   Similarly, for the spectinomycin (Sp) resistance gene, the plasmid pDG1727 (Gene, 167, 335, (1995)) having the spectinomycin resistance gene was used as a template, and the SpF and SpR primer sets shown in Table 1 were used. Was used to prepare a spectinomycin resistance gene region by PCR.

Figure 2009038985
Figure 2009038985

次に、図１に示したように、得られた遺伝子上流断片、遺伝子下流断片及び薬剤耐性遺伝子領域の3断片を混合して鋳型として、htrA-R2及びhtrA-F2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が連続して含まれるhtrA遺伝子欠失用DNA断片（D）を得た。htrB遺伝子欠失用DNA断片も同様の手法によりhtrB-R2及びhtrB-F2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって取得した。   Next, as shown in FIG. 1, the obtained SOE using the htrA-R2 and htrA-F2 primer sets as a template by mixing the obtained gene upstream fragment, gene downstream fragment and drug resistance gene region 3 fragments. The htrA gene deletion DNA fragment (D) containing 3 fragments continuously was obtained by -PCR method. A DNA fragment for htrB gene deletion was also obtained by the SOE-PCR method using a primer set of htrB-R2 and htrB-F2 in the same manner.

コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Kao9株）（特開2006-174707号公報）の形質転換を行った。なお、プロテアーゼ遺伝子９重欠失株（Kao9株）とは、枯草菌のaprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXの各遺伝子を欠損した枯草菌変異株である。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）もしくはスペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。   Using the obtained DNA fragment by the competent cell transformation method, a protease gene 9-deficient strain (Kao9 strain) (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-174707) was transformed. In addition, the protease gene 9-deficient strain (Kao9 strain) is a Bacillus subtilis mutant strain lacking the genes for Bacillus subtilis aprE, nprB, nprE, bpr, vpr, mpr, epr, wprA and aprX. After transformation, colonies grown on LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) or spectinomycin (0.5 μg / mL) were isolated as transformants.

得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによって標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、htrA遺伝子欠失株及びhtrB遺伝子欠失株（ΔhtrA株、ΔhtrB株）を構築した。さらに、同様の手法によりhtrB欠失用DNA断片を用いてΔhtrA株の形質転換を行い、htrA遺伝子及びhtrB遺伝子が共に欠失したhtrA/htrB遺伝子欠失株株（ΔhtrA/B株）を構築した。   The genomic DNA of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed by PCR that the target gene was replaced with a drug resistance gene. As described above, an htrA gene-deleted strain and an htrB gene-deleted strain (ΔhtrA strain, ΔhtrB strain) were constructed. Furthermore, the ΔhtrA strain was transformed using the htrB deletion DNA fragment in the same manner, and an htrA / htrB gene deletion strain (ΔhtrA / B strain) in which both the htrA gene and the htrB gene were deleted was constructed. .

〔実施例２〕
実施例１にて得られたΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼの生産性を指標として行った。リパーゼ生産性評価の際に用いる発現用DNAは以下の手法にて構築した。枯草菌１６８株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表2に示されるS237p+lipApre-FとlipA-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、リパーゼLipA（Eur J Biochem 1993 216 155-160）をコードする配列番号２３で示される塩基配列のうちLipAのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表2に示されるS237-F(BamHI)とS237p+lipApre-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２５で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報、本遺伝子によりコードされるアルカリセルラーゼのアミノ酸配列を配列番号２６に示す）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られたの2断片を混合して鋳型とし、表2に示されるS237-F(BamHI)とlipA-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、LipAのシグナル配列、プロ配列、成熟酵素領域、転写終結領域が連結したDNA断片を得た。得られたDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaＩ制限酵素切断点に挿入し、LipA生産性評価用プラスミドpHLApmを構築した。 [Example 2]
The heterologous protein productivity evaluation of the ΔhtrA strain, ΔhtrB strain and ΔhtrA / B strain obtained in Example 1 was performed using the productivity of the lipase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 as an index. The expression DNA used in the lipase productivity evaluation was constructed by the following method. PCR was performed using the S237p + lipApre-F and lipA-R (XbaI) primer sets shown in Table 2 using genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, and lipase LipA (Eur J Biochem 1993 216 155- Among the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 encoding 160), a 1.2 kb DNA fragment containing the LipA signal sequence, pro sequence and mature enzyme region was amplified. Also, using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, using the S237-F (BamHI) and S237p + lipApre-R primer sets shown in Table 2 PCR was performed, and the transcription initiation control region and translation initiation control of the alkaline cellulase gene shown in SEQ ID NO: 25 (JP 2000-210081, the amino acid sequence of the alkaline cellulase encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 26) A 0.6 kb DNA fragment encoding the promoter region was amplified. Next, the obtained two fragments were mixed and used as a template, and by performing SOE-PCR using the S237-F (BamHI) and lipA-R (XbaI) primer sets shown in Table 2, the alkaline cellulase gene Thus, a DNA fragment was obtained in which the signal sequence, pro-sequence, mature enzyme region, and transcription termination region of LipA were linked downstream of the transcription initiation control region and the translation initiation control promoter region. The obtained DNA fragment was inserted into the BamHI-XbaI restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct a plasmid pHLApm for evaluating LipA productivity.

Figure 2009038985
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プロトプラスト形質転換法を用いてKao9株、ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株にpHLApmを導入後、これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のリパーゼ活性をリキテックリパーゼカラー（ロシュ）により測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたLipAの量を求めた。リキテックリパーゼカラーは、1,2-O-ジラウリル-rac-グリセロ-3-グルタル酸-(6-メチルレゾルフィン)エステルを基質として含み、遊離したメチルレゾルフィンの増加による吸光度変化を測定することでリパーゼ活性を測定する試薬である（Neumann, U.ら EP 207252）。具体的には、試薬1（緩衝液）と試薬2（基質液）を5:3の割合で混合した反応溶液100μLに、13.3 mMリン酸緩衝液（pH7.4 和光純薬工業）で適宜希釈したサンプル溶液50μLを混合し、マイクロプレートリーダー（SPECTRAmax PLUS, Molecular Devices）によって30℃における570 nmの吸光度（A570nm）変化を10分間測定した。1分間にメチルレゾルフィンを1μM遊離する酵素量を1ユニット（U）と定義し、酵素キャリブレーターC.f.a.s.II（ロシュ）を標準液として、各サンプルの活性（U/L）を測定した。結果を図2に示す。   After introducing pHLApm into Kao9 strain, ΔhtrA strain, ΔhtrB strain and ΔhtrA / B strain using protoplast transformation method, the resulting strain was shaken and cultured overnight at 30 ° C in 5 mL of LB medium. 0.03 mL of the solution is inoculated into 30 mL of 2xL-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) at 30 ° C Then, shaking culture was performed for 3 days. After culturing, the lipase activity of the culture supernatant from which the cells were removed by centrifugation was measured with Liquitec lipase color (Roche), and the amount of LipA secreted and produced outside the cells by the culture was determined. Liquitec lipase color contains 1,2-O-dilauryl-rac-glycero-3-glutaric acid- (6-methylresorufin) ester as a substrate and measures the change in absorbance due to the increase of free methylresorufin (Neumann, U. et al. EP 207252). Specifically, 100 µL of the reaction solution in which reagent 1 (buffer solution) and reagent 2 (substrate solution) were mixed at a ratio of 5: 3 was appropriately diluted with 13.3 mM phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries). 50 μL of the sample solution was mixed, and the change in absorbance at 570 nm (A570 nm) at 30 ° C. was measured for 10 minutes using a microplate reader (SPECTRAmax PLUS, Molecular Devices). The amount of enzyme that releases 1 μM of methylresorufin per minute was defined as 1 unit (U), and the activity (U / L) of each sample was measured using an enzyme calibrator C.f.a.s.II (Roche) as a standard solution. The result is shown in figure 2.

図2は、24時間（白）、48時間（灰）、72時間（黒）目にサンプリングを行った結果であり、横軸にはhtrA、htrBをKao9株から欠失（−）もしくは非欠失（＋）した株を示している。縦軸には培養液の遠心後上清におけるリパーゼ活性を示しており、活性値はKao9株［htrA、htrBとも非欠失（+）で表記］を宿主とした場合の48時間目における活性を100%とした相対活性で示している。この結果より、リパーゼはhtrA、htrB単独欠失では殆ど生産性向上効果がみられない一方で、両欠失株には明らかに生産性向上効果（113%）が見られることがわかる。   Figure 2 shows the results of sampling at 24 hours (white), 48 hours (gray), and 72 hours (black). The horizontal axis shows htrA and htrB deleted from Kao9 strain (-) or absent. The lost (+) strain is shown. The vertical axis shows the lipase activity in the supernatant after centrifugation of the culture solution, and the activity value is the activity at 48 hours when the Kao9 strain [both htrA and htrB are expressed as non-deleted (+)] is used as the host. The relative activity is shown as 100%. From these results, it can be seen that lipase shows almost no improvement in productivity when htrA or htrB alone is deleted, whereas the deletion improvement strain clearly shows an improvement in productivity (113%).

〔実施例３〕セルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ分泌生産評価
実施例１にて得られたΔhtrA/B株のリパーゼ以外の異種タンパク質生産性評価は、配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由アルカリプロテアーゼ及び配列番号３４で示されるアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼの生産性を指標として行った。 [Example 3] Cellulase, protease, and amylase secretion production evaluation The heterologous protein productivity evaluation other than the lipase of the ΔhtrA / B strain obtained in Example 1 was carried out using an alkaline cellulase consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a sequence The productivity of Bacillus genus alkaline protease consisting of the amino acid sequence shown by No. 32 and alkaline amylase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID No. 34 was used as indicators.

＜セルラーゼ分泌生産能評価＞
アルカリセルラーゼ生産性評価に関しては、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を用いて行った。プロトプラスト形質転換法を用いてKao9株及びΔhtrA/B株にpHY-S237を導入後、これによって得られた菌株を5mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.03 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm 硫酸マンガン4-5水和物、15 ppm テトラサイクリン）に接種し、30℃で4日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。 <Evaluation of cellulase secretion production ability>
Regarding the evaluation of alkaline cellulase productivity, a DNA fragment (3.1 kb) encoding an alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) derived from Bacillus sp. KSM-S237 is a BamHI restriction enzyme of shuttle vector pHY300PLK. This was performed using the recombinant plasmid pHY-S237 inserted at the breakpoint. After introducing pHY-S237 into Kao9 strain and ΔhtrA / B strain using protoplast transformation method, the obtained strain was cultured with shaking in 5 mL LB medium at 30 ° C overnight, and 0.03 mL of this culture solution was further added. Inoculate 30 mL of 2xL-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) at 30 ° C for 4 days. Shaking culture was performed. After culturing, the alkaline cellulase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline cellulase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. For the measurement of cellulase activity, 50 μL of 0.4 mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside (Seikagaku) was added to 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries). The amount of p-nitrophenol liberated when mixed and reacted at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance at 420 nm (OD420 nm). The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.

＜プロテアーゼ分泌生産能評価＞
アルカリプロテアーゼ生産性評価は以下の手法にて行った。まず、発現用DNAの構築に際して、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリプロテアーゼ（特許第3026111）をコードする配列番号３１で示される塩基配列のうちアルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２５で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られたの2断片を混合して鋳型とし、表3に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、アルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域が連結した1.8kbのDNA断片を得た。得られた1.8kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP（S237p）を構築した。 <Evaluation of protease secretion production ability>
The alkaline protease productivity was evaluated by the following method. First, in constructing DNA for expression, genomic DNA extracted from Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) was used as a template for S237pKAPpp-F and KAPter-R (BglII) shown in Table 3. Perform PCR using the primer set to amplify a 1.2 kb DNA fragment containing the alkaline protease signal sequence, pro sequence and mature enzyme region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 encoding alkaline protease (patent 3026111) did. Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, PCR was performed using the S237ppp-F2 (BamHI) and S237pKAPpp-R primer sets shown in Table 3. Then, a 0.6 kb DNA fragment encoding the transcription initiation control region and the translation initiation control promoter region in the alkaline cellulase gene shown in SEQ ID NO: 25 (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) was amplified. Next, the obtained 2 fragments were mixed and used as a template, and by performing SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and KAPter-R (BglII) primer sets shown in Table 3, the alkaline cellulase gene A 1.8 kb DNA fragment was obtained in which the signal sequence, prosequence and mature enzyme region of alkaline protease were ligated downstream of the transcription initiation control region and the translation initiation control promoter region. The obtained 1.8 kb DNA fragment was inserted into the BamHI-BglII restriction enzyme cleavage point of the shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct a plasmid pHYKAP (S237p) for evaluating alkaline protease productivity.

Figure 2009038985
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さらに、構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM CaCl2溶液で適宜希釈した培養上清50μlに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液（pH10.5）を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度変化(OD420nm)により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。 Further, the constructed plasmid pHYKAP (S237p) was introduced into each strain by protoplast transformation. The recombinant strain thus obtained was shake-cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After the culture, the alkaline protease activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of the alkaline protease secreted and produced outside the cells by the culture was determined. The activity of protease in the culture supernatant was measured as follows. That is, the culture supernatant 50μl diluted appropriately with 2 mM CaCl 2 solution, 75 mM boric acid -KCl buffer containing 7.5mM of Succinyl-L-Alanyl-L- Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide the (Stana Peptide Institute) as a substrate 100 μL of the solution (pH 10.5) was added and mixed, and the amount of p-nitroaniline released upon reaction at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance at 420 nm (OD420 nm). The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitroaniline per minute was defined as 1 U.

＜アミラーゼ分泌生産能評価＞
アルカリアミラーゼ評価生産性評価は以下の手法にて行った。まず、発現用DNAの構築に際して、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表4に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、成熟型のアルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする領域を含む1.5kbのDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片のうち、成熟型アミラーゼをコードする領域及びその下流を配列番号３３に示す。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表4に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、表4に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流に成熟型のアルカリアミラーゼをコードする遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片を得た。得られた2.2kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。 <Evaluation of amylase secretion production ability>
Alkaline amylase evaluation Productivity evaluation was performed by the following method. First, when constructing DNA for expression, K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R shown in Table 4 were used as a template with genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946). PCR using the (XbaI) primer set and a 1.5 kb DNA containing a region encoding a mature alkaline amylase (JP 2000-184882, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) The fragment was amplified. Of the amplified DNA fragment, the region encoding mature amylase and its downstream are shown in SEQ ID NO: 33. Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 (FERM BP-7875) as a template, S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 4 were used. PCR was performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment containing a transcription initiation control region, a translation initiation control promoter region, and a region encoding a secretory signal sequence of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081). Next, the two fragments obtained were mixed and used as a template.By performing SOE-PCR using the primer set of S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 4, the alkaline cellulase gene A 2.1 kb DNA fragment was obtained in which a gene encoding a mature alkaline amylase was linked downstream of a transcription initiation regulatory region, a translation initiation regulatory promoter region, and a region encoding a secretory signal sequence. The obtained 2.2 kb DNA fragment was inserted into the BamHI-XbaI restriction enzyme cleavage point of the shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct a plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating alkaline amylase productivity.

Figure 2009038985
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さらに、構築したプラスミドpHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃において振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。   Furthermore, the constructed plasmid pHYK38 (S237ps) was introduced into each strain by protoplast transformation. The recombinant strain thus obtained was subjected to shaking culture in 10 mL of LB medium overnight at 37 ° C., and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined.

培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。   Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used to measure the amylase activity in the culture supernatant. In other words, 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1% NaCl-1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries) was added to 100 μL of R1 and R2 mixture (R1 (coupling enzyme): R2 (amylase substrate) ) = 5: 1 (Vol.)) Was added and mixed, and the amount of p-nitrophenol released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance (OD405 nm) at 405 nm. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.

＜結果＞
本実施例で行ったセルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼの生産性評価結果を図3に示す。図3は、24時間（白）、48時間（灰）、72時間（黒）目にサンプリングを行った結果であり（a）がセルラーゼ、（b）がプロテアーゼ、(c)がアミラーゼの生産性評価結果である。縦軸に培養液の遠心後上清における各酵素活性を相対活性で示しており、セルラーゼ、プロテアーゼに関してはKao9株を宿主とした場合の48時間目における活性を100%とした相対活性で示している。また、アミラーゼに関してはKao9株を宿主とした場合の72時間目における活性を100%とした相対活性で示している。この結果より、プロテアーゼはΔhtrA/B欠失株で顕著な生産性向上効果があることがわかった（156%）。 <Result>
The results of productivity evaluation of cellulase, protease, and amylase performed in this example are shown in FIG. Figure 3 shows the results of sampling at 24 hours (white), 48 hours (ash), and 72 hours (black), where (a) is cellulase, (b) is protease, and (c) is amylase productivity. It is an evaluation result. The vertical axis shows the relative activity of each enzyme in the supernatant after centrifugation of the culture solution, and the cellulase and protease are expressed as relative activities with the activity at 48 hours when the Kao9 strain is used as the host as 100%. Yes. As for amylase, the activity at 72 hours when the Kao9 strain is used as a host is shown as a relative activity with 100%. From these results, it was found that protease was a ΔhtrA / B deletion strain and had a significant productivity improvement effect (156%).

＜比較実験＞
本実施例では、上述したΔhtrA/B株における異種タンパク質の生産性と、ΔhtrA単独欠失株及びΔhtrB単独欠失株による異種タンパク質の生産性とを比較した。すなわち、プラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって、実施例１にて得られたΔhtrA株、ΔhtrB株、ΔhtrA/B株及びKao9株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を上述した手法にて測定した。 <Comparison experiment>
In this example, the productivity of the heterologous protein in the ΔhtrA / B strain described above was compared with the productivity of the heterologous protein by the ΔhtrA single deletion strain and the ΔhtrB single deletion strain. That is, plasmid pHYKAP (S237p) was introduced into the ΔhtrA strain, ΔhtrB strain, ΔhtrA / B strain and Kao9 strain obtained in Example 1 by the protoplast transformation method. The recombinant strain thus obtained was shake-cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the alkaline protease activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured by the method described above.

＜結果＞
本比較実験で行ったプロテアーゼの72時間目における生産性評価結果を図4に示す。活性はKao9株を宿主とした場合の培養活性を100%とする相対活性で示している。図4よりΔhtrA単独欠失株、ΔhtrB単独欠失株によるプロテアーゼ生産性向上効果は確認できず、プロテアーゼ生産性向上には両遺伝子の多重欠失（ΔhtrA/B欠失株）が必要であることが判明した。 <Result>
FIG. 4 shows the results of evaluating the productivity of the protease at 72 hours conducted in this comparative experiment. The activity is shown as a relative activity with the culture activity as 100% when the Kao9 strain is used as a host. From FIG. 4, the effect of improving protease productivity by a single deletion strain of ΔhtrA and a single deletion of ΔhtrB could not be confirmed, and multiple deletions of both genes (ΔhtrA / B deletion strain) are necessary to improve protease productivity. There was found.

〔実施例４〕野生株及びプロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）、プロテアーゼ5重欠失株（Kao5株）を親株とした場合のΔhtrA/Bによるリパーゼ及びアミラーゼ生産性向上効果
実施例1と同様の手法にて野生型枯草菌（Bacillus subtilis 168株）、プロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）（特開2006-174707号公報）、プロテアーゼ5重欠失株(kao5株)（特開2006-174707号公報）からhtrA及びhtrBを二重欠失した株168ΔhtrA/B株、Kao3ΔhtrA/B株、Kao5ΔhtrA/B株を作製した。ここで、プロテアーゼ3重欠失株（Kao3株）は、aprE、nprE、及びaprXの3遺伝子が欠失した変異株であり、プロテアーゼ5重欠失株(kao5株)は、nprB、bpr、mpr、epr及びwprA を欠失した変異株である。プロトプラスト形質転換法によって、作製した変異株及び親株に実施例1で作成したプラスミドpHLApmもしくは実施例2において構築したプラスミドpHYKAP(S237p)を導入し、これによって得られた組換え菌株を10 mLのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの2×L-マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のリパーゼ活性またはアルカリプロテアーゼ活性を実施例2または実施例3と同様の手法にて測定した。 [Example 4] Improvement of lipase and amylase productivity by ΔhtrA / B when a wild strain, a triple protease deletion strain (Kao3 strain), and a five protease deletion strain (Kao5 strain) are used as parent strains In the same manner, wild-type Bacillus subtilis (Bacillus subtilis 168 strain), protease triple-deficient strain (Kao3 strain) (JP-A-2006-174707), protease 5-deficient strain (kao5 strain) (JP-A 2006) Strain 168ΔhtrA / B, Kao3ΔhtrA / B, and Kao5ΔhtrA / B from which htrA and htrB were double-deleted were prepared from No. -174707. Here, the protease triple deletion strain (Kao3 strain) is a mutant strain in which three genes of aprE, nprE and aprX are deleted, and the protease triple deletion strain (kao5 strain) is nprB, bpr, mpr , Epr and wprA deleted mutants. By the protoplast transformation method, the plasmid pHLApm prepared in Example 1 or the plasmid pHYKAP (S237p) constructed in Example 2 was introduced into the prepared mutant and parent strain, and the resulting recombinant strain was transferred to 10 mL of LB. The culture medium was shaken overnight at 37 ° C, and 0.05 mL of this culture was added to 50 mL of 2 x L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4 -5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the lipase activity or alkaline protease activity of the culture supernatant from which the cells were removed by centrifugation was measured in the same manner as in Example 2 or Example 3.

＜結果＞
本実施例で行ったリパーゼの72時間目における生産性評価結果を図5(a)に、プロテアーゼの生産性評価結果を図5(b)に示す。活性は各々の親株を宿主とした場合の培養活性を100%とする相対活性で示している。図5(a)よりリパーゼに関してはKao3株及びKao5株を親株としてhrtA及びhtrBを欠失した場合に生産性向上効果が確認された（127%及び123%）。また、図5(b)よりプロテアーゼに関してはKao5株を親株としてhrtA及びhtrBを欠失した場合に生産性向上効果が確認された（183%）。 <Result>
FIG. 5 (a) shows the results of evaluating the lipase productivity in 72 hours, and FIG. 5 (b) shows the results of evaluating the productivity of protease. The activity is shown as a relative activity with the culture activity as 100% when each parent strain is used as a host. From FIG. 5 (a), it was confirmed that the lipase was improved in productivity when hrtA and htrB were deleted using Kao3 and Kao5 as parent strains (127% and 123%). Further, from FIG. 5 (b), the productivity improvement effect was confirmed for the protease when hrtA and htrB were deleted with the Kao5 strain as the parent strain (183%).

SOE-PCRによる遺伝子欠失導入用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失（薬剤耐性遺伝子と置換）させる方法を示す模式図である。It is a schematic diagram showing preparation of a DNA fragment for gene deletion introduction by SOE-PCR and a method of deleting a target gene (substitution with a drug resistance gene) using the DNA fragment. ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株におけるリパーゼ分泌生産能を示す特性図である。It is a characteristic figure which shows the lipase secretion production ability in (DELTA) htrA strain | stump | stock, (DELTA) htrB strain | stump | stock, and (DELTA) htrA / B strain | stump | stock. ΔhtrA/B株におけるセルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼの分泌生産能を示す特性図である。It is a characteristic view showing the secretory production ability of cellulase, protease and amylase in the ΔhtrA / B strain. ΔhtrA株、ΔhtrB株及びΔhtrA/B株におけるプロテアーゼ分泌生産能を示す特性図である。It is a characteristic figure which shows the protease secretion production ability in (DELTA) htrA strain | stump | stock, (DELTA) htrB strain | stump | stock, and (DELTA) htrA / B strain | stump | stock. 168ΔhtrA/B株、Kao3ΔhtrA/B、Kao5ΔhtrA/Bにおけるリパーゼ及びプロテアーゼの分泌生産能を示す特性図である。It is a characteristic figure which shows the lipase and protease secretory production ability in 168 (DELTA) htrA / B strain | stump | stock, Kao3 (DELTA) htrA / B, and Kao5 (DELTA) htrA / B.

Claims (14)

枯草菌のhtrA遺伝子及びhtrB遺伝子、若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物。   A microorganism in which the htrA gene and htrB gene of Bacillus subtilis or a gene corresponding to the gene is deleted or inactivated. 上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子を更に欠失又は不活性化したことを特徴とする請求項１記載の微生物。   The microorganism according to claim 1, wherein one or more genes encoding a protease different from the protease encoded by the htrA gene, the htrB gene or a gene corresponding to the gene are further deleted or inactivated. . 上記htrA遺伝子、上記htrB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子によりコードされるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼをコードする遺伝子が、枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子並びに当該各遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項２記載の微生物。   A gene encoding a protease different from the protease encoded by the htrA gene, the htrB gene or the gene corresponding to the gene is an aprE gene of n. Bacillus subtilis, nprB gene, nprE gene, bpr gene, vpr gene, mpr gene, The microorganism according to claim 2, wherein the microorganism is selected from the group consisting of an epr gene, a wprA gene, an aprX gene, and genes corresponding to the respective genes. 枯草菌のaprE遺伝子、nprB遺伝子、nprE遺伝子、bpr遺伝子、vpr遺伝子、mpr遺伝子、epr遺伝子、wprA遺伝子及びaprX遺伝子、又は当該各遺伝子に相当する遺伝子を更に欠失又は不活性化したことを特徴とする請求項１記載の微生物。   It is characterized by further deleting or inactivating the aprE gene, nprB gene, nprE gene, bpr gene, vpr gene, mpr gene, epr gene, wprA gene and aprX gene of Bacillus subtilis, or genes corresponding to the respective genes. The microorganism according to claim 1. バチルス属細菌であることを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項記載の微生物。   The microorganism according to any one of claims 1 to 4, wherein the microorganism is a Bacillus bacterium. 枯草菌であることを特徴とする請求項５記載の微生物。   6. The microorganism according to claim 5, wherein the microorganism is Bacillus subtilis. タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１記載の微生物。   2. The microorganism according to claim 1, wherein a gene encoding a protein or polypeptide is introduced. 上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。   8. The microorganism according to claim 7, wherein at least one region selected from a transcription initiation control region, a translation initiation control region and a secretion signal region is bound upstream of a gene encoding the protein or polypeptide. 上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。   8. The microorganism according to claim 7, wherein three regions comprising a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are bound upstream of a gene encoding the protein or polypeptide. 上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、枯草菌由来のセルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kbに存在する転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。   8. The microorganism according to claim 7, wherein a transcription initiation control region and a translation initiation control region existing 0.6 to 1 kb upstream of a cellulase gene derived from Bacillus subtilis are linked upstream of the gene encoding the protein or polypeptide. . 上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、バチルス属細菌のリパーゼ遺伝子由来又はプロテアーゼ遺伝子由来の分泌シグナル領域を結合したことを特徴とする請求項７記載の微生物。   The microorganism according to claim 7, wherein a secretory signal region derived from a lipase gene of a Bacillus bacterium or a protease gene is linked upstream of the gene encoding the protein or polypeptide. 上記タンパク質又ポリペプチドをコードする遺伝子は枯草菌のLipA遺伝子であることを特徴とする請求項７乃至１１いずれか一項記載の微生物。   The microorganism according to any one of claims 7 to 11, wherein the gene encoding the protein or polypeptide is a LipA gene of Bacillus subtilis. 請求項１乃至１２いずれか一項記載の微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。   A method for producing a protein or polypeptide using the microorganism according to any one of claims 1 to 12. 請求項１２記載の微生物を用いるリパーゼの製造方法。   A method for producing a lipase using the microorganism according to claim 12.
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