JPH10319017A - Measuring method for substance utilizing fluorescent energy transfer and reagent therefor - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simpler measuring system capable of lowly suppress a background, enabling high-sensitivity measurement, and capable of being implemented by a constant system. SOLUTION: In this method for measuring a substance X utilizing affinity reaction among a substance X for targeted for measurement, a substance A labeled by a fluoreseent substance F1 and having bonding capacity with X, and a substance B labeled by a fluoreseent substance F2 and having bonding capability with X, F1 and F2 are in a relationship between a donor and a receptor for fluorescent energy transfer. A method implemented by a constant system, includes two kinds of fluorescent labeled substances F1-A and B-F2.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光エネルギー転
移を利用した物質の測定方法およびそのための試薬に関
する。特に、測定対象物質に対して親和性を有する第１
の物質および第２の物質をそれぞれ標識する異なる蛍光
物質間での蛍光エネルギー転移を利用した物質の測定方
法およびそのための試薬に関する。[0001] The present invention relates to a method for measuring a substance using fluorescence energy transfer and a reagent therefor. In particular, the first substance having an affinity for the substance to be measured
The present invention relates to a method for measuring a substance utilizing fluorescence energy transfer between different fluorescent substances which respectively label the substance and the second substance, and a reagent therefor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血液や尿中の生体成分、保存剤等の食品
添加物、抗生物質、汚染物質、感染性物質等の食品中に
混入される有害物質などの水溶性物質の分析測定は、臨
床上極めて有用な情報を得るために不可欠であり、ま
た、感染防止、公害防止など衛生面での対応においても
重要である。これらの分析対象物質の測定方法は、従来
より継続的に研究されており、より簡便且つ迅速で、し
かも高感度な測定方法の開発が進められている。BACKGROUND ART Analytical measurement of water-soluble substances such as harmful substances mixed in foods such as biological components in blood and urine, food additives such as preservatives, antibiotics, pollutants, infectious substances, etc. It is indispensable to obtain extremely useful information clinically, and is also important for hygiene measures such as infection prevention and pollution prevention. Methods for measuring these analytes have been continually studied, and the development of simpler, faster, and more sensitive measurement methods has been promoted.

【０００３】抗原または抗体、ホルモンまたはホルモン
レセプター、レクチンまたはレクチン結合性糖質、サイ
トカインまたはサイトカインレセプター、核酸などの物
質の測定は、通常、検体を測定対象物質に特異的な親和
性を有する物質と反応させて、形成される複合体（ある
いは複合体を形成しなかった該特異的親和性を有する物
質）を何らかの手段を用いて計測することにより行われ
る。[0003] In the measurement of substances such as antigens or antibodies, hormones or hormone receptors, lectins or lectin-binding carbohydrates, cytokines or cytokine receptors, and nucleic acids, a specimen is usually measured with a substance having a specific affinity for the substance to be measured. The reaction is carried out, and the complex formed (or the substance having a specific affinity that did not form a complex) is measured by using any means.

【０００４】例えば、抗原または抗体を測定する免疫測
定法において従来使用されている方法としては、沈降反
応や凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法や、分別検
出の容易な物質で標識した、測定対象抗原または抗体に
親和性を有する抗体または抗原を用いる標識化免疫測定
法などがあり、後者の方が一般に検出感度は優れてい
る。標識化免疫測定法には、標識物質として放射性物質
を用いるラジオイムノアッセイ、酵素を用いるエンザイ
ムイムノアッセイ（Rubensteinら, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 47: 846 (1972); Ullmanら, Biochim. B
iophys. Acta, 567: 66 (1979)）、蛍光物質を用いる蛍
光イムノアッセイ（Coons ら, J. Exp. Med., 91: 1 (1
950)）などが含まれる。[0004] For example, as a method conventionally used in an immunoassay for measuring an antigen or an antibody, an immunoturbidimetric method in which a sedimentation reaction or an agglutination reaction is optically detected, or a method in which a substance is labeled with a substance which can be easily separated and detected. And a labeled immunoassay using an antibody or antigen having affinity for the antigen or antibody to be measured, and the latter is generally superior in detection sensitivity. Labeled immunoassays include radioimmunoassay using a radioactive substance as a labeling substance and enzyme immunoassay using an enzyme (Rubenstein et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 47: 846 (1972); Ullman et al., Biochim. B
iophys. Acta, 567: 66 (1979)), and a fluorescent immunoassay using a fluorescent substance (Coons et al., J. Exp. Med., 91: 1 (1
950)).

【０００５】標識として放射性物質を用いる方法は、検
出感度の面で特に優れているが、放射性物質を取り扱う
特別の施設や特殊な測定装置を必要とするなどの不便性
から、最近では酵素や蛍光物質を標識として用いる非Ｒ
Ｉ測定法が多く利用されてきており、その検出感度の向
上が図られている。例えば、酵素標識法においては、標
識酵素の活性測定に用いる基質を比色用基質から蛍光法
用基質や発光用基質に変えることにより検出感度が飛躍
的に向上した。Methods using radioactive substances as labels are particularly excellent in terms of detection sensitivity. However, recently, enzymes and fluorescent substances have been used because of the inconvenience of requiring special facilities for handling radioactive substances and special measuring devices. Non-R using substance as label
The I measurement method has been widely used, and its detection sensitivity has been improved. For example, in the enzyme labeling method, the detection sensitivity has been dramatically improved by changing the substrate used for measuring the activity of the labeled enzyme from a colorimetric substrate to a fluorometric substrate or a luminescent substrate.

【０００６】蛍光標識を用いる測定法として、従来よ
り、単一の蛍光物質で標識した、測定対象物質と結合能
を有する物質を検体と反応させ、形成される複合体（あ
るいは複合体を形成しなかった該標識化物質）の蛍光物
質を励起して放出される蛍光を計測する方法が用いられ
てきた。また、測定対象物質と結合能を有する未標識の
物質をまず結合させ、さらに該物質と結合能を有する蛍
光標識化物質を結合させる間接蛍光法も用いられてお
り、非特異的反応が少なくなるために直接蛍光法よりも
感度的には優れているといわれている。[0006] As a measurement method using a fluorescent label, conventionally, a substance labeled with a single fluorescent substance and capable of binding to a substance to be measured is reacted with a sample to form a complex (or a complex formed by forming a complex). A method of measuring the fluorescence emitted by exciting the fluorescent substance (the labeling substance that did not exist) has been used. Further, an indirect fluorescence method of first binding an unlabeled substance having a binding ability to a substance to be measured and further binding a fluorescently labeled substance having a binding ability to the substance is also used, so that non-specific reactions are reduced. Therefore, it is said that the sensitivity is superior to the direct fluorescence method.

【０００７】しかしながら、酵素標識法、単一の蛍光物
質を用いる直接または間接蛍光標識法のいずれの方法も
試料中の夾雑物質の影響を受けやすく、また、非特異的
反応があるため、十分な測定感度が得られない場合があ
り、臨床検査等への使用においては現場のニーズに十分
に対応できていないのが現状である。[0007] However, both the enzyme labeling method and the direct or indirect fluorescent labeling method using a single fluorescent substance are susceptible to contaminants in the sample and have a non-specific reaction. In some cases, measurement sensitivity cannot be obtained, and the current situation is that it cannot sufficiently meet the needs of the site when used for clinical tests and the like.

【０００８】これに対し、夾雑物質の影響を受けにくい
蛍光標識法として、蛍光エネルギー転移（fluorescence
energy transfer）を利用した測定方法が近年注目され
てきている。蛍光エネルギー転移とは、多くの場合、特
定の関係にある２つの蛍光物質間で生じるものであり、
一方の蛍光物質が励起されて放出される蛍光が他方の蛍
光物質を励起してより長波長の蛍光を生じせしめる現象
である。蛍光エネルギー転移は、１対の蛍光物質の分子
間距離が約１０ｎｍ以内である時に起こるとされてお
り、その蛍光エネルギー転移量は分子間距離の６乗に反
比例するといわれている［Hermanら，in Fluorescence
Microscopy of Living Cells in Culture- Part B, Aca
demic Press, New York, pp. 220-245 (1989)］。On the other hand, as a fluorescent labeling method which is not easily affected by contaminants, a fluorescent energy transfer (fluorescence)
Recently, a measurement method using energy transfer has been attracting attention. Fluorescent energy transfer often occurs between two fluorescent substances in a specific relationship,
Fluorescence emitted by excitation of one fluorescent substance excites the other fluorescent substance to generate longer wavelength fluorescence. Fluorescent energy transfer is said to occur when the intermolecular distance between a pair of fluorescent substances is within about 10 nm, and the amount of fluorescent energy transfer is said to be inversely proportional to the sixth power of the intermolecular distance [Herman et al., In Fluorescence
Microscopy of Living Cells in Culture- Part B, Aca
demic Press, New York, pp. 220-245 (1989)].

【０００９】したがって、単一の蛍光物質を標識として
用いる方法では夾雑物質による短寿命蛍光の影響を受け
るが、２種の蛍光物質間の蛍光エネルギー転移を用いる
方法ではより長波長の蛍光を生じるので、夾雑物質によ
る短寿命蛍光の影響を回避することができ、その結果測
定感度がより向上する。しかも、本法によれば、測定対
象物質と結合した標識化物質と遊離の標識化物質を分離
する必要がなく、均一系での測定が可能である。Therefore, a method using a single fluorescent substance as a label is affected by short-lived fluorescence due to contaminants, but a method using fluorescent energy transfer between two fluorescent substances generates a longer-wavelength fluorescence. In addition, the influence of short-lived fluorescence due to contaminants can be avoided, and as a result, measurement sensitivity is further improved. Moreover, according to the present method, it is not necessary to separate the labeled substance bound to the substance to be measured from the free labeled substance, and the measurement can be performed in a homogeneous system.

【００１０】ハンセンら（特開昭６０−２３３５５５号
公報）は、この測定原理を免疫測定に適用し、測定対象
物質に対して親和性を有する第１の結合パートナーを、
蛍光エネルギー移動を誘起し得る一対の蛍光物質のうち
のいずれか一方で標識し、該結合パートナーに対して親
和性を有する第２の結合パートナーをもう一方で標識し
て、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとの
抗原抗体反応を測定対象物質で競合させ、蛍光エネルギ
ー転移量の変化を指標にして測定対象物質量を測定し
た。[0010] Hansen et al. (Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-233555) apply this measurement principle to an immunoassay, and identify a first binding partner having affinity for a substance to be measured.
Labeling one of the pair of fluorescent substances capable of inducing fluorescence energy transfer, and labeling a second binding partner having affinity for the binding partner with the other, so that the first binding partner The antigen-antibody reaction with the second binding partner was competed with the substance to be measured, and the amount of the substance to be measured was measured using the change in the amount of transferred fluorescence energy as an index.

【００１１】また、スタブリアンノポロスら（特開昭６
２−２４０８６４号公報）は、測定対象物質に対して親
和性を有する第１の結合パートナーを、蛍光エネルギー
転移を誘起し得る一対の蛍光物質のうちのいずれか一方
で標識し（結合構成要素）、該結合パートナーに対して
親和性を有する第２の結合パートナーをもう一方で標識
して（報告構成要素）、まず検体を結合構成要素と反応
させて複合体を形成させた後、さらに報告構成要素を反
応させて［測定対象物質：結合構成要素：報告構成要
素］複合体を形成させ、該複合体の２種の蛍光物質間の
立体配置的関係の変化に伴う蛍光エネルギー転移量を計
測することにより測定対象物質量を測定した。Also, Stavrian Nopolos et al.
No. 2-240864) labels a first binding partner having an affinity for a substance to be measured with one of a pair of fluorescent substances capable of inducing fluorescence energy transfer (binding component). Labeling a second binding partner having affinity for the binding partner with the other (reporting component), first reacting the analyte with the binding component to form a complex, and then The elements are allowed to react to form a [substance to be measured: binding component: reporting component] complex, and the amount of fluorescence energy transfer associated with a change in the configurational relationship between the two types of fluorescent substances of the complex is measured. Thus, the amount of the substance to be measured was measured.

【００１２】しかしながら、スタブリアンオポロスらの
方法は、蛍光エネルギー転移を誘起し得る一対の蛍光物
質の一方を測定対象物質に親和性を有する結合パートナ
ー（結合構成要素）に、他方を該結合パートナーに対し
て親和性を有する結合パートナー（報告構成要素）に標
識したものであるので、測定対象物質を含まない、２種
の結合パートナーのみの複合体による蛍光も計測され、
バックグラウンドが高くなって測定感度が低くなるとい
う欠点を有する。また、ハンセンらの方法は、第１の結
合パートナーと第２の結合パートナーとの抗原抗体反応
を測定対象物質で競合させるというものであって、蛍光
エネルギー量が測定対象物質量に正に相関するものでは
なく、競合法における感度の低さという欠点を回避し得
ない。However, according to the method of Stavrian Opolos et al., One of a pair of fluorescent substances capable of inducing fluorescent energy transfer is used as a binding partner (binding component) having an affinity for a substance to be measured, and the other is used as the binding partner. Is labeled with a binding partner (reporting component) that has an affinity for, fluorescence measured by a complex of only two types of binding partners, which does not include the substance to be measured, is measured.
There is a disadvantage that the background becomes high and the measurement sensitivity becomes low. The method of Hansen et al. Involves competing an antigen-antibody reaction between a first binding partner and a second binding partner with a substance to be measured, and the amount of fluorescent energy is positively correlated with the amount of the substance to be measured. However, the disadvantage of low sensitivity in the competitive method cannot be avoided.

【００１３】[0013]

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、夾雑物質の影響を受けにくく、また、均一系で
の測定が可能であるという蛍光エネルギー転移法の長所
を保持したまま、バックグラウンドを低くすることによ
って、測定対象物質をより精度よく且つ高感度に測定す
ることができる測定系を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a background image which is less susceptible to contaminants and can perform measurement in a homogeneous system while maintaining the advantages of the fluorescence energy transfer method. It is an object of the present invention to provide a measurement system capable of measuring a substance to be measured more accurately and with high sensitivity by reducing the value of.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、測定対象物質に
対して親和性を有する２種の結合パートナーのそれぞれ
に、蛍光エネルギー転移を誘起し得る一対の蛍光物質の
いずれか一方を標識し、これらと検体とを反応させて２
種の結合パートナーの両方が測定対象物質と結合した複
合体を形成させ、該複合体中の一方の蛍光物質を励起さ
せたところ、他方の蛍光物質との間で蛍光エネルギーの
転移が起こり得ることを見出した。さらに本発明者ら
は、当該反応系ではバックグラウンドが低く抑えられる
ため、微量の測定対象物質の検出が可能であることを実
証して本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, two types of binding partners having an affinity for a substance to be measured have fluorescence energy One of a pair of fluorescent substances capable of inducing metastasis is labeled, and these are reacted with a sample to obtain 2
When a complex in which both of the species binding partners are bound to the substance to be measured is formed and one of the fluorescent substances in the complex is excited, transfer of fluorescent energy between the fluorescent substance and the other fluorescent substance can occur. Was found. Further, the present inventors have completed the present invention by demonstrating that the background can be suppressed low in the reaction system, so that it is possible to detect a trace amount of a substance to be measured.

【００１５】すなわち、本発明は以下に示す通りのもの
である。 （１）１種以上の蛍光物質Ｆ１で標識された、測定対象
物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａと、１種以上のＦ
１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識された、測定対象物質
Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを使用する物質Ｘの測
定方法であって、Ｆ１とＦ２が蛍光エネルギー転移の供
与体と受容体の関係にあることを特徴とする方法。 （２）測定対象物質Ｘと、１種以上の蛍光物質Ｆ１で標
識された、測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物質
Ａおよび１種以上のＦ１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識
された、測定対象物質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂ
との親和性反応により生成する複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ
−Ｆ２の、Ｆ１を励起させることによって放出される蛍
光によりＦ２を励起させ、該励起により放出される蛍光
を測定することを含む上記（１）の測定方法。 （３）測定対象物質Ｘが、抗原、抗体、ホルモン、ホル
モンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖質、サイ
トカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マーカーおよ
びそれらの一部分からなる群より選択される上記（１）
または（２）の測定方法。 （４）測定対象物質Ｘが抗原であり、Ｘと結合能を有す
る第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか一方が、
Ｘに対する抗体、ペプチドまたはレクチンであり、他方
が、該抗体とは異なる部位でＸと結合し得る抗体、ペプ
チドまたはレクチンである上記（３）の測定方法。 （５）測定対象物質Ｘが抗体であり、Ｘと結合能を有す
る第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか一方が、
Ｘが結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチンであり、
他方が、Ｘを抗原として結合し得る抗体、Ｘが結合し得
る抗原、ペプチドまたはレクチンである上記（３）の測
定方法。 （６）測定対象物質Ｘと、測定対象物質Ｘと結合能を有
する第１の物質Ａとの親和性反応、および測定対象物質
Ｘと、測定対象物質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂと
の親和性反応が、それぞれ抗原抗体反応、ホルモン−ホ
ルモンレセプター反応、レクチン−レクチン結合性糖質
反応、サイトカイン−サイトカインレセプター反応およ
び腫瘍マーカー−腫瘍マーカーレセプター反応からなる
群より選択される上記（３）の測定方法。 （７）均一系で実施することを特徴とする上記（１）〜
（６）のいずれかの測定方法。 （８）１種以上の蛍光物質Ｆ１で標識された、測定対象
物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａと、１種以上のＦ
１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識された、測定対象物質
Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを含む試薬であって、
Ｆ１とＦ２が蛍光エネルギー転移の供与体と受容体の関
係にあることを特徴とする物質Ｘの測定用試薬。 （９）測定対象物質Ｘが、抗原、抗体、ホルモン、ホル
モンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖質、サイ
トカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マーカーおよ
びそれらの一部分からなる群より選択される上記（８）
の測定試薬。 （１０）測定対象物質Ｘが抗原であり、Ｘと結合能を有
する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか一方
が、Ｘに対する抗体、ペプチドまたはレクチンであり、
他方が、該抗体とは異なる部位でＸと結合し得る抗体、
ペプチドまたはレクチンである上記（９）の測定試薬。 （１１）測定対象物質Ｘが抗体であり、Ｘと結合能を有
する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか一方
が、Ｘが結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチンであ
り、他方が、Ｘを抗原として結合し得る抗体、Ｘが結合
し得る抗原、ペプチドまたはレクチンである上記（９）
の測定試薬。 （１２）測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａ
および第２の物質Ｂが、それぞれ抗原抗体反応、ホルモ
ン−ホルモンレセプター反応、レクチン−レクチン結合
性糖質反応、サイトカイン−サイトカインレセプター反
応および腫瘍マーカー−腫瘍マーカーレセプター反応か
らなる群より選択される親和性反応により測定対象物質
Ｘと結合し得るものである上記（９）の測定試薬。 （１３）均一系測定用である上記（８）〜（１２）のい
ずれかの測定試薬。That is, the present invention is as follows. (1) A first substance A labeled with one or more fluorescent substances F1 and capable of binding to a substance X to be measured, and one or more F substances
1. A method for measuring a substance X using a second substance B capable of binding to a substance X to be measured, which is labeled with a fluorescent substance F2 different from 1 and wherein F1 and F2 are donors and acceptors of fluorescent energy transfer. A method characterized by being in a physical relationship. (2) The first substance A having the binding ability to the measurement target substance X and the first substance A labeled with the one or more types of fluorescent substances F1 and the one or more types of fluorescent substances F1 are labeled with a different fluorescent substance F2. A second substance B capable of binding to the substance X to be measured
Complex F1-A: X: B formed by affinity reaction with
-The measurement method according to the above (1), comprising exciting F2 by fluorescence emitted by exciting F1 of F2, and measuring fluorescence emitted by the excitation. (3) The substance (X) wherein the substance X to be measured is selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a hormone, a hormone receptor, a lectin, a lectin-binding saccharide, a cytokine, a cytokine receptor, a tumor marker and a part thereof.
Or the measuring method of (2). (4) The substance X to be measured is an antigen, and one of the first substance A and the second substance B having a binding ability to X is:
The method according to the above (3), wherein the method is an antibody, peptide or lectin against X, and the other is an antibody, peptide or lectin capable of binding to X at a site different from the antibody. (5) The substance X to be measured is an antibody, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is:
An antigen, peptide or lectin to which X can bind;
The method according to (3), wherein the other is an antibody capable of binding X as an antigen, an antigen, peptide or lectin capable of binding X. (6) Affinity reaction between the substance X to be measured and the first substance A capable of binding to the substance X to be measured, and the second substance B capable of binding to the substance X to be measured and the substance X to be measured Wherein the affinity reaction with (3) is selected from the group consisting of antigen-antibody reaction, hormone-hormone receptor reaction, lectin-lectin-binding carbohydrate reaction, cytokine-cytokine receptor reaction, and tumor marker-tumor marker receptor reaction. ) Measurement method. (7) The above (1) to (1), which are carried out in a homogeneous system.
The measuring method according to any one of (6). (8) A first substance A labeled with one or more fluorescent substances F1 and capable of binding to the substance X to be measured, and one or more F substances
A reagent labeled with a fluorescent substance F2 different from 1 and containing a second substance B capable of binding to the substance X to be measured,
A reagent for measuring substance X, wherein F1 and F2 are in a relationship between a donor and an acceptor for fluorescence energy transfer. (9) The above-mentioned (8), wherein the substance X to be measured is selected from the group consisting of antigens, antibodies, hormones, hormone receptors, lectins, lectin-binding carbohydrates, cytokines, cytokine receptors, tumor markers and a part thereof.
Measuring reagent. (10) The substance X to be measured is an antigen, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antibody, peptide or lectin against X;
The other is an antibody that can bind to X at a site different from the antibody;
The measuring reagent according to the above (9), which is a peptide or a lectin. (11) The substance X to be measured is an antibody, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antigen, peptide or lectin to which X can bind, and the other is (9) which is an antibody capable of binding X as an antigen, an antigen, peptide or lectin capable of binding X
Measuring reagent. (12) First substance A capable of binding to the substance X to be measured
And the second substance B has an affinity selected from the group consisting of an antigen-antibody reaction, a hormone-hormone receptor reaction, a lectin-lectin-binding carbohydrate reaction, a cytokine-cytokine receptor reaction, and a tumor marker-tumor marker receptor reaction, respectively. The reagent according to the above (9), which is capable of binding to the substance X to be measured by a reaction. (13) The measuring reagent according to any one of the above (8) to (12), which is used for measuring a homogeneous system.

【００１６】[0016]

【発明の実施の形態】本発明の測定系の概念図を図１に
示す。本発明の測定方法は、蛍光エネルギー転移現象を
応用したものである。一般に、ある第１の蛍光物質Ｆ１
の蛍光波長（第１蛍光波長λ₂ ）が第２の蛍光物質Ｆ２
の励起光波長（第２励起光波長λ₂ ）と重なる場合、Ｆ
１とＦ２が約１０ｎｍ以内の距離で近接していれば、Ｆ
２はＦ１の放出する蛍光によって励起され（このため、
実際には第１蛍光はほとんど計測されない）、より長波
長の蛍光を生じ得る（このような関係にある時、Ｆ１を
蛍光エネルギー転移の供与体、Ｆ２を蛍光エネルギー転
移の受容体というものとする）。Ｆ２の放出する蛍光は
長波長（第２蛍光波長λ₃ ）であり、Ｆ１の蛍光に比べ
て遅延しているために、夾雑物質による短寿命蛍光の影
響を回避することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS FIG. 1 shows a conceptual diagram of a measuring system according to the present invention. The measurement method of the present invention is an application of the fluorescence energy transfer phenomenon. Generally, a certain first fluorescent substance F1
Has the fluorescence wavelength (first fluorescence wavelength λ ₂ ) of the second fluorescent substance F2
When the wavelength overlaps with the excitation light wavelength (second excitation light wavelength λ ₂ ), F
If 1 and F2 are close to each other within a distance of about 10 nm, F
2 is excited by the fluorescence emitted by F1 (for this reason,
In practice, the first fluorescence is hardly measured, and can generate longer wavelength fluorescence (in such a relationship, F1 is referred to as a donor of the fluorescent energy transfer and F2 is referred to as an acceptor of the fluorescent energy transfer). ). The fluorescence emitted by F2 has a long wavelength (second fluorescence wavelength λ ₃ ) and is delayed as compared with the fluorescence of F1, so that the influence of short-lived fluorescence due to contaminants can be avoided.

【００１７】本発明の測定方法の特徴は、Ｆ１およびＦ
２でそれぞれ標識された物質ＡおよびＢがいずれも測定
対象物質Ｘに対して親和性を有する物質であり、物質Ａ
と物質Ｂは直接的に親和性に基づく結合をしないという
点である。したがって、異なる蛍光物質Ｆ１、Ｆ２で標
識された２種の物質ＡおよびＢは、測定対象物質Ｘの介
在なしには複合体を形成し得ないので、従来法（図２）
でみられる蛍光標識された物質同士のみの複合体Ｆ１−
Ａ：Ｂ−Ｆ２（ここでＢは、物質Ａに結合能を有する物
質である）によるバックグラウンドを回避することがで
きる。The characteristic of the measuring method of the present invention is that F1 and F1
2 are substances having an affinity for the substance X to be measured,
And substance B do not directly bind based on affinity. Therefore, the two substances A and B labeled with different fluorescent substances F1 and F2 cannot form a complex without the intervention of the substance X to be measured.
F1-complex of only fluorescently labeled substances seen in
A: Background caused by B-F2 (where B is a substance capable of binding to substance A) can be avoided.

【００１８】本発明の測定方法における測定対象物質Ｘ
は、該物質と結合能を有する物質が存在するものであれ
ば特に限定されないが、抗原、抗体、ホルモン、ホルモ
ンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖質、サイト
カイン、サイトカインレセプター、腫瘍マーカーおよび
それらの一部分などが好ましく例示される。Substance X to be measured in the measuring method of the present invention
Is not particularly limited as long as there is a substance capable of binding to the substance, but may be an antigen, an antibody, a hormone, a hormone receptor, a lectin, a lectin-binding saccharide, a cytokine, a cytokine receptor, a tumor marker and a part thereof. And the like are preferably exemplified.

【００１９】測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物
質Ａおよび第２の物質Ｂは、測定対象物質に応じて適宜
選択され得るが、物質Ａと物質Ｂは直接的に親和性に基
づく結合をしないものである必要がある。例えば、Ｘが
抗原であれば、物質ＡおよびＢのいずれか一方が、該ペ
プチドに対する抗体、ペプチド、レクチン等、他方が、
該抗体とは異なる部位で該抗原と結合する抗体（抗原が
同一の認識結合部位を複数有する場合は物質Ａ、Ｂは同
一物質でもよい）、ペプチド、レクチン等である組合せ
が挙げられる。また、Ｘが抗体であれば、物質Ａおよび
Ｂのいずれか一方が、該抗体と結合し得る抗原、ペプチ
ド、レクチン等、他方が、該抗体と結合し得る抗原（物
質Ａと同一抗原でもよい）、該抗体を抗原として認識す
る抗体、Ｆｃレセプター、ＩｇＥレセプター、ペプチ
ド、レクチン等である組合せが例示される。The first substance A and the second substance B capable of binding to the substance X to be measured can be appropriately selected according to the substance to be measured, but the substance A and the substance B are directly based on affinity. Must not combine. For example, when X is an antigen, one of the substances A and B is an antibody against the peptide, a peptide, a lectin, etc., and the other is
Antibodies that bind to the antigen at a site different from the antibody (substances A and B may be the same if the antigen has a plurality of the same recognition binding sites), peptides, lectins, and the like are included. When X is an antibody, one of substances A and B is an antigen, peptide, lectin, etc., which can bind to the antibody, and the other is an antigen which can bind to the antibody (the same antigen as substance A may be used). ), Combinations that are antibodies that recognize the antibody as an antigen, Fc receptors, IgE receptors, peptides, lectins and the like.

【００２０】測定対象物質Ｘがホルモン、レクチン、サ
イトカインまたは腫瘍マーカーである場合には、Ｘと結
合能を有する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂは、Ｘが
抗原の場合に例示された物質の組合せに加えて、いずれ
か一方が、それぞれに特異的なホルモンレセプター、レ
クチン結合性糖質、サイトカインレセプターまたは腫瘍
マーカーレセプター、他方が、該レセプター以外のＸに
親和性を有する抗体、ペプチド、レクチン等である組合
せが挙げられる。また、測定対象物質Ｘがレセプターの
場合、Ｘと結合能を有する第１の物質Ａおよび第２の物
質Ｂのいずれか一方が、レセプターが認識する物質（例
えば、ホルモン、レクチン、サイトカイン、腫瘍マーカ
ー等）、他方がそれ以外のＸに親和性を有する抗体、ペ
プチド、レクチン等である組合せが例示される。When the substance X to be measured is a hormone, lectin, cytokine or tumor marker, the first substance A and the second substance B capable of binding to X are exemplified when X is an antigen. In addition to the combination of substances, one of them is a specific hormone receptor, a lectin-binding saccharide, a cytokine receptor or a tumor marker receptor, and the other is an antibody, a peptide having an affinity for X other than the receptor, Combinations such as lectins are included. When the substance X to be measured is a receptor, one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is a substance recognized by the receptor (for example, a hormone, a lectin, a cytokine, a tumor marker). Etc.), and combinations in which the other is an antibody, peptide, lectin or the like having an affinity for other X.

【００２１】さらに、測定対象物質Ｘと結合能を有する
第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂは、上記の各物質の、
少なくともＸとの結合能を決定する部位を含む一部分で
あってもよい。Further, the first substance A and the second substance B having a binding ability to the substance X to be measured are each of the above substances,
It may be a part including at least a site for determining the binding ability to X.

【００２２】抗原は、抗体と抗原抗体反応によって結合
し得る物質であれば特に限定されず、必ずしも抗体産生
能（免疫原性）を有していなくてもよい。あらゆるタン
パク質の他、タンパク質の抗原決定基を含む断片、細胞
表面受容体であるＣＤ抗原、ホルモン、サイトカイン、
腫瘍マーカー抗原、抗生物質、毒素、糖鎖抗原などの生
理活性物質、研究用の合成ペプチド等が含まれる。The antigen is not particularly limited as long as it can bind to an antibody by an antigen-antibody reaction, and does not necessarily have to have antibody-producing ability (immunogenicity). In addition to all proteins, fragments containing protein antigenic determinants, cell surface receptor CD antigens, hormones, cytokines,
Examples include physiologically active substances such as tumor marker antigens, antibiotics, toxins, sugar chain antigens, and synthetic peptides for research.

【００２３】抗体としては、完全なポリクローナルまた
はモノクローナル抗体の他、それらの一部分である相補
性決定領域（ＣＤＲ）および１以上のＣＤＲを含む領
域、すなわち、Ｆab、Ｆ(ab') ₂ 、Ｈ鎖、Ｌ鎖、可変領
域（ＶH ＋ＣH １またはＶ_L ＋Ｃ_L ）、超可変領域（Ｖ
H またはＶL ）、さらには、それらの融合物またはそれ
らが組み合わされたもの、例えばscＦv （ＶH ＋ＶL ）
等も含まれる。ポリクローナル抗体並びにモノクローナ
ル抗体は、定法に従って調製され得る。また、測定対象
物質によっては市販のポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体を使用することもできる。なお、免疫原性のな
い抗原（不完全抗原）に対する抗体を得るには、適当な
タンパク質に結合して動物に免疫すればよい。Ｆab、Ｆ
(ab') ₂ 、Ｈ鎖、Ｌ鎖、可変領域などの抗体の一部分
は、抗体をパパイン、トリプシンなどのプロテアーゼで
処理および／またはｐＨと還元剤（例えば、２−メルカ
プトエタノール、ジチオスレイトール等）処理すること
により調製することができる。さらに、抗体、Ｆab、Ｆ
(ab') ₂ 、Ｈ鎖、Ｌ鎖、可変領域、超可変領域、ＣＤ
Ｒ、scＦv 等は、遺伝子工学的手法を用いて作製するこ
ともできる。The antibody may be a complete polyclonal or monoclonal antibody, or a region containing a complementarity determining region (CDR) and one or more CDRs, ie, Fab, F (ab ') ₂ , or H chain. , L chain, variable region (VH + CH1 or _VL + _CL ), hypervariable region (V
H or VL), or a fusion thereof or a combination thereof, for example, scFv (VH + VL)
Etc. are also included. Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared according to a standard method. Depending on the substance to be measured, a commercially available polyclonal or monoclonal antibody can also be used. In order to obtain an antibody against an antigen having no immunogenicity (incomplete antigen), an animal may be immunized by binding to an appropriate protein. Fab, F
A part of the antibody such as (ab ') ₂ , H chain, L chain, and variable region can be obtained by treating the antibody with a protease such as papain or trypsin and / or reducing the pH and a reducing agent (eg, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, etc.). ) Treatment. Furthermore, antibodies, Fab, F
(ab ') ₂ , H chain, L chain, variable region, hypervariable region, CD
R, scFv, etc. can also be prepared using genetic engineering techniques.

【００２４】ホルモンおよびホルモンレセプターとして
は、インスリン、グルカゴン、チロトロピン（ＴＳ
Ｈ）、ソマトスタチン（ＧＩＨ）等とそれらのレセプタ
ー等がそれぞれ例示される。As hormones and hormone receptors, insulin, glucagon, thyrotropin (TS
H), somatostatin (GIH) and the like, and their receptors and the like.

【００２５】レクチンおよびレクチン結合性糖質の例と
しては、コンカナバリンＡ−グリコーゲン、デキストラ
ン、酵母マンナン等、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）−キチ
ンオリゴ糖等、インゲンマメ由来フィトヘマグルチニン
（ＰＨＡ）−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガ
ラクトサミン含有糖質等が挙げられる。Examples of lectins and lectin-binding carbohydrates include concanavalin A-glycogen, dextran, yeast mannan, wheat germ agglutinin (WGA) -chitin oligosaccharides and the like, and phytohemagglutinin (PHA) -D-galactose derived from common beans. , N-acetyl-D-galactosamine-containing saccharides and the like.

【００２６】サイトカインおよびサイトカインレセプタ
ーとしては、インターフェロン、インターロイキン、腫
瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上
皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子等とそれらのレセプタ
ー等が例示される。Examples of cytokines and cytokine receptors include interferon, interleukin, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, and their receptors.

【００２７】腫瘍マーカーとしては、癌の診断やスクリ
ーニングの指標として従来使用され、あるいは提案され
ている生体物質であれば特に限定されないが、例えば、
α−フェトプロテイン、ガン胎児性抗原、ＣＡ１９−
９、ＣＡ１２−５、塩基性胎児タンパク、膵胎児抗原、
アルドラーゼ、アルカリフォスファターゼ、γグルタミ
ルトランスペプチダーゼ、ニューロン特異的エノラー
ゼ、５’ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ・アイ
ソザイムＶ、異常プロトロンビン等が挙げられる。The tumor marker is not particularly limited as long as it is a biological substance conventionally used or proposed as an index for diagnosis or screening of cancer.
α-fetoprotein, carcinoembryonic antigen, CA19-
9, CA12-5, basic fetal protein, pancreatic fetal antigen,
Aldolase, alkaline phosphatase, γ-glutamyl transpeptidase, neuron-specific enolase, 5 ′ nucleotide phosphodiesterase isozyme V, abnormal prothrombin, and the like.

【００２８】測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物
質Ａを標識する蛍光物質Ｆ１は、その蛍光波長が、測定
対象物質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを標識する蛍
光物質Ｆ２の励起光波長と重なるものであれば、特に制
限されない。例えば、アクリジンイソチオシアネート、
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソ
チオシアネート、ルシファーイエロー、ビニルスルフォ
ン、フルオレセインイソチオシアネート、リアクティブ
レッド、ローダミンＸイソチオシアネート、テキサスレ
ッド、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４，
４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２、
２’−ジスルフォン酸、４−アセトアミド−４’−イソ
チアナト−スチルベン−２，２’−ジスルフォン酸、ス
クシンイミジルピレンブチレートなどが挙げられる。ま
た、場合によっては種々のグリーンフルオレセンスプロ
テイン（ＧＦＰ；クローンテック社製）の使用が可能で
ある。The fluorescent substance F1 for labeling the first substance A having the binding ability with the substance X to be measured has a fluorescence wavelength of the fluorescent substance F2 for labeling the second substance B having the binding ability with the substance X to be measured. The wavelength is not particularly limited as long as it overlaps with the excitation light wavelength. For example, acridine isothiocyanate,
4-dimethylaminophenylazophenyl-4′-isothiocyanate, lucifer yellow, vinyl sulfone, fluorescein isothiocyanate, reactive red, rhodamine X isothiocyanate, Texas red, malachite green isothiocyanate, 4,
4'-diisothiocyanatodihydro-stilbene-2,
2'-disulfonate, 4-acetamido-4'-isothianato-stilbene-2,2'-disulfonate, succinimidylpyrene butyrate and the like. In some cases, various green fluorescein proteins (GFP; manufactured by Clontech) can be used.

【００２９】測定対象物質Ｘと結合能を有する第２の物
質Ｂを標識する蛍光物質Ｆ２は、その励起光波長が、測
定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａを標識する
蛍光物質Ｆ１の放出する蛍光波長と重なるものであれ
ば、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、ロ
ーダミン、スルフォローダミン１０１（テキサスレッ
ド）、ピレン、ルシファーイエロー、アクリジン、リボ
フラビン、種々のＧＦＰ等が挙げられる。The fluorescent substance F2 for labeling the second substance B capable of binding to the substance X to be measured is such that the excitation light wavelength thereof is a fluorescent substance for labeling the first substance A capable of binding to the substance X to be measured. There is no particular limitation as long as it overlaps the fluorescence wavelength emitted by F1, but examples include fluorescein, rhodamine, sulfolodamine 101 (Texas Red), pyrene, lucifer yellow, acridine, riboflavin, various GFPs, and the like.

【００３０】蛍光物質Ｆ１とＦ２の組合せは、それらが
蛍光エネルギー転移の供与体−受容体の関係にあれば特
に制限はないが、一例として、フルオレスカミンとジク
ロロトリアジニンフルオレセイン、フルオレセインとロ
ーダミンＢ、Ｒ−フィコトリエンとアロフィコシアニ
ン、フルオレセインとローダミンＸ、フルオレセインと
テキサスレッドまたはマラカイトグリーン等が挙げられ
る。The combination of the fluorescent substances F1 and F2 is not particularly limited as long as they are in a donor-acceptor relationship for the fluorescent energy transfer. For example, fluorescamine and dichlorotriazinine fluorescein, and fluorescein and rhodamine B , R-phycotriene and allophycocyanin, fluorescein and rhodamine X, fluorescein and Texas Red or Malachite Green.

【００３１】測定対象物質Ｘと結合能を有する物質Ａお
よびＢは、それらの両端または側鎖の官能基を利用して
直接または架橋剤を介して間接的に、蛍光物質Ｆ１およ
びＦ２でそれぞれ標識される。使用する蛍光物質は、例
えばイソチオシアネートまたはニトロアリールハライド
の形で標識される物質中のアミノ基と結合させることが
できる。結合させるアミノ基の選択は、１級アミノ基、
２級アミノ基のｐＫａ値の差に基づいて反応時のｐＨを
制御することもしくは保護基を使用することにより行う
ことができる。標識される物質中のカルボキシル基に蛍
光物質を結合させる場合、ブロモメチル基などを活性基
として利用すればよい。さらに、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
などのカルボジイミド化合物を適宜応用することもでき
る。また、標識される物質中の水酸基を結合基として利
用する場合、酸クロリドまたはアシルニトリル基などを
反応活性基として使用すればよい。標識される物質中の
チオール基を利用する場合は、アリルハライド化合物、
活性化マレイミド化合物などを使用すればよい。ＧＦＰ
は有機化学的に標識することもできるが、標識される物
質がペプチド性物質であれば、該物質との融合タンパク
質として遺伝子工学的手法を用いて発現させることも可
能である。The substances A and B having the binding ability to the substance X to be measured are labeled with the fluorescent substances F1 and F2, respectively, directly or indirectly through a cross-linking agent by using the functional groups of both ends or side chains thereof. Is done. The fluorescent substance used can be linked to an amino group in the substance to be labeled, for example in the form of an isothiocyanate or a nitroaryl halide. The selection of the amino group to be bound includes a primary amino group,
It can be carried out by controlling the pH during the reaction based on the difference in pKa value of the secondary amino group or by using a protecting group. When a fluorescent substance is bonded to a carboxyl group in a substance to be labeled, a bromomethyl group or the like may be used as an active group. Further, 1-ethyl-3- (3
-Dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
Such a carbodiimide compound can be appropriately applied. When a hydroxyl group in a substance to be labeled is used as a binding group, an acid chloride or an acylnitrile group may be used as a reactive group. When utilizing a thiol group in the substance to be labeled, an allyl halide compound,
An activated maleimide compound or the like may be used. GFP
Can be labeled organically, but if the substance to be labeled is a peptidic substance, it can be expressed as a fusion protein with the substance using genetic engineering techniques.

【００３２】また、有機化学的な架橋剤を用いて間接的
に蛍光物質を標識させることも可能であり、従来公知の
種々の長さのリンカーアームが使用され得る。架橋剤の
例としては、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキ
サノネート、エチレングリコイルビス（スクシニミジル
スクシネート）、４，４’−ジチオビスフェニラジド、
ジメチルピメミリデートなどが挙げられ、定法に従って
使用され得る。また、架橋基の長さおよび種類を変える
ことにより、蛍光エネルギー転移量を調節することがで
きる。It is also possible to indirectly label a fluorescent substance with an organic chemical crosslinking agent, and conventionally known linker arms of various lengths can be used. Examples of the crosslinking agent include N-succinimidyl-6-maleimidohexanonate, ethyleneglycolbis (succinimidylsuccinate), 4,4′-dithiobisphenylazide,
Dimethyl pimemydate and the like can be used according to a conventional method. Further, by changing the length and type of the cross-linking group, the amount of transfer of the fluorescent energy can be adjusted.

【００３３】さらに、蛋白性の物質を介しても蛍光物質
を標識させることができる。すなわち、標識される物質
の測定対象物質Ｘとの認識結合部位以外の部位を認識し
得る抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、補
体などが仲介タンパク質として挙げられる。標識される
物質と仲介タンパク質との結合は、標識された該物質と
測定対象物質との複合体が形成されたときに蛍光エネル
ギー転移が妨害されないように立体配置を工夫すること
ができる。仲介タンパク質と蛍光物質との結合は上述の
直接標識法を適用することができる。Further, a fluorescent substance can be labeled through a proteinaceous substance. That is, an antibody capable of recognizing a site other than a recognition binding site of the substance to be measured with the substance X to be measured, protein A, protein G, lectin, complement, and the like are exemplified as the mediating protein. The binding between the substance to be labeled and the mediating protein can be devised in such a configuration that the fluorescence energy transfer is not hindered when a complex of the labeled substance and the substance to be measured is formed. For the binding between the mediating protein and the fluorescent substance, the above-described direct labeling method can be applied.

【００３４】標識反応後、未反応の蛍光物質は、透析イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、またはカラムクロマトグラフィーなどの一般的な
分離技術を組み合わせて分離除去することができ、蛍光
標識された、測定対象物質Ｘと結合能を有する物質を精
製することができる。After the labeling reaction, the unreacted fluorescent substance can be separated and removed by a combination of general separation techniques such as dialysis ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, or column chromatography, and the fluorescently labeled substance is unreacted. In addition, a substance capable of binding to the substance X to be measured can be purified.

【００３５】本発明の測定方法は、測定対象物質Ｘと、
上記のようにして作製される１種以上の蛍光物質Ｆ１で
標識された、測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物
質Ａ（Ｆ１−Ａ）および１種以上のＦ１とは異なる蛍光
物質Ｆ２で標識された、測定対象物質Ｘと結合能を有す
る第２の物質Ｂ（Ｂ−Ｆ２）との親和性反応によりサン
ドイッチ状の３分子複合体Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２を生
成させ、この複合体中のＦ１を励起させることによって
放出される蛍光によりＦ２を励起させ、該励起により放
出される蛍光の強度を計測することにより行われる。The measuring method of the present invention comprises the steps of:
First substance A (F1-A) labeled with at least one kind of fluorescent substance F1 prepared as described above and capable of binding to substance X to be measured, and at least one kind of fluorescent substance different from F1 An affinity reaction between the substance X to be measured and a second substance B (B-F2) having a binding ability, which is labeled with F2, generates a sandwich-like three-molecule complex F1-A: X: B-F2. This is performed by exciting F2 with the fluorescence emitted by exciting F1 in this complex, and measuring the intensity of the fluorescence emitted by the excitation.

【００３６】測定対象物質Ｘと蛍光標識化物質Ｆ１−Ａ
との親和性反応、および測定対象物質Ｘと蛍光標識化物
質Ｂ−Ｆ２との親和性反応は、同時に行っても、あるい
は逐次的に行ってもよい。反応条件（反応温度、反応液
のｐＨ、反応時間等）は、利用される親和性反応におい
て、通常使用される各条件を適宜選択することができ
る。Substance X to be measured and fluorescently labeled substance F1-A
Reaction, and the affinity reaction between the substance X to be measured and the fluorescent labeling substance BF2 may be performed simultaneously or sequentially. The reaction conditions (reaction temperature, pH of the reaction solution, reaction time, etc.) can be appropriately selected from those generally used in the affinity reaction to be used.

【００３７】本発明の測定方法は、蛍光エネルギー転移
を利用するものであるから、親和性反応において複合体
を形成しなかった遊離の蛍光標識化物質Ｆ１−Ａおよび
Ｂ−Ｆ２が共存していても蛍光強度の計測が可能であ
る。したがって、均一系および不均一系のいずれでも測
定することができるが、簡便性の面から均一系での使用
がより好ましい。Since the measurement method of the present invention utilizes fluorescence energy transfer, free fluorescently labeled substances F1-A and B-F2 which did not form a complex in the affinity reaction coexist. Can also measure the fluorescence intensity. Therefore, it can be measured in either a homogeneous system or a heterogeneous system, but it is more preferable to use a homogeneous system in terms of simplicity.

【００３８】不均一系で測定する場合には、親和性反応
終了後、未反応の遊離蛍光標識化物質Ｆ１−ＡおよびＢ
−Ｆ２を反応生成物Ｆ１−Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２から分離除
去してから蛍光強度の測定を実施する。反応生成物と未
反応物の分離法としては、反応生成物を免疫沈降させる
方法、遊離の未反応物を吸着により除く方法などが例示
される。When measurement is carried out in a heterogeneous system, unreacted free fluorescently labeled substances F1-A and B
-F2 is separated and removed from the reaction product F1-A: X: B-F2, and then the fluorescence intensity is measured. Examples of a method for separating a reaction product from an unreacted product include a method for immunoprecipitating a reaction product and a method for removing free unreacted material by adsorption.

【００３９】さらに、一方の蛍光標識化物質を固相化
し、親和性反応終了後、反応液を除くことにより未反応
物を除去する方法が好ましく例示される。固相は従来公
知のものが使用可能であり、例えばポリスチレンビー
ズ、マイクロプレート、アガロースゲル、セファデック
ス等が挙げられる。Further, a preferred example is a method in which one fluorescently labeled substance is immobilized, and after the completion of the affinity reaction, unreacted substances are removed by removing the reaction solution. A conventionally known solid phase can be used, and examples thereof include polystyrene beads, a microplate, agarose gel, and Sephadex.

【００４０】本発明の測定試薬は、本発明の測定方法を
簡便に実施するための試薬である。具体的には、該測定
試薬は、１種以上の蛍光物質Ｆ１で標識された、測定対
象物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａと、１種以上の
Ｆ１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識された、測定対象物
質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを含む試薬であっ
て、且つＦ１とＦ２が蛍光エネルギー転移の供与体と受
容体の関係にあることを特徴とする。The measuring reagent of the present invention is a reagent for easily carrying out the measuring method of the present invention. Specifically, the measurement reagent is a first substance A labeled with one or more kinds of fluorescent substances F1 and capable of binding to the substance X to be measured, and one or more kinds of fluorescent substances F2 different from F1. A labeled reagent containing a second substance B capable of binding to the substance X to be measured, wherein F1 and F2 are in a relationship between a donor and an acceptor for fluorescence energy transfer.

【００４１】測定対象物質Ｘと結合能を有する第一の物
質Ａおよび第２の物質Ｂは、上述のようにＸの種類に応
じて適宜選択される。また、蛍光エネルギー転移の生じ
得る一対の蛍光物質Ｆ１およびＦ２の組合せも上述した
ように適宜選択できる。The first substance A and the second substance B capable of binding to the substance X to be measured are appropriately selected according to the type of X as described above. In addition, a combination of a pair of fluorescent substances F1 and F2 that can cause fluorescence energy transfer can be appropriately selected as described above.

【００４２】また本発明の測定試薬は、さらに、測定対
象物質Ｘと、２種の蛍光標識化物質Ｆ１−ＡおよびＢ−
Ｆ２との親和性反応において使用され得る試薬、例えば
反応用緩衝液等、検量線作成のための測定対象物質Ｘの
標準試料等を含むキット化されたものも包含する。The measuring reagent of the present invention further comprises a substance X to be measured and two fluorescently labeled substances F1-A and B-
Reagents that can be used in the affinity reaction with F2, for example, kits containing a standard sample of the substance to be measured X for preparing a calibration curve, such as a reaction buffer, are also included.

【００４３】[0043]

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは単なる例示であって、本発明を何
ら限定するものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are merely illustrative and do not limit the present invention.

【００４４】実施例１ フルオレセイン標識マウス抗Ｂ
型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）モノクローナル
抗体の作製 ＨＢｓＡｇのａ抗原に対するマウスモノクローナル抗体
（日本バイオテスト社製）１０ｍｇに５００ｍＭ炭酸緩
衝液（ｐＨ９．５）を加えて全量１ｍｌとした（抗体濃
度１０ｍｇ／ｍｌ）。該溶液にフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ；シグマ社製）１００μｇを加
え、暗所で、４℃、６時間攪拌しながら反応させた。反
応終了後、反応液を透析膜に移し、１０ｍＭリン酸緩衝
生理食塩水（ｐＨ７．２）にて、５回／日の頻度で透析
外液を交換しながら３日間透析を行った。この後、該透
析液を再度５００ｍＭ炭酸緩衝液と交換した。透析後、
全蛋白をＤＥＡＥセファロースカラムにチャージし、塩
化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、分画した。各
分画は、ＨＢｓＡｇを１μｇ／ウェルとなるように固相
化したマイクロタイタープレートと、ペルオキシダーゼ
で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を用いて
ＥＬＩＳＡ法により検定し、ＨＢｓＡｇに対して結合活
性を有し、且つ非特異的反応の小さい画分を集め、約１
ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度まで濃縮した。Example 1 Fluorescein-labeled mouse anti-B
Preparation of Hepatitis Hepatitis Virus Surface Antigen (HBsAg) Monoclonal Antibody 500 mM carbonate buffer (pH 9.5) was added to 10 mg of a mouse monoclonal antibody against HBsAg a antigen (manufactured by Nippon Biotest) to make a total volume of 1 ml (antibody concentration 10 mg / ml). 100 μg of fluorescein isothiocyanate (FITC; manufactured by Sigma) was added to the solution, and the mixture was reacted in a dark place with stirring at 4 ° C. for 6 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was transferred to a dialysis membrane, and dialyzed against 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.2) for 3 days while exchanging the external solution at a frequency of 5 times / day. Thereafter, the dialysate was replaced again with a 500 mM carbonate buffer. After dialysis,
All proteins were charged onto a DEAE Sepharose column, eluted with a sodium chloride concentration gradient, and fractionated. Each fraction was assayed by ELISA using a microtiter plate on which HBsAg was immobilized to 1 μg / well and a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Capel), and bound to HBsAg. The active and non-specific reaction fractions were collected and
It was concentrated to a protein concentration of mg / ml.

【００４５】実施例２ スルフォローダミン１０１標識
ウサギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体の作製 ＨＢｓＡｇに対するウサギポリクローナル抗体（ダコ社
製）１０ｍｇを、ＦＩＴＣの代わりにスルフォローダミ
ン１０１クロリド（同人化学社製）を、またペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりにペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社製）を使用する以
外は、実施例１と同様にの処理を行い、約１ｍｇ／ｍｌ
の蛋白濃度まで濃縮したスルフォローダミン１０１標識
ウサギ抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体を得た。Example 2 Preparation of Sulfolodamine 101-Labeled Rabbit Anti-HBsAg Polyclonal Antibody A rabbit polyclonal antibody against HBsAg (manufactured by Dako) 10 mg, sulfoldamine 101 chloride (manufactured by Dojindo) instead of FITC and peroxidase were used. Except for using a peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Dako) in place of the labeled anti-mouse IgG antibody, the same treatment as in Example 1 was carried out to obtain about 1 mg / ml.
A rabbit anti-HBsAg polyclonal antibody labeled with sulfolodamine 101 concentrated to a protein concentration of 1% was obtained.

【００４６】実施例３ ＨＢｓＡｇの測定 実施例１および２で得られた各濃縮標品を混合し、それ
ぞれ０．２μｇ／ｍｌの濃度となるように１％ウシ血清
アルブミン（クリスタルグレード，フラクションＶ；シ
グマ社製）を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．２）で希釈し、該溶液９５０μｌに対してＨＢｓＡ
ｇの希釈系列（０．５〜２０μｇ）溶液５０μｌを加え
た。該混合液を、蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ（パーキン・エ
ルマー社製）を用いて、励起波長４９０ｎｍで励起さ
せ、波長５００〜６３０ｎｍの範囲で蛍光測定を行った
（スキャン速度：５００ｎｍ／分，スリットサイズ：５
ｎｍ）。６１０ｎｍにおけるスルフォローダミン１０１
の蛍光変化量をＨＢｓＡｇ量に対してプロットした結
果、図３に示すように、蛍光強度は調べられた範囲でよ
い直線性を示し、少なくともこの濃度範囲での高精度な
測定が可能であることが示された。Example 3 Measurement of HBsAg Each of the concentrated preparations obtained in Examples 1 and 2 was mixed, and 1% bovine serum albumin (crystal grade, fraction V; 10 mM phosphate buffered saline (pH: Sigma)
7.2), and 950 μl of the solution was diluted with HBsA.
50 μl of a 1 g dilution series (0.5-20 μg) solution was added. The mixture was excited with an excitation wavelength of 490 nm using a fluorimeter LS50B (manufactured by Perkin-Elmer), and fluorescence was measured in the wavelength range of 500 to 630 nm (scan speed: 500 nm / min, slit size: 5
nm). Sulfoldamine 101 at 610 nm
Is plotted against the amount of HBsAg. As shown in FIG. 3, the fluorescence intensity shows good linearity in the examined range, and it is possible to perform highly accurate measurement in at least this concentration range. It has been shown.

【００４７】[0047]

【発明の効果】本発明の測定方法は、蛍光エネルギー移
動を利用しているので夾雑物質の影響を受けにくく、し
かもサンドイッチ法によるのでバックグラウンドを低く
することができる。したがって、より高精度且つ高感度
な測定が要求される臨床検査等への利用において特に有
用である。また、本発明の測定方法は、均一系での測定
が可能であるから、臨床現場等での自動分析機への適用
など、より簡便な測定系を確立するのに有効である。The measurement method of the present invention utilizes fluorescence energy transfer, so that it is hardly affected by contaminants, and the background can be reduced by the sandwich method. Therefore, the present invention is particularly useful for use in clinical tests and the like that require more accurate and sensitive measurements. In addition, since the measurement method of the present invention can perform measurement in a homogeneous system, it is effective for establishing a simpler measurement system such as application to an automatic analyzer at a clinical site or the like.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の蛍光エネルギー転移を利用した蛍光標
識測定法の概念図である。FIG. 1 is a conceptual diagram of a fluorescent label measurement method using fluorescence energy transfer according to the present invention.

【図２】従来の蛍光エネルギー転移を利用した蛍光標識
測定法の概念図である。FIG. 2 is a conceptual diagram of a conventional fluorescent label measurement method using fluorescence energy transfer.

【図３】６１０ｎｍにおけるスルフォローダミン１０１
の蛍光変化量をＨＢｓＡｇ量の関数としてプロットした
結果を示す図である。FIG. 3. Sulfoldamine 101 at 610 nm.
FIG. 7 is a diagram showing the results of plotting the amount of change in fluorescence as a function of the amount of HBsAg.

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 １種以上の蛍光物質Ｆ１で標識された、
測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａと、１種
以上のＦ１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識された、測定
対象物質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを使用する物
質Ｘの測定方法であって、Ｆ１とＦ２が蛍光エネルギー
転移の供与体と受容体の関係にあることを特徴とする方
法。1. A method of claim 1, wherein the label is labeled with one or more fluorescent substances F1.
A substance using a first substance A having a binding ability to the substance X to be measured and a second substance B having a binding ability to the substance X to be measured, which is labeled with one or more kinds of fluorescent substances F2 different from F1. A method for measuring X, wherein F1 and F2 are in a relationship between a donor and an acceptor of fluorescence energy transfer. 【請求項２】 測定対象物質Ｘと、１種以上の蛍光物質
Ｆ１で標識された、測定対象物質Ｘと結合能を有する第
１の物質Ａおよび１種以上のＦ１とは異なる蛍光物質Ｆ
２で標識された、測定対象物質Ｘと結合能を有する第２
の物質Ｂとの親和性反応により生成する複合体Ｆ１−
Ａ：Ｘ：Ｂ−Ｆ２の、Ｆ１を励起させることによって放
出される蛍光によりＦ２を励起させ、該励起により放出
される蛍光を測定することを含む請求項１記載の測定方
法。2. A first substance A, which is labeled with a substance X to be measured and at least one kind of fluorescent substance F1 and has a binding ability to the substance X to be measured, and a fluorescent substance F different from one or more kinds of F1.
2 that has a binding ability to the substance to be measured X labeled with 2
Complex F1- formed by an affinity reaction with substance B
2. The method according to claim 1, comprising exciting F2 of A: X: B-F2 with fluorescence emitted by exciting F1, and measuring fluorescence emitted by the excitation. 【請求項３】 測定対象物質Ｘが、抗原、抗体、ホルモ
ン、ホルモンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖
質、サイトカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マー
カーおよびそれらの一部分からなる群より選択される請
求項１または２記載の測定方法。3. The substance X to be measured is selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a hormone, a hormone receptor, a lectin, a lectin-binding carbohydrate, a cytokine, a cytokine receptor, a tumor marker and a part thereof. 2. The measuring method according to 2. 【請求項４】 測定対象物質Ｘが抗原であり、Ｘと結合
能を有する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか
一方が、Ｘに対する抗体、ペプチドまたはレクチンであ
り、他方が、該抗体とは異なる部位でＸと結合し得る抗
体、ペプチドまたはレクチンである請求項３記載の測定
方法。4. The substance to be measured X is an antigen, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antibody, peptide or lectin against X, and the other is: 4. The method according to claim 3, wherein the antibody, peptide or lectin is capable of binding to X at a site different from the antibody. 【請求項５】 測定対象物質Ｘが抗体であり、Ｘと結合
能を有する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれか
一方が、Ｘが結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチン
であり、他方が、Ｘを抗原として結合し得る抗体、Ｘが
結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチンである請求項
３記載の測定方法。5. The substance X to be measured is an antibody, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antigen, peptide or lectin to which X can bind, The method according to claim 3, wherein the other is an antibody capable of binding X as an antigen, an antigen, peptide or lectin capable of binding X. 【請求項６】 測定対象物質Ｘと、測定対象物質Ｘと結
合能を有する第１の物質Ａとの親和性反応、および測定
対象物質Ｘと、測定対象物質Ｘと結合能を有する第２の
物質Ｂとの親和性反応が、それぞれ抗原抗体反応、ホル
モン−ホルモンレセプター反応、レクチン−レクチン結
合性糖質反応、サイトカイン−サイトカインレセプター
反応および腫瘍マーカー−腫瘍マーカーレセプター反応
からなる群より選択される請求項３記載の測定方法。6. An affinity reaction between a substance X to be measured and a first substance A having a binding ability to the substance X to be measured, and a second substance having a binding ability to the substance X to be measured and the substance X to be measured. The affinity reaction with substance B is selected from the group consisting of antigen-antibody reaction, hormone-hormone receptor reaction, lectin-lectin-binding carbohydrate reaction, cytokine-cytokine receptor reaction and tumor marker-tumor marker receptor reaction, respectively. Item 3. The measuring method according to Item 3. 【請求項７】 均一系で実施することを特徴とする請求
項１〜６のいずれかに記載の測定方法。7. The measurement method according to claim 1, wherein the measurement is performed in a homogeneous system. 【請求項８】 １種以上の蛍光物質Ｆ１で標識された、
測定対象物質Ｘと結合能を有する第１の物質Ａと、１種
以上のＦ１とは異なる蛍光物質Ｆ２で標識された、測定
対象物質Ｘと結合能を有する第２の物質Ｂを含む試薬で
あって、Ｆ１とＦ２が蛍光エネルギー転移の供与体と受
容体の関係にあることを特徴とする物質Ｘの測定用試
薬。8. The method according to claim 1, wherein the label is labeled with one or more fluorescent substances F1.
A reagent containing a first substance A having a binding ability to the substance X to be measured and a second substance B having a binding ability to the substance X to be measured, which is labeled with one or more kinds of fluorescent substances F2 different from F1. A reagent for measuring a substance X, wherein F1 and F2 are in a relationship between a donor and an acceptor for fluorescent energy transfer. 【請求項９】 測定対象物質Ｘが、抗原、抗体、ホルモ
ン、ホルモンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖
質、サイトカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マー
カーおよびそれらの一部分からなる群より選択される請
求項８記載の測定試薬。9. The substance X to be measured is selected from the group consisting of antigens, antibodies, hormones, hormone receptors, lectins, lectin-binding carbohydrates, cytokines, cytokine receptors, tumor markers and a part thereof. Measuring reagent. 【請求項１０】 測定対象物質Ｘが抗原であり、Ｘと結
合能を有する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれ
か一方が、Ｘに対する抗体、ペプチドまたはレクチンで
あり、他方が、該抗体とは異なる部位でＸと結合し得る
抗体、ペプチドまたはレクチンである請求項９記載の測
定試薬。10. The substance X to be measured is an antigen, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antibody, peptide or lectin against X, and the other is The measurement reagent according to claim 9, which is an antibody, a peptide, or a lectin capable of binding to X at a site different from the antibody. 【請求項１１】 測定対象物質Ｘが抗体であり、Ｘと結
合能を有する第１の物質Ａおよび第２の物質Ｂのいずれ
か一方が、Ｘが結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチ
ンであり、他方が、Ｘを抗原として結合し得る抗体、Ｘ
が結合し得る抗原、ペプチドまたはレクチンである請求
項９記載の測定試薬。11. The substance X to be measured is an antibody, and one of the first substance A and the second substance B capable of binding to X is an antigen, peptide or lectin to which X can bind, The other is an antibody capable of binding X as an antigen, X
10. The measurement reagent according to claim 9, wherein is a bindable antigen, peptide or lectin. 【請求項１２】 測定対象物質Ｘと結合能を有する第１
の物質Ａおよび第２の物質Ｂが、それぞれ抗原抗体反
応、ホルモン−ホルモンレセプター反応、レクチン−レ
クチン結合性糖質反応、サイトカイン−サイトカインレ
セプター反応および腫瘍マーカー−腫瘍マーカーレセプ
ター反応からなる群より選択される親和性反応により測
定対象物質Ｘと結合し得るものである請求項９記載の測
定試薬。12. A first substance having a binding ability to a substance X to be measured.
Are selected from the group consisting of antigen-antibody reaction, hormone-hormone receptor reaction, lectin-lectin-binding carbohydrate reaction, cytokine-cytokine receptor reaction, and tumor marker-tumor marker receptor reaction, respectively. 10. The measuring reagent according to claim 9, which can bind to the substance X to be measured by an affinity reaction. 【請求項１３】 均一系測定用である請求項８〜１２の
いずれかに記載の測定試薬。13. The measuring reagent according to claim 8, which is used for measuring a homogeneous system.