JP4831352B2 - Probe binding particle, method for producing the same, and blocking agent - Google Patents

Description

本発明は、プローブ結合粒子およびその製造方法ならびに粒子などの固相のブロッキング剤に関する。   The present invention relates to a probe-binding particle, a method for producing the same, and a solid phase blocking agent such as a particle.

近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出方式として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相へ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質をブロッキング剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。   In recent years, for the purpose of early detection of diseases, etc., it has been required to increase the sensitivity of tests, and improving the sensitivity of diagnostic agents has become a major issue. In diagnostic agents using a solid phase such as magnetic particles, in order to improve sensitivity, a method using enzyme color development as a detection method is being switched to a method using fluorescence or chemiluminescence that can obtain higher sensitivity. With the development of these detection techniques, it is theoretically said that it has reached a level at which even the presence of a single molecule of a test substance can be detected, but in reality, sufficient sensitivity has not been obtained. The reason for this is that in the diagnosis of detecting specific substances in the presence of biomolecules such as serum, coexisting biomolecules, secondary antibodies, luminescent substrates, etc. adsorb non-specifically to the solid phase, resulting in noise. Increasing the sensitivity is hindering. For this reason, in immunodiagnostic measurement, albumin, casein, gelatin are usually used to reduce the decrease in sensitivity due to non-specific adsorption of substances other than substances that specifically bind to the solid surface used for the immune reaction. By using a biological material such as a blocking agent, non-specific adsorption is suppressed and noise is reduced.

しかしながら、従来法によるブロッキング操作を施しても、なお、非特異的な吸着が残り、さらに、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。   However, even if the blocking operation by the conventional method is performed, non-specific adsorption still remains, and when a biologically derived blocking agent is used, there is a problem of biological contamination represented by BSE. Development of a high-performance blocking agent is desired.

化学合成によるブロッキング剤としては、特開平１１−２８７８０２号公報や特許第３４０７３９７号にポリオキシエチレンを有するポリマーが提案されているが、これらのブロッキング剤によるノイズ低減効果は不十分であった。
特開平１１−２８７８０２号公報 特許第３４０７３９７号 As a blocking agent by chemical synthesis, polymers having polyoxyethylene have been proposed in JP-A-11-287802 and Japanese Patent No. 34079797, but the noise reduction effect by these blocking agents was insufficient.
JP 11-287802 A Japanese Patent No. 34079797

本発明の目的は、非特異吸着が低減され、高いＳ／Ｎ比を得ることができるプローブ結合粒子およびその製造方法、ならびに、化学発光免疫診断測定等において十分なノイズ低減効果を有する化学合成のブロッキング剤を提供することである。   An object of the present invention is to provide a probe-binding particle capable of obtaining a high S / N ratio with reduced non-specific adsorption, a method for producing the same, and chemical synthesis having a sufficient noise reduction effect in chemiluminescence immunodiagnostic measurement and the like. It is to provide a blocking agent.

本発明者らは、この課題を解決するために、特定の官能基を有する水溶性重合体が顕著なブロッキング効果を示すことを見いだし、本発明を完成した。   In order to solve this problem, the present inventors have found that a water-soluble polymer having a specific functional group exhibits a remarkable blocking effect, and completed the present invention.

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む。 A method for producing probe-bound particles according to an aspect of the present invention includes:
Binding a probe to the surface of the particle;
A step of treating the particles to which the probe is bound, using a blocking agent comprising a water-soluble copolymer having a functional group represented by the following formula (1):
including.

・・・・・（１）
上記プローブ結合粒子の製造方法において、
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有することができる。

(1)
In the method for producing probe-bound particles,
In the step of binding the probe, the particles may have at least one group selected from a carboxyl group, an active ester group, a tosyl group, an amino group, and an epoxy group.

上記プローブ結合粒子の製造方法において、
前記粒子は、磁性粒子であることができる。 In the method for producing probe-bound particles,
The particles can be magnetic particles.

本発明の一態様に係るブロッキング剤は、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなる。   The blocking agent which concerns on 1 aspect of this invention consists of a water-soluble copolymer which has a functional group shown by following formula (1).

・・・・・（１）
上記ブロッキング剤において、前記水溶性共重合体を、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得ることができる。

(1)
In the blocking agent, the water-soluble copolymer can be obtained by copolymerizing (meth) acryloylmorpholine and other monomers.

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得られる。   The probe-coupled particle according to one embodiment of the present invention is obtained by the above-described method for producing a probe-coupled particle.

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記ブロッキング剤を表面に有する。   The probe binding particle according to one embodiment of the present invention has the blocking agent on the surface.

上記プローブ結合粒子によれば、非特異吸着が低減され、高いＳ／Ｎ比を得ることができる。   According to the probe binding particles, non-specific adsorption is reduced, and a high S / N ratio can be obtained.

上記ブロッキング剤は、化学合成により製造できることから生物汚染の可能性がないうえ、従来用いられてきたブロッキング剤に比べて、ノイズ低減効果が高い。より具体的には、上記ブロッキング剤は、非特異吸着低減のために使用されている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤を代替することができる。   Since the said blocking agent can be manufactured by chemical synthesis, there is no possibility of biological contamination, and the noise reduction effect is higher than that of conventionally used blocking agents. More specifically, the blocking agent can replace a blocking agent such as bovine serum albumin (BSA) used for reducing non-specific adsorption.

また、上記ブロッキング剤は、免疫診断に使用される粒子（例えば磁性粒子）に用いた場合にシグナル増強効果を発現することができる。   Moreover, the said blocking agent can express a signal enhancement effect, when it uses for the particle | grains (for example, magnetic particle) used for an immunodiagnosis.

以下、本発明の一実施形態に係るブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法について説明する。   Hereinafter, a blocking agent, probe-binding particles, and a production method thereof according to an embodiment of the present invention will be described.

１．ブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法
１．１．ブロッキング剤の構造
本発明の一実施形態に係るブロッキング剤は、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなる。 1. Blocking agent and probe-binding particles and production method thereof 1.1. Structure of blocking agent The blocking agent according to one embodiment of the present invention comprises a water-soluble copolymer having a functional group represented by the following formula (1).

・・・・・（１）
水溶性共重合体は、上記式（１）で示される官能基以外に、水酸基、アルコキシアルキル基、ポリオキシエチレン基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン基、１級〜４級アミノ基、アミド基などの親水基；アルキル基、アリール基、カルボン酸アルキルエステル基などの疎水基を側鎖として含んでいてもよい。

(1)
In addition to the functional group represented by the above formula (1), the water-soluble copolymer is a hydroxyl group, alkoxyalkyl group, polyoxyethylene group, carboxyl group, carbonyl group, sulfone group, primary to quaternary amino group, amide group. Hydrophobic groups such as alkyl groups, aryl groups, and carboxylic acid alkyl ester groups may be included as side chains.

水溶性共重合体は、上記式（１）で示される官能基を側鎖に有することが好ましい。この場合、水溶性共重合体の主鎖としては、例えば、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネートなどを挙げることができ、製造が容易であることから、好ましい主鎖はポリエチレンである。   The water-soluble copolymer preferably has a functional group represented by the above formula (1) in the side chain. In this case, examples of the main chain of the water-soluble copolymer include polyethylene, polyether, polyamide, polyester, polycarbonate, and the like. Since the production is easy, the preferable main chain is polyethylene.

水溶性共重合体の分子量は、好ましくは１，０００〜１，０００，０００、より好ましくは２，０００〜２００，０００である。   The molecular weight of the water-soluble copolymer is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 2,000 to 200,000.

１．２．ブロッキング剤の製造
本実施形態に係るブロッキング剤において、水溶性共重合体は、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得ることができる。 1.2. Production of Blocking Agent In the blocking agent according to this embodiment, the water-soluble copolymer can be obtained by copolymerizing (meth) acryloylmorpholine and other monomers.

好ましいモノマーの比率は、（メタ）アクリロイルモルホリン５０〜９９重量部とその他のモノマー５０〜１重量部であり、より好ましいモノマーの比率は、（メタ）アクリロイルモルホリン６０〜９８重量部とその他のモノマー４０〜２重量部である。   A preferred monomer ratio is 50 to 99 parts by weight of (meth) acryloylmorpholine and 50 to 1 part by weight of other monomers, and a more preferred monomer ratio is 60 to 98 parts by weight of (meth) acryloylmorpholine and other monomers 40. ~ 2 parts by weight.

（メタ）アクリロイルモルホリンには、アクリロイルモルホリン、メタクリロイルモルホリン、およびこれらの混合物が含まれ、好ましくは、アクリロイルモルホリンを用いる。   The (meth) acryloylmorpholine includes acryloylmorpholine, methacryloylmorpholine, and a mixture thereof, and preferably acryloylmorpholine is used.

その他のモノマーとしては、例えば、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールエチルエーテル（メタ）アクリレートなどのアルコキシアルキル基を有するモノマー；ポリエチレングリコール（メタ）アクリルエステル、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルエステルなどのポリオキシエチレン基を有するモノマー；アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのカルボキシル基を有するモノマー；ダイアセトンアクリルアミド、アクロレイン、ホルミルスチロールなどのカルボニル基を有するモノマー；スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのスルホン基を有するモノマー；アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのメチルクロライド４級塩などの１級〜４級アミノ基を有するモノマー；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドなどのアミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンなどの疎水性モノマーを挙げることができる。   Other monomers include, for example, monomers having a hydroxyl group such as hydroxyethyl (meth) acrylate and allyl alcohol; monomers having an alkoxyalkyl group such as methoxyethyl (meth) acrylate and diethylene glycol ethyl ether (meth) acrylate; polyethylene glycol ( Monomers having a polyoxyethylene group such as (meth) acrylic ester and polyethylene glycol di (meth) acrylic ester; monomers having a carboxyl group such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, maleic acid, crotonic acid; diacetone acrylamide, Monomers having a carbonyl group such as acrolein and formylstyrene; styrene sulfonic acid, isoprene sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpro Monomers having a sulfone group such as sulfonic acid; monomers having primary to quaternary amino groups such as allylamine, aminostyrene, N, N-dimethylaminopropylacrylamide, and methyl chloride quaternary salt of N, N-dimethylaminopropylacrylamide Monomers having amide groups such as (meth) acrylamide and N, N-dimethyl (meth) acrylamide; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, lauryl (meth) acrylate And hydrophobic monomers such as cyclohexyl (meth) acrylate, isobornyl (meth) acrylate, benzyl (meth) acrylate, and styrene.

これらのモノマーのうち、アミノ基を有するモノマーを共重合することにより、アニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。また、疎水性モノマーを共重合することにより、疎水性の固相表面と疎水結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。   Among these monomers, by copolymerizing a monomer having an amino group, it becomes possible to perform a Coulomb bond with the anionic solid phase surface, thereby enhancing the blocking effect. Further, by copolymerizing a hydrophobic monomer, it becomes possible to form a hydrophobic bond with the hydrophobic solid phase surface, thereby enhancing the blocking effect.

本実施形態に係るブロッキング剤は、これらのモノマーと、必要に応じて副原料である重合開始剤、界面活性剤、電解質、分子量調節剤などを必要に応じて添加し、水、アルコール、ＴＨＦ、ＤＭＦあるいはこれらの混合液などの溶媒中で重合を行うことにより得ることができる。重合時間は好ましくは１〜１０時間、重合温度は好ましく０〜１２０℃である。   The blocking agent according to the present embodiment is added with these monomers and, if necessary, a polymerization initiator, a surfactant, an electrolyte, a molecular weight regulator, and the like, which are auxiliary materials, if necessary, water, alcohol, THF, It can be obtained by polymerization in a solvent such as DMF or a mixture thereof. The polymerization time is preferably 1 to 10 hours, and the polymerization temperature is preferably 0 to 120 ° C.

なお、開始剤として、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「ＶＡ−０６７」）などのカチオン性開始剤を使用することにより、ブロッキング剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。このような開始剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．２〜５質量部である。   As initiators, 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (“V-50” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2′-azobis (1-imino-1-pyrrolidino) By using a cationic initiator such as -2-ethylpropane) dihydrochloride ("VA-067" manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the blocking agent can be coulomb bonded to the anionic solid phase surface. Thus, the blocking effect can be enhanced. The amount of the initiator used is preferably 0.2 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.

また、分子量調節剤として、２−メルカプトエチルアミン（システアミン）、３−メルカプトプロピルアミン、２−メルカプトプロピルアミンなどのカチオン性分子量調節剤を使用することにより、上記のカチオン性開始剤と同様にブロッキング剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。このような分子量調節剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．１〜１０質量部である。   In addition, by using a cationic molecular weight regulator such as 2-mercaptoethylamine (cysteamine), 3-mercaptopropylamine, 2-mercaptopropylamine as a molecular weight regulator, a blocking agent in the same manner as the above cationic initiator. Can be coulomb-bonded to the anionic solid phase surface, and the blocking effect can be enhanced. The use amount of such a molecular weight regulator is preferably 0.1 to 10 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.

１．３．ブロッキング剤の用途ならびにプローブ結合粒子およびその製造
本実施形態に係るブロッキング剤は、従来の免疫診断測定において用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、さらに非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。 1.3. Use of blocking agent and probe-binding particles and production thereof The blocking agent according to this embodiment further suppresses non-specific adsorption by substituting albumin, casein, gelatin and the like used in conventional immunodiagnostic measurement, Noise can be reduced.

例えば、プレート法において、プレートへ抗体などのプローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、プレート表面を処理することができる。   For example, in the plate method, after binding a probe such as an antibody to the plate, the blocking agent according to this embodiment can be added to treat the plate surface.

また、本実施形態に係るブロッキング剤は例えば、プローブ結合粒子の製造に好適に使用することができる。本実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程とを含む。   Moreover, the blocking agent which concerns on this embodiment can be used conveniently for manufacture of probe coupling | bonding particle | grains, for example. The method for producing probe-bound particles according to the present embodiment includes a step of binding a probe to the surface of the particle and a step of processing the particles to which the probe is bound using the blocking agent according to the present embodiment.

ここで、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程は、例えば、本実施形態に係るブロッキング剤を粒子の表面に所定時間接触させることにより行うことができる。これにより、粒子表面における非特異吸着を抑制し、ノイズを低減することができる。また、この工程は例えば、本実施形態に係るブロッキング剤の溶液中に粒子を分散させた状態で行うことができる。   Here, the process of processing the particle | grains with which the probe was couple | bonded using the blocking agent which concerns on this embodiment can be performed by making the blocking agent which concerns on this embodiment contact the particle | grain surface for a predetermined time, for example. . Thereby, nonspecific adsorption | suction on the particle | grain surface can be suppressed and noise can be reduced. Moreover, this process can be performed in the state which disperse | distributed the particle | grains in the solution of the blocking agent which concerns on this embodiment, for example.

この場合、プローブを結合させる粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を少なくとも表面に有することが好ましい（その理由については後述する）。また、この場合、粒子は磁性粒子であることが好ましい。   In this case, the particle to which the probe is bonded preferably has at least one group selected from a carboxyl group, an active ester group, a tosyl group, an amino group, and an epoxy group on the surface (the reason will be described later). . In this case, the particles are preferably magnetic particles.

より具体的には、例えば、イムノクロマト法において、着色粒子に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、着色粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。また、例えば、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡなどのアッセイ法において、磁性粒子の表面に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、該磁性粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。   More specifically, for example, in an immunochromatography method, after binding a probe such as an antibody to a colored particle, the blocking agent according to this embodiment is added to treat the surface of the colored particle, thereby binding the probe-bound particle. Can be obtained. Further, for example, in an assay method such as EIA, CLIA, CLEIA, etc., after binding a probe such as an antibody to the surface of the magnetic particle, the blocking agent according to this embodiment is added to treat the surface of the magnetic particle. Thus, probe-bound particles can be obtained.

以上に説明したように、本実施形態に係るブロッキング剤は、上記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減し、免疫診断測定における擬陽性の出現率を低下することができる。   As described above, the blocking agent according to the present embodiment comprises a water-soluble copolymer having a functional group represented by the above formula (1), thereby suppressing non-specific adsorption and reducing noise. The incidence of false positives in immunodiagnostic measurements can be reduced.

本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、特にカルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、エポキシ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子（例えば磁性粒子）を処理する場合、例えば、ブロッキング剤中のアミド結合と粒子表面の活性基とが共有結合を形成し、免疫診断用抗体の配向性を向上させることから、シグナルを増強する効果が発現する。また、ブロッキング剤の脱離を抑制することができるため、界面活性剤などを含むバッファー類に対して、極めて安定性に富んだ検査試薬となる。   When the particles having at least the surface of an active group such as a carboxyl group, an active ester group, a tosyl group, an amino group, and an epoxy group (for example, magnetic particles) are treated using the blocking agent according to the present embodiment, for example, blocking Since the amide bond in the agent and the active group on the particle surface form a covalent bond and improve the orientation of the immunodiagnostic antibody, the effect of enhancing the signal appears. Further, since the elimination of the blocking agent can be suppressed, the test reagent is extremely stable with respect to buffers containing a surfactant or the like.

本実施形態に係るブロッキング剤が特に良好な効果を発現する担体は、カルボキシル基を有する粒子（例えば磁性粒子）である。その好ましい処理方法としては、カルボキシル基を有する粒子を水溶性カルボジイミドなどで活性エステルとし、免疫診断プローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤（シグナル増強剤）で処理する方法が挙げられる。   The carrier in which the blocking agent according to this embodiment exhibits a particularly good effect is particles having a carboxyl group (for example, magnetic particles). As a preferable treatment method, there is a method in which particles having a carboxyl group are converted into active esters with water-soluble carbodiimide or the like, and after binding an immunodiagnostic probe, the particles are treated with a blocking agent (signal enhancer) according to this embodiment.

本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のプローブ結合粒子の製造方法によって得ることができる。例えば、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のブロッキング剤を表面に有することができる。   The probe binding particles according to this embodiment can be obtained by the above-described method for manufacturing probe binding particles. For example, the probe binding particle according to the present embodiment can have the above-described blocking agent on the surface.

なお、本実施形態に係るブロッキング剤は、従来の免疫診断薬において添加剤として用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、保存時における固定化抗体の活性低下を防止したり、非特異検体のシグナルを抑制したり、抗原抗体反応を促進させる効果も有する。   In addition, the blocking agent according to the present embodiment can prevent the decrease in the activity of the immobilized antibody during storage by substituting albumin, casein, gelatin and the like used as additives in conventional immunodiagnostics, It also has the effect of suppressing the signal of a specific sample and promoting the antigen-antibody reaction.

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。 2. Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

２．１．実施例１
アクリロイルモルホリン９５ｇおよびメチルメタクリレート５ｇを水９００ｇに溶解して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら、７０℃まで昇温し、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド１ｇおよび２−メルカプトエチルアミン２ｇを添加した後、６時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して３時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた共重合体溶液を透析により精製し、さらに凍結乾燥することにより、本実施例のブロッキング剤（Ａ−１）９８ｇを得た。ブロッキング剤（Ａ−１）の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量５，０００をメインピークとするブロードなピークであった。 2.1. Example 1
95 g of acryloylmorpholine and 5 g of methyl methacrylate were dissolved in 900 g of water and put into a separable flask equipped with a stirrer. While nitrogen was blown into this, the temperature was raised to 70 ° C., 1 g of 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride and 2 g of 2-mercaptoethylamine were added, and polymerization was continued for 6 hours. After raising the temperature to 0 ° C. and aging for 3 hours, the mixture was cooled to room temperature. The obtained copolymer solution was purified by dialysis and further freeze-dried to obtain 98 g of the blocking agent (A-1) of this example. The molecular weight distribution of the blocking agent (A-1) by liquid chromatography was a broad peak having a molecular weight of 5,000 as a main peak.

カルボキシル基を有する磁性粒子（商品名「ＭＡＧ１１０１」、ＪＳＲ社製）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１０μｇを加え１５時間室温で反応した。反応後、ブロッキング剤（Ａ−１）の０．４％水溶液１２５μＬを加え、さらに１時間室温で攪拌した。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したタンパク結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られた免疫検査用粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離して上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定することによりシグナル強度を得た。化学発光量の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」）を用いた。その結果、シグナル強度は１１７５１３ＲＩＵであった。   1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) was dispersed in an aqueous dispersion having a solid content concentration of 1% in which 1 mg of magnetic particles having a carboxyl group (trade name “MAG1101”, manufactured by JSR) was dispersed. ) The carboxyl group was activated by adding an aqueous solution and rotating and stirring at room temperature for 2 hours. After separating this magnetically and discarding the supernatant, 10 μg of an antibody against human α-fetoprotein (hereinafter referred to as “AFP”) which is a tumor marker (hereinafter referred to as “anti-AFP antibody”, manufactured by Cosmo Bio Inc.) The mixture was reacted for 15 hours at room temperature. After the reaction, 125 μL of a 0.4% aqueous solution of blocking agent (A-1) was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 1 hour. This was magnetically separated, washed repeatedly with a cleaning solution (containing 25 mmol / L Tris-HCl, pH 7.4, 0.01% Tween 20), diluted with a cleaning solution to a particle concentration of 0.5%, and used as a primary probe. Protein-bound particles (immunoassay particles) bound with anti-AFP antibodies were obtained. Take 10 μl of the resulting immunological particle dispersion (corresponding to 50 μg of particles) in a test tube and mix with 50 μl of a standard specimen of AFP antigen (manufactured by Nippon Biotest) diluted to 100 ng / mL with fetal calf serum (FCS). And allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes. After separating the particles by magnetic separation and removing the supernatant, an anti-AFP antibody labeled with alkaline phosphatase (hereinafter referred to as “ALP”) as a secondary antibody (manufactured by Fujirebio Inc., attached to Lumipulse AFP-N) Using reagent) 40 μl was added and allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes. Then, after magnetic separation and removal of the supernatant, the particles obtained by repeating washing three times with PBS were dispersed in 50 μl of 0.01% Tween 20, and transferred to a new tube. After adding 100 μl of ALP substrate solution (Lumipulse substrate solution: manufactured by Fujirebio Inc.) and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, signal intensity was obtained by measuring the amount of chemiluminescence. A chemiluminescence measuring apparatus (trade name “Lumat LB9507”) manufactured by Bertol Japan KK was used for the measurement of the chemiluminescence amount. As a result, the signal intensity was 11717513 RIU.

また、上記ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にして化学発光量を測定することにより得られたノイズ強度は、５８ＲＩＵであった。   In addition, instead of 50 μl of the standard sample of AFP antigen diluted to 100 ng / mL with fetal calf serum (FCS), the amount of chemiluminescence should be measured in the same manner as above except that 50 μl of FCS not containing AFP antigen is used. The noise intensity obtained from the above was 58 RIU.

２．２．比較例１
実施例１において、アクリロイルモルホリンの代わりにポリエチレングリコールメタクリレートを使用した以外は、実施例1と同様にして、上記式（１）で示される官能基を有さないブロッキング剤を得た。但し、本比較例においては、重合中に溶液の粘度上昇が見られたため、重合中に適宜、水を添加した。本比較例で得られたブロッキング剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量８，０００をメインピークとするブロードなピークであった。 2.2. Comparative Example 1
In Example 1, a blocking agent having no functional group represented by the above formula (1) was obtained in the same manner as in Example 1 except that polyethylene glycol methacrylate was used instead of acryloylmorpholine. However, in this comparative example, since an increase in the viscosity of the solution was observed during the polymerization, water was appropriately added during the polymerization. The molecular weight distribution of the blocking agent obtained in this Comparative Example by liquid chromatography was a broad peak with a molecular weight of 8,000 as the main peak.

また、本比較例で得られたブロッキング剤を用いて、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、１０９０３３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１０３ＲＩＵであった。   Further, the magnetic particles were processed in the same manner as in Example 1 using the blocking agent obtained in this Comparative Example, and the signal intensity and noise intensity were determined. As a result, the signal intensity was 109033 RIU, and the noise intensity was 103 RIU.

２．３．比較例２
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９７６２５ＲＩＵであり、ノイズ強度は、８５ＲＩＵであった。 2.3. Comparative Example 2
In Example 1, except that bovine serum albumin was used instead of the blocking agent (A-1), the magnetic particles were processed in the same manner as in Example 1 to determine the signal intensity and noise intensity. As a result, the signal intensity was 97625 RIU and the noise intensity was 85 RIU.

２．４．比較例３
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）を使用しなかった以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９４７５３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１２１ＲＩＵであった。 2.4. Comparative Example 3
In Example 1, except that the blocking agent (A-1) was not used, the magnetic particles were processed in the same manner as in Example 1 to determine signal intensity and noise intensity. As a result, the signal intensity was 947553 RIU, and the noise intensity was 121 RIU.

Claims (7)

粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む、プローブ結合粒子の製造方法。

・・・・・（１） Binding a probe to the surface of the particle;
A step of treating the particles to which the probe is bound, using a blocking agent comprising a water-soluble copolymer having a functional group represented by the following formula (1):
A method for producing probe-bound particles, comprising:

(1) 請求項１において、
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有する、プローブ結合粒子の製造方法。 In claim 1,
In the step of binding the probe, the particle has at least one group selected from a carboxyl group, an active ester group, a tosyl group, an amino group, and an epoxy group. 請求項１または２において、
前記粒子は、磁性粒子である、プローブ結合粒子の製造方法。 In claim 1 or 2,
The method for producing probe-bonded particles, wherein the particles are magnetic particles. 下記式（１）で示される官能基を有する水溶性共重合体からなるブロッキング剤。

・・・・・（１） A blocking agent comprising a water-soluble copolymer having a functional group represented by the following formula (1).

(1) 請求項４において、
前記水溶性共重合体は、（メタ）アクリロイルモルホリンと、その他のモノマーとを共重合して得られる、ブロッキング剤。 In claim 4,
The water-soluble copolymer is a blocking agent obtained by copolymerizing (meth) acryloylmorpholine and other monomers. 請求項１ないし３のいずれかに記載のプローブ結合粒子の製造方法によって得られるプローブ結合粒子。   Probe-bound particles obtained by the method for producing probe-bound particles according to any one of claims 1 to 3. 請求項４または５に記載のブロッキング剤を表面に有する、プローブ結合粒子。   Probe-bound particles having the blocking agent according to claim 4 or 5 on the surface.