JP4806963B2 - β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法およびこれに用いる酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、β（ｂｅｔａ）−ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関し、より詳しくは、新規な酵素を用いたβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。
β−ヒドロキシアミノ酸、α（ａｌｐｈａ）位に光学活性を有するアミノ酸などのアミノ酸は、医薬品の中間体などとしての利用が期待される物質である。α位に異なる２つの置換基を有する光学活性アミノ酸誘導体である光学活性α−アルキルセリン誘導体およびその塩の製造方法としては、例えば以下の方法が知られている。
１）光学活性セリン誘導体とピバルアルデヒドより得られる光学活性オキサゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献１）
２）光学活性金属触媒を用いるα−イソシアノカルボン酸エステルとパラホルムアルデヒドの不斉アルドール反応による方法（非特許文献２）
３）光学活性オキサゾリジンクロムカルベン錯体とオキサジン化合物から得られる光学活性β−ラクタム化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献３）
４）光学活性アジリジン化合物の不斉開環反応（非特許文献４）
５）光学活性バリン誘導体と光学活性アラニン誘導体から得られる光学活性ピラジノン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献５）
６）２−メチル−２−プロペン酸誘導体にシャープレス不斉ジヒドロキシル化を行い、得られる光学活性ジオール化合物を光学活性アジド化合物に導き還元する方法（非特許文献６）
１）光学活性セリン誘導体とピバルアルデヒドより得られる光学活性オキサゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献１）
２）光学活性金属触媒を用いるα−イソシアノカルボン酸エステルとパラホルムアルデヒドの不斉アルドール反応による方法（非特許文献２）
３）光学活性オキサゾリジンクロムカルベン錯体とオキサジン化合物から得られる光学活性β−ラクタム化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献３）
４）光学活性アジリジン化合物の不斉開環反応（非特許文献４）
５）光学活性バリン誘導体と光学活性アラニン誘導体から得られる光学活性ピラジノン化合物への不斉アルキル化による方法（非特許文献５）
６）２−メチル−２−プロペン酸誘導体にシャープレス不斉ジヒドロキシル化を行い、得られる光学活性ジオール化合物を光学活性アジド化合物に導き還元する方法（非特許文献６）
また、医薬品の中間体として有望視される物質の一つとして、例えばα−メチル−Ｌ−セリンがある。α−メチル−Ｌ−セリンを酵素反応を利用して製造する方法としては、例えば、Ｄ−アラニンと５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸を原料とし、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．２．７）の利用する方法が知られている。従来の技術では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来の酵素をもちいていたが、酵素を得るためには培地中に高価なα−メチル−セリンを添加する必要があった（非特許文献７）。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌由来の酵素の場合、４ｍｍｏｌの原料（Ｄ−Ａｌａ）からα−メチル−Ｌ−セリンを得ているが収率は１１％であり、実用的に満足のいくものではなかった。
Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，１９８７，７０，１１９４−１２１６
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８，２９，２３５−２３８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，５８，５９１８−５９２４
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３６，３６３９−３６４２
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２８０９−２８２０
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００１，１２，９４９−９５７
Ｗｉｌｓｏｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２３７ ３１７１−３１７９
上記のように光学活性アミノ酸の製法については様々な手法が研究されている。しかし、光学活性アミノ酸やβ−ヒドロキシアミノ酸の種類は多く、より簡便な手法、またはより効率よく、安価に様々な光学活性アミノ酸やβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する方法が求められている。本発明は、簡便な手法によるβ−ヒドロキシアミノ酸およびその光学活性体を生成する新たな方法およびこれに用いられる酵素等を提供することを課題とする。
本発明者等はβ−ヒドロキシアミノ酸の新たな製法について鋭意研究したところ、Ｄ−アミノ酸を出発物質とし、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または所定のアルデヒドを介在させる反応系において、その反応を触媒する新たなタンパク質を見出した。さらに、このタンパク質を用いることにより、簡便にβ−ヒドロキシアミノ酸を生成でき、しかも生成物が光学活性を生じ得るアミノ酸である場合には、Ｌ−アミノ酸を選択的に生成し得ることが見出された。本発明は係る知見に基づくものであり、下記β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法およびこれに用いる酵素などを提供するものである。
〔１〕パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属からなる群のいずれかの属に属する微生物に由来する酵素の存在下で、下記式（Ｉ）：
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）においてＲ2は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させる、下記式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ3は水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔２〕式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、Ｄ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるβ−ヒドロキシアミノ酸がα−メチル−Ｌ−セリンである、〔１〕に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔３〕下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質の存在下で、下記式（Ｉ）：
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）においてＲ2は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させる、下記式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ3は水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔４〕式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｄ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−α−アミノ酸がα−メチル−Ｌ−セリンである、上記〔３〕に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔５〕パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属からなる群のいずれかの属に属する微生物に由来し、かつ下記式（Ｉ）：
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）においてＲ2は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ3は水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔６〕下記式（Ｉ）：
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）においてＲ2は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるアルデヒドとを反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ3は水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するし、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔７〕上記〔６〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕下記（ａ）から（ｆ）よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（式（Ｉ）において、Ｒ1は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
（式（ＩＩ）においてＲ2は、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
（式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）中のＲ1と同じであり、式（ＩＩＩ）におけるＲ3は水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい）
〔９〕上記〔７〕または〔８〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔９〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
に示されるアルデヒドとを反応させる、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔２〕式（Ｉ）に示されるアミノ酸が、Ｄ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるβ−ヒドロキシアミノ酸がα−メチル−Ｌ−セリンである、〔１〕に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔３〕下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質の存在下で、下記式（Ｉ）：
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
に示されるアルデヒドとを反応させる、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔４〕式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｄ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−α−アミノ酸がα−メチル−Ｌ−セリンである、上記〔３〕に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔５〕パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属からなる群のいずれかの属に属する微生物に由来し、かつ下記式（Ｉ）：
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
に示されるアルデヒドとを反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔６〕下記式（Ｉ）：
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸および／または下記式（ＩＩ）：
に示されるアルデヒドとを反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するし、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔７〕上記〔６〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕下記（ａ）から（ｆ）よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔９〕上記〔７〕または〔８〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔９〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
本発明により、簡便な手法でβ−ヒドロキシアミノ酸を生成することができる。
また、本発明は、光学活性を有するβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する場合、Ｌ−型のアミノ酸を選択的に生成することができるため、Ｌ−アミノ酸の製法として効率がよい。また、本発明により、新規な酵素について組換え体や形質転換体を作製し、安価に大量生産を行うことができる。
また、本発明は、光学活性を有するβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する場合、Ｌ−型のアミノ酸を選択的に生成することができるため、Ｌ−アミノ酸の製法として効率がよい。また、本発明により、新規な酵素について組換え体や形質転換体を作製し、安価に大量生産を行うことができる。
以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ （２００１／０１／１５）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。
本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ （２００１／０１／１５）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。
本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。
本発明のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法においては、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸（５，１０−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）および／または式（ＩＩ）で示されるアルデヒドとを反応させる。なお、本明細書および図面では、テトラハイドロ葉酸をＴＨＦと略称する場合がある。同様に、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸は５，１０−メチレンＴＨＦとも表す。５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）で示されるアルデヒドは双方を用いてもよいし、いずれか一方のみを用いてもよい。
式（Ｉ）におけるＲ1をより具体的に示すと以下の通りである。
Ｒ1が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。
Ｒ1が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。
また、Ｒ1が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基などが挙げられる。
Ｒ1が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが挙げられる。
Ｒ1が炭素数が７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、ナフチルアルキル基などが挙げられる。
Ｒ1が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、およびデカノキシ基から選ばれる基が置換されたものなどが挙げられる。
Ｒ1は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
Ｒ1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
また、Ｒ1は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ1は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。
さらに、上記Ｒ1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ1は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。
式（Ｉ）に示されるＤ−α−アミノ酸としては、例えば、それぞれＤ−α−型の、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、２−アミノ−ｎ−酪酸などが挙げられ、好ましくは、アラニン、セリン、２−アミノ−ｎ−酪酸、より好ましくはアラニンが例示される。
式（ＩＩ）におけるＲ2をより具体的に示すと次の通りである。
Ｒ2が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル、イソヘキシル基などが挙げられる。
Ｒ2が炭素数１〜６のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、イソプロピル基、ｎブチル基、イソブチル基、ｓｅｃブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ｎペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎヘキシル、イソヘキシル基などが挙げられる。
また、Ｒ2が炭素数６〜１４のアリール基である場合とは、具体例を示すと、フェニル基、トリル基、キシリル基、ビフェニリル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、などが挙げられる。
Ｒ2が炭素数３〜１０のシクロアルキル基である場合とは、具体例を示すと、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプタニル基、シクロオクタニル基、シクロノナニル基、シクロデカニル基などが挙げられる。
Ｒ2が炭素数７〜１９のアラルキル基である場合とは、具体例を示すと、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基、トリチル基などのフェニルアルキル基、シンナミル基、スチリル基、並びにナフチルアルキル基、などが挙げられる。
Ｒ2が炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基である場合とは、具体例を示すと、炭素数１〜１０のアルキル基に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、フェノキシ基、ヘプトキシ基、オクトキシ基、ノナノキシ基、およびデカノキシ基から選ばれる基が置換されたものなどが挙げられる。
Ｒ2は、上記炭化水素の炭素骨格中にヘテロ原子を含む基であってもよい。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられる。
Ｒ2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
Ｒ2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
また、Ｒ2は、上記に示す基において炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む炭化水素基であってもよい。
さらに、上記Ｒ2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ2は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。
さらに、上記Ｒ2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、Ｒ2は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数３までのアルキル基、炭素数３までのアルコキシル基、ケト基（＝Ｏ）、水酸基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、アミド基（−ＣＯＮＨ2）、イミノ基（＝ＮＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ2）等から選ばれる１種または２種以上が置換・付加されたものであってもよい。
なお、式（ＩＩ）はホルムアルデヒド（Ｒ2が水素）は含まない。しかし、ホルムアルデヒドは、５，１０−メチレンＴＨＦを供給するために使用し得る。５，１０−メチレンＴＨＦは、ホルムアルデヒドとＴＨＦとを反応させることにより容易に得ることができる。また、５，１０−メチレンＴＨＦと式（Ｉ）のＤ−アミノ酸とを反応させると、ＴＨＦを生じる。すなわち、５，１０−ＴＨＦとＴＨＦは、循環的反応系を形成し得る。本発明においては、ＴＨＦの循環的反応系を副次的反応系として利用することができる。
式（ＩＩＩ）におけるＲ1は式（Ｉ）におけるそれと同じである。また、式（ＩＩＩ）において、Ｒ3は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、炭素数７〜１９のアラルキル基、炭素数２〜１１のアルコキシアルキル基、これらの炭素骨格中にヘテロ原子を含む基、およびこれらの炭素骨格中に炭素−炭素不飽和結合を含む基からなる群より選ばれ、これらの基は直鎖であっても分岐していてもよく、さらに置換基を有していてもよい。Ｒ3において、水素以外の選択し得る炭化水素基の具体例は、上記Ｒ2と同じである。
本発明おける好ましい一形態としては、例えば、Ｄ−α−アラニンと５、１０−メチレンＴＨＦとを反応させて、α−メチル−Ｌ−セリンを生成する系が含まれる。図１に、その反応系の具体例を示す。
図１に示すように、ＴＨＦとホルムアルデヒドとを反応させることにより、５，１０−メチレンＴＨＦを生成する。５，１０−メチレンＴＨＦとＤ−α−アラニンとを所定の酵素の存在下において反応させる。その反応によって、Ｄ−α−メチルセリンを生成すると共にＴＨＦを生成する。ＴＨＦは５，１０−メチレンＴＨＦを供給するための原料として再利用し得る。ホルムアルデヒドによって５，１０−メチレンＴＨＦを再生する形態の場合、少量のホルムアルデヒドを逐次的に反応系に添加していくことが好ましい。ホルムアルデヒドは反応性が高いため、５，１０−メチレンＴＨＦの消費に合わせて逐次添加することにより、副産物等の生成を抑制し得る。
また、図１の例に示されるように、本発明のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法は、所定の酵素を用いることにより、Ｌ体のアミノ酸を優先的に生成させる方法として好適である。ここで「Ｌ体を優先的に生成」とは、生成されるβ−ヒドロキシアミノ酸に占めるＬ体の比率が、Ｄ体よりも高いことを意味し、好ましくはＬ体の比率が７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。この場合のセリン誘導体に占めるＬ体の比率は[Ｌ体]／（［Ｄ体］＋[Ｌ体]）＊１００で算出される。
反応温度は、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは５〜９であり、より好ましくは６〜８である。
本発明において、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと、Ｄ−α−アミノ酸との反応は所定の酵素の存在下において行われる。この反応を触媒し得る酵素としては、例えば、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属からなる群のいずれかの属に属する微生物から得ることができる。微生物についてのより具体的な例としては、パラコッカス・エスピー（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アミノバクター・エスピー（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．）、エンシファー・エスピー（Ｅｎｓｉｆｅｒ・ｓｐ．）などが挙げられ、より好ましくは、パラコッカス・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４８、アミノバクター・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４５、エンシファー・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４６などが例示される。
なお、ＦＥＲＭ番号が付与された菌株は下記の通り寄託された菌株であり、各番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。
なお、ＦＥＲＭ番号が付与された菌株は下記の通り寄託された菌株であり、各番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。
（１）名称：パラコッカス・エスピー ＡＪ１１０４０２
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４８
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４８
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
（２）名称；アミノバクター・エスピー ＡＪ１１０４０３
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４５
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４５
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
（３）名称：エンシファー・エスピー ＡＪ１１０４０４
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４６
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４６
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
寄託された日：２００５年３月８日
本発明においてβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応に用いられる酵素としては、より具体的には下記のタンパク質が例示される。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
上記のタンパク質を用いることにより、β−ヒドロキシアミノ酸を簡便に生成することができる。また、本発明の方法によって、β−ヒドロキシアミノ酸のなかでもα位に不斉炭素を有するＬ−アミノ酸を選択性良く生成し得る。特に、Ｄ−α−アラニンと５，１０−メチレンＴＨＦとを反応させる系においては、実質的にα−メチル−Ｌ−セリンのみを生成可能であり、効率よく光学活性アミノ酸を得ることができる。
配列番号５に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ａ）は、パラコッカス・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４８株から単離し得る。また、配列番号１１に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｃ）は、アミノバクター・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４５株から単離し得る。また、配列番号１６に示すアミノ酸を有するタンパク質（Ｅ）は、エンシファー・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４６から単離し得る。
上記のように、本発明においては、（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質も用い得る。まず（Ａ）のタンパク質を例とすると、上記（Ａ）に示すタンパク質と実質的に同じタンパク質として（Ｂ）に示すタンパク質が提供される。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。ただし、（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において１または数個の置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ６．５−８．０の条件下で、（Ａ）のタンパク質の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
上記（Ｂ）に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシアミン等でインビトロ処理する方法、及び（Ａ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、（Ａ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
（Ａ）のタンパク質と（Ｂ）のタンパク質の関係と同様に、（Ｃ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｄ）のタンパク質が、（Ｅ）のタンパク質と実質的に同一のタンパク質として（Ｆ）のタンパク質が例示される。
また、（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）のタンパク質とそれぞれ実質的に同一のタンパク質として、アミノ酸配列による相同性が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列を有するタンパク質が例示される。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性の計算は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値またはこれと同等の計算手法による数値である。
本発明は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドとして、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）に示されるタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドとして具体的には、下記（ａ）、（ｃ）、（ｅ）に示すポリヌクレオチドが例示される。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
上記（ａ）のポリヌクレオチドは、（Ａ）のタンパク質をコードしており、パラコッカス・エスピー ＦＥＲＭ Ｐ−２０４４８株から単離し得る。また、（ｃ）のポリヌクレオチドは、（Ｃ）のタンパク質をコードしており、アミノバクター・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４５株から単離し得る。また、（ｅ）のポリヌクレオチドは（Ｅ）のタンパク質をコードしており、エンシファー・エスピーＦＥＲＭ Ｐ−２０４４６から単離し得る。
単離の方法について（ａ）のポリヌクレオチドの場合を例に説明する。配列番号４に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、パラコッカス・エスピーの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）参照）またはハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えば本発明の方法における反応を触媒する活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号４に記載された塩基配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、コード領域を挟むように、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーの組み合わせを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。
プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機 ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などを用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
また、上記（ａ）、（ｃ）、（ｅ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｂ）のポリヌクレオチドが、また（ｃ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｄ）のポリヌクレオチドが、また（ｅ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして下記（ｆ）のポリヌクレオチドが例示される。
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦおよび／または式（ＩＩ）のアルデヒドと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ハイブリダイズさせるポリヌクレオチドとしては、例えばプローブを用い得る。それぞれの場合において、プローブは、配列番号４、１０、１５に記載の各塩基配列に基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブは、プラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。また、一旦、上記のような実質的に同一のポリヌクレオチドが検出された後は、ＰＣＲ等によって増幅することも定法により可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列についての相同性（％）の計算は各遺伝子のORF全体（終止コドンを含む）をもちいて、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝６、ｐｉｃｋ ｕｐ ｌｏｃａｔｉｏｎ＝１の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた数値として表示する。また、他の例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
なお、上記のように上記（ｂ）のポリヌクレオチドの場合には、それぞれ３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ａ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。上記（ｄ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｃ）のタンパク質と対比して同様である。また上記（ｆ）のポリヌクレオチドの場合については（Ｅ）のタンパク質と対比して同様である。
本発明において用いられる酵素は、上記のような反応を触媒し得る状態で反応系内に存在すれば、その形態に特に限定はない。具体的形態としては、酵素を生産する微生物の培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も酵素含有物として利用できる。
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について、上記（Ａ）のタンパク質を一例として説明する。他のタンパク質についても同様に実施可能である。
上記（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体は、上記（ａ）の塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ組換えポリヌクレオチドを作製し、これを用いて作製することができる。例えば、配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡを作製して適切な宿主に導入することにより（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体が得られる。配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。培養等の取り扱いが簡便で、高価な成分を要せずとも培養できる宿主を用いることにより、β−ヒドロキシアミノ酸の大量生産をより簡便に、また安価に行うことができる。
配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、パラコッカス・エスピー、アミノバクター・エスピー、エンシファー・エスピーなどに由来する上記酵素をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号４などのＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８， ３２６ （１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ． ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
目的のタンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、そのタンパク質を生産する形質転換体内でそのタンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア コリ ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１株などが好適な例として挙げられる。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
本発明で用いられる触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、およびその誘導体等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
本発明で用いられるタンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、そのタンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とタンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
触媒活性を有するタンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
プロモータ、所定の活性を有する目的タンパク質またはその目的タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所定のタンパク質またはその融合タンパク質が発現生産される。
融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、目的タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的とするタンパク質を切り出せるようにしてもよい。
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
目的のタンパク質またはこれを含む融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。目的タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、目的タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、目的タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化し、変性剤を透析等により除去して目的タンパク質を得ることができる。
以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
実施例１：２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の検出
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で、表１に示した微生物をそれぞれ３０℃、２４時間培養した。得られた菌体を３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた培養液０．１５ｍｌを０．２％α−メチル−ＤＬ−セリンを含む３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で、表１に示した微生物をそれぞれ３０℃、２４時間培養した。得られた菌体を３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に１白金耳接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた培養液０．１５ｍｌを０．２％α−メチル−ＤＬ−セリンを含む３ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。
培養後、菌体を遠心分離し、培養液と等量の０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で菌体を２回洗浄した。０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、全量０．３ｍｌの菌体懸濁液を調製し、４℃にて超音波破砕処理をした。遠心分離（１６，０００ｇ、１０分）で得られる上清を０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、無細胞抽出液とした。
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ α−メチル−ＤＬ−セリン、０．５ｍＭ テトラヒドロ葉酸、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭ ピリドキサールリン酸、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、０．４ｍＭ ＮＡＤＰ、１Ｕ／ｍｌ ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素の組成を有する反応液−１に、０．０５ｍｌの無細胞抽出液を添加して、全量０．１ｍｌで３０℃、１０分間反応させた。０．１５ｍｌの０．６Ｎ塩酸により反応を停止し、遠心分離（１６，０００ｇ、１０分）で得られる上清を室温にて１０分間放置した。生じる５，１０−メテニル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸に起因する３５０ｎｍの吸光度（Ｅ１１）を測定した。なお、対照として、前記反応液−１においてα−メチル−ＤＬ−セリンの代わりに水を添加したもので行った反応によって得られる反応液の５，１０−メテニル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸に起因する吸光度（Ｅ１０）を測定し、α−メチル−ＤＬ−セリン特異的な吸光度変化（ＥΔ１＝Ｅ１１−Ｅ１０）を算出し、表１に示した。
実施例２：Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２株由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの精製
（１）無細胞抽出液の調製
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で３０℃、２４時間培養したパラコッカス・スピーシーズの菌体を５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた培養液を０．２％ α−メチル−ＤＬ−セリン、０．１７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ（ｐＨ７．０）液体培地２Ｌに接種し、５００ｍｌ容の坂口フラスコに５０ｍｌずつ分注し、３０℃、１２０往復／分で２２時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００ｇ、１０分）により集菌し、０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下、緩衝液Ｉとする）で２回洗浄し、緩衝液Ｉを用いて１００ｍｌの菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分）で得られる上清を超遠心分離（２００，０００ｇ、３０分）を行い、得られた上清を無細胞抽出液とした。
（１）無細胞抽出液の調製
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社）で３０℃、２４時間培養したパラコッカス・スピーシーズの菌体を５００ｍｌ容の坂口フラスコ内の５０ｍｌのＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ液体培地に接種し、３０℃、１２０往復／分で２４時間培養した。得られた培養液を０．２％ α−メチル−ＤＬ−セリン、０．１７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ（ｐＨ７．０）液体培地２Ｌに接種し、５００ｍｌ容の坂口フラスコに５０ｍｌずつ分注し、３０℃、１２０往復／分で２２時間培養した。得られた菌体を遠心分離（８，０００ｇ、１０分）により集菌し、０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下、緩衝液Ｉとする）で２回洗浄し、緩衝液Ｉを用いて１００ｍｌの菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分）で得られる上清を超遠心分離（２００，０００ｇ、３０分）を行い、得られた上清を無細胞抽出液とした。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
無細胞抽出液を予め緩衝液Ｉで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、０−１Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。なお、この操作は無細胞抽出液を半量づつ２回に分けて行った。
無細胞抽出液を予め緩衝液Ｉで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、０−１Ｍ塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。なお、この操作は無細胞抽出液を半量づつ２回に分けて行った。
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー
上記（２）で得られた酵素の活性画分を等量の２Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと混和し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし１−０Ｍ硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。
上記（２）で得られた酵素の活性画分を等量の２Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと混和し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｉと平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし１−０Ｍ硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。
（４）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
上記（３）で得られた酵素の活性画分を０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に透析し、予め同緩衝液で平衡化されたＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＨＡｐカラム（生化学工業製）にアプライした。２．５−２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）にて酵素を溶出させた。この酵素の活性画分を下記実験において精製酵素として用いた。
上記（３）で得られた酵素の活性画分を０．０２ｍＭピリドキサールリン酸を含む２．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に透析し、予め同緩衝液で平衡化されたＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＨＡｐカラム（生化学工業製）にアプライした。２．５−２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）にて酵素を溶出させた。この酵素の活性画分を下記実験において精製酵素として用いた。
このようにして得られた酵素の活性画分は、比活性３．５１Ｕ／ｍｇであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー染色液でゲルを染色させたところ、分子量約４７，０００の位置に均一なバンドが検出された。
実施例３：Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２株由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびコードする塩基配列の決定
実施例２で調製した精製酵素５０ｐｍｏｌ相当をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシーケンサーに供し、３０アミノ酸を決定した（配列番号１）。
実施例２で調製した精製酵素５０ｐｍｏｌ相当をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシーケンサーに供し、３０アミノ酸を決定した（配列番号１）。
次いで、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２株のゲノムＤＮＡ５μｇをＰｓｔＩ（５０Ｕ）にて切断した後、ＴａＫａＲａＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのマニュアル記載の方法に従って、ＰｓｔＩカセットとライゲートした。ライゲートミックスを鋳型として、カセットプライマーＣ１とプライマーＨＭＴ＿ＦＷ１（配列番号２）の組み合わせによってＰＣＲ（９４℃：３０秒、４７℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）を行った。次いでこのＰＣＲ反応液を鋳型として２回目のＰＣＲ（９４℃：３０秒、５５℃：２分、７２℃：１分、３０サイクル）をカセットプライマーＣ２とプライマーＨＭＴ＿ＦＷ２（配列番号３）をもちいて行った。増幅が確認された約０．７ｋｂ長の断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（プロメガ社）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。目的断片を有するプラスミドをＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３１００）により塩基配列を確認した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ処理して得られる約１．１ｋｂ長の遺伝子断片をプローブとして、染色体ＤＮＡを各種制限酵素処理後、サザン解析したところ、ＢｇｌＩＩ／ＮｒｕＩ処理した場合に約３．５ｋｂにポジティブシグナルを確認した。
次いで、染色体ＤＮＡをＢｇｌＩＩ／ＮｒｕＩ処理後、アガロース電気泳動し、約３．５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＨＭＴ０１として、挿入配列３４７５ｂｐについて塩基配列を決定したところ、４２５アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号４）が存在し、Ｎ末端解析結果から得られたアミノ酸配列と同一の配列を有していたことから目的の遺伝子の取得を確認した。本遺伝子配列のＯＲＦについて、相同性検索をおこなったところ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとアミノ酸配列での相同性が５５％であることが確認された。
実施例４：Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２株由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによる発現
ｐＨＭＴ０１を鋳型として、プライマーＰＨＭＴ＿ＳＤ＿Ｅｃｏ（配列番号６）及びプライマーＰＨＭＴ＿ｔｅｒ２＿Ｈｉｎｄ（配列番号７）をもちいてＰＣＲにより２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＯＲＦ領域１．２ｋｂを増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理した後、予めＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＵＣ１８とライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド（ｐＵＣＰＨＭＴ０１）を有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＰＨＭＴ０１と命名した。
ｐＨＭＴ０１を鋳型として、プライマーＰＨＭＴ＿ＳＤ＿Ｅｃｏ（配列番号６）及びプライマーＰＨＭＴ＿ｔｅｒ２＿Ｈｉｎｄ（配列番号７）をもちいてＰＣＲにより２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のＯＲＦ領域１．２ｋｂを増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理した後、予めＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＵＣ１８とライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド（ｐＵＣＰＨＭＴ０１）を有する形質転換体を得た。この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＰＨＭＴ０１と命名した。
ＪＭ１０９／ｐＵＣＰＨＭＴ０１を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。２．５ｍｌの前培養液を５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で培養を行った。培養１時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、３．０２Ｕ／ｍｇであった。なお、ｐＵＣ１８をＪＭ１０９に導入した形質転換体；ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８から上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。
実施例５：Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０３株由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．ＡＪ１１０４０３株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ミックスプライマーＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＦＷ１（配列番号８）、及びＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＲＶ２（配列番号９）によりＰＣＲ反応により、０．６ｋｂの増幅断片を確認した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０３株ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、３．５ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。
Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ．ＡＪ１１０４０３株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ミックスプライマーＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＦＷ１（配列番号８）、及びＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＲＶ２（配列番号９）によりＰＣＲ反応により、０．６ｋｂの増幅断片を確認した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０３株ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、３．５ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。
次いで、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｏｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０３ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ処理後、アガロース電気泳動し、約３．５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＡＨＭＴ０１として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４２５アミノ酸からなるＯＲＦが存在するのを確認した（配列番号１０）。
ｐＡＨＭＴ０１を鋳型として、プライマーＡ２＿Ｂａｍ（配列番号１２）、及びＡ２＿ｔｅｒ＿Ｐｓｔ（配列番号１３）によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲにより得られた１．２ｋｂの増幅断片をＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ処理し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＵＣＡＨＭＴ０１とした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、この形質転換体をＪＭ１０９／ｐＵＣＡＨＭＴ０１と命名した。
ＪＭ１０９／ｐＵＣＡＨＭＴ０１を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。２．５ｍｌの前培養液を５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で培養を行った。培養１時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、０．２７Ｕ／ｍｇであった。なお、ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８より上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。
実施例６：Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０４株由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の取得
Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０４株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ミックスプライマーＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＦＷ２（配列番号１４）、及びＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＲＶ２（配列番号９）によりＰＣＲ反応により、０．６ｋｂの増幅断片を確認した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、５ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。
Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０４株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、ミックスプライマーＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＦＷ２（配列番号１４）、及びＨＭＴ＿ＭＩＸ＿ＲＶ２（配列番号９）によりＰＣＲ反応により、０．６ｋｂの増幅断片を確認した。このＰＣＲ産物をプローブとして、Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩによって処理した後、サザン解析を行ったところ、５ｋｂ長にポジティブシグナルが得られた。
次いで、Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓｐ． ＡＪ１１０４０４株ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理後、アガロース電気泳動し、約５ｋｂ断片を精製し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトにライゲートした。この反応液をもちいてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、ライブラリーを作製した。上記プローブをもちいてコロニーハイブリダイズを行い、ポジティブコロニーを取得し、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドをｐＥＨＭＴ０１として、挿入配列について塩基配列を決定したところ、４２５アミノ酸をコードするＯＲＦが存在した（配列番号１５）。
ｐＥＨＭＴ０１を鋳型として、プライマーＢ＿Ｅｃｏ（配列番号１７）、及びＢ＿ｔｅｒ＿Ｂａｍ（配列番号１８）によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応により得られた１．２ｋｂの増幅断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＵＣＥＨＭＴ０１とした。このプラスミドによりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体は、ＪＭ１０９／ｐＵＣＥＨＭＴ０１と命名した。
ＪＭ１０９／ｐＵＣＥＨＭＴ０１を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間前培養した。２．５ｍｌの前培養液を５０ｍｌの１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で培養を行った。培養１時間後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理によって、菌体を破砕し、遠心分離（１８，０００ｇ、１０分、４℃）により得られる上澄み液を無細胞抽出液として、２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を測定したところ、０．１０Ｕ／ｍｇであった。なお、ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８より上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。
実施例７：Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるα−メチル−Ｌ−セリン生成反応
１００ｍＭＤ−アラニン、２０ｍＭホルムアルデヒド、０．５ｍＭテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の組成にて、実施例２で調製した精製酵素溶液を終濃度４７μｇ／ｍｌになるように添加し、３０℃で１６時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。
１００ｍＭＤ−アラニン、２０ｍＭホルムアルデヒド、０．５ｍＭテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の組成にて、実施例２で調製した精製酵素溶液を終濃度４７μｇ／ｍｌになるように添加し、３０℃で１６時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。
反応終了後、２ｍＭ硫酸銅水溶液を等量加え、ＳｕｍｉｃｈｉｒａｌＯＡ−６１００（住化分析センター）によりＨＰＬＣ分析を行った（移動相：１ｍＭ硫酸銅水溶液、カラム温度：４０℃、流速：１ｍｌ／分、検出：ＵＶ２１５ｎｍ）。その結果、１９ｍＭのα−メチル−Ｌ−セリンが検出され、α−メチル−Ｄ−セリンのピークは検出されなかった。
実施例８：Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＪ１１０４０２由来２−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによるα−メチル−Ｌ−セリン生成
実施例４記載の方法によりＪＭ１０９／ｐＵＣＰＨＭＴ０１を４００ｍｌ培養し、遠心分離後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて洗菌した。この菌体を１００ｍｌの反応液（１５０ｍＭ（１５ｍｍｏｌ）Ｄ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、０．３ｍＭテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加し、３０℃にて、攪拌しながら５０．５ｍｌの６００ｍＭホルムアルデヒド水溶液を２４時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。
実施例４記載の方法によりＪＭ１０９／ｐＵＣＰＨＭＴ０１を４００ｍｌ培養し、遠心分離後、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて洗菌した。この菌体を１００ｍｌの反応液（１５０ｍＭ（１５ｍｍｏｌ）Ｄ−アラニン、０．１ｍＭピリドキサールリン酸、０．３ｍＭテトラヒドロ葉酸、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加し、３０℃にて、攪拌しながら５０．５ｍｌの６００ｍＭホルムアルデヒド水溶液を２４時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液［コード番号：１６２２３−５５］を用いた。
実施例７と同様の条件でＨＰＬＣ分析を行った。その結果、６６．４ｍＭ（９．５ｍｍｏｌ）のα−メチル−Ｌ−セリンが反応液中に得られ、α−メチル−Ｄ−セリンは検出限界以下であった。
実施例９：タンパク質の相同性
上記で得られた各酵素のアミノ酸配列について相同性を計算した。アミノ酸配列の相同性の計算は株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた。
上記で得られた各酵素のアミノ酸配列について相同性を計算した。アミノ酸配列の相同性の計算は株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた。
なお、下記Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来の酵素は、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）においてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＡ６４４５６としてアミノ酸配列が登録されている。また、下記Ｅ．ｃｏｌｉ由来の酵素は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ２３９１２としてアミノ酸配列が登録されている。
本発明はアミノ酸の製法に係る産業において有用である。本発明は、各種のβ−ヒドロキシアミノ酸、光学活性アミノ酸の製造に寄与し、例えば医薬中間体などの製法として利用されることが期待される。
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
Claims (9)
- 下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる１種または２種以上のタンパク質の存在下で、下記式（Ｉ）：
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸とを反応させる、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質 - ホルムアルデヒドの存在下で、前記反応が行なわれる、請求項１に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
- 式（Ｉ）で示されるアミノ酸が、Ｄ−α−アラニンであり、式（ＩＩＩ）で示されるＬ−α−アミノ酸がα−メチル−Ｌ−セリンである、請求項１または２に記載のβ−ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
- 下記式（Ｉ）：
に示されるＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンテトラハイドロ葉酸とを反応させて、下記式（ＩＩＩ）：
に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有する、下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれるいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するし、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質 - パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、アミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、およびエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属からなる群のいずれかの属に属する微生物に由来するタンパク質である、請求項４に記載のタンパク質。
- 請求項４または５に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記（ａ）から（ｆ）よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式（Ｉ）のＤ−α−アミノ酸と、５，１０−メチレンＴＨＦと反応させて、式（ＩＩＩ）に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項６または７に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
- 請求項８に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
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