JP4780405B2 - Method for measuring test substance using binding affinity, and control method for binding affinity analysis for measurement of test substance - Google Patents
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本発明は、結合親和性を利用する被検物質の測定方法、及び被検物質の測定のための結合親和性解析の制御方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring a test substance using binding affinity and a control method for binding affinity analysis for measuring the test substance.
従来より、生物的な結合親和性を利用し、その結合量を評価することにより、タンパク質やペプチド等を測定することが行われている。例えば、抗原と抗体、リガンドとレセプターの特異的な結合反応を利用した測定方法が知られている。これらは、特に、結合親和力が大きく、かつ反応に特異性があるため、試料中の特定の被検物質を高感度に測定できるとして、医学、農学等の生物的分野において広く利用されている。 Conventionally, proteins, peptides, and the like have been measured by using biological binding affinity and evaluating the amount of binding. For example, a measurement method using a specific binding reaction between an antigen and an antibody and a ligand and a receptor is known. These are widely used in biological fields such as medicine and agriculture because they can measure a specific test substance in a sample with high sensitivity because of particularly high binding affinity and specific reaction.
しかしながら、生物的な結合親和性を利用した測定方法は、広範な分野における種々な試料に対して利用されるがため、要求される測定精度および測定範囲は、測定試料、並びに測定目的によって相違する。例えば、被検物質の存在量が未知の試料に対しては、その存在量の見当をつけるため広範な測定範囲をもつことが必要とされる。一方で、正確な存在量を測定したい場合には、高い精度をもって測定することが必要とされる。また、被検物質の濃度に応じて、測定範囲を変動させる必要もあった。そして、測定精度及び測定範囲は、被検物質に対する結合親和性に依存することが知られている。そのため、測定対象物に応じて、かかる結合親和性を確実、かつ簡便に制御できる方法が望まれている。 However, since a measurement method using biological binding affinity is used for various samples in a wide range of fields, the required measurement accuracy and measurement range differ depending on the measurement sample and the measurement purpose. . For example, for a sample whose amount of test substance is unknown, it is necessary to have a wide measurement range in order to determine the amount of the sample. On the other hand, when it is desired to measure an accurate abundance, it is necessary to measure with high accuracy. In addition, it was necessary to vary the measurement range according to the concentration of the test substance. It is known that the measurement accuracy and measurement range depend on the binding affinity for the test substance. Therefore, a method capable of reliably and simply controlling the binding affinity according to the measurement object is desired.
かかる事情に鑑み、なかでも、抗原抗体反応を利用した免疫測定方法において、様々な試みが報告されていた。例えば、測定する被検物質の種類とその測定範囲を拡大するため、複数の異なる結合親和性を有する抗体を同時に用いる方法が報告されていた（特許文献１を参照）。詳細には、同一の抗原に対して異なる結合親和性をもつ抗体を併用することにより測定範囲を拡大すること、及び、異なる抗原に対する抗体を併用して多数の抗原を同時に測定すること、並びに、両者を同時に実現するものである。しかしながら、所望の特性を有する抗体を得るためには市販の抗体の中から必要な結合特性を有する抗体を検索して入手するか、若しくは、新規な抗体を作製する必要があった。新規な抗体の作製には、通常３ヶ月以上の長期を要し、望みの特性の抗体を得るには大規模なスクリーニングを要し、結合特性の調整には限界があった。 In view of such circumstances, among others, various attempts have been reported in immunoassay methods using antigen-antibody reactions. For example, there has been reported a method of simultaneously using a plurality of antibodies having different binding affinities in order to expand the types of test substances to be measured and their measurement ranges (see Patent Document 1). Specifically, expanding the measurement range by using antibodies having different binding affinities for the same antigen, and simultaneously measuring multiple antigens using antibodies against different antigens, and Both are realized at the same time. However, in order to obtain an antibody having a desired characteristic, it is necessary to search for and obtain an antibody having a necessary binding characteristic from commercially available antibodies, or to prepare a new antibody. The production of a new antibody usually takes a long period of 3 months or more, and a large-scale screening is required to obtain an antibody with the desired characteristics, and there is a limit to the adjustment of the binding characteristics.
そして、抗体の抗体価数の観点からの抗体特性の研究についても報告されていた（非特許文献１を参照）。詳細には、ＩｇＧ等の二価の抗体は、抗原結合部位を２箇所に有することから２分子の抗原と結合できるが、結合定数等の抗体特性測定は一価の抗体を基準としているため補正が必要となることが報告されていた。しかしながら、ここでの報告は、抗体特性測定のみの検討に限定され、また、検討した抗体の抗体価数も一価、および二価のみであった。 And the research of the antibody characteristic from a viewpoint of the antibody valence of an antibody was also reported (refer nonpatent literature 1). Specifically, a bivalent antibody such as IgG can bind to two molecules of antigen because it has two antigen binding sites, but it is corrected because measurement of antibody properties such as binding constants is based on a monovalent antibody. Was reported to be necessary. However, the report here is limited to the examination of only the antibody characteristic measurement, and the antibody valency of the examined antibody was only monovalent and bivalent.
従来法によっては、測定対象物に応じて、結合親和性反応を確実、かつ簡便に制御できる技術は報告されておらず、かかる技術の構築が依然として望まれていた。特に、結合親和性において被検物質と競合する競合物質と、被検物質との競合反応を利用した、いわゆる競合法においては、結合親和性反応の制御は難しく、かかる反応を確実、かつ簡便に制御できる技術の構築が特に望まれていた。 Depending on the conventional method, there has been no report on a technique that can reliably and easily control the binding affinity reaction according to the measurement object, and the construction of such a technique has been desired. In particular, in a so-called competition method that uses a competitive reaction between a competitive substance that competes with a test substance in terms of binding affinity and the test substance, it is difficult to control the binding affinity reaction. The construction of a controllable technology was particularly desired.
さらに、結合親和性を利用する測定方法において、適切に感度および測定範囲を調整でき、かつ、様々な試料に対して適用できる効率的な測定技術を確立すべく検討が重ねられていた。例えば、免疫クロマトグラフィーの着色度合いを段階的に評価することにより被検物質の濃度を測定する方法が報告されていた（特許文献２、３を参照）。しかしながら、かかる方法は簡易に段階評価することが可能であるが定量には不向きであり、その使用用途は限定されるのが実情であった。
Furthermore, in the measurement method using the binding affinity, studies have been made to establish an efficient measurement technique that can appropriately adjust the sensitivity and measurement range and can be applied to various samples. For example, a method for measuring the concentration of a test substance by stepwise evaluating the degree of coloring in immunochromatography has been reported (see
さらに、測定値から経験式（４パラメーターロジスティックモデル）を用いて検量線を作成する方法が報告されていた（特許文献４を参照）。しかしながら、かかる方法によって得られる検量線が経験式であるため、抗原−抗体−測定系の組合せ毎に予め多数のデータから検量線に使用する４個のパラメーターを求める必要があった。そのため、煩雑な手順を要するため、更に簡便に検量線を求めることができる技術の開発が望まれていた。そして、液相中の抗原と抗体を反応させた後、該液相を固定化抗原に接触させて未反応抗体を捕捉しその抗体を測定することで間接的に液相中の抗原を検出する競合法において、抗体濃度を解離平衡定数の１／２以下とし、かつ未反応の抗体を含む液相と固定化抗原の接触時間を極端に短くして液相中の抗原と抗体の結合状態を乱さないように抑制することにより、検出下限を理論的に到達可能な抗体の解離平衡定数に近づけ、かつ擬似的に液相中の抗原と抗体の結合反応のみを反映した検量線となることも報告されている（特許文献１を参照）。しかしながら、かかる方法も、抗体濃度が低く、かつ固定化抗原との接触時間が極端に短いため固定化抗原で捕捉できる抗体総数が少なく、その結果シグナルが低くなり表面積が小さくなるマイクロ流路への応用が困難となる問題点があった。また固定化抗原への接触時間を短く抑制したまま捕捉する抗体総数を多くするには、固定化抗原上に液相を大量に送液する必要があり、この点でもマイクロ流路への応用には問題があった。また、高分子量抗原と抗体の２者間の反応で理論計算値による検量線と実験値が一致することが報告された（非特許文献２を参照）が、被検物質・競合物質・結合物質の３者間の反応である、いわゆる競合法には応用できなかった。
したがって、本発明の第一の課題は、競合法に基づく結合親和性解析を利用した被検物質の測定技術において、測定目的に応じて測定精度及び測定範囲を適切に調整できる技術の構築を目的とする。 Therefore, the first object of the present invention is to establish a technique capable of appropriately adjusting the measurement accuracy and measurement range according to the measurement purpose in the measurement technique of the test substance using the binding affinity analysis based on the competition method. And
さらに、本発明の第二の課題は、競合法に基づく結合親和性解析を利用した被検物質の測定技術において、その測定感度、および測定範囲を適切に調整でき、更には、測定技術の効率化を図ることを目的とする。 Furthermore, the second problem of the present invention is that the measurement sensitivity and measurement range can be appropriately adjusted in the measurement technique of the test substance using the binding affinity analysis based on the competition method, and further the efficiency of the measurement technique. The purpose is to make it easier.
本発明者が鋭意検討を行った結果、競合法に基づく被検物質とその結合物質との特異的な結合親和性を利用した測定方法において、結合物質の価数を上げることにより被検物質の測定精度を向上できることを見出すと共に、結合物質の価数を下げることにより幅広い濃度範囲での測定が達成できることを見出した。更に、鋭意検討を重ねた結果、結合物質の価数を、結合物質を架橋可能な架橋物質により簡便、かつ迅速に制御できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventor, in a measurement method using a specific binding affinity between a test substance and its binding substance based on the competition method, the test substance of the test substance is increased by increasing the valence of the binding substance. It was found that measurement accuracy can be improved, and that measurement in a wide concentration range can be achieved by lowering the valence of the binding substance. Furthermore, as a result of extensive studies, it has been found that the valence of the binding substance can be easily and quickly controlled by a crosslinking substance capable of crosslinking the binding substance, and the present invention has been completed based on these findings.
上記目的を達成するため、下記の〈１〉〜〈８〉の構成からなる発明を提供する。
〈１〉結合親和性を利用する被検物質の測定方法であって、（i）前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質を、架橋物質により架橋処理する工程、（ii） 前記被検物質と、前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質とを、工程（i）において架橋処理した結合物質に競合的に反応させる工程、（iii） 前記結合物質と前記競合物質間での複合体の形成を測定する工程、を備える測定方法。
〈２〉前記結合物質が、抗体である上記〈１〉の測定方法。
〈３〉前記架橋物質が、結合物質に対する抗体である上記〈１〉又は〈２〉の測定方法。
上記〈１〉〜〈３〉の構成によれば、結合物質の架橋により高精度な測定を達成することができる。また、結合物質の架橋を抑えることで広範な濃度範囲での測定を行うこともでき、測定目的に応じた被検物質の測定が達成される。
In order to achieve the above object, an invention comprising the following <1> to <8> is provided.
<1> A method for measuring a test substance using binding affinity, comprising: (i) a step of cross-linking a binding substance having binding affinity for the test substance with a cross-linking substance; and (ii) the test subject A step of competitively reacting a substance and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the binding substance with the binding substance subjected to the crosslinking treatment in step (i), (iii) the binding substance and the competitive substance Measuring the formation of a complex between them.
<2> The method according to <1>, wherein the binding substance is an antibody.
<3> The measuring method according to <1> or <2>, wherein the cross-linking substance is an antibody against a binding substance.
According to the configurations <1> to <3>, highly accurate measurement can be achieved by crosslinking of the binding substance. Moreover, it is also possible to perform measurement in a wide concentration range by suppressing the crosslinking of the binding substance, and the measurement of the test substance corresponding to the measurement purpose is achieved.
〈４〉上記〈１〉〜〈３〉のいずれか測定方法を実施するための試薬を備えた、結合親和性を利用する被検物質の測定用キット。
上記〈４〉の構成によれば、このように被検物質の測定に必要な試薬をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な被検物質の測定が可能となる。
<4> A test substance measurement kit using binding affinity, comprising a reagent for carrying out the measurement method according to any one of <1> to <3> above.
According to the configuration <4> above, the reagent necessary for measurement of the test substance is kitted and configured as described above, so that the test substance can be measured easily and quickly.
〈５〉被検物質を測定するための結合親和性解析の制御方法であって、
（i） 前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質を、架橋物質により架橋処理する工程、（ii） 前記被検物質と、前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質とを、工程（i）において架橋処理された結合物質に競合的に反応させる工程、（iii） 前記結合物質と前記競合物質間での複合体の形成を測定する工程、を備えた試料中の被検物質の測定するための結合親和性解析において、工程（i）の架橋処理の制御を通して、前記結合物質の価数を変更することにより測定精度及び測定範囲の少なくとも一方を調整して結合親和性解析を制御する制御方法。
〈６〉前記結合物質が、抗体である上記〈５〉の制御方法。
〈７〉前記架橋物質が、結合物質に対する抗体である上記〈５〉又は〈６〉に記載の制御方法。
上記〈５〉〜〈７〉の構成によれば、結合物質の架橋の程度の制御を通して結合物質の価数を変更することにより、測定目的に応じて適切に測定精度、測定範囲を制御することができる。また、本発明の制御方法は、架橋物質により簡便に行うことができることから、ユーザ自身が自ら望む測定精度及び測定範囲に調整することが可能である。
<5> A control method of binding affinity analysis for measuring a test substance,
(I) a step of cross-linking a binding substance having binding affinity for the test substance with a cross-linking substance; (ii) a competitive substance that competes with the test substance in terms of binding affinity for the test substance and the binding substance. And (iii) a step of measuring the formation of a complex between the binding substance and the competitive substance in a sample. In the binding affinity analysis for measuring the test substance, the binding affinity is adjusted by adjusting at least one of the measurement accuracy and the measurement range by changing the valence of the binding substance through the control of the crosslinking treatment in the step (i). Control method to control sex analysis.
<6> The control method according to <5>, wherein the binding substance is an antibody.
<7> The control method according to <5> or <6>, wherein the cross-linking substance is an antibody against a binding substance.
According to the above configurations <5> to <7>, the measurement accuracy and the measurement range can be appropriately controlled according to the measurement purpose by changing the valence of the binding substance through the control of the degree of crosslinking of the binding substance. Can do. In addition, since the control method of the present invention can be easily performed using a cross-linking substance, it is possible to adjust the measurement accuracy and measurement range desired by the user himself / herself.
〈８〉上記〈５〉〜〈７〉のいずれかの制御方法を実施するための試薬を備えた、被検物質を測定するための結合親和性解析の制御用キット。
上記〈８〉の構成によれば、このように結合親和性解析の制御に必要な試薬をキットして構成することにより、簡便且つ迅速に、測定目的に応じた測定感度、測定範囲に制御することができる。
<8> A control kit for binding affinity analysis for measuring a test substance, comprising a reagent for performing the control method according to any one of <5> to <7> above.
According to the configuration of <8> above, by configuring the reagents necessary for the control of the binding affinity analysis as a kit, the measurement sensitivity and the measurement range according to the measurement purpose can be controlled easily and quickly. be able to.
以下、本発明について詳細に説明する。しかし、本発明は以下の説明に限定されることなく適宜変更することができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following description and can be modified as appropriate.
１．結合親和性を利用する被検物質の測定方法
本発明の結合親和性を利用する被検物質の測定方法は競合法に基づく。競合法は、試料中の被検物質の存在や量を、被検物質に対する結合親和性を有する結合物質が、被検物質又は競合物質（前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する）に結合する度合いによって決定する方法である。具体的には、一定量の結合物質と一定量の競合物質との反応中に、測定すべき被検物質を共存させて競合させた時、被検物質の存在により結合物質と結合する競合物質が減少する。その減少の度合いにより、測定すべき被検物質の量を算出するものである。そして、本発明の被検物質の測定方法おいては、予め結合物質は架橋物質により架橋処理される。
1. Method for Measuring Test Substance Utilizing Binding Affinity The method for measuring a test substance using the binding affinity of the present invention is based on a competition method. In the competitive method, the presence or amount of a test substance in a sample is determined by the binding substance having binding affinity for the test substance competing with the test substance or the competitive substance (the test substance in binding affinity for the binding substance). ) To determine the degree of combination. Specifically, a competitive substance that binds to a binding substance due to the presence of the test substance when the test substance to be measured coexists in the reaction between a fixed quantity of the binding substance and a constant quantity of the competitive substance. Decrease. The amount of the test substance to be measured is calculated based on the degree of the decrease. In the method for measuring a test substance of the present invention, the binding substance is previously subjected to a crosslinking treatment with a crosslinking substance.
本発明の被検物質の測定方法は、抗原抗体反応、レセプター・リガンド反応、レクチン−糖（糖鎖、複合糖質等）等、任意の生物的な結合親和性反応に適用することができる。特には、抗原抗体反応が好ましい。ここで、生物的な結合親和性反応とは、生体物質等が有する特異的識別能を利用する反応であり、複数の物質が非共有結合により可逆的かつ選択的に結合する反応を意味するものとする。 The method for measuring a test substance of the present invention can be applied to any biological binding affinity reaction such as antigen-antibody reaction, receptor / ligand reaction, lectin-sugar (sugar chain, glycoconjugate, etc.). In particular, antigen-antibody reaction is preferable. Here, the biological binding affinity reaction is a reaction that utilizes the specific discrimination ability of biological substances, etc., and means a reaction in which a plurality of substances are reversibly and selectively bound by non-covalent bonds. And
ここで、本発明の被検物質の測定方法に用いられる試料は、測定対象となる被検物質を含み得る試料であれば特に制限はない。例えば、動物由来の血液、血漿、血清、脳脊髄液、羊水、乳、汗、尿、唾液、喀痰、糞便、組織、細胞培養物等の生体由来試料、植物の根、茎、葉、花、果実等の植物由来試料、土壌、地下水、河川水、湖沼水等の環境試料、肉、卵、加工食品等の食品等が例示される。また、これらの試料は必要に応じて分離、精製等の前処理が施されていてもよい。 Here, the sample used in the method for measuring a test substance of the present invention is not particularly limited as long as it can contain the test substance to be measured. For example, animal-derived blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, milk, sweat, urine, saliva, sputum, feces, tissue, cell culture, and other biological samples, plant roots, stems, leaves, flowers, Examples include plant-derived samples such as fruits, environmental samples such as soil, groundwater, river water, and lake water, foods such as meat, eggs, and processed foods. Further, these samples may be subjected to pretreatment such as separation and purification as necessary.
そして、本発明における被検物質は、当該被検物質に対する結合親和性を有する結合物質が存在するものであれば特に制限はない。したがって、天然物、遺伝子工学的技術及び化学合成技術等による合成物の別を問わない。例えば抗原抗体反応を惹起する抗原と為り得る各種タンパク質、糖、脂質、その他の有機物等が挙げられる。また、本明細書における抗原には、抗体との結合能を有しているが免疫原性を有していない低分子化合物であるハプテン等も好ましく例示される。ハプテンとしてはPCB類、ダイオキシン類等が例示される。また、適当なキャリアタンパク質との結合物であってよく、共有結合等の化学的に結合したものの他、単に物理的吸着により結合したものであってもよい。このようなキャリアタンパク質としては、牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、オボアルブミン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、グロブリン、カゼイン等が例示される。更には、被検物質として、レセプター・リガンド反応のリガンドと為り得るホルモン、成長因子、神経伝達物質、サイトカインの他、PCB類、ダイオキシン類等の化合物質も好ましく例示される。 And the test substance in this invention will not be restrict | limited especially if the binding substance which has the binding affinity with respect to the said test substance exists. Therefore, it does not matter whether the product is a natural product, genetic engineering technology, chemical synthesis technology or the like. For example, various proteins, sugars, lipids, and other organic substances that can occur as antigens that cause antigen-antibody reaction are included. In addition, the antigen in the present specification is preferably exemplified by a hapten which is a low molecular weight compound which has an ability to bind to an antibody but does not have immunogenicity. Examples of haptens include PCBs and dioxins. Moreover, it may be a conjugate with an appropriate carrier protein, and may be a conjugate obtained by physical adsorption in addition to a chemical linkage such as a covalent bond. Examples of such carrier proteins include serum albumin such as bovine serum albumin and human serum albumin, ovalbumin, keyhole / limpet / hemocyanin, globulin, and casein. Furthermore, as a test substance, in addition to hormones, growth factors, neurotransmitters, and cytokines that can be ligands for receptor / ligand reaction, compound substances such as PCBs and dioxins are preferably exemplified.
結合物質としては、測定対象の被検物質に対する結合親和性を有する物質であれば、特に制限はない。例えば、被検物質が抗原である場合には、当該抗原に特異的に結合する抗体が結合物質と為り得、また、被検物質がリガンドである場合には、当該リガンドに特異的に結合するレセプターが結合物質と為り得る。また、この逆も好ましく例示されるが、これらに限定するものではない。これらは天然物、遺伝子工学的技術及び化学合成技術等による人工合成物の別を問わない。また、公知の方法で得られた被検物質に対する結合親和性を有するこれらの断片でもよい。 The binding substance is not particularly limited as long as it has a binding affinity for the analyte to be measured. For example, when the test substance is an antigen, an antibody that specifically binds to the antigen can be a binding substance, and when the test substance is a ligand, it specifically binds to the ligand. The receptor that does can become a binding substance. Moreover, the reverse is also preferably exemplified, but not limited thereto. These may be natural products, genetic engineering techniques, chemical synthesis techniques, or other artificial synthetic products. Further, these fragments having binding affinity for a test substance obtained by a known method may be used.
結合物質が抗体である場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれをも好適に利用可能である。これらは市販品を利用できると共に、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の哺乳動物に抗原となり得る前記被検物質を免疫することによって得られたポリクローナル抗体をも好適に使用できる。さらに、前記被検物質に対する抗体産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得られたハイブリドーマ細胞を培養して得られたモノクローナル抗体をも好適に利用できる。そして、免疫に際しては、必要に応じて適当なアジュバンドと併用することができる。また、パパイン、ペプシン等のタンパク分解酵素での処理で得られる、Ｆ（ａｂ´）2フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント等の抗原結合能を保持する抗体断片が例示される。また遺伝子組換え等の公知の遺伝子工学的技術、及び化学合成技術等に基づいて調製された抗体をも含む。 When the binding substance is an antibody, both a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be suitably used. As these, commercially available products can be used, and polyclonal antibodies obtained by immunizing mammals such as mice, rats, rabbits, goats, sheep, and guinea pigs with the test substance that can serve as antigens can also be suitably used. Furthermore, a monoclonal antibody obtained by culturing a hybridoma cell obtained by cell fusion of an antibody-producing cell against the test substance and a myeloma cell can also be suitably used. In immunization, it can be used in combination with an appropriate adjuvant as necessary. Further, antibody fragments having antigen-binding ability such as F (ab ′) 2 fragment, Fab fragment, Fv fragment, etc. obtained by treatment with proteolytic enzymes such as papain and pepsin are exemplified. Moreover, the antibody prepared based on well-known genetic engineering techniques, such as gene recombination, a chemical synthesis technique, etc. is also included.
結合物質がレセプターである場合には、細胞膜上に存在する膜レセプター、細胞内に存在する核内レセプターの別を問わない。例えば、PCB類、ダイオキシン類に対するアリール炭化水素レセプター（Ａｈレセプター）等が例示されるが、これに限定するものでない。また、レセプターの部分精製物でもよく、また融合タンパク質の形態であってもよい。 When the binding substance is a receptor, it does not matter whether it is a membrane receptor present on the cell membrane or a nuclear receptor present in the cell. Examples include, but are not limited to, aryl hydrocarbon receptors (Ah receptors) for PCBs and dioxins. Further, it may be a partially purified product of the receptor, or may be in the form of a fusion protein.
競合物質としては、結合物質に対する結合親和性が被検物質と同一若しくは類似物質であることが好ましく、結合物質に対して被検物質と競合的に結合する物質であれば特に制限はない。したがって、該結合物質に対する結合親和性を有する限り、被検物質と同一の物質でもよく、また、類似構造を有する、いわゆる擬似物質でもよい。例えば、被検物質と同一又は擬似物質に標識等の何らかの修飾が施された物質が好適に利用できる。さらに、被検物質の修飾体としては、被検物質と同一又は擬似物質を適当なキャリアタンパク質上に固定化されたものであってもよく、共有結合等の化学的に結合したものの他、単に物理的吸着により固定化したものであってもよい。また、適当なスペーサーを介して結合してもよい。このようなキャリアタンパク質として、牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、オボアルブミン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、グロブリン、カゼイン等が例示される。 The competitive substance is preferably a substance having the same or similar binding affinity for the binding substance as the test substance, and is not particularly limited as long as it is a substance that competitively binds to the test substance with respect to the binding substance. Therefore, as long as it has binding affinity for the binding substance, it may be the same substance as the test substance or may be a so-called pseudo substance having a similar structure. For example, a substance that is the same as the test substance or a substance that has been subjected to some modification such as a label can be suitably used. Furthermore, the modified substance of the test substance may be the same or a pseudo substance immobilized on an appropriate carrier protein as the test substance. In addition to a chemical bond such as a covalent bond, It may be immobilized by physical adsorption. Moreover, you may couple | bond through an appropriate spacer. Examples of such carrier proteins include bovine serum albumin, serum albumin such as human serum albumin, ovalbumin, keyhole / limpet / hemocyanin, globulin, and casein.
例えば、被検物質が抗原である場合には、結合物質である抗体の抗原結合部位に競合的に結合する物質であれば特に制限はない。したがって、測定に用いる抗体に対して結合親和性を有する限り、被検物質と同一の抗原をも使用でき、更には、類似構造を有する、いわゆる擬似抗原をも使用できる。例えば、被検物質と同一の抗原又は擬似抗原に標識やキャリアタンパク質への結合等の何らかの修飾が施された抗原が好適に利用できる。要するに、測定に用いる抗体の抗原結合部位によって認識される、被検物質のエピトープと同一又は類似のエピトープを備えた物質であれば特に制限はない。したがって、このようなエピトープを含む断片であってもよい。 For example, when the test substance is an antigen, there is no particular limitation as long as it is a substance that competitively binds to the antigen binding site of an antibody that is a binding substance. Therefore, as long as it has binding affinity for the antibody used for measurement, the same antigen as the test substance can be used, and furthermore, a so-called pseudoantigen having a similar structure can be used. For example, an antigen in which some modification such as labeling or binding to a carrier protein is applied to the same antigen or pseudoantigen as the test substance can be suitably used. In short, there is no particular limitation as long as it is a substance having the same or similar epitope as the epitope of the test substance recognized by the antigen binding site of the antibody used for measurement. Therefore, it may be a fragment containing such an epitope.
被検物質、および競合物質としては使用できる物質につき、特に被検物質（抗原）と擬似抗原の組み合わせにつき下記にて例示する。しかしながら、これに限定されるものではない。 Examples of substances that can be used as test substances and competing substances, particularly combinations of test substances (antigens) and pseudoantigens, are shown below. However, the present invention is not limited to this.
・被検物質・・・ビオチン等の低分子化合物（ハプテン）
・競合物質・・・ビオチン等の低分子化合物（ハプテン）をキャリアタンパク質上に固定した結合体
・ Test substance: biotin and other low molecular weight compounds (hapten)
・ Competing substances: conjugates in which a low molecular weight compound (hapten) such as biotin is immobilized on a carrier protein
・被検物質・・・抗原タンパク質
・競合物質・・・抗原タンパク質のエピトープ部分のみを取り出したペプチド断片
・ Test substance: Antigen protein ・ Competing substance: Peptide fragment obtained by extracting only the epitope part of the antigen protein
・被検物質・・・PCB等
・競合物質・・・PCB等に対して結合親和性を有する抗体が、本来の意図に反して結合してしまう骨格分子のビフェニル
・ Test substance ... PCB etc. ・ Competing substance ... Biphenyl, a skeletal molecule that binds to the PCB with binding affinity against the original intention
本発明において、結合物質の架橋に用いる架橋物質としては、結合物質間を架橋できる物質であり、架橋される結合物質の被検物質に対する結合親和性に影響を与えない限り公知のものを利用できる。つまり、結合物質−被検物質間、結合物質−競合物質間の安定性を損なわない限り、特に制限はなく、免疫学的架橋、化学的架橋の別を問わない。免疫学的に架橋する架橋物質としては、結合物質に対する抗体が例示される。ここで、架橋物質として抗体を用いる場合、抗体の抗体価数は２価以上である。したがって、ＩｇＧ、又はＩｇＭであることが好ましい。また、２分子以上の抗体を、適当な架橋試薬を用いて架橋させたものを用いてもよい。また、抗体としては、２価以上の抗体価数を有する限り、Ｆ（ａｂ´）2フラグメント等の抗体フラグメントでもよく、また、２分子以上のＦ（ａｂ´）2フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント等の抗体フラグメントを、架橋試薬を用いて架橋したものを利用することができる。また、結合物質が抗体であり、それに対する抗抗体を架橋物質として使用する場合には同種の動物由来の抗体とすることが好ましい。 In the present invention, the cross-linking substance used for cross-linking of the binding substance is a substance capable of cross-linking between the binding substances, and a known substance can be used as long as the binding affinity of the binding substance to be cross-linked to the test substance is not affected. . That is, there is no particular limitation as long as the stability between the binding substance and the test substance and between the binding substance and the competitor is not impaired, and it does not matter whether immunological crosslinking or chemical crosslinking is performed. Examples of the immunologically cross-linking substance include antibodies against binding substances. Here, when an antibody is used as the cross-linking substance, the antibody valence of the antibody is two or more. Therefore, IgG or IgM is preferable. Moreover, you may use what cross-linked the antibody of 2 or more molecules using the appropriate crosslinking reagent. Further, the antibody may be an antibody fragment such as an F (ab ′) 2 fragment as long as it has an antibody valence of 2 or more, and two or more F (ab ′) 2 fragments, Fab fragments, and Fv fragments. And the like obtained by crosslinking an antibody fragment such as the above using a crosslinking reagent. In addition, when the binding substance is an antibody and an anti-antibody is used as a cross-linking substance, it is preferable to use an antibody derived from the same species.
化学的に架橋する架橋物質としては、結合物質と結合可能な官能基を同一分子内に２以上有する多官能性試薬が例示される。このような官能基としては、スクシンイミド基、スルホン化スクシンイミド基、マレイミド基等が例示される。そして、このような官能基を２以上有する多官能性試薬としては公知のいずれの物質をも使用できる。例えば、結合物質のＳＨ基同士を架橋する試薬、ＳＨ基とＮＨ基を架橋する試薬、ＮＨ基同士を架橋する試薬、ＮＨ基とＣＯＯＨ基を架橋する試薬が挙げられるがこれに限定するものではない。そして、ＳＨ基同士を架橋する試薬として（Ｎ,Ｎ´−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、ビス（Ｎ´マレイミドメチル）エーテル等のビスマレイミド化合物等が例示される。また、ＳＨ基とＮＨ基を架橋する試薬としてＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等のマレイミド−スクシンイミジルエステル型化合物等が例示される。また、ＮＨ基同士を架橋する試薬としてグルタルアルデヒドの他、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート等のビススクシンイミジル等が例示される。ＮＨ基とＣＯＯＨ基を架橋する試薬として1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド化合物等が例示される。さらに、結合物質間を直接連結できる試薬、例えば、ジスルフィド結合を形成させる酸化剤等も利用できる。架橋に際して、結合物質に適当な鎖長の反応性側鎖（スペーサー）を予め導入、若しくは導入するための試薬を付加することもでき、また酵素、ストレプトアビジン等の標識等を介して結合させるように構成してもよい。また、複数の抗体分子を1分子の標識に結合した抗体−標識複合体を構成する一部の抗体同士を架橋させるように構成してもよい。 Examples of the cross-linking substance that is chemically cross-linked include polyfunctional reagents having two or more functional groups capable of binding to the binding substance in the same molecule. Examples of such a functional group include a succinimide group, a sulfonated succinimide group, and a maleimide group. Any known substance can be used as the polyfunctional reagent having two or more such functional groups. Examples include a reagent that crosslinks SH groups of a binding substance, a reagent that crosslinks SH groups and NH groups, a reagent that crosslinks NH groups, and a reagent that crosslinks NH groups and COOH groups. Absent. Examples of a reagent for crosslinking SH groups include bismaleimide compounds such as (N, N ′-(1,3-phenylene) bismaleimide, bis (N′maleimidomethyl) ether), etc. Examples of the reagent for crosslinking the NH group include maleimide-succinimidyl ester type compounds such as N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate and succinimidyl 4- (P-maleimidophenyl) butyrate. Examples of the reagent for cross-linking each other include glutaraldehyde and bissuccinimidyl such as dithiobissuccinimidyl propionate, etc. 1-ethyl-3- ( Carbodiimi such as 3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, dichlorocarbodiimide Examples include compounds that can directly link the binding substances, for example, oxidizing agents that form disulfide bonds, etc. Reactive side chains (spacers) of appropriate chain length for the binding substances upon crosslinking May be added in advance, or a reagent for introduction may be added, or may be configured to be bound via a label such as an enzyme, streptavidin, etc. Further, a plurality of antibody molecules may be labeled as one molecule. Alternatively, a part of the antibodies constituting the antibody-label complex bound to may be crosslinked.
架橋物質の添加量は、測定目的に応じて適宜設定することができる。架橋物質の添加量の増加に伴い、結合物質の架橋度合い（つまり、結合物質の価数）が上昇する。そして、高精度の測定を要求する場合には、架橋物質の添加量を増加させる。一方で、広範な濃度での測定を要求する場合には、架橋物質の添加量を低減させる等、測定目的に応じて添加量を当業者は適宜設定できる。したがって、一次スクリーニングのようなラフスクリーニングの場合には、好ましくは結合物質の架橋の程度を低減させて広範な濃度範囲での測定を行う。更に、最終的な精密測定の場合には、好ましくは結合物質の架橋の程度を増加させて高精度な測定を行う。また、結合物質の架橋度合い（つまり、結合物質の価数）は、架橋物質と結合物質の接触時間を制御することによっても調整することができる。 The addition amount of the crosslinking substance can be appropriately set according to the measurement purpose. As the addition amount of the crosslinking substance increases, the degree of crosslinking of the binding substance (that is, the valence of the binding substance) increases. And when a highly accurate measurement is requested | required, the addition amount of a crosslinking substance is increased. On the other hand, when measurement is required in a wide range of concentrations, those skilled in the art can appropriately set the addition amount according to the measurement purpose, such as reducing the addition amount of the cross-linking substance. Therefore, in the case of rough screening such as primary screening, measurement is preferably performed in a wide concentration range by reducing the degree of cross-linking of the binding substance. Furthermore, in the case of the final precision measurement, it is preferable to increase the degree of cross-linking of the binding substance and perform a highly accurate measurement. In addition, the degree of crosslinking of the binding substance (that is, the valence of the binding substance) can be adjusted by controlling the contact time between the crosslinking substance and the binding substance.
つまり、競合法に基づく結合親和性を利用した測定系においては、検量線の傾きと測定精度、測定範囲は以下のような特徴を有する。
（１）検量線の傾きが大きいほど、高精度に測定可能である。一方で測定範囲は狭まる。
（２）検量線の傾きが小さいほど、広範範囲での測定が可能である。一方で、測定精度は低下する。
That is, in the measurement system using the binding affinity based on the competition method, the slope of the calibration curve, the measurement accuracy, and the measurement range have the following characteristics.
(1) The larger the slope of the calibration curve, the higher the accuracy of measurement. On the other hand, the measurement range is narrowed.
(2) The smaller the slope of the calibration curve, the wider the measurement is possible. On the other hand, measurement accuracy decreases.
なぜならば、競合法は上記したように、試料中の被検物質の存在や量を、被検物質共在下での結合物質に競合物質が結合する度合いによって決定する方法である。ここで、結合物質が一価であれば被検物質は競合物質とは結合できなくなるが、結合物質が二価であれば被検物質と競合物質に同時に結合できることとなる。このため、被検物質が結合物質より十分に低濃度である場合には、結合物質が一価であれば競合物質と結合できる結合物質は少なくなるが、結合物質が二価ならば競合物質と結合する結合物質の量はほとんど変化しない。一方、被検物質の濃度が高くなるにつれ、結合物質が一価の場合は競合物質と結合する結合物質は緩やかに減少する。しかし、結合物質が二価の場合は比較的急速に競合物質と結合する結合物質が減少する。したがって、結合物質の価数が大きいほど、被検物質の濃度が高くなるにつれて競合物質と結合する結合物質は急激に減少する。このため、結合物質の価数が大きくなるほど、検量線の傾きが大きくなる（免疫競合反応における抗体の抗体価数の影響をシミュレーションした図１、２を参照）。ここで、結合物質の価数（結合物質の結合価）とは、一分子の結合物質が同時に結合できる物質の分子数を意味し、つまり一分子の結合物質が結合できる手の数をいう。このとき、架橋物質により結合されている場合には架橋結合物質全体で一分子として算出する。抗体を例示すると、一つの抗体分子に結合できる、抗原分子の数を意味し、抗体価数、抗体結合価とも称される。 This is because, as described above, the competitive method is a method for determining the presence or amount of a test substance in a sample based on the degree of binding of the competitive substance to the binding substance in the presence of the test substance. Here, if the binding substance is monovalent, the test substance cannot be bound to the competitor substance, but if the binding substance is divalent, the test substance and the competitor substance can be bound simultaneously. For this reason, when the test substance is sufficiently lower in concentration than the binding substance, the binding substance that can bind to the competitive substance is less if the binding substance is monovalent, but if the binding substance is divalent, The amount of binding material that binds remains almost unchanged. On the other hand, as the concentration of the test substance increases, when the binding substance is monovalent, the binding substance binding to the competitor substance gradually decreases. However, when the binding substance is divalent, the binding substance that binds to the competitor substance relatively rapidly decreases. Therefore, the larger the valence of the binding substance, the more rapidly the binding substance that binds to the competitive substance decreases as the concentration of the test substance increases. For this reason, as the valence of the binding substance increases, the slope of the calibration curve increases (see FIGS. 1 and 2 in which the influence of the antibody valence of the antibody in the immune competition reaction is simulated). Here, the valence of the binding substance (the binding valence of the binding substance) means the number of molecules of the substance that can be bound simultaneously by one molecule of the binding substance, that is, the number of hands that can be bound by one molecule of the binding substance. At this time, when it is bound by a cross-linking substance, the entire cross-linking substance is calculated as one molecule. When an antibody is exemplified, it means the number of antigen molecules that can bind to one antibody molecule, and is also referred to as an antibody valence or an antibody binding valence.
そして、本発明の被検物質の測定方法においては、好ましくは、測定の便宜のため、結合物質、競合物質は、適当な標識物質により標識される。このような標識物質は公知であるので当業者は適宜選択して使用でき、反応において必要とされる安定性と機能性を保持できる限りは、公知のいずれをも使用できる。したがって、直接標識、間接標識の別を問わない。放射性同位体元素、酵素、蛍光色素、発光物質等が例示される。具体的には、適切な放射性同位元素標識として、32Ｐ、35Ｓ、131Ｉ、45Ｃａ、3Ｈ等が例示される。酵素標識として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが例示される。また、蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＣＡ）、テキサスレッド、シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）等のシアニン色素、量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標）等）等が例示される。更に、ジゴキシゲニンやビオチン等をも好適に利用できる。しかし、これらに限定するものではない。標識は既知の手法により行うことができる。 In the method for measuring a test substance of the present invention, preferably, for the convenience of measurement, the binding substance and the competitive substance are labeled with an appropriate labeling substance. Since such a labeling substance is known, those skilled in the art can appropriately select and use it, and any known substance can be used as long as the stability and functionality required in the reaction can be maintained. Therefore, it does not matter whether direct labeling or indirect labeling is used. Examples include radioisotope elements, enzymes, fluorescent dyes, luminescent substances, and the like. Specifically, 32 P, 35 S, 131 I, 45 Ca, 3 H and the like are exemplified as suitable radioisotope labels. Examples of the enzyme label include peroxidase and alkaline phosphatase. As fluorescent labels, cyanine dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine (TAMRA), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRICA), Texas red, cyanine 3 (Cy3) and cyanine 5 (Cy5), quantum Examples include dots (Qdot (registered trademark) and the like). Furthermore, digoxigenin, biotin and the like can be suitably used. However, it is not limited to these. The labeling can be performed by a known method.
また、競合物質、結合物質は必要に応じて不溶性支持体に固定化することができる。不溶性支持体としては、例えば、ガラス、シリカゲル、ベンナイト等の無機物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成高分子物質、アガロース、デキストラン、ポリサッカライド等の不溶性多糖が好ましく使用できる。また、これらの支持体は、球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレート、メンブラン等の形態で使用することができる。 In addition, the competing substance and the binding substance can be immobilized on an insoluble support as necessary. As the insoluble support, for example, inorganic substances such as glass, silica gel, and bennite, synthetic polymer substances such as polystyrene, polyethylene, and polypropylene, and insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and polysaccharide can be preferably used. In addition, these supports can be used in the form of a sphere, rod, fine particle, or the like, or in the form of a test tube, a microplate, a membrane or the like.
不溶性支持体への固定化は、公知の方法に従って行うことができる。物理的吸着法、化学結合法が例示される。物理的吸着法は、結合物質又は競合物質と不溶性支持体とを、水、生理食塩水、各種緩衝液等の水溶性溶媒中で接触させることにより行うことができる。化学的結合法としては、ジアゾ法、酸アジド法、イソシアナート法、ブロムシアン法等による共有結合の形成による固定化が例示される。また、官能基を２以上有する架橋試薬を用いて固定化する方法も利用できる。架橋試薬としては、結合物質と結合可能な官能基を同一分子内に２以上有する多官能性試薬が例示される。このような官能基としては、スクシンイミド基、スルホン化スクシンイミド基、マレイミド基等が例示される。そして、このような官能基を２以上有する多官能性試薬としては公知のいずれの物質をも使用できる。また、抗体、ビオチン−ストレプトアビジン等を利用して固定化することもできる。固定化に際しては、非特異的結合の抑制のため、必要に応じてブロッキング等の処理を行うことができる。 Immobilization to an insoluble support can be performed according to a known method. Examples include physical adsorption methods and chemical bonding methods. The physical adsorption method can be performed by bringing a binding substance or a competitive substance and an insoluble support into contact with each other in a water-soluble solvent such as water, physiological saline or various buffer solutions. Examples of the chemical bonding method include immobilization by formation of a covalent bond by a diazo method, an acid azide method, an isocyanate method, a bromocyan method, or the like. Moreover, the method of immobilizing using the crosslinking reagent which has 2 or more of functional groups can also be utilized. Examples of the crosslinking reagent include polyfunctional reagents having two or more functional groups capable of binding to the binding substance in the same molecule. Examples of such a functional group include a succinimide group, a sulfonated succinimide group, and a maleimide group. Any known substance can be used as the polyfunctional reagent having two or more such functional groups. It can also be immobilized using an antibody, biotin-streptavidin or the like. Upon immobilization, treatment such as blocking can be performed as necessary to suppress nonspecific binding.
本発明の結合親和性を利用する被検物質の測定方法における操作手順及び反応条件等は、通常の免疫測定方法等の結合親和性を利用する測定方法と同様にして行うことができる。したがって、結合物質、競合物質の添加量は、被検物質に応じて当業者が適宜設定することができる。 The operation procedure and reaction conditions in the test substance measurement method using the binding affinity of the present invention can be carried out in the same manner as the measurement method using the binding affinity such as a normal immunoassay method. Therefore, the addition amount of the binding substance and the competitive substance can be appropriately set by those skilled in the art according to the test substance.
例えば、試料中の被検物質を、所定量の結合物質、所定量の競合物質と接触させる。このとき、結合物質は、予め測定目的に応じた所定量の架橋物質と接触させることにより架橋処理されてある。接触は好ましくは液相形態で行われる。これにより、試料中に含まれる被検物質と所定量の競合物質とが結合物質への結合に対して競合する。そして、結合物質と競合物質の反応生成物の量を測定する。このとき、反応生成物の量は公知の方法により測定することができ、標識が付されている場合には標識に応じて公知の標識検出システムに基づいて測定できる。 For example, a test substance in a sample is brought into contact with a predetermined amount of a binding substance and a predetermined amount of a competitive substance. At this time, the binding substance is previously crosslinked by contacting with a predetermined amount of the crosslinking substance according to the measurement purpose. Contact is preferably done in liquid phase form. Thereby, the test substance contained in the sample competes with the binding substance for a predetermined amount of the binding substance. Then, the amount of the reaction product of the binding substance and the competitive substance is measured. At this time, the amount of the reaction product can be measured by a known method, and when a label is attached, it can be measured based on a known label detection system according to the label.
また、好ましくは、被検物質濃度が既知の標準試料溶液を作製し、かかる標準試料溶液を用いて濃度と測定強度との関係を求めた検量線を作成し、かかる検量線に基づいて、被検試料の測定強度より濃度を求める。 Preferably, a standard sample solution having a known concentration of the test substance is prepared, a calibration curve is created by using the standard sample solution to obtain a relationship between the concentration and the measurement intensity, and the test sample is analyzed based on the calibration curve. The concentration is obtained from the measured intensity of the test sample.
上記した通り、好ましくは競合物質、若しくは結合物質が不溶性支持体に固定化される。ここで、競合物質が固定化される態様を例示して詳細に説明するが、適用しえる反応系の種類に応じて当業者の技術常識に基づいて適宜変更することができる。 As described above, the competitor or the binding substance is preferably immobilized on the insoluble support. Here, an embodiment in which the competitive substance is immobilized will be described in detail, but can be appropriately changed based on the common general knowledge of those skilled in the art depending on the type of reaction system to be applied.
まず、競合物質を不溶性支持体に固定化する。このとき、夾雑タンパク質の不溶性支持体表面への非特異的結合を防止するため、必要に応じてブロッキング等の処理を行う。次に、測定対象の被検物質を含み得る試料と、結合物質とを同時に加え反応させる。このとき、結合物質は、予め測定目的に応じた所定量の架橋物質と接触させることにより架橋処理されてある。結合親和性反応が平衡に達した後、支持体に固定化された競合物質に結合することによって支持体上に捕捉された抗体以外の、被検物質と結合した抗体、並びに未反応物質を除去する。次いで、支持体に補足された抗体の量により、競合物質と結合した抗体量を測定する。抗体に標識が付されていてもよいし、また、適当な標識二次抗体等を用いて抗体量を測定することができる。 First, the competitor is immobilized on an insoluble support. At this time, in order to prevent nonspecific binding of the contaminating protein to the surface of the insoluble support, a treatment such as blocking is performed as necessary. Next, a sample that can contain a test substance to be measured and a binding substance are simultaneously added and reacted. At this time, the binding substance is previously crosslinked by contacting with a predetermined amount of the crosslinking substance according to the measurement purpose. After the binding affinity reaction reaches equilibrium, the antibody bound to the test substance other than the antibody captured on the support by binding to the competitor immobilized on the support and unreacted substances are removed. To do. The amount of antibody bound to the competitor is then measured by the amount of antibody captured on the support. The antibody may be labeled, and the amount of antibody can be measured using an appropriate labeled secondary antibody or the like.
更に、本発明の測定方法は、流路中に競合物質を固定化するフロー型の測定装置に適用することができる。 Furthermore, the measurement method of the present invention can be applied to a flow-type measurement apparatus that immobilizes a competitive substance in a flow path.
２．結合親和性を利用する被検物質の測定用キット
本発明は、上記結合親和性を利用する被検物質の測定方法を実施するための試薬を備えた、結合親和性を利用する被検物質の測定用キットを提供する。このように被検物質の測定に必要な試薬をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な被検物質の測定が可能となる。このような試薬キットとしては、結合物質と架橋物質の組み合わせ、また、競合抗原をも組み合わせたキットが例示される。更には、結合親和性反応の実施に必要な緩衝液をもキットとして組み込むことができる。このように結合物質と架橋物質とを別個にキットに組み込むことにより、ユーザ自身が自ら望む測定精度及び測定範囲に調整することで、測定目的に応じた被検物質の測定が可能となる。また、特定の測定精度、測定範囲に設定した、予め適当な価数となるよう結合物質を架橋物質により架橋処理された形態で構成することも可能である。
2. The present invention relates to a test kit for measuring a test substance using binding affinity, comprising a reagent for carrying out the above-described method for measuring a test substance using binding affinity. A measurement kit is provided. In this way, by configuring a reagent necessary for measurement of a test substance as a kit, it is possible to easily and quickly measure the test substance. Examples of such a reagent kit include a combination of a binding substance and a crosslinking substance, and a combination of a competitive antigen. Furthermore, a buffer necessary for carrying out the binding affinity reaction can also be incorporated as a kit. By incorporating the binding substance and the cross-linking substance into the kit separately in this way, the test substance can be measured according to the measurement purpose by adjusting the measurement accuracy and measurement range desired by the user himself / herself. It is also possible to configure the binding substance that has been set to a specific measurement accuracy and measurement range and previously crosslinked with a crosslinking substance so as to have an appropriate valence.
３．被検物質を測定するための結合親和性解析の制御方法
本発明は、上記結合親和性を利用する被検物質の測定方法において、その測定精度、測定範囲を制御する方法を提供する。これにより、上記被検物質を測定するための結合親和性解析を制御できる。つまり、架橋物質による架橋の程度を変更することで測定精度を調整でき、また、測定範囲を調整でき、双方を同時に調整する方法をも提供する。架橋の程度の変更は、例えば、結合物質と反応させる架橋物質の量を制御する、若しくは、結合物質と架橋物質との反応時間を制御することにより、簡便、かつ迅速に行うことができる。したがって、測定目的に応じて、架橋の程度を変更することで、適切に測定精度、及び測定範囲を調整することができる。ここで、結合親和性解析とは、上記で説明した結合親和性を利用した測定方法を意味するものであり、免疫測定法等を好ましく例示される。
3. TECHNICAL FIELD The present invention provides a method for controlling the measurement accuracy and measurement range in a method for measuring a test substance using the above-described binding affinity. Thereby, the binding affinity analysis for measuring the said test substance is controllable. That is, it is possible to adjust the measurement accuracy by changing the degree of cross-linking by the cross-linking substance, to adjust the measurement range, and to provide a method for adjusting both at the same time. The degree of crosslinking can be changed easily and quickly, for example, by controlling the amount of the crosslinking substance to be reacted with the binding substance or by controlling the reaction time between the binding substance and the crosslinking substance. Therefore, the measurement accuracy and the measurement range can be appropriately adjusted by changing the degree of crosslinking according to the measurement purpose. Here, the binding affinity analysis means a measurement method using the above-described binding affinity, and an immunoassay method or the like is preferably exemplified.
具体的には、結合物質の架橋の程度を上がることにより、結合物質の価数を大きくすることができる。結合物質の価数が大きいと、競合様式の測定方法おいては、被検物質が高濃度になるにつれ、急激に競合物質と結合する結合物質量が減少することから、検量線の傾きが急になる。つまり、結合物質の価数が大きくなると、被検物質の正確な濃度の定量が可能となり測定精度が向上する。一方、結合物質の架橋の程度を下げることにより、結合物質の価数を小さくしておくことができる。結合物質の価数が小さいと、競合様式の測定方法おいては、被検物質が高濃度になっても、緩やかに競合物質と結合する結合物質量が減少することから、検量線の傾きが緩やかになる。つまり、結合物質の価数を小さくすることで、広範な濃度範囲に亘って被検物質を測定できる。これにより、被検物質が高濃度で含まれる場合であっても、希釈を要せず、若しくは従来よりも希釈の回数を低減することが可能となる。 Specifically, the valence of the binding substance can be increased by increasing the degree of crosslinking of the binding substance. If the valence of the binding substance is large, in the competition mode measurement method, the amount of binding substance that binds to the competitor substance rapidly decreases as the test substance concentration increases, so the slope of the calibration curve steepens. become. That is, when the valence of the binding substance is increased, the concentration of the test substance can be accurately quantified, and the measurement accuracy is improved. On the other hand, by reducing the degree of crosslinking of the binding substance, the valence of the binding substance can be reduced. If the valence of the binding substance is small, in the competition mode measurement method, the amount of binding substance that binds to the competitive substance gradually decreases even when the test substance becomes high in concentration. Be gentle. That is, the test substance can be measured over a wide concentration range by reducing the valence of the binding substance. Thereby, even when the test substance is contained at a high concentration, it is not necessary to dilute, or the number of dilutions can be reduced as compared with the conventional case.
したがって、一次スクリーニングのようなラフスクリーニングの場合には、好ましくは結合物質の架橋の程度を低減させて広範な濃度範囲での測定を行う。また、最終的な精密測定の場合には、好ましくは結合物質の架橋の程度を増加させて高精度な測定を行うべく、測定目的に応じて適切に測定精度、測定範囲を制御することができる。また、本発明の制御方法は、架橋物質により簡便に行うことができることから、ユーザ自身が自ら望む測定精度及び測定範囲に調整することが可能である。 Therefore, in the case of rough screening such as primary screening, measurement is preferably performed in a wide concentration range by reducing the degree of cross-linking of the binding substance. In the case of final precision measurement, the measurement accuracy and the measurement range can be appropriately controlled according to the measurement purpose, preferably in order to increase the degree of crosslinking of the binding substance and perform high-accuracy measurement. . In addition, since the control method of the present invention can be easily performed using a cross-linking substance, it is possible to adjust the measurement accuracy and measurement range desired by the user himself / herself.
４．被検物質の測定するための結合親和性解析の制御用キット
本発明は、上記被検物質の測定するための結合親和性解析の制御方法を実施するための試薬を備えた、被検物質の測定するための結合親和性解析の制御用キットを提供する。このように結合親和性解析の制御に必要な試薬をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な結合親和性解析の制御が可能となる。このような試薬キットとしては、結合物質と架橋物質の組み合わせ、また、競合抗原をも組み合わせたキットが例示される。更には、結合親和性反応の実行に必要な緩衝液をもキットとして組み込むことができる。このように結合物質と架橋物質とを別個にキットに組み込むことにより、ユーザ自身が自ら望む測定精度及び測定範囲に調整することが可能である。
4). The present invention relates to a control kit for binding affinity analysis for measuring a test substance.The present invention provides a test substance comprising a reagent for carrying out the control method for binding affinity analysis for measuring the test substance. A control kit for binding affinity analysis for measurement is provided. In this way, by configuring the reagents necessary for the control of the binding affinity analysis as a kit, it is possible to easily and quickly control the binding affinity analysis. Examples of such a reagent kit include a combination of a binding substance and a crosslinking substance, and a combination of a competitive antigen. Furthermore, a buffer necessary for carrying out the binding affinity reaction can also be incorporated as a kit. Thus, by incorporating the binding substance and the cross-linking substance separately in the kit, it is possible to adjust the measurement accuracy and measurement range desired by the user himself / herself.
５．検出感度調整方法、及び該方法を利用した測定装置
本発明は、被検物質を前記被検物質と結合親和性を有する結合物質との、結合親和性を利用した被検物質の測定方法であって、
（i）前記被検物質と、前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質とを、前記結合物質に競合的に反応させる工程、
（ii）前記結合物質と前記競合物質間での複合体の形成を測定する工程、を備える測定方法において、
被検物質又は競合物質に対する結合物質の特性値（結合速度定数と解離速度定数）と、装置パラメーターＭ（競合物質と結合物質の結合が拡散律速などで阻害されていることを示す１以下の定数）とを使用して、被検物質、競合物質、結合物質の間の反応速度式に対して、競合物質と結合物質との間の結合速度定数のみに装置パラメーターＭを掛け、一定時間後の結合濃度を算出することにより理論検量線を得る方法、を提供する。
5. The present invention is a method for measuring a test substance using a binding affinity between a test substance and a binding substance having binding affinity with the test substance. And
(I) a step of competitively reacting the test substance and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the binding substance with the binding substance;
(Ii) measuring the formation of a complex between the binding substance and the competitor,
Characteristic values (binding rate constant and dissociation rate constant) of the binding substance with respect to the test substance or competitor substance, and apparatus parameter M (constant of 1 or less indicating that the binding between the competitor substance and the binding substance is inhibited by diffusion rate control) ) Is used to multiply the reaction rate equation between the test substance, the competitor substance, and the binding substance by only the binding rate constant between the competitor substance and the binding substance by the apparatus parameter M, and after a certain period of time. A method for obtaining a theoretical calibration curve by calculating a binding concentration is provided.
ここで、結合物質の特性値とは、結合速度定数と解離速度定数を、また、装置パラメーターＭとは、競合物質と結合物質の結合が拡散律速などで阻害されていることを示す１以下の定数を指す。 Here, the characteristic value of the binding substance is the binding rate constant and the dissociation rate constant, and the apparatus parameter M is 1 or less indicating that the binding between the competitor and the binding substance is inhibited by diffusion rate control or the like. Points to a constant.
更に、測定したい濃度範囲に合わせて理論検量線から結合物質の濃度と装置パラメーターＭを逆算して設定することで検出濃度レンジの調整を行う装置をも提供する。 Furthermore, an apparatus is also provided that adjusts the detection concentration range by back-calculating the binding substance concentration and the device parameter M from the theoretical calibration curve according to the concentration range to be measured.
これにより、被検物質が高濃度である場合であっても、希釈を要せずに装置の検出濃度レンジを調整することによって、被検物質の濃度測定が可能となる。また、抗体特性値と装置パラメーターから検量線を予測できるため、繰り返しの測定を要することなく簡便、かつ迅速に検出感度の予測が可能となるという利点がある。そして、高濃度の抗体にも好適に適用できるため、検出シグナルが低下する等の特性を有する、表面積の小さい反応器、例えばマイクロ流路を使用する検出装置でも容易に利用できる。更には、抗体特性値と測定値から新規な装置の装置パラメーターを、また測定値と装置パラメーターから新規な抗体の抗体特性値を求めることが出来るという利点もある。 As a result, even when the test substance has a high concentration, the concentration of the test substance can be measured by adjusting the detection concentration range of the apparatus without requiring dilution. In addition, since a calibration curve can be predicted from antibody characteristic values and apparatus parameters, there is an advantage that detection sensitivity can be predicted easily and quickly without the need for repeated measurement. And since it can be applied suitably also to a high concentration antibody, it can also be easily used in a detection device using a small surface area reactor, for example, a micro flow channel, which has characteristics such as a reduction in detection signal. Furthermore, there is an advantage that a device parameter of the new device can be obtained from the antibody characteristic value and the measured value, and an antibody property value of the new antibody can be obtained from the measured value and the device parameter.
[実施例１］
結合物質の価数が結合親和性解析に与える影響の検討
結合物質の価数の結合親和性解析（測定精度及び測定範囲）に与える影響を、抗原抗体反応系に利用して検討した。
[Example 1]
Examination of influence of binding substance valence on binding affinity analysis The influence of binding substance valence on binding affinity analysis (measurement accuracy and measurement range) was examined using an antigen-antibody reaction system.
〔方法〕
本実施例においては、結合物質（抗ビオチン抗体（フナコシ社より購入、商品コード番号UBC 1230-0661）を用いて、被検物質として該抗体に対する抗原であるビオチン（シグマ社製、製品番号B4639）を競合法により測定した。このとき、競合物質としては、該抗体に対する抗原であるビオチンをウシ血清アルブミン上に固定化したビオチン結合ウシ血清アルブミンを使用した。
〔Method〕
In this example, a binding substance (anti-biotin antibody (purchased from Funakoshi Co., Ltd., product code number UBC 1230-0661) was used as a test substance, biotin (product number B4639, manufactured by Sigma) as an antigen against the antibody. In this case, biotin-conjugated bovine serum albumin in which biotin, which is an antigen for the antibody, was immobilized on bovine serum albumin was used as a competitor.
かかるビオチン結合ウシ血清アルブミンは、以下の通り調製した。
ビオチン化試薬キット（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit、フナコシ社より購入、商品コード番号21430）を使用して、ウシ血清アルブミン（シグマ社製、製品番号A7030）にビオチンを結合することによって調製した。続いて、20 μg/ml-PBSとなるよう調製し、下記の実験に用いた。
Such biotin-conjugated bovine serum albumin was prepared as follows.
Use biotinylated reagent kit (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit, purchased from Funakoshi, product code number 21430) to bind biotin to bovine serum albumin (manufactured by Sigma, product number A7030). It was prepared by. Subsequently, 20 μg / ml-PBS was prepared and used in the following experiment.
抗原（競合）固定化ビーズの調製
ポリスチレンビーズ（90μm-φ：ガンツ化成製）約0.1ｇを約５mlのリン酸緩衝食塩水（以下「PBS」と称する：シグマ社製、製品番号P4417）で３回洗浄を行った。洗浄後、５mlのPBSに懸濁し、ビーズ懸濁液を得た。ビーズ懸濁液から200μlを分取し、ビーズをスピンダウンしてPBSを除いた後、上記にて調製した400μlの抗原（競合）−PBS溶液400μl（抗原濃度20μg/ml）と混合して４℃で一晩撹拌し、ビーズに抗原（競合）を固定化した。抗原（競合）固定化後のビーズを400μlのTween20含有リン酸緩衝食塩水（以下「PBS-T」と称する：シグマ社製、製品番号P3563）で３回洗浄した。続いて、400μlのブロッキング剤（ブロックエース：大日本住友製薬製、カタログ番号UK-B80：滅菌水にて１％濃度に調製）を添加し、室温で２時間撹拌した。その後、400μlのPBS-Tで３回洗浄を行った後、200μlのPBS-Tにビーズを懸濁させて４℃にて実験まで保存した。
Preparation of antigen (competition) -immobilized beads About 0.1 g of polystyrene beads (90 μm-φ: manufactured by Ganz Kasei Co., Ltd.) were added with about 5 ml of phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”: Sigma, product number P4417). Washed once. After washing, it was suspended in 5 ml of PBS to obtain a bead suspension. 200 μl was taken from the bead suspension, the beads were spun down to remove PBS, and then mixed with 400 μl of the antigen (competition) -PBS solution prepared above (
（競合反応）
まず、抗体（結合物質）を量子ドット標識キット（Qdot（登録商標）655抗体標識キット：住商バイオサイエンス社より購入、商品番号2202-1J）にて、添付のプロトコールに従って標識し、標識化抗体を調製した。そして、ブロックエース（滅菌水にて１％濃度に調製）中に、かかる標識化抗体を0.1μg/ml、標識化抗体に対する抗体（抗抗体（架橋物質））をそれぞれ0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/mlのいずれか、すなわち標識化抗体／抗抗体（結合物質／架橋物質）＝１、10、100の比率となるように混合し、室温で１時間静置した。次に、検出対象の抗原（被検物質）を10倍希釈系列で40μg/mlから0.004μg/mlになるようにブロックエースにて希釈した試料を調製すると共に、ブランク試料としてブロックエースのみの試料も用意した。これら抗原溶液を、室温で1時間静置した抗体溶液と１：１の比率で混合して以下の実験に用いた。ここでは、抗抗体として、抗マウスIgG抗体（シグマ社製：製品番号M1397）を使用した。続いて、上記で調製した15μlの抗原（競合）固定化ビーズの懸濁液を100μlのブロックエースで３回洗浄後、上記で調製した抗原（被検）濃度既知の試料50μlを添加し室温で1時間振盪し反応させた。反応後のビーズを100μlのブロックエースで３回洗浄した後、ビーズの蛍光強度を蛍光顕微鏡で測定した。測定後、試料中の抗原（被検）濃度が０の時の蛍光強度を100％として、各試料中の抗原（被検）濃度での蛍光強度の相対値を算出した。そして、蛍光強度の、試料中の抗原（被検）濃度に対する経験的検量線より検量線の傾きを算出した（表１）。具体的には、４パラメーターロジスティックモデルに基づいて算出した。該検量線は市販のマイクロプレートリーダーMODEL 680解析システム（バイオラッド社製）等のELISAデータ分析ソフトにより算出できる。
(Competitive reaction)
First, an antibody (binding substance) is labeled with a quantum dot labeling kit (Qdot (registered trademark) 655 antibody labeling kit: purchased from Sumisho Biosciences, product number 2202-1J) according to the attached protocol. Prepared. And during Block Ace (prepared to 1% concentration with sterilized water), 0.1 μg / ml of the labeled antibody and 0.1 μg / ml and 0.01 μg of the antibody against the labeled antibody (anti-antibody (crosslinking substance)), respectively. / ml, 0.001 μg / ml, that is, labeled antibody / anti-antibody (binding substance / crosslinking substance) = 1, 10, and 100 were mixed and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, prepare a sample in which the antigen to be detected (test substance) is diluted with Block Ace to a dilution ratio of 40 μg / ml to 0.004 μg / ml in a 10-fold dilution series, and a sample containing only Block Ace as a blank sample Also prepared. These antigen solutions were mixed at a ratio of 1: 1 with an antibody solution that was allowed to stand at room temperature for 1 hour and used in the following experiments. Here, an anti-mouse IgG antibody (manufactured by Sigma: product number M1397) was used as an anti-antibody. Subsequently, the 15 μl antigen (competition) -immobilized bead suspension prepared above was washed three times with 100 μl Block Ace, and then 50 μl of the sample with the known antigen (test) concentration prepared above was added at room temperature. The reaction was shaken for 1 hour. After the reaction, the beads were washed 3 times with 100 μl of Block Ace, and the fluorescence intensity of the beads was measured with a fluorescence microscope. After the measurement, the fluorescence intensity when the antigen (test) concentration in the sample was 0 was defined as 100%, and the relative value of the fluorescence intensity at the antigen (test) concentration in each sample was calculated. Then, the slope of the calibration curve was calculated from the empirical calibration curve of the fluorescence intensity with respect to the antigen (test) concentration in the sample (Table 1). Specifically, it was calculated based on a 4-parameter logistic model. The calibration curve can be calculated by ELISA data analysis software such as a commercially available microplate reader MODEL 680 analysis system (manufactured by Bio-Rad).
[比較例１]
〔方法〕
上記実施例１と同様、実施例１にて調製した標識化抗体（結合物質）を0.1μg/mlとなるようブロックエース（滅菌水にて１％濃度に調製）にて希釈した。検出対象の抗原（被検物質）も同様に10倍希釈系列で40μg/mlから0.004μg/mlになるようにブロックエースにて希釈した試料を調製すると共に、ブランク試料としてブロックエースのみの試料も用意した。これら抗原溶液と抗体溶液を１：１の比率で混合した。次に、上記実施例１で調製した15μlの抗原（競合）固定化ビーズの懸濁液をブロックエースで３回洗浄後、実施例１と同様にして、抗原（被検）濃度既知の試料50μlと標識化抗体と混合し室温で1時間振盪し反応させた。実施例１と同様にして、反応後のビーズの蛍光強度を測定し、蛍光強度の、試料中の抗原（被検）濃度に対する経験的検量線より、検量線の傾きを算出した（表１）。
[Comparative Example 1]
〔Method〕
In the same manner as in Example 1, the labeled antibody (binding substance) prepared in Example 1 was diluted with Block Ace (prepared to a 1% concentration with sterilized water) so as to be 0.1 μg / ml. Similarly, prepare a sample diluted with Block Ace so that the antigen to be detected (test substance) will be 40 μg / ml to 0.004 μg / ml in a 10-fold dilution series, and a sample containing only Block Ace as a blank sample Prepared. These antigen solution and antibody solution were mixed at a ratio of 1: 1. Next, 15 μl of the antigen (competition) -immobilized bead suspension prepared in Example 1 was washed 3 times with Block Ace, and 50 μl of a sample with a known antigen (test) concentration was obtained in the same manner as in Example 1. And labeled antibody, and the mixture was reacted by shaking at room temperature for 1 hour. In the same manner as in Example 1, the fluorescence intensity of the beads after the reaction was measured, and the slope of the calibration curve was calculated from the empirical calibration curve of the fluorescence intensity with respect to the antigen (test) concentration in the sample (Table 1). .
[比較例２]
〔方法〕
実施例１の抗抗体（架橋物質）に代え、実施例１の抗抗体と同一の形状ではあるが、被検物質であるビオチンにも本実施例で使用した標識化抗体（結合物質）にも反応しない抗体（マウスIgG：シグマ社製、製品番号15381）を、上記実施例１で調製した標識化抗体に対して１の割合で添加した。それ以外は、実施例１と同様にして競合反応に供した。そして、実施例１と同様にして、反応後のビーズの蛍光強度を測定し、蛍光強度の、各試料中の抗原（被検）濃度に対する経験的検量線より検量線の傾きを算出した（表１）。
[Comparative Example 2]
〔Method〕
Instead of the anti-antibody (crosslinking substance) of Example 1, the same shape as the anti-antibody of Example 1, but also the biotin as the test substance and the labeled antibody (binding substance) used in this example An unreacted antibody (mouse IgG: manufactured by Sigma, product number 15381) was added at a ratio of 1 to the labeled antibody prepared in Example 1 above. Otherwise, it was subjected to a competitive reaction in the same manner as in Example 1. Then, in the same manner as in Example 1, the fluorescence intensity of the beads after the reaction was measured, and the slope of the calibration curve was calculated from the empirical calibration curve of the fluorescence intensity with respect to the antigen (test) concentration in each sample (Table). 1).
〔結果〕
表１に、実施例１及び比較例１、２において得られた検量線の傾きを示すと共に、図３に実施例（結合物質／架橋物質＝１）、比較例１によって得られた検量線を示す。
表１、および図３に示す通り、実施例１において抗抗体（架橋物質）の添加量を増やす毎に、検量線の傾きが大きくなることが判明した。つまり、抗体（結合物質）に対する抗体である抗抗体は該抗体同士を結合する。そうして、抗抗体の添加量の増加により、抗体の抗体価数が大きくなる。したがって、抗体の抗体価数が大きくなることにより、検量線の傾きが大きくなることが導ける。
一方で、抗抗体を添加しない場合（比較例１）、及び本実施例に用いた抗体を架橋する能力のない抗体を添加した場合（比較例２）においては、検量線の傾きは同じであった。このことから、実施例１で判明した検量線の傾きの変動は、抗抗体による、抗体の架橋に起因するものであることが導かれる。
〔result〕
Table 1 shows the slopes of the calibration curves obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2, and FIG. 3 shows the calibration curves obtained in Example (binding substance / crosslinking substance = 1) and Comparative Example 1. Show.
As shown in Table 1 and FIG. 3, it was found that the slope of the calibration curve increases each time the amount of anti-antibody (crosslinking substance) added in Example 1 is increased. That is, an anti-antibody that is an antibody against an antibody (binding substance) binds the antibodies together. Thus, the antibody valency of the antibody increases as the amount of anti-antibody added increases. Therefore, it can be derived that the slope of the calibration curve increases as the antibody valency of the antibody increases.
On the other hand, the slope of the calibration curve was the same when no anti-antibody was added (Comparative Example 1) and when an antibody that was not capable of crosslinking the antibody used in this Example was added (Comparative Example 2). It was. From this, it is derived that the fluctuation of the slope of the calibration curve found in Example 1 is due to the cross-linking of the antibody by the anti-antibody.
同時に、抗体の抗体価数が大きくなることにより、検量線の傾きが大きくなることから、抗体の抗体価数が大きくなることにより測定精度を向上できることも判明した。一方、抗体の抗体価数が小さいと広範な測定範囲の測定が可能であることから、測定系に用いる抗体の抗体価数の制御により、測定精度と測定範囲を簡便かつ迅速に制御できることも判明した。 At the same time, since the slope of the calibration curve increases as the antibody valency of the antibody increases, it was also found that the measurement accuracy can be improved by increasing the antibody valency of the antibody. On the other hand, it is clear that measurement accuracy and measurement range can be controlled easily and quickly by controlling the antibody valence of the antibody used in the measurement system, since it is possible to measure a wide range of measurement when the antibody valence is small. did.
［実施例２］競合法における検出感度の調整
競合法における検出感度の調整につき検討した。具体的には、本実施例においては、抗原抗体反応に基づく競合法において、抗体特性値と、抗原・抗体の組み合わせによらない装置パラメーターとから、抗体濃度に関係なく適用できる理論検量線を提供するべく検討を行った。
[Example 2] Adjustment of detection sensitivity in competition method Adjustment of detection sensitivity in the competition method was studied. Specifically, this example provides a theoretical calibration curve that can be applied regardless of antibody concentration from antibody characteristic values and instrument parameters that do not depend on the combination of antigen and antibody in a competition method based on an antigen-antibody reaction. We examined to do.
〔方法〕
（１）被検物質の測定：実験値
本実施例においては、被検物質としてビオチン（シグマ社製、製品番号B4639）を、該被検体物質に対する結合物質（抗ビオチン抗体：シグマ社製、製品番号B3640）を用いて競合法により測定した。このとき、競合物質としては、該抗ビオチン抗体に対する抗原であるビオチンをウシ血清アルブミン上に固定化したビオチン結合ウシ血清アルブミンを使用した。
〔Method〕
(1) Measurement of test substance: experimental value In this example, biotin (Sigma, product number B4639) was used as the test substance, and a binding substance to the test substance (anti-biotin antibody: product of Sigma, product) No. B3640) and measured by the competition method. At this time, biotin-conjugated bovine serum albumin in which biotin, which is an antigen for the anti-biotin antibody, was immobilized on bovine serum albumin was used as a competitor.
かかるビオチン結合ウシ血清アルブミンは、実施例１と同様にして、20 μg/ml-PBSとなるよう調製し、下記の実験に用いた。 Such biotin-conjugated bovine serum albumin was prepared in the same manner as in Example 1 so as to be 20 μg / ml-PBS and used in the following experiment.
抗原（競合）固定化ビーズの調製
ポリスチレンビーズ（90μm-φ：ガンツ化成製）約0.1ｇを約５mlのリン酸緩衝食塩水（以下「PBS」と称する：シグマ社製、製品番号P4417）で３回洗浄を行った。洗浄後、５mlのPBSに懸濁し、ビーズ懸濁液を得た。ビーズ懸濁液から200μlを分取し、ビーズをスピンダウンしてPBSを除いた後、400μlの抗原（競合）−PBS溶液（抗原濃度20μg/ml）と混合して４℃で一晩撹拌し、ビーズに抗原（競合）を固定化した。抗原（競合）固定化後のビーズを400μlのTween20含有リン酸緩衝食塩水（以下「PBS-T」と称する：シグマ社製、製品番号P3563）で３回洗浄した。続いて、400μlのブロッキング剤（ブロックエース：大日本住友製薬製、カタログ番号UK-B80：滅菌水にて１％濃度に調製）を添加し、室温で２時間撹拌した。その後、400μlのPBS-Tで３回洗浄を行った後、200μlのPBS-Tにビーズを懸濁させて４℃にて実験まで保存した。
Preparation of antigen (competition) -immobilized beads About 0.1 g of polystyrene beads (90 μm-φ: manufactured by Ganz Kasei Co., Ltd.) were added with about 5 ml of phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”: Sigma, product number P4417). Washed once. After washing, it was suspended in 5 ml of PBS to obtain a bead suspension. Take 200 μl from the bead suspension, spin down the beads to remove PBS, mix with 400 μl of antigen (competition) -PBS solution (
次に、上記保存ビーズ懸濁液から20μlを分取し、滅菌水100μlにて３回洗浄した。洗浄後のビーズ懸濁液をマイクロ流路チップに導入し、ビーズがほぼ風乾された状態でシール（Advanced Polyolefin Microplate Sealing Tape：３Ｍ社製）にて封着し流出を防止した。なお封入されるビーズの個数は約70個となるように作製し、蛍光を持つ混入物（ホコリ等）が無いことを事前に蛍光顕微鏡で確認後に以下の反応に使用した。 Next, 20 μl was taken from the above stored bead suspension and washed three times with 100 μl of sterilized water. The washed suspension of beads was introduced into a microchannel chip, and the beads were sealed with a seal (Advanced Polyolefin Microplate Sealing Tape: manufactured by 3M) with the beads almost air-dried to prevent outflow. The number of beads to be encapsulated was prepared so as to be about 70, and it was used for the following reaction after confirming beforehand that there was no fluorescent contaminant (dust etc.) with a fluorescence microscope.
競合反応
まず、抗体（結合物質）を量子ドット標識キット（Qdot（登録商標）655抗体標識キット：住商バイオサイエンス社より購入、商品番号2202-1J）にて、添付のプロトコールに従って標識した。調製した標識化抗体（結合物質）を0.05μg/ml、検出対象抗原（被検物質）を10倍希釈系列で10μg/mlから0.001μg/mlになるように反応用バッファーにて希釈した試料を調製すると共に、ブランク試料として標識化抗体のみの試料も用意した。調製した試料50μl、洗浄用バッファー200μlを、夫々シリンジにて分取し、シリンジポンプに設置した。まず試料を分取したシリンジと上記で調製したマイクロ流路チップをシリコンチューブで接続し、シリンジポンプ（KD Scientific、Model 210）を使用して1μl/minで20μl送液した。次に、試料用シリンジを外してから、洗浄用バッファーを分取したシリンジを同様にマイクロ流路チップに接続して1000μl/minで40μl送液した。送液終了後、直ちに蛍光顕微鏡で蛍光強度を測定した。そして、抗原（被検）の濃度が０の時の蛍光強度を100％として、各抗原（被検）濃度での蛍光強度の相対値を算出した。
Competitive reaction First, an antibody (binding substance) was labeled with a quantum dot labeling kit (Qdot (registered trademark) 655 antibody labeling kit: purchased from Sumisho Biosciences, product number 2202-1J) according to the attached protocol. Prepare a sample diluted with reaction buffer so that the prepared labeled antibody (binding substance) is 0.05 μg / ml and the detection target antigen (test substance) is diluted 10-fold to 0.001 μg / ml in a 10-fold dilution series. In addition to the preparation, a sample containing only the labeled antibody was prepared as a blank sample. The prepared sample (50 μl) and the washing buffer (200 μl) were collected with a syringe and placed in a syringe pump. First, the syringe from which the sample was collected and the microchannel chip prepared above were connected by a silicon tube, and 20 μl was fed at 1 μl / min using a syringe pump (KD Scientific, Model 210). Next, after removing the sample syringe, the syringe from which the washing buffer was separated was similarly connected to the microchannel chip and fed at 40 μl at 1000 μl / min. Immediately after the feeding, the fluorescence intensity was measured with a fluorescence microscope. Then, assuming that the fluorescence intensity when the concentration of the antigen (test) was 0 was 100%, the relative value of the fluorescence intensity at each antigen (test) concentration was calculated.
ここで、ここで、使用したバッファーは以下の通り調製した。
・反応用バッファー、及び洗浄用バッファー
リン酸緩衝食塩水（シグマ社製、製品番号P4417の錠剤を1錠、精製水200 mlに溶解して調製）を89 ml、4%ブロックエース（大日本住友製薬製、カタログ番号GJ-1388-03）を10 ml、1(w/v)% TritonX-100（Sigma社製、製品番号T9284を精製水で希釈して調製）を1 mlの割合で混合して調製した。
Here, the buffer used here was prepared as follows.
・ Reaction buffer and washing buffer Phosphate buffered saline (prepared by dissolving 1 tablet of Sigma, product number P4417 in 200 ml of purified water), 89 ml, 4% Block Ace (Sumitomo Dainippon) 10 ml of pharmaceutical product, catalog number GJ-1388-03) and 1 (w / v)% TritonX-100 (manufactured by Sigma, prepared by diluting product number T9284 with purified water) are mixed at a rate of 1 ml. Prepared.
（２）装置パラメーターの決定、および理論検量線の作成
ここでは、上記（１）で得られた測定結果と理論検量線を比較した。具体的には、理論検量線を作成すると共に、装置パラメーターを決定した。
(2) Determination of apparatus parameters and creation of theoretical calibration curve Here, the measurement results obtained in the above (1) were compared with the theoretical calibration curve. Specifically, a theoretical calibration curve was created and instrument parameters were determined.
このとき、計算の前提となる各値は、以下の通りであった。
・抗体濃度0.05μg/ml
・固定抗原（競合）総数1010分子
・抗原（被検）濃度0〜10ppm
・フローセル容積0.075μl
そして、抗体特性値は以下の通りとした。
・抗原（被検）への結合速度定数kon＝3×103 M-1s-1
・抗原（被検）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
・固定抗原（競合）への結合速度定数kon＝1×107 M-1s-1
・固定抗原（競合）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
At this time, each value used as a premise of calculation was as follows.
・ Antibody concentration 0.05μg / ml
・ Total number of fixed antigen (competition) 10 10 molecules ・ Antigen (test)
・ Flow cell volume 0.075μl
The antibody characteristic values were as follows.
・ Binding rate constant k on antigen (test) = 3 × 10 3 M -1 s -1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 −3 s −1 for antigen (test)
・ Binding rate constant k on to fixed antigen (competition) = 1 × 10 7 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 -3 s -1 for fixed antigen (competition)
まず、送液前の抗体と抗原（被検）の結合を反応時間30分として式（１）に従って算出し、続いて、送液中の抗体と固定抗原（競合）の結合を反応時間20分として式（２）に従って４次ルンゲ・クッタ法を用いて近似計算した。この時に理論検量線が一致するように装置パラメーターを決定した。 First, the binding between the antibody before feeding and the antigen (test) is calculated according to the formula (1) with a reaction time of 30 minutes, and then the binding between the antibody and the immobilized antigen (competition) in the feeding is performed for 20 minutes. Approximate calculation using the fourth-order Runge-Kutta method according to equation (2). At this time, the apparatus parameters were determined so that the theoretical calibration curves would coincide.
〔結果〕
装置パラメーターＭ＝0.01を得た。
そして、上記（１）の被検物質の測定にて得られた各測定値を、図４中の「点」で示すと共に、（２）の理論検量線の作成にて得られた検量線を、図４中の「実線」で示す。
〔result〕
An instrument parameter M = 0.01 was obtained.
And each measured value obtained by the measurement of the test substance in the above (1) is indicated by “point” in FIG. 4, and the calibration curve obtained in the creation of the theoretical calibration curve in (2) This is indicated by a “solid line” in FIG.
[実施例３］実験値と理論検量線の比較
実施例２で得られた装置パラメーターＭ＝0.01を使用し、２種類の抗体に対する抗原の組み合わせ、また、２種類の抗原に対する抗体の組み合わせにおける理論検量線を算出し、この理論検量線を、別個に測定した実験値と比較した。
[Example 3] Comparison of experimental value and theoretical calibration curve The apparatus parameter M = 0.01 obtained in Example 2 was used, the combination of antigens for two types of antibodies, and the theory for the combination of antibodies for two types of antigens. A calibration curve was calculated and this theoretical calibration curve was compared with experimental values measured separately.
〔方法〕
抗原抗体の組み合わせは以下の通りである。
・抗ビオチン抗体（シグマ社製、製品番号B3640）−ビオチン結合ウシ血清アルブミン（実施例１と同様にして調製）
・抗ビオチン抗体（フナコシ社より購入、商品コード番号UCB 1230-0661）−ビオチン（シグマ社製、製品番号B4639：実施例１と同じものを使用）
〔Method〕
Combinations of antigen and antibody are as follows.
Anti-biotin antibody (manufactured by Sigma, product number B3640) -biotin-conjugated bovine serum albumin (prepared in the same manner as in Example 1)
Anti-biotin antibody (purchased from Funakoshi, product code number UCB 1230-0661)-biotin (manufactured by Sigma, product number B4639: the same as in Example 1)
そして、抗体として使用した、抗ビオチン抗体（シグマ社製、製品番号B3640）の抗体特性は以下の通りとした。（本組合せでは抗原と固定抗原は同一物質（ビオチン結合ウシ血清アルブミン）を使用）
・抗原（被検）への結合速度定数kon＝１×107 M-1s-1
・抗原（被検）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
・固定抗原（競合）への結合速度定数kon＝1×107 M-1s-1
・固定抗原（競合）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
The antibody characteristics of the anti-biotin antibody (manufactured by Sigma, product number B3640) used as the antibody were as follows. (In this combination, the same substance (biotin-conjugated bovine serum albumin) is used for the antigen and the fixed antigen.)
・ Binding rate constant k on antigen (test) = 1 × 10 7 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 −3 s −1 for antigen (test)
・ Binding rate constant k on to fixed antigen (competition) = 1 × 10 7 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 -3 s -1 for fixed antigen (competition)
そして、もう一方の抗体として使用した、抗ビオチン抗体（フナコシ社より購入、商品コード番号UCB 1230-0661）の抗体特性値は以下の通りであった。
・抗原（被検）への結合速度定数kon＝2×103 M-1s-1
・抗原（被検）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
・固定抗原（競合）への結合速度定数kon＝5×105 M-1s-1
・固定抗原（競合）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
The antibody characteristic values of the anti-biotin antibody (purchased from Funakoshi, product code number UCB 1230-0661) used as the other antibody were as follows.
・ Binding rate constant k on to antigen (test) = 2 × 10 3 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 −3 s −1 for antigen (test)
・ Binding rate constant k on fixed antigen (competition) = 5 × 10 5 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 -3 s -1 for fixed antigen (competition)
他の手順、及び条件は、実施例２に従って算出した理論検量線と、実験値を比較した。 Other procedures and conditions were compared with the theoretical calibration curve calculated according to Example 2 and experimental values.
〔結果〕
結果を図５、６に示す。
ここで、図５は、抗ビオチン抗体（シグマ社製、製品番号B3640）と、ビオチン結合ウシ血清アルブミンの組み合わせの結果を示す。図６は、抗ビオチン抗体（フナコシ社より購入、商品コード番号UCB 1230-0661）とビオチンの組み合わせの結果を示す。
図５、６に示す通り、理論検量線と、実験値が一致した。
〔result〕
The results are shown in FIGS.
Here, FIG. 5 shows the result of a combination of an anti-biotin antibody (manufactured by Sigma, product number B3640) and biotin-conjugated bovine serum albumin. FIG. 6 shows the results of a combination of an anti-biotin antibody (purchased from Funakoshi, product code number UCB 1230-0661) and biotin.
As shown in FIGS. 5 and 6, the theoretical calibration curve and the experimental value coincided.
［比較例３］経験式による検量線の作成
本比較例においては、従来からの経験式からの検量線を作成し、得られた検量線と実測値との整合性を検討し、上記実施例２の結果と比較した。
[Comparative Example 3] Preparation of calibration curve by empirical formula In this comparative example, a calibration curve was created from a conventional empirical formula, and the consistency between the obtained calibration curve and the measured value was examined. Compared with the results of 2.
〔方法〕
本比較例においては、実施例２と同様、被検物質ビオチン（シグマ社製、製品番号B4639）を、結合物質（抗ビオチン抗体：シグマ社製、製品番号B3640）を用いて競合法により測定した。このとき、競合物質としては、該抗ビオチン抗体に対する抗原であるビオチンをウシ血清アルブミン上に固定化したビオチン結合ウシ血清アルブミンを使用した。
〔Method〕
In this comparative example, as in Example 2, the test substance biotin (manufactured by Sigma, product number B4639) was measured by a competitive method using a binding substance (anti-biotin antibody: product of Sigma, product number B3640). . At this time, biotin-conjugated bovine serum albumin in which biotin, which is an antigen for the anti-biotin antibody, was immobilized on bovine serum albumin was used as a competitor.
実験値をもとに、具体的には、４パラメーターロジスティックモデルに基づいて算出した。該検量線は、市販のマイクロプレートリーダーMODEL 680解析システム（バイオラッド社製）等のELISAデータ分析ソフトにより算出できる。 Based on the experimental values, specifically, it was calculated based on a 4-parameter logistic model. The calibration curve can be calculated by ELISA data analysis software such as a commercially available microplate reader MODEL 680 analysis system (manufactured by Bio-Rad).
ｂ：変曲点での傾き
ｃ：変曲点での抗原濃度
ｄ：バックグランド（抗原濃度無限大の時の測定値）
ｘ：抗原濃度
ｙ：測定値
b: slope at the inflection point c: antigen concentration at the inflection point d: background (measured value when the antigen concentration is infinite)
x: antigen concentration y: measured value
〔結果〕
結果を図７に示す。
図７に示す通り、検量線と実測値は良好な一致を示したが、式（３）は経験式であるため、抗原・抗体・装置（測定条件）の組合せごとに予め測定値から検量線を求めておく必要がある点で煩雑な手順を要した。
〔result〕
The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 7, the calibration curve and the actual measurement value were in good agreement, but since Equation (3) is an empirical equation, the calibration curve from the measurement value in advance for each combination of antigen, antibody, and device (measurement conditions). It took a complicated procedure in that it was necessary to ask for.
［比較例４］
本比較例においては、装置パラメーターをＭ＝１として理論検量線を作成し、得られた検量線と実測値との整合性を検討し、上記実施例２の結果と比較した。
[Comparative Example 4]
In this comparative example, a theoretical calibration curve was created with the apparatus parameter set to M = 1, the consistency between the obtained calibration curve and the actual measurement value was examined, and compared with the results of Example 2 above.
〔方法〕
本比較例においても、実施例２と同様、被検物質としてビオチン（シグマ社製、製品番号B4639）を、結合物質（抗ビオチン抗体：シグマ社製、製品番号B3640）を用いて、を競合法により測定した。このとき、競合物質としては、該抗ビオチン抗体に対する抗原であるビオチンをウシ血清アルブミン上に固定化したビオチン結合ウシ血清アルブミンを使用した。
〔Method〕
Also in this comparative example, in the same manner as in Example 2, using biotin (Sigma, product number B4639) as a test substance and binding substance (anti-biotin antibody: product of Sigma, product number B3640), competition method It was measured by. At this time, biotin-conjugated bovine serum albumin in which biotin, which is an antigen for the anti-biotin antibody, was immobilized on bovine serum albumin was used as a competitor.
実際の測定値と、装置パラメーターＭ＝１として算出した理論検量線を対比した。 The actual measured value was compared with the theoretical calibration curve calculated with the apparatus parameter M = 1.
〔結果〕
結果を図８に示す。
図８に示す通り、固定抗原（競合）への結合が過大に計算されるため実験値と理論検量線が解離した。
〔result〕
The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 8, since the binding to the fixed antigen (competition) was excessively calculated, the experimental value and the theoretical calibration curve were dissociated.
［実施例４］抗体濃度による検出濃度範囲の調整
本実施例においては、結合物質として使用する抗体濃度変更に対応した検出濃度範囲の調整につき検討した。
[Example 4] Adjustment of detection concentration range by antibody concentration In this example, adjustment of the detection concentration range corresponding to a change in the concentration of an antibody used as a binding substance was studied.
〔方法〕
実施例２で得た装置パラメーターＭ＝0.01を使用し、実施例２と同様に、但し抗体濃度のみ0.3nMから30nMまで変更して理論検量線を計算した。
〔Method〕
Using the apparatus parameter M = 0.01 obtained in Example 2, the theoretical calibration curve was calculated in the same manner as in Example 2, except that only the antibody concentration was changed from 0.3 nM to 30 nM.
このとき、抗体特性値は以下の通りとした。
・抗原（被検）への結合速度定数kon＝1×107 M-1s-1
・抗原（被検）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
・固定抗原（競合）への結合速度定数kon＝1×107 M-1s-1
・固定抗原（競合）への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
At this time, the antibody characteristic values were as follows.
・ Binding rate constant k on antigen (test) = 1 × 10 7 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 −3 s −1 for antigen (test)
・ Binding rate constant k on to fixed antigen (competition) = 1 × 10 7 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant k off = 1 × 10 -3 s -1 for fixed antigen (competition)
〔結果〕
結果を図９に示す。
図９に示す通り、抗体濃度に応じて検出濃度範囲が調整されることを確認した。したがって、本発明の方法によって、抗体濃度に関係なく適用できる理論検量線を提供できることが判明した。
〔result〕
The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 9, it was confirmed that the detection concentration range was adjusted according to the antibody concentration. Therefore, it has been found that the method of the present invention can provide a theoretical calibration curve that can be applied regardless of antibody concentration.
［実施例５］装置パラメーターによる検出濃度範囲の調整
本実施例においては、装置パラメーターに変更に対応した検出濃度範囲の調整につき検討した。
[Example 5] Adjustment of detection concentration range by apparatus parameter In this example, adjustment of the detection concentration range corresponding to the change in the apparatus parameter was studied.
〔方法〕
このとき、抗体特性値は以下の通りとした。
・抗原（被検物質）への結合速度定数kon＝1×104 M-1s-1
・抗原への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1、
・固定抗原への結合速度定数kon＝1×107 M-1s-1、
・固定抗原への解離速度定数koff＝1×10-3 s-1
〔Method〕
At this time, the antibody characteristic values were as follows.
・ Binding rate constant k on antigen (test substance) = 1 × 10 4 M −1 s −1
・ Dissociation rate constant to antigen k off = 1 × 10 −3 s −1 ,
-Binding rate constant k on fixed antigen = 1 x 10 7 M -1 s -1 ,
・ Dissociation rate constant for fixed antigen k off = 1 × 10 −3 s −1
そして、抗体濃度を0.3nMとし、実施例２と同様に、但し装置パラメーターをＭ＝0.0037からＭ＝0.037まで変更して理論検量線を算出した。 The antibody concentration was 0.3 nM, and the theoretical calibration curve was calculated in the same manner as in Example 2 except that the apparatus parameters were changed from M = 0.0037 to M = 0.037.
〔結果〕
結果を図１０に示す。図１０に示す通り、装置パラメーターに応じて検出濃度範囲が調整された。
〔result〕
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10, the detection concentration range was adjusted according to the apparatus parameters.
Claims (8)
ここで、前記測定方法は、測定精度及び測定濃度範囲を調整して被検物質を測定するものであり、以下の工程、
（ｉ）前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質を、架橋物質により架橋処理する工程、
（ｉｉ）前記被検物質と、前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質とを、前記工程（ｉ）において架橋処理した結合物質に競合的に反応させる工程、
（ｉｉｉ）前記結合物質と前記競合物質間での複合体の形成を測定する工程、を備え、
前記工程（ｉ）の架橋処理において、前記被検物質の測定精度及び測定濃度範囲を調整するために、所望の測定精度及び測定濃度範囲に応じた結合物質の価数を選択して架橋の程度を増減させる、測定方法。 A method for measuring a test substance using binding affinity,
Here, the measurement method is to measure the test substance by adjusting the measurement accuracy and the measurement concentration range, and the following steps:
(I) a step of crosslinking a binding substance having binding affinity for the test substance with a crosslinking substance;
(Ii) a step of competitively reacting the test substance and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the binding substance to the binding substance that has been subjected to the crosslinking treatment in the step (i),
(Iii) measuring the formation of a complex between the binding substance and the competitor,
In the crosslinking treatment of the step (i), in order to adjust the measurement accuracy and measurement concentration range of the test substance, the degree of crosslinking is selected by selecting the valence of the binding substance according to the desired measurement accuracy and measurement concentration range. Increase or decrease the measurement method.
前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質、前記結合物質を架橋するための架橋物質、及び前記被検物質と前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質を含むキット。 A kit for measuring a test substance using binding affinity, comprising a reagent for performing the measurement method according to any one of claims 1 to 3,
A kit comprising a binding substance having binding affinity for the test substance, a cross-linking substance for cross-linking the binding substance, and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the test substance and the binding substance.
（ｉ）前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質を、架橋物質により架橋処理する工程、
（ｉｉ）前記被検物質と、前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質とを、前記工程（ｉ）において架橋処理された結合物質に競合的に反応させる工程、
（ｉｉｉ）前記結合物質と前記競合物質間での複合体の形成を測定する工程、を備えた試料中の被検物質の測定において、
前記結合物質と前記競合物質の結合の拡散律速反応による阻害を補正するため、測定装置と送液速度を含む物理的反応条件に固有の０より大きく１以下の定数である装置パラメーターを決定し、続いて、
前記架橋処理における架橋の程度を、前記複合体の形成によって生じるシグナルが前記測定装置の検出限界となる結合物質の価数を選択して増減する、制御方法。 A control method of binding affinity analysis for measuring a test substance,
(I) a step of crosslinking a binding substance having binding affinity for the test substance with a crosslinking substance;
(Ii) a step of competitively reacting the test substance and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the binding substance to the binding substance cross-linked in the step (i),
(Iii) measuring a test substance in a sample comprising a step of measuring the formation of a complex between the binding substance and the competitor substance,
In order to correct the inhibition of the binding between the binding substance and the competitor due to the diffusion-controlled reaction, apparatus parameters that are constants greater than 0 and less than or equal to 1 inherent to physical reaction conditions including the measurement apparatus and the liquid feeding speed are determined. continue,
A control method in which the degree of cross-linking in the cross-linking treatment is increased or decreased by selecting a valence of a binding substance at which a signal generated by formation of the complex becomes a detection limit of the measuring device.
前記被検物質に対する結合親和性を有する結合物質、前記結合物質を架橋するための架橋物質、及び前記被検物質と前記結合物質に対する結合親和性において被検物質と競合する競合物質を含むキット。 A control kit for binding affinity analysis for measuring a test substance, comprising a reagent for carrying out the control method according to any one of claims 5 to 7,
A kit comprising a binding substance having binding affinity for the test substance, a cross-linking substance for cross-linking the binding substance, and a competitive substance that competes with the test substance in binding affinity for the test substance and the binding substance.
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