JP4817356B2 - 光学顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、光学顕微鏡に関し、特に詳しくは試料に照射するレーザ光と異なる波長の光を検出する光学顕微鏡に関する。

ラマン分光測定は、試料が気体、液体、結晶、無定形固体であることを問わず、温度は高温でも低温でも可能であり、測定において、真空などの特殊な測定雰囲気を必要をしないという利点を持つ。さらに、試料の前処理を特に必要とせず、試料をそのままの状態で測定可能であるなどの長所があり、これらの長所を生かした測定が多くなされている。ラマン分光測定を利用することによって、分子を非染色で観測すること、及び半導体中の不純物を観測することができる

このようなラマン分光測定を行うため、分光器を用いたラマン顕微鏡が開示されている（特許文献１、特許文献２）。このラマン顕微鏡では、試料にレーザ光を集光して照射している。そして、試料からのラマン散乱光を分光器で分光することにより、ラマンスペクトルを測定することができる。さらに、これらのラマン顕微鏡では、試料を移動させて測定することにより、特定の波長におけるラマン散乱光強度の空間分布を測定することができる。また、シリンドリカルレンズにより試料をライン状に照明して、ＣＣＤカメラにより検出するラマン顕微鏡も開示されている（非特許文献１）。
特開２００２−１４０４３号公報 特開２００３−３４４７７６号公報 ＣＨＡＲＬＥＮＥ Ａ．ＤＲＵＭＭ、他１名「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｒａｍａｎ Ｌｉｎｅ−Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ、１９９５年、４９巻、第９号、ｐ．１３３１−１３３７

しかしながら、従来のラマン顕微鏡では以下のような問題点があった。例えば、生体のラマン散乱は弱いため、１点あたりのラマンスペクトルの測定時間（積算時間）が長くなる。例えば、１点あたりの積算時間を１秒すると、６４×６４ｐｉｘｅｌの画像を取得する場合に１時間以上（４０９６秒＝６４×６４秒）かかってしまう。さらに積算時間を上げて波長分解能を向上させる場合、解像度を上げるため又はより広い領域を測定するため測定点を増やす場合は、測定時間がより長時間となってしまうという問題点があった。

このような長時間の測定を避けるためには、測定範囲、すなわち観察範囲を狭くする必要がある。また、測定範囲を広くするためには、解像度を下げる必要がある。あるいは、測定するスペクトルの範囲を狭くしたり、特定の波長に対してのみ測定する必要がある。このように従来のラマン顕微鏡では、測定時間が長時間となるため、測定が制限されてしまうという問題点があった。

このように従来のラマン顕微鏡では、測定時間が長時間となってしまい測定が制限されるという問題点があった。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、測定時間を短縮することができる光学顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様にかかる光学顕微鏡は、レーザ光源（例えば、本発明の実施の形態にかかるレーザ光源１１）と、前記レーザ光源からの光ビームをライン状の光ビームに変換する光変換手段（例えば、本発明の実施の形態にかかる第３のレンズシリンドリカル１５及び／又はアイリス絞り３９）と、前記ライン状に変換された光ビームを走査する走査手段（例えば、本発明の実施の形態にかかるガルバノミラー２３）と、前記走査手段により走査された光ビームをライン状に集光して試料に入射させる対物レンズ（例えば、本発明の実施の形態にかかる対物レンズ２７）と、前記試料に入射された光ビームのうち、異なる波長となって前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光を前記レーザ光源から前記試料に入射するライン状の光ビームと分岐する第１のビームスプリッタ（例えば、本発明の実施の形態にかかる第１のビームスプリッタ２２）と、前記第１のビームスプリッタにより分岐された出射光が入射する入射側に前記ライン状の光ビームに対応する方向に沿って配置された入射スリット（例えば、本発明の実施の形態にかかる入射スリット３２）を有し、前記入射スリットを通過した前記出射光を波長に応じて空間的に分散させる分光器（例えば、本発明の実施の形態にかかる分光器３３）と、前記分光器で分散させた出射光を検出する２次元アレイ光検出器（例えば、本発明の実施の形態にかかる検出器３４）とを備えるものである。これにより、測定時間を短縮することができる。

本発明の第２の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記走査手段がガルバノミラーであることを特徴とするものである。これにより、走査速度を向上することができ、さらに試料に照射される光ビームの変動を少なくすることができる。よって、利便性を向上することができる。

本発明の第３の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記走査手段が前記光ビームのラインの方向と垂直な方向に光ビームを走査するものである。これにより、測定時間を短縮することができる。

本発明の第４の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記光変換手段がシリンドリカルレンズを有していることを特徴とするものである。これにより、レーザ光源からの光を効率よく試料に入射させることができ、測定時間を短縮することができる。

本発明の第５の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記シリンドリカルレンズにより前記入射光が集光される位置にスリット状の開口を有するアイリス絞り（例えば、本発明の実施の形態にかかるアイリス絞り３９）であって、前記開口の大きさが可変であるアイリス絞りが設けられているものである。これにより、測定時間を短縮することができる。

本発明の第６の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記第１のスプリッタと前記２次元アレイ光検出器の間に、前記レーザ光源のレーザ波長の光を遮るフィルタ（例えば、本発明の実施の形態にかかるエッジフィルタ３８）が設けられていることを特徴とするものである。これにより、測定時間を短縮することができる。

本発明の第７の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記光変換手段により集光される面と試料面とが互いに共役な関係となり、前記試料面と前記入射スリットが互いに共役な関係となっているものである。これにより、分解能を向上することができる。

本発明の第８の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記対物レンズと前記試料との相対距離が可変であることを特徴とするものである。これにより、簡易な構成で３次元測定を行うことができる。

本発明の第９の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記試料の前記対物レンズと反対側に配置され、照明光を出射する照明光源（例えば、本発明の実施の形態にかかる照明光源４１）と、前記照明光源からの照明光をリング状の照明光にするリングスリット（例えば、本発明の実施の形態にかかるリングスリット４３）と、前記リング状の照明光を集光して前記試料に入射させるコンデンサーレンズ（例えば、本発明の実施の形態にかかるコンデンサーレンズ４４）と、前記コンデンサーレンズにより集光され前記試料を透過した透過光が前記対物レンズを介して入射する第２のビームスプリッタ（例えば、本発明の実施の形態にかかる第２のビームスプリッタ２１）であって、前記透過光の光路を前記レーザ光源からの前記入射光の光路と分岐する第２のビームスプリッタと、前記第２のビームスプリッタによって分岐された透過光の前記リングスリットに対応するリング状の領域に位相差を設ける位相板（例えば、本発明の実施の形態にかかる位相板４６）と、前記位相板からの透過光を撮像する撮像素子（例えば、本発明の実施の形態にかかるＣＣＤカメラ４８）とをさらに備えるものである。これにより、透過光を検出することができるため、利便性を向上することができる。

本発明の第１０の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記第１のビームスプリッタが前記第２のビームスプリッタの試料側に配置され、前記第１のビームスプリッタを介して前記透過光が前記第２のビームスプリッタに入射していることを特徴とするものである。これにより、試料からの出射光を効率よく検出器に入射されることができるため、測定時間を短縮することができる。

本発明の第１１の態様にかかる光学顕微鏡は、上述の光学顕微鏡において、前記撮像素子により、前記試料中の位相が異なる位相物体の分布を観察するものである。これにより、簡易な構成で位相物体を観察することができるため、利便性を向上することができる。

本発明によれば、測定時間を短縮することができる光学顕微鏡を提供することができる。

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。

本発明の実施の形態にかかる光学顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は本実施の形態にかかる光学顕微鏡の光学系の構成を模式的に示す図である。１は光学顕微鏡、１１はレーザ光源、１２はミラー、１３は第１のシリンドリカルレンズ、１４は第２のシリンドリカルレンズ、１５は第３のシリンドリカルレンズ、１６はレンズ、２１は第２のビームスプリッタ、２２は第１のビームスプリッタ、２３はガルバノミラー、２４はレンズ、２５はミラー、２６はレンズ、２７は対物レンズ、２８は試料、３１はレンズ、３２は入射スリット、３３は分光器、３４は検出器、３５は処理装置、３８はエッジフィルタ、３９はアイリス絞り、４１は照明光源、４２はレンズ、４３はリングスリット、４４はコンデンサーレンズ、４５ａはレンズ、４５ｂはレンズ、４６は位相板、４７はレンズ、４８は撮像素子である。また、６１はレーザ光源１１から試料２８に入射する入射光、６２は入射光６１のうち試料２８でラマン散乱されて試料２８から出射された出射光、７１は照明光源４１から試料２８に入射する照明光、７２は照明光源４１から入射した照明光７１のうち試料２８を透過した透過光である。

光学顕微鏡１はレーザ光源１１、出射光６２を分光する分光器３３、分光器３３で分光された出射光６２を検出する検出器３４及びレーザ光源１１と分光器３３との間の光学系を有するラマン顕微鏡並びに、照明光源４１、照明光源４１から入射して試料２８を透過した透過光７２を検出するＣＣＤカメラ４８及び照明光源４１からＣＣＤカメラ４８までの光学系を有する位相差顕微鏡を備えている。位相差顕微鏡とラマン顕微鏡では光学系が重複した部分を有している。本実施の形態かかる光学顕微鏡１では、レーザ光源１１又は照明光源４１をオフすることにより、ラマン顕微鏡又は位相差顕微鏡のいずれか一方で観察することができる。すなわちラマン顕微鏡及び位相差顕微鏡が排他的に使用される。なお、光源をオフする他、レーザ光源１１又は照明光源４１からの光を遮るシャッターをそれぞれ設けて、いずれか一方からの光を遮光してもよい。

まず、光学顕微鏡１のうちのラマン顕微鏡の構成について図１を参照して説明する。レーザ光源１１は単色のレーザ光を出射する。レーザ光源１１には、例えば、スペクトラフィジックス社製Ｍｉｌｌｅｎｎｉａを用いることができる。このレーザ光源１１はレーザ波長５３２ｎｍ、線幅０．２４ｎｍ、最大出力が１０ＷのＮｄ／ＹＶＯ４レーザである。レーザ光源１１はこのレーザ波長を有するレーザ光を出射する。レーザ光源１１からのレーザ光が後述の光学系を伝播して試料２８に入射する入射光６１となる。

レーザ光源１１からの入射光６１は図示しないレンズなどにより平行光束となって、ミラー１２に入射する。そして、入射光６１はミラー１２で反射され第１の第１のシリンドリカルレンズ１３に入射する。第１のシリンドリカルレンズ１３は入射光６１を１方向にのみ屈折する。以下、光の伝播方向、すなわち光軸方向をＺ方向とし、Ｚ方向に垂直な平面をＸＹ平面として説明する。第１のシリンドリカルレンズ１３はＹ方向の焦点距離が５０ｍｍのレンズであり、入射光６１をＹ方向に屈折させる。第１のシリンドリカルレンズ１３によってＹ方向に屈折された入射光６１はライン状に集光される。すなわち、入射光６１は第１のシリンドリカルレンズ１３により一旦、Ｘ方向に沿ったライン状の光ビームに変換される。ライン状に集光された入射光６１は広がって、第２のシリンドリカルレンズ１４に入射する。第２のシリンドリカルレンズ１４はＹ方向の焦点距離が１００ｍｍのレンズである。第２のシリンドリカルレンズ１４は入射光６１をＹ方向に屈折させ、平行光束に変換する。すなわち、第２のシリンドリカルレンズ１４からの入射光６１はＹ方向に伸びたビーム形状をしている。換言すると第１のシリンドリカルレンズ１３及び第２のシリンドリカルレンズ１４はＹ方向にビーム径を広げるビームエキスパンダーである。

第２のシリンドリカルレンズ１４からの入射光６１は第３のシリンドリカルレンズ１５に入射する。第３のシリンドリカルレンズ１５はＸ方向の焦点距離が１００ｍｍのレンズである。第３のシリンドリカルレンズ１５はＸ方向に入射光６１を屈折させる。この第３のシリンドリカルレンズ１５によって、入射光６１はＸ方向に集光される。よって、第３のシリンドリカルレンズ１５は入射光６１をＹ方向に沿ったライン状の光ビームに変換する。シリンドリカルレンズを用いることにより効率よくライン状の光に変換することができる。第３のシリンドリカルレンズ１５はアイリス絞り３９の位置で入射光６１を結像する。すなわち、第３のシリンドリカルレンズ１５はアイリス絞り３９の位置で、入射光６１がライン状に光ビームとなるよう集光する。換言すると、第３のシリンドリカルレンズ１５の後の像面部にアイリス絞り３９を配置する。アイリス絞り３９はライン状の入射光６１の方向に対応するスリット状の開口部を有している。アイリス絞り３９は試料２８に集光されるライン状の入射光６１の大きさを設定する。このアイリス絞り３９の開口部の大きさを可変とすることによって、試料２８上における入射光６１の光ビームのスポットの大きさ、すなわちラマン顕微鏡における照明領域を調整することができる。

第３のシリンドリカルレンズ１５によって屈折され、アイリス絞り３９を通過してライン状に変換された入射光６１はＸ方向に広がってレンズ１６に入射する。レンズ１６は例えば、焦点距離１６０ｍｍのレンズである。レンズ１６は、第３のシリンドリカルレンズ１５により一旦ライン状に集光された後、広がって入射する入射光６１を屈折して、平行光束にする。レンズ１６からの入射光６１の一部は第２のビームスプリッタ２１及び第１のビームスプリッタ２２を通過して、ガルバノミラー２３に入射する。ガルバノミラー２３は入射光６１を走査するとともに、レンズ２４の方向に反射する。すなわち、ガルバノミラー２３はライン状に変換された光ビームを走査する走査手段である。処理装置３５から電気信号を入力してガルバノミラー２３の角度を変えることにより、入射光６１を走査することができる。

ガルバノミラー２３で反射された入射光６１はレンズ２４に入射する。レンズ２４は例えば、焦点距離が２００ｍｍのレンズであり、入射光６１を屈折させる。レンズ２４で屈折された入射光６１は、ミラー２５に入射する。ミラー２５に入射した入射光６１は反射され、レンズ２６に入射する。レンズ２６は例えば、焦点距離が２００ｍｍのレンズである。レンズ２６は入射光６１を屈折して、対物レンズ２７に入射させる。対物レンズ２７は入射光６１を集光して試料２８に入射させる。対物レンズ２７には、例えば、ニコン製アポクロマート ＮＡ １．２ ｘ６０を用いることができる。対物レンズ２７は第３のシリンドリカルレンズ１５によってライン状に変換された入射光６１を試料面上においてライン状に集光する。すなわち、アイリス絞り３９と試料２８とは互いに共役な関係に配置される。

試料２８に入射した入射光６１の一部はラマン散乱される。試料２８に入射した入射光６１のうち、ラマン散乱により対物レンズ２７側に出射した光を出射光６２とする。すなわち、ラマン散乱光のうち、対物レンズ２７に入射したものを出射光６２とする。ラマン散乱された出射光６２は入射光６１とは異なる波長となっている。すなわち、ラマンシフトによって出射光６２は入射光６１の振動数からずれて散乱される。この出射光６２のスペクトルがラマンスペクトルとなる。したがって、出射光６２のスペクトルを測定することにより、試料２８中に含まれる物質の化学構造及び物理的状態を特定することができる。すなわち、ラマンスペクトルには、試料２８を構成する物質の振動数の情報が含まれるため、出射光６２を分光器３３で分光して検出することにより、試料２８中の物質を特定することができる。そして、入射光６１をＸＹＺ方向にスキャンして試料２８の全面又は一部の領域からの出射光６２のスペクトルを測定することにより、ラマンスペクトルの３次元測定を行うことができる。測定したラマンスペクトルのうち、特定の波長に注目することにより、特定の物質の３次元空間分布の測定も可能となる。具体的には、試料２８を生体細胞とした場合、核酸や脂質の空間分布あるいはスクロースやポリスチレン球の空間分布を測定することができる。

ラマン散乱され、対物レンズ２７に入射した出射光６２は、入射光６１と同じ光路を伝播していく。すなわち、対物レンズ２７により屈折され、ミラー２５で反射され、レンズ２４で屈折され、ガルバノミラー２３で反射され、第１のビームスプリッタ２２に入射する。第１のビームスプリッタ２２は入射した出射光６２のうち、一部をレンズ３１の方向に反射する。例えば、第１のビームスプリッタ２２は反射率が８０％で透過率が２０％のものを用いている。すなわち、第１のビームスプリッタ２２に入射された出射光６２のうち、８０％の光がレンズ３１に入射する。レンズ３１と第１のビームスプリッタ２２との間にはエッジフィルタ３８が配置されている。このエッジフィルタ３８により、レーザ波長と同じ波長の散乱光が除去される。すなわち、エッジフィルタ３８はレーリー散乱光とラマン散乱光との波長差に基づいてレーリー散乱光を除去する。これにより、ラマン散乱による出射光６２からレーザ波長と同じ波長の散乱光が分離される。なお、レーザ波長の光を遮光するエッジフィルタの替わりに、第１のビームスプリッタ２２としてダイクロイックミラーを用いてもよい。これにより、効率よくラマン散乱光のみを検出することができる。

エッジフィルタ３８を通過した出射光６２は、レンズ３１に入射する。レンズ３１を通過した光は入射側に入射スリット３２が有する分光器３３に入射する。すなわち、出射光６２は入射スリット３２を通過して、分光器３３で分光される。レンズ３１は出射光６２を屈折させて、入射スリット３２上に結像する。ここで、試料２８面上において入射光６１はライン状に結像されているため、入射スリット３２上において出射光６２はライン状に集光される。入射スリット３２の方向とライン状の出射光６２の方向を一致させる。すなわち、試料２８上のライン状の入射光と入射スリット３２の開口とは互いに共役な関係となるよう配置される。したがって、ラマン顕微鏡はコンフォーカル光学系として構成される。すなわち、アイリス絞り３９と試料２８面上とが互いに共役な関係となるように配置され、試料２８面上と入射スリット３２とが互いに共役な関係となるように配置されている。したがって、アイリス絞り３９が設けられたＸＹ平面及び試料２８が設けられた面上において、入射光６１はＹ方向に沿ってライン状に集光される。そして、試料２８から散乱して出射した出射光６２は入射スリット３２上でＹ方向に沿ってライン状に集光される。そして、入射スリット３２はＹ方向に沿った開口部を有しており、この開口部に入射した光のみを検出器３４側に透過させる。レーザ光源１１から試料２８までの照明光学系及び試料２８から検出器３４まで観察光学系をこのような結像光学系とすることにより、共焦点ラマン顕微鏡とすることができる。これにより、Ｚ方向の分解能の高い測定を行うことができる。

分光器３３は回折格子（グレーティング）やプリズムなどの分光素子を備えており、入射スリット３２から入射した光をその波長に応じて空間的に分散させる。反射型回折格子を用いた分光器３３の場合、さらに入射スリット３２からの光を分光素子までに導く球面ミラーと分光素子によって分光された光を検出器３４まで導く球面ミラーなどの光学系が設けられている。出射光６２は分光器３３によって入射スリット３２の方向と垂直な方向に分散される。分光器３３により分光された出射光６２は検出器３４に入射する。検出器３４は受光素子がマトリクス状に配列されたエリアセンサである。すなわち、検出器３４は画素がアレイ状に配置された２次元ＣＣＤなどの２次元アレイ光検出器である。

検出器３４は、イメージインテンシファイア付き冷却ＣＣＤを用いることができる。検出器３４は例えば、プリンストン・インスツルメンツ社製１０２４×２５６画素の電子冷却ＣＣＤ（−２５℃）を用いることができる。検出器３４の画素は、入射スリット３２に対応する方向に沿って配置されている。したがって、検出器３４の画素の一方の配列方向は入射スリット３２の方向と一致し、他方の配列方向は、分光器３３の分散方向と一致する。ここで、検出器３４の入射スリット３２の方向に対応する方向をＹ方向とし、入射スリット３２と垂直な方向、すなわち、分光器３３によって出射光６２が分散される方向をＸ方向とする。

検出器３４は各画素で受光した出射光６２の光強度に応じた検出信号を処理装置３５に出力する。処理装置３５はパーソナルコンピュータ（ＰＣ）などの情報処理装置であり、検出器３４からの検出信号をメモリなどに記憶していく。そして、検出結果に所定の処理を行い、モニターに表示する。さらに、処理装置３５はガルバノミラー２３の走査や、図示しない試料２８のステージの駆動を制御している。ここで、検出器３４のＸ方向は出射光６２の波長（振動数）に対応している。すなわち、Ｘ方向に配列されている画素列において、一端の画素は長波長（低振動数）の出射光６２を検出し、他端の画素は短波長（高振動数）の出射光６２を検出する。このように、検出器３４のＸ方向における光強度の分布はラマンスペクトルの分布を示すことになる。

一方、ライン状の入射光６１を用いているため、検出器３４のＹ方向は、試料２８のＹ方向に対応している。すなわち、Ｙ方向に配列されている画素列において、一端の画素はライン状の入射光６１によって照明された領域の一端からの出射光６２を検出し、他端の画素はライン状の入射光６１によって照明された領域の他端からの出射光６２を検出している。換言すれば、検出器３４のＹ方向に配列された画素の位置は、試料２８上での位置に対応しており、Ｙ方向の光強度分布は、試料２８上における出射光６２の空間分布を示すことになる。このように検出器３４の受光面におけるＸ方向の位置はラマンスペクトルの波長に対応し、Ｙ方向の位置は試料２８上での位置に対応する。そして、入射光６１をガルバノミラー２３により走査して、試料２８と入射光６１との相対位置をＸ方向にずらしていく。試料２８上での照明領域をＸ方向に走査することにより、ライン状の入射光６１の長さ及び走査距離に対応する領域を照明することができる。これにより、ラマンスペクトルの２次元空間分布を測定することができる。さらに、ガルバノミラー２３の走査距離が十分でない場合は、試料２８を駆動ステージとして照明領域を広くしてもよい。

本実施の形態では、ライン状の入射光６１を走査している。これにより、試料２８のＸＹ平面における任意のポイントのラマンスペクトルを測定することができる。さらに、点照明を走査する場合やステージを走査する場合に比べて、走査速度を向上することができるため、スペクトルの測定時間を短縮化することができる。すなわち、試料２８の広い領域におけるラマンスペクトルの測定を短時間で行うことができる。よって、試料２８の観察領域を広くした場合でも、長時間の測定時間が必要とならない。これにより、ラマンスペクトルの波長分解能を向上した場合や、より広い範囲のスペクトルを測定した場合でも、測定時間が長時間とならず、実用的な観察を行なうことができる。例えば、任意の波長（振動数）のラマン散乱光に着目した２次元像の観察や試料２８の特定の点におけるラマンスペクトルの測定を高い分解能で行なうことができる。

さらに、本実施の形態では、ラマン顕微鏡をライン状に光を集光するコンフォーカル光学系として構成している。これにより、Ｚ方向の分解能を向上することができるため、ラマンスペクトルの３次元測定が可能になる。すなわち、対物レンズ２７の試料２８との相対距離を変化させ、試料２８上の焦点位置をＺ方向に走査することができる。これにより、ＸＹＺ方向の走査が可能となり、ラマンスペクトルを３次元空間分布の測定をすることができる。換言すると、立体的な試料２８の任意にポイントにおいて、ラマンスペクトルを測定することができる。このような、ラマンスペクトルの３次元空間分布を測定した場合でも、ライン状に照明することにより、測定時間を短縮することができる。よって、実用的な時間で測定を行うことができる。

次に、位相差顕微鏡の構成について説明する。位相差顕微鏡の照明光源４１にはランプ光源が用いられている。照明光源４１はラマン顕微鏡の対物レンズ２７と反対側に配置されている。照明光源４１から出射した照明光７１はレンズ４２で屈折され、リングスリット４３に入射する。リングスリット４３はリング状の領域に光を透過する透過部が設けられた輪帯である。リングスリット４３は照明光源４１からの照明光７１をリング状の照明光７１に変換する。リングスリット４３によりリング状に変換された照明光７１はコンデンサーレンズ４４により集光された試料２８に入射する。コンデンサーレンズ４４は試料２８上でリング状の照明光７１が重なるように集光する。

コンデンサーレンズ４４で集光された照明光７１のうち、試料２８を透過した透過光７２は、対物レンズ２７に入射する。透過光７２は出射光６２が入射する光学部品と同じ光学部品を伝播していく。すなわち、透過光７２は、対物レンズ２７で屈折され、レンズ２６で屈折され、ミラー２５で反射され、レンズ２４で屈折され、ガルバノミラー２３に入射する。位相差顕微鏡を用いる場合、ガルバノミラー２３による走査を行わないで観察を行なう。例えば、ガルバノミラー２３はレンズ２４の光軸に対して４５°傾斜して配置されている。よって、ガルバノミラー２３は、透過光を９０°の角度で反射させて、第１のビームスプリッタ２２の方向に反射する。第１のビームスプリッタ２２に入射した透過光の一部は第２のビームスプリッタ２１に入射する。上述のように、第１のビームスプリッタ２２の透過率は２０％であるので、第１のビームスプリッタ２２に入射した透過光７２のうちの２０％が第２のビームスプリッタ２１に入射する。第２のビームスプリッタ２１に入射した透過光７２のうちの一部は反射され、レンズ４５ａに入射する。そして、透過光７２は、レンズ４５ａで屈折されて、レンズ４５ｂに入射する。レンズ４５ａで屈折された透過光７２はレンズ４５ａの前側で結像して、レンズ４５ｂに入射する。レンズ４５ｂは、入射した透過光７２を屈折させる。レンズ４５ｂにより屈折された透過光７２は、位相板４６に入射する。

位相板４６はリング状の位相膜が設けられている。このリング状の位相膜に入射した光は、その他の領域に入射した光からπ／２の位相差が与えられる。すなわち、リング状の位相膜が設けられた領域に入射した透過光７２は、その内側及びその外側に入射した透過光７２よりもπ／２だけ位相が遅れる。位相板４６を通過した透過光７２はレンズ４７で屈折されて、ＣＣＤカメラ４８に入射する。レンズ４７はＣＣＤカメラ４８の受光面に透過光を結像するよう配置されている。

このように位相差顕微鏡を設けることによって、試料２８の屈折率の異なる位相物体の分布を観察することができる。したがって、細胞の状態を維持できる緩衝溶液中に細胞を注入した場合において、緩衝溶液と細胞との間に透過率の差がほとんどない物質であっても屈折率の差によって細胞を観察することができる。すなわち、緩衝溶液に対して細胞が位相物体となる。この、位相物体の分布、すなわち細胞の空間分布を位相差顕微鏡で観察できる。そして、その細胞の密度が高い領域のみラマンスペクトルの３次元空間分布を測定する。すなわち、透明な緩衝溶液中に透明な細胞を注入した場合であっても細胞の空間分布を測定することができる。このように、上記の構成により効率的な測定を行うことができるため、実質的に長時間ラマンスペクトルの測定を行うことができる。よって光学顕微鏡の利便性を向上することができる。

光学顕微鏡１は、位相差顕微鏡とラマン顕微鏡を備える構成をしているため、様々な観察を行なうことができる。光学顕微鏡の応用範囲を広くすることができ、今までに不可能であった観察を行なうことができる。この光学系により、高分解能でラマンスペクトルを測定することができる。また、高い分解能でラマンスペクトルの３次元空間分布を測定した場合であっても、測定時間を短縮することができる。例えば、Ｈｅｌａ細胞などの細胞の観察を高分解能で行なうことができる。

次に試料２８の近傍の構成について図２〜図４を用いて説明する。図２は試料２８の近傍の光学系を模式的に示す図である。図３は試料２８上における入射光６１のスポットを示す平面図である。図４はリングスリット４３の構成を示す平面図である。

まず、ラマン顕微鏡において、試料２８に入射するレーザ光源１１からの入射光６１について説明する。入射光６１は対物レンズ２７により、試料２８に集光される。試料２８は透明なステージ２９に載置されている。ステージ２９はＸＹＺステージとすることが好ましい。ここでは、試料２８の対物レンズ２７側の表面に集光される様子について図示しているが、Ｚ方向に走査する場合は、対物レンズ２７又はステージ２９を移動して、対物レンズ２７と試料２８との間の距離を光軸に沿って変化させればよい。例えば、対物レンズ２７とステージ２９との距離は処理装置３５により変化させることができる。このように、対物レンズ２７と試料２８との距離を可変とすることにより、ラマンスペクトルの３次元空間分布を測定することができる。なお、ガルバノミラー２３の替わりにステージ２９でＸ方向に走査してもよい。このようにステージ２９を走査することによっても試料２８全面を観察することができる。

この入射光６１は試料２８上において図３に示すよう照射される。シリンドリカルレンズ１５によって入射光６１はライン状に変換されているため、試料２８上において入射光６１の光ビームのスポットはライン状となっている。入射光６１はシリンドリカルレンズ１５によって変換された方向、すなわち、Ｙ方向に沿って、ライン状となっている。ライン状の入射光６１のスポットは例えば、Ｙ方向に６０μｍ程度の長さとすることができる。このライン状の入射光６１はガルバノミラー２３によって例えば、Ｘ方向に走査される。すなわち、入射光６１がライン状に延びている方向と垂直な方向に走査を行う。これにより、試料２８の一定の領域を照明することができる。この入射光６１のうち、試料２８で散乱されて出射された出射光６２が上述のように分光器３３で分光され、検出器３４で検出される。

次に、位相差顕微鏡における、照明光源４１からの照明光７１について説明する。照明光７１はレンズ４２を介してリングスリット４３に入射する。リングスリット４３は入射した照明光７１をリング状の照明光７１に変換する。このリングスリット４３の形状は図５に示すようになっている。図４はリングスリット４３の構成を示す平面図である。リングスリット４３はリング状の透過部４３ａが形成された円板により構成されている。透過部４３ａの外側及び内側には遮光部４３ｂが形成されている。透過部４３ａに入射した光はリングスリット４３を透過し、遮光部４３ｂに入射した光はリングスリット４３により遮光される。なお、透過部４３ａの内側の遮光部４３ｂと外側の遮光部４３ｂとを接続する接続部４３ｃが透過部４３ａを横切るよう配置される。この接続部４３ｃによって、リング状の透過部４３ａは３つに分断される。この接続部４３ｃは均等、すなわち、１２０°毎に設けることがこのましい。接続部４３ｃに入射した光は遮光部４３ｂと同様に遮光される。

このような透過部４３ａを有する円形の板によって、リングスリット４３を構成することができる。なお、上記の説明ではリングスリット４３は円形の板により構成したが、これに限るものではない。例えば、リングスリット４３を液晶素子などによって構成してもよい。あるいは、透明な板の上に遮光膜を形成して遮光部４３ｂを形成してもよい。

このリングスリット４３を透過した内側及び外側に照明光７１は広がって、コンデンサーレンズ４４に入射する。コンデンサーレンズ４４はリングスリット４３から広がって入射する照明光７１を試料２８に屈折させる。この照明光７１は透明なステージ２９を介して試料２８を照明する。これにより、試料２８の所定の領域が照明光７１により照明される。この照明光７１のうち、試料２８を透過した透過光７２をＣＣＤカメラ４８で検出する。このように試料２８の前面側及び背面側から照明光源４１からの照明光７１及びレーザ光源からのレーザ光を入射させる。これにより、簡易な光学系で位相差顕微鏡とラマン顕微鏡とを有する光学顕微鏡１を構成することができる。

つぎに、分光器３３の入射スリット３２上における出射光６２のビームスポットについて図５を用いて説明する。図５は入射スリット３２の構成を示す平面図であり、合わせて出射光６２についても図示している。入射スリット３２はＹ方向に延びた開口部３２ａを有している。この、開口部３２ａを通過した光が分光器３３で分光され、検出器３４に入射する。入射スリット３２の幅、すなわち、入射スリット３２の開口部３２ａのＸ方向の幅は、例えば、１０μｍとすることができる。入射スリット３２にはライン状のビームスポットを有する出射光６２が入射される。すなわち、入射光６１はシリンドリカルレンズ１５及びアイリス絞り３９によってライン状に変換された後、試料２８に入射されているので、入射スリット３２上においてもＹ方向に沿ったライン状のスポットを形成する。

試料上のライン状の入射光６１と分光器３３の入射スリット３２とが結像関係にあることで、ラマン顕微鏡はスリット共焦点光学系となっている。すなわち、アイリス絞り３９と試料２８上におけるライン状の入射光６１が互いに共役な位置関係となっており、入射スリット３２の開口部３２ａと試料２８上におけるライン状の入射光６１が互いに共役な位置関係となっている。これにより、入射光６１が集光している面以外で出射された出射光６２を入射スリット３２により除去することができる。例えば、図２に示したように試料２８の対物レンズ側の表面に集光されている場合、その他の面からのラマン散乱光等は入射スリット３２の開口部３２ａの外側に入射して、除去される。すなわち、試料２８の内部からの出射光６２は図５に示すように入射スリット３２の開口部３２ａの外側に入射する。したがって、所定の面以外からの出射光６２は入射スリット３２によって遮光され、検出に寄与しない。このように、コンフォーカル光学系とすることにより、Ｚ方向の分解能を向上することができる。なお、試料面と検出器３４での受光面での像の倍率は、例えば、５０倍とすることができる。この場合、６０μｍの長さのライン状の照明が、検出器３４の受光面では約３ｍｍとなる。

このように入射スリット３２を通過した出射光６２は分光器３３で分光され、検出器３４に入射する。分光器３３はスリット状の出射光６２をその波長（振動数）に応じて、Ｘ方向に分散させる。すなわち、分光器３３は、スリット状の出射光６２をその方向と垂直な方向に分散させる。分光器３３で分散されたスリット状に出射光６２を２次元アレイの検出器３４で検出する。これにより、ラマンスペクトルの空間分布を測定することができる。

具体的には、検出器３４の画素がＸＹ方向に配列されているとすると。Ｘ方向は出射光の波長を示し、Ｙ方向は出射光６２の試料２８上での位置を示す。すなわち、Ｘ方向に同じ位置にある画素において受光される出射光６２は同じ波長である。試料面上の同じ位置から出射された出射光であっても、その波長が異なる場合、Ｘ方向において異なる画素で受光される。一方、Ｙ方向の同じ位置にある画素において受光される出射光６２は、試料２８上においてＹ方向の同じ位置から出射されている。同じ波長の出射光６２は、試料面上でのＹ方向の位置に応じて、受光面上でのＹ方向において異なる画素で受光される。換言すると、検出器３４の受光面上のＸ―Ｙ平面における光の強度分布は、出射光６２のω―Ｙ平面での強度分布を示す。なお、ωは出射光６２の角振動数である。このようにライン状に照明することにより、測定時間を短縮することができる。具体的には１／（１ライン分の画素数）だけ、測定時間を短縮することができる。さらに、広範な観察範囲の測定を行った場合でも、解像度を下げることなく測定を行うことができる。また、レーザ光をライン状として照明しているため、従来のラマン顕微鏡と比べて、単位面積当たりのレーザ強度を低減することができる。すなわち、点光源であるレーザ光源からのレーザ光を空間的に分散させて線照明としているため、単位面積当たりのレーザ強度を低減することができる。したがって、点照明の場合と同じ照射量を照射しようとした場合でも、単位時間、単位面積当たりのレーザ照射量を低減することができる。これにより、レーザ光による試料の損傷を防ぐことができる。特にレーザ光に対して損傷しやすい生体を試料とする場合に有効である。

ここで、入射光６１を走査したときに検出器３４で検出される出射光６２について図６を用いて説明する。図６は、本発明にかかる光学顕微鏡１において２次元測定されるラマンスペクトルを示すイメージ図である。図６（ａ）は試料面上において走査される入射光６１を模式的に示す図である。図６（ｂ）は図６（ａ）に示すように入射光６１を走査したときに検出器の受光面を概念的に示す図である。

図６（ａ）に示すように、試料２８上において、Ｙ方向に沿ったライン状の入射光６１はＸ方向に走査される。ここで、試料２８上においてライン状の入射光６１ａ、入射光６１ｂ、入射光６１ｃ、入射光６１ｄの順で走査したものとして説明する。このとき、入射光６１ａ、入射光６１ｂ、入射光６１ｃ及び入射光６１ｄのそれぞれの位置からの出射光について、検出器３４によりラマンスペクトルの測定が行われたものとする。ここで、入射光６１ａからの出射光６２が検出器に入射したときの受光面を受光面６５ａとする。すなわち、入射光６１ａの位置からのラマン散乱光である出射光６２は受光面６５ａに入射する。同様に、入射光６１ｂ、入射光６１ｂ及び入射光６１ｃからの出射光６２が検出器に入射したときの受光面をそれぞれ受光面６５ｂ、受光面６５ｃ及び受光面６５ｄとする。この受光面６５ａ〜６５ｄのそれぞれにおける光強度分布がＹ方向におけるラマンスペクトルの分布を表している。したがって、図６（ｂ）に示すように、この受光面６５ａ〜６５ｄまでの測定結果をＸ方向に並べることで、ＸＹ平面におけるラマンスペクトルの分布を測定することができる。さらに、Ｚ方向に走査することで、ＸＹＺ−ωの４次元の測定を行うことができる。４次元測定を行うことにより、様々なスペクトル解析を行なうことができる。

次に、位相差顕微鏡の構成について図７及び図８を用いて説明する。図７は位相差顕微鏡の光学系の構成を示す図である。図８は位相板の構成を示す平面図である。なお、図７において、ステージ２９とレンズ２６からレンズ４５ｂまでの光学系とは省略して図示している。また、図７ではリングスリット４３の光透過部の一方のみから通過する照明光７１及びその照明光７１による０次の回折光７４と＋１次の回折光７３のみを代表して図示している。照明光源４１からの照明光７１はレンズ４２により屈折されてリングスリット４３に入射する。リングスリット４３は例えば、図４に示した形状のものを用いることができる。リングスリット４３に入射した照明光７１は透過部４３ａのみ通過することができるためリング状に変換される。リング状の照明光７１はコンデンサーレンズ４４により集光されて、試料２８を照明する。リング状の照明光７１は試料２８上で光軸上の点を中心として重なるように集光されている。ここで、リング状の照明光７１は光軸上の点を含む領域を照明するようコンデンサーレンズ４４により集光されている。試料２８に入射した照明光７１のうち試料２８を透過した透過光７２は０次の回折光（直接光）７４と１次の回折光７３とを含んでいる。すなわち、試料２８における屈折率の差、すなわち位相に差があると、回折を生じる。位相差量が小さいとき、０次の回折光７４と１次の回折光７３は１／４波長（π／２）ずれている。

０次の回折光７４を照明光７１の入射方向と同じ方向で試料２８を透過する。一方、１次の回折光７３は照明光７１の入射方向から所定の角度（回折角）だけ傾いて試料２８を照射する。なお、ここでは、説明の簡略化のため試料２８やステージにおける屈折を省略して説明している。０次の回折光７４と１次の回折光７３とを含む透過光７２は対物レンズ２７に入射する。そして、対物レンズ２７により屈折され、図１で示した光学系を伝播する。このとき、０次の回折光７４と１次の回折光７３とは異なる経路で伝播して、位相板４６に入射する。位相板４６には図８に示すようリング状の位相膜４６ａが設けられている。すなわち、位相板４６は、透明な円板とその上に設けられたリング状の位相膜４６ａから構成される。０次の回折光７４は位相板４６の位相膜４６ａが設けられた領域に入射する。一方、１次の回折光７３は位相板４６の位相膜４６ａが設けられていない領域に入射する。すなわち、一次の回折光７３はリング状の位相膜４６ａより内側の領域に入射する。なお、図７では＋１次の回折光７３しか図示していないため、１次の回折光７３は位相膜４６ａの内側のみを通過しているが、−１次の回折光は位相膜４６ａより外側を通過する。

位相膜４６ａは入射した光の位相を１／４波長遅らせて出射する。すなわち、位相膜４６ａが設けられた領域に入射した０次の回折光７４は位相膜４６ａ設けられていない領域に入射した１次の回折光７３に比べて、１／４波長遅れて出射する。リングスリット４３と位相板４６とは互いに共役な関係となっている。よって、リングスリット４３の透過部４３ａと位相膜４６ａとは試料２８を介して互いに共役な形状をしている。したがって、０次の回折光７４のみ位相膜４６ａが設けられた領域に入射して、１次の回折光７３は位相膜４６ａが設けられていない領域に入射する。このように、位相板４６はリングスリット４３の透過部４３ａに対応する領域に位相差を設ける。

この、１次の回折光７３と０次の回折光７４とがレンズ４７により集光されてＣＣＤカメラ４８の受光面に入射する。１次の回折光７３と０次の回折光７４とは、ＣＣＤカメラ４８の受光面において、同じ領域に入射する。すなわち、レンズ４７は１次の回折光７３と０次の回折光７４がＣＣＤカメラ４８の受光面において、レンズ４７の光軸上の点を中心として重なるよう透過光７２を集光する。

位相膜４６ａによって、０次の回折光７４と１次の回折光７３とは１／４波長ずれているため、干渉により位相物体が明るくなる。これにより、位相物体のＸＹ平面における分布を測定することができる。

なお、１次の回折光７３の強度が０次の回折光７４に比べて弱い場合、位相膜４６ａが設けられている領域の透過率を低くしてもよい。具体的には、吸収膜を位相膜４６ａが設けられている領域に設ける。これにより、コントラストを高くすることができる。また、上述の説明では、０次の回折光７４が入射する領域の位相をπ／２遅らせたが、π／２進ませてもよい。例えば、リング状の領域だけ位相板４６の厚さを薄くすることにより、位相を進ませることができる。なお、位相差顕微鏡の構成は上述の構成に限られるものではない。

ここで、出射光６２の光路を入射光６１の光路から分岐する第１のブームスプリッタ２２を第２のビームスプリッタ２１よりも試料２８側に配置している。すなわち、第２のビームスプリッタ２１により分岐される透過光７２は、第１のビームスプリッタ２２を介して第２のビームスプリッタ２１に入射する。第１のビームスプリッタ２２と第３のシリンドリカルレンズ１５の間に、第２のビームスプリッタ２２が配置される。このような配置にすることにより、ラマン顕微鏡と位相差顕微鏡とを備える光学顕微鏡において、ラマン散乱光の強度を低下させることなく観察することができる。すなわち、入射光６１は第２のビームスプリッタ２２を通過するが、出射光６２は第２のビームスプリッタ２１を通過することがない。これによって、第２のビームスプリッタ２１による光の損失がなくなり、ラマン散乱光の強度低下を抑制することができる。したがって、測定時間が長くなるのを防ぐことができる。

なお、上述の説明では、ラマン顕微鏡を備えた光学顕微鏡１について説明したが、本発明はこれに限られるものでない。入射光６１のレーザ波長と異なる波長で試料から出射する出射光６２を検出する顕微鏡であればよい。例えば、励起光によって励起される蛍光を検出する顕微鏡や、赤外吸収を検出する顕微鏡であってもよい。これらの顕微鏡でも、短時間で、スペクトルの空間分布の測定を行うことができる。

上記の説明では、第1のビームスプリッタ２２を反射した出射光６２と第２のビームスプリッタ２１を反射した透過光７２を検出したが、光学系の配置を変えてビームスプリッタを透過した光を検出するようにしてもよい。

上記のように、入射光６１の光ビームを走査することによって、走査速度を速くすることができる。これにより、測定時間を短縮化することができる。なお、上記の説明では、走査手段をガルバノミラー２３として説明したが、これに限るものでもよい。例えば、音響光学偏光器（ＡＯＤ）を用いて入射光６１を走査してもよい。また、レーザ光源１１からのレーザ光をライン状に変換する光変換手段はシリンドリカルレンズ、ライン状の開口を有するアイリス絞り及びパウエルレンズを単独で、あるいは組み合わせて構成することができる。

本発明にかかる光学顕微鏡の構成を示す図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において、試料近傍の構成を模式的に示す図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において、レーザ光源から試料に入射する入射光を説明するための図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において用いられるリングスリットの構成を示す平面図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において用いられるスリットに入射する出射光を説明するための図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において２次元測定されるラマンスペクトルを示すイメージ図である。 本発明にかかる光学顕微鏡の一部である位相差顕微鏡の光学系の一例を示す図である。 本発明にかかる光学顕微鏡において用いられる位相板の構成を示す平面図である。

符号の説明

１１ レーザ光源、１２ ミラー、１３ 第１のシリンドリカルレンズ、
１４ 第２の第３のシリンドリカルレンズ１５ 第３のシリンドリカルレンズ、
１６ レンズ、２１ 第２のビームスプリッタ、２２ 第１のビームスプリッタ、
２３ ガルバノミラー、２４ レンズ、２５ ミラー、２６ レンズ、
２７ 対物レンズ、２８ 試料、３１ レンズ、３２ スリット、３３ 分光器、
３４ 検出器、３５ 処理装置、３８ エッジフィルタ、３９ アイリス絞り、
４１ 照明光源、４２ レンズ、４３ リングスリット、４３ａ 透過部、
４４ コンデンサーレンズ、４５ レンズ、
４６ 位相板、４６ａ 位相差膜、４７ レンズ、４８ ＣＣＤカメラ、
６１ 入射光、６２ 出射光、７１ 照明光、７３ ０次の回折光、７４ １次の回折光

Claims (11)

1. レーザ光源と、
   前記レーザ光源からの光ビームをライン状の光ビームに変換する光変換手段と、
   前記ライン状に変換された光ビームを走査する走査手段と、
   前記走査手段により走査された光ビームをライン状に集光して試料に入射させる対物レンズと、
   波長差に基づいて光を分岐する第１のビームスプリッタであって、前記試料に入射された光ビームのうち、異なる波長となって前記試料から前記対物レンズ側に出射する出射光を前記レーザ光源から前記試料に入射するライン状の光ビームと分岐する第１のビームスプリッタと、
   前記第１のビームスプリッタにより分岐された出射光が入射する入射側に前記ライン状の光ビームに対応する方向に沿って配置された入射スリットを有し、前記入射スリットを通過した前記出射光を波長に応じて空間的に分散させる分光器と、
   前記分光器で分散させた出射光を検出する２次元アレイ光検出器と、
   前記試料の前記対物レンズと反対側に配置され、照明光を出射する照明光源と、
   前記照明光源からの照明光をリング状の照明光にするリングスリットと、
   前記リング状の照明光を集光して前記試料に入射させるコンデンサーレンズと、
   前記コンデンサーレンズにより集光され前記試料を透過した透過光が前記対物レンズ及び第１のビームスプリッタを介して入射する第２のビームスプリッタであって、前記透過光の光路を前記レーザ光源からの前記入射光の光路と分岐する第２のビームスプリッタと、
   前記第２のビームスプリッタによって分岐された透過光の前記リングスリットに対応するリング状の領域に位相差を設ける位相板と、
   前記位相板からの透過光を撮像する撮像素子と、を備える光学顕微鏡。
2. 前記走査手段がガルバノミラーであることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記走査手段が前記光ビームのラインの方向と垂直な方向に光ビームを走査する請求項１又は２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記光変換手段がシリンドリカルレンズであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光学顕微鏡。
5. 前記シリンドリカルレンズにより前記入射光が集光される位置にスリット状の開口を有するアイリス絞りであって、前記開口の大きさが可変であるアイリス絞りが設けられている請求項４に記載の光学顕微鏡。
6. 前記第１のビームスプリッタと前記２次元アレイ光検出器の間に、前記レーザ光源のレーザ波長の光を遮るフィルタが設けられていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の光学顕微鏡。
7. 前記光変換手段により集光される面と試料面とが互いに共役な関係となり、前記試料面と前記入射スリットが互いに共役な関係となっている請求項1乃至６のいずれかに記載の光学顕微鏡。
8. 前記対物レンズと前記試料との相対距離が可変であることを特徴とする請求項７に記載の光学顕微鏡。
9. 前記撮像素子により、前記試料中の位相が異なる位相物体の分布を観察する請求項１乃至８のいずれかに記載の光学顕微鏡。
10. 前記レーザ光源からのレーザ光と、前記照明光源からの照明光とが排他的に使用され、
    前記照明光源からの照明光が使用される際に、前記走査手段による走査が停止していることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の光学顕微鏡。
11. 前記第１のビームスプリッタがダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の光学顕微鏡。

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