JP4733022B2 - 新規ダニアレルゲン - Google Patents
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Description
ダニアレルギー疾患については、屋内塵中のアレルゲン源としてヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)及びコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)の2種のダニが報告されている(非特許文献1および2を参照)。これらのダニから、主要ダニアレルゲンが分画されており、それらはダニ***物及び/又はダニ虫体中に含有されている分子量24−28kDの糖蛋白(pI 4.6〜7.2)、及び/又は分子量14.5−20kDのタンパク質(pI 5〜7.2)であることがわかっている(非特許文献3から7を参照)。
ダニアレルゲンの遺伝子について、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p1(分子量:25,371)及びDer p2(分子量:14,131)が、またコナヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer f1(分子量:25,191)及びDer f2(分子量:14,021)がクローニングされ塩基配列も決定されている(非特許文献8から15を参照)。これらのアレルゲンについて組換えアレルゲンも作製されており、アレルゲンの研究が進んでいる。また、分子量約30,000のアレルゲンとしてDer f3もその塩基配列が報告されている(非特許文献16を参照)。さらにダニアレルゲンとして、ma10,ma3,ma15,ma29,ma44,ma50,ma113,ma114,ma115(特許文献1を参照)も報告されといる。さらに、抗Der f2血清と強い交差反応性を示す、ma124も報告されている(特許文献2を参照)。
また、イヌにおいて98kDaと109kDaのDer f15(非特許文献17を参照)及び60kDaのDer f18(非特許文献18を参照)がIgEが強く反応するアレルゲンであるとの報告がある。
ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵(ハウスダスト)抽出物および/またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験が主流であった。RAST(radio allergosorbent test)法による血清中のIgE抗体価(相対値)の測定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験等も併用されてはいたが、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であった。
従来より、屋内塵(ハウスダスト)抽出液を用いて、屋内塵性ダニを特異的アレルゲンとする気管支喘息の減感作治療法が行われてきた。しかし、屋内塵の組成は十分分析されていなかった。また、屋内塵には多種類の不純物が含まれるので、アナフィラキシーを誘発する危険もあり、その際の屋内塵の投与量も極度に制限されていた。このため従来の減感作治療は効果が極めて低かった。従って、より有効でありかつ安全な減感作治療用抗原が望まれていた。従来より、高分子粗ダニ***物画分に減感作治療に有効なアレルゲンが存在することが知られていたが、このような画分からは減感作治療用に充分な量のダニアレルゲンは得られなかった。従って、ダニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法では、治療用抗原の安定供給は困難である。また、前記のように、従来より遺伝子組換え技術により種々の組換えダニアレルゲンについて報告されていた。しかしながら、これらのアレルゲンは必ずしも、実際の治療に有効とはいえず、より有効な新たなダニアレルゲン活性の高い組換えダニアレルゲンの提供が望まれていた。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規なダニアレルゲンを見出し、該アレルゲンが減感作治療に優れた効果を奏することを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
[1] 以下の(a)又は(b)の組換えダニアレルゲン、
(a)配列番号2または35で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
(b)配列番号2または35で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン
[2] 以下の(a)又は(b)のダニアレルゲンをコードする遺伝子、
(a)配列番号2または35で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
(b)配列番号2または35で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン
[3] 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子、
(c)配列番号1または34で表される塩基配列を含むDNA
(d)配列番号1または34の塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNA
[4] [1]のダニアレルゲンの断片ペプチド、
[5] 配列番号3から19で表されるアミノ酸配列を少なくとも1つ含むアミノ酸配列からなる[4]の断片ペプチド、
[6] [4]または[5]の断片ペプチドをコードするダニアレルゲンの断片遺伝子、
[7] [2]もしくは[3]の遺伝子または[6]に記載の断片遺伝子を含有する組換えベクター、
[8] [1]のダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質、
[9] [7]の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞、
[10] [9]の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法、
[11] [9]の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他のタンパク質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法、
[12] [1]の組換えダニアレルゲン、[4]の断片ペプチドまたは[8]記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、
[13] [1]の組換えダニアレルゲン、[4]の断片ペプチドまたは[8]記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬、
[14] [1]に記載のダニアレルゲンに対する抗体、
[15] モノクローナル抗体である[14]のダニアレルゲンに対する抗体、
[16] [15]のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
[17] [14]から[16]のいずれかの抗体を用いる屋内塵中のダニアレルゲンの免疫学的測定方法、ならびに
[18] ELISAである[17]の屋内塵中のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004−116089の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、リコンビナントイヌFcεRIα鎖のIgE結合性を示す図である。
図3は、Dermatophagoides farinae特異的IgEの検出の結果を示す図である。
図4は、リコンビナントイヌFcεRIα鎖を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図5は、Dermatophagoides farinae抽出抗原の2次元電気泳動パターンを示す写真である。
図6は、Dermatophagoides farinaeアレルゲンタンパク質の2次元電気泳動ウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図7−1は、Zen1遺伝子の部分塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図7−2は、Zen1遺伝子の部分塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である(図7−1の続き)。
図8−1は、Zen1遺伝子の全長cDNA塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図8−2は、Zen1遺伝子の全長cDNA塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である(図8−1の続き)。
図8−3は、Zen1遺伝子の全長cDNA塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である(図8−2の続き)。
図8−4は、Zen1遺伝子の全長cDNA塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である(図8−3の続き)。
図9は、大腸菌を用いて作製・精製したリコンビナントZen1のSDS−PAGEの結果を示す写真である。
図10は、抗Zen1ポリクローナル抗体のウエスタンブロッティングによる反応解析の結果を示す写真である。レーン1はリコンビナントZen1を、レーン2はダニ虫体の結果を表す。
図11は、リコンビナントZen1のIgE反応性をELISAにて解析した結果を示す図である。
(1) ダニアレルゲンZen1タンパク質の単離および部分配列決定
臨床的にダニアレルギーと診断された動物から得られたダニアレルゲン特異的IgEを用いてダニアレルギーを特定する。具体的には、例えばダニアレルゲン特異的IgEを含む血清、ダニ抽出物およびアレルゲン特異的IgEを認識するIgEレセプターを用いたウエスタンブロッティングよりダニアレルゲンを同定すればよい。アレルゲンの同定は公知の方法により行うことができる。
このようにして同定される本発明の新規なダニアレルゲンであるZen1タンパク質は、分子量150kDa〜200kDaのタンパク質である。
同定されたダニアレルゲンの単離は、電気泳動を行い、ダニアレルゲンのスポットからダニアレルゲンを抽出することにより行うことができる。この際、他のタンパク質と完全に分離するためには、2次元電気泳動を行うことが望ましい。
抽出したダニアレルゲンを用いて、公知の方法で部分配列決定を行うことができる。部分配列を決定する公知の方法として、MS/MS解析によるde novo sequencingやペプチドマッピングがある。
(2) RT−PCRによるcDNAクローンの作製
ダニよりmRNAを抽出し、該mRNAを鋳型にしてダニアレルゲンcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製し、スクリーニングすることにより、本発明のダニアレルゲンをコードするDNAを得ることができる。
mRNAの供給源はダニ虫体であり、好ましくは屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダニ等の虫体であるが、これらには限定されない。mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。得られたmRNAを鋳型として、上記(1)により得られた配列情報に基づいてプライマーを設計し、ダニアレルゲンをコードするcDNA断片を合成する。得られた断片をpGEM(Promega製)等の適当なベクターにサブクローニングし、常法により、例えばサイクルシークエンス法により塩基配列を決定する。
本発明のダニアレルゲンの部分アミノ酸配列を配列番号3から19に示す。このうち、配列番号3から7に示される配列がde novo sequencingにより決定した配列であり、配列番号19にN末端アミノ酸配列を示す。配列番号8から18に示される配列がペプチドマッピングにより決定した配列である。
本発明は、ダニアレルゲンであるZen1タンパク質の断片であって、配列番号3から19に示されるアミノ酸配列の少なくとも1つを含むアミノ酸配列からなるダニアレルゲンを含む。
配列番号1に本発明のダニアレルゲンであるZen1タンパク質をコードするZen1遺伝子のDNAの部分塩基配列を、配列番号34に全長塩基配列を示す。配列番号2に本発明のダニアレルゲンであるZen1タンパク質の部分アミノ酸配列を、配列番号35に全長アミノ酸配列を例示する。
これらのアミノ酸配列からなるタンパク質がダニアレルゲン活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも1個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号2または配列番号35で表されるアミノ酸配列の少なくとも1個、好ましくは1又は数個(例えば1〜10個、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号2で表わされるアミノ酸配列に少なくとも1個、好ましくは1又は数個(例えば1〜10個、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列の少なくとも1個、好ましくは1又は数個(例えば1〜10個、さらに好ましくは1〜5個)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
このような配列番号2または配列番号35のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号2または配列番号35のアミノ酸配列と、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号2または配列番号35のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号2または配列番号35のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
また、上記配列番号1または配列番号34に示すDNA配列を有する遺伝子と相補的な配列からなるDNAと下記の条件下でハイブリダイズすることができるDNAであってダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の遺伝子に含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる)を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50% フォルムアミド、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×デンハルツ(Denhardt’s)溶液、100μg/mlサケ***DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるDNAである。
さらに、上記DNAに対するRNA、又は該RNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるRNAであってダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするRNAも本発明に含まれる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターDNAは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pUC19、pTV118 N(宝酒造社製)、pUEX2(アマシャム社製)、pGEX−4T、pKK233−2(ファルマシア社製)、pMAM−neo(クロンテック社製)等が挙げられる。
本発明の発現ベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により行うことができる。例えば、ダニアレルゲンcDNAのEcoRIで消化した断片を、プラスミドpUC19のマルチクローニング部位のEcoRI部位に挿入することができる。また、該断片をプラスミドベクターpGEX−4TのEcoRI部位に連結して発現ベクターを得ることができる。
本発明の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母又は動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌としては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・卵巣(CHO)細胞、ヨトウガの卵巣細胞であるSf 21細胞やSf 9細胞、サルCOS細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
本発明の組換えダニアレルゲンには、直接発現に加えて、他のタンパク質との融合タンパク質として発現されたものも含まれ、以下、該融合タンパク質を融合組換えダニアレルゲンという。ここで、融合する他のタンパク質としては特に限定されないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、プロテインA、マルトース結合タンパク質等が挙げられる。
本発明の組換えダニアレルゲンは、アレルゲン活性に必須な領域のみのペプチド断片であってもよく、また、アレルゲン活性に必須な領域からなるものであってもよい。また、ダニアレルゲンタンパク質のみを発現させて得られたものの他に、融合タンパク質として発現したものから他のタンパク質を脱離せしめて得られたものでもよい。
すなわち、本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質である。ここで、ダニアレルゲン活性を有するとは、哺乳動物に対してアレルギー反応を誘導し得ることをいう。
本発明のダニアレルゲンは、以下の方法により製造することができる。上記形質転換株の培養終了後、菌体を集菌し、種々のプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊する。細胞デブリスにある膜局在性のタンパク質をフェニルメタンスルフォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチンA、エチレンジアミン四酢酸等のプロテアーゼインヒビター及びラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、トリトンX−100、ノニデットP40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られたダニアレルゲン・グルタチオンS−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、例えばグルタチオン固定化アフィニティクロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグラフィー等で精製する。なお、グルタチオン固定化担体は、ファルマシア社製のものである。また、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、活性化されたトレシル担体(例えば、トレシルGMゲル(栗田工業社製)、トレシルトヨパール(東ソー社製)、トレシルセファロース(ファルマシア社製)等が用いられる)にウサギ抗ダニ虫体抗体を共有結合させたものである。また、ダニアレルゲンと6×His等のHis tagとの融合タンパクを得て、金属を固定化した固定化金属アフィニティービーズ等を用いて精製することもできる。
精製された融合組換えダニアレルゲンは、プロテアーゼで消化し、ELISA及びダニアレルギー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験(アレルギー,37,725(1988))でモニター下に、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて分画する。
本発明は、ダニアレルゲンを有効成分として含むダニアレルギー疾患治療剤をも包含する。該治療剤は、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドを乾燥して粉末状で採取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として調製することができる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いる。
本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて成人1回あたり約20μg以下の範囲となるように適宜選択し、毎週1から数回程度投与される。
また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニアレルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製された組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドを常法により調製して得るが、例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、これをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従って用いられる。
また、ダニアレルギー診断用滴定試薬として用いる場合も同様に常法により調製されるが、例えば、組換えダニアレルゲンまたはその断片ペプチドをハンクス緩衝液で適当に溶解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用いる。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球から遊離するヒスタミン量をHPLCを用いて測定する〔アレルギー,37,725(1988)〕。
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の50%量(滴定曲線の変曲点)から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、(1)血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。(2)血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応させた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値(血液滴定曲線値)は、通常、組換えダニアレルゲンで血球浮遊液を滴定して得られる値(血球浮遊液滴定曲線値)より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG抗体(遮断抗体)が存在するためである。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。アレルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用である。
本発明は、本発明のダニアレルゲンまたはその断片ペプチドに対する抗体も包含する。該抗体は公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる。該抗体は、例えば屋内塵ダスト中のダニアレルゲンの有無等を測定するのに用いることができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばELISAにより行うことができる。この際、屋内塵からタンパク質を抽出し、測定すればよい。
なお、本発明のダニアレルゲンの組換えタンパク質を発現させ、発現させた当該組換えタンパク質を用いてダニアレルギー患畜犬との特異IgE反応、あるいは皮内反応などの試験を実施することにより、本発明のダニアレルゲンタンパク質がアレルゲンタンパクとしての機能を確定させることが出来る。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
尚、各実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク、和光純薬、シグマ、ディフコなどから購入した市販のものを使用した。また、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は宝酒造、東洋紡、インビトロジェン、などから購入し、販売者の指示に従って使用した。
イヌ高親和性IgEレセプターα鎖(FcεRIα)cDNAのシグナルペプチド部位を除いた細胞外領域を制限酵素EcoRI及びXhoI部位を付加したかたちでPCRにて増幅し、大腸菌発現プラスミドベクターpGEX4T−1(アマシャムバイオサイエンス社製)のEcoRI及びXhoI部位にT4−DNAリガーゼで連結し、得られた組換えプラスミドをE.coli TOP10株(インビトロジェン社製)に形質転換した。この形質転換株をアンピシリン100μg/mLを含有するLB培地中、37℃で一晩培養した後、少量を新たなLB培地に継代し、600nmのODが1.0になるまで培養した。ついで、最終濃度1mMになるようにIPTG(isopropyl−1−thio−β−D−galactoside)を添加した後3時間目に集菌し、PBS(pH7.4)で1回洗浄した。再度集菌した細胞をPBS(pH7.4)中で超音波処理することにより溶解し、遠心により不溶画分を除去し、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(GST)と融合したイヌFcεRIαを含む可溶性画分を回収した。次いで、この可溶化画分からグルタチオンセファロース4Bカラム(アマシャムバイオサイエンス社製)によりGSTと融合したイヌFcεRIαを得た。10リットルの培養液から1.0mgの融合タンパク質(GST−FcεRIα)を得た。得られた精製GST−FcεRIαはSDS−PAGEにおいて45kDaの単一のバンドを呈することを確認した(図1)。イムノプレートに(ナルジェヌンク社製)リコンビナントイヌIgE(BETHYL社製)と精製イヌIgGを1.0μg、つぎに0.1μg、0.05μg、0.025μg、0.0125μg、0.00625μgと2倍階段希釈で固相化し、精製GST−FcεRIαの反応性を確認したところ、IgEと反応しIgGと反応しないことを確認した(図2)。イムノプレート(ナルジェヌンク社製)にコナヒョウヒダニ抽出抗原(GREER社製)4.0μgを固相化し、コナヒョウヒダニ陽性イヌ血清(コナヒョウヒダニ抗原液(GREER社製)を生理食塩水にて50倍に希釈したものを用いた皮内反応によりコナヒョウヒダニに陽性を呈したイヌ血清)を反応させ、ビオチン標識したGST−FcεRIαを加え、さらにペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン(Jackson Immuno Research社製)及び基質添加による発色反応によりGST−FcεRIα鎖がダニアレルゲン特異的IgEを認識することを確認した(図2)。さらにコナヒョウダニ抽出抗原(GREER社製)4.0μgをイムノプレート(ナルジェヌンク社製)に固相化し、コナヒョウダニ抽出抗原を免疫したイヌ血清を反応させた。本GST−FcεRIαと56℃にて1時間熱処理したコナヒョウヒダニ陽性イヌ血清とは反応しないこと、またイヌ精製IgGとは反応しないこと、そしてリコンビナントイヌIgE(BETHYL社製)と反応が確認されることにより、本GST−FcεRIαはアレルゲン特異的IgEを認識するものと考えられた(図3)。図3中「−」は56℃にて1時間処理しないものを、「+」は56℃にて1時間処理したものを示し、「cont.」は、非免液血清を示す。
アトピー性皮膚炎を発症し、コナヒョウヒダニアレルゲン抽出抗原液(GREER社製)を用いた皮内反応及び実施例1にて確立したリコンビナントイヌFcεRIα鎖を用いたELISA法にてダニアレルギーと診断された8頭のイヌ血清及び血漿を用いてウエスタンブロット解析を実施した。コナヒョウヒダニ抽出抗原液100.0μLにβ−メルカプトエタノールを終濃度50.0μL/mLになるように添加したLaemmliサンプルバッファー(BIO−RAD社製)200μLを加え、100℃で5分間熱処理した後、ゲル濃度5〜20%のポリアクリドアミドゲル(PAGEL;ATTO社製)にアプライし、電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、PVDFメンブラン(Hybond−P;アマシャムバイオサイエンス社製)にトランスファーし、メンブランをブロッキング液(5%スキムミルク添加PBST(PBSに終濃度0.1%になるようにTween20を加えたもの))中で4℃にて一晩放置した。メンブランをPBSTで10分間洗浄したのち、イヌ血清または血漿をブロッキング液で10倍希釈しメンブランに添加し室温にて3時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を3回行った後、ビオチン標識したイヌFcεRIαをブロッキング液で希釈しメンブランに添加し室温にて2時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を3回行った後、PBSTで10,000倍に希釈したストレプトアビジン−HRPコンジュゲート(アマシャムバイオサイエンス社製)をメンブランに添加し室温にて1時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を5回行った後、ECL Plusウエスタンブロティング検出システム(アマシャムバイオサイエンス社製)反応液をメンブラン上に添加し5分間室温にて反応させた後、X線フィルム(Hyperfilm ECL;アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量150kDaから250kDaの間に強く反応するタンパク質を検出した(図4)。図4中、矢印で示したバンドが分子量150kDaから250kDaの間の強く反応するタンパク質のバンドである。図4中、1から8までの数字は、8頭のイヌのそれぞれを示し、「ct.」は陰性血清を示す。
分子量150kDaから250kDaの間のIgEの強く反応するアレルゲンタンパク質の単離を2次元電気泳動にて実施した。2次元電気泳動はプロティアンIEFセル(BIO−RAD社製)を用いて実施した。コナヒョウヒダニ抽出抗原(GREER社製)1.0mgを1.0mLの膨潤バッファー(2−D スターターキット;BIO−RAD社製)に溶解した。溶解液300μLを17cmのIPG Readyストリップゲル(pH4−7;BIO−RAD社製)にフォーカシングトレイを用いてActive条件(50V,20℃,12時間)にて膨潤させた。膨潤後、以下の条件にてフォーカシングを行った。まず、STEP1(250V,20分,20℃)にて過剰の塩類を除く操作を行い、STEP2にて6時間かけて電圧を250Vから10,000Vまで上昇させた。STEP3にて電圧10,000V、トータルボルトアワー値60,000VHにてフォーカシングを行った。2次元目の電気泳動を行う前にIPG ReadyストリップゲルをSDS−PAGE平衡化バッファーI(6M 尿素、0.375M Tris pH8.8、2% SDS、20% グリセロール、2%(w/v)DTT;BIO−RAD社製)を用いて10分間穏やかに振とうした。その後、SDS−PAGE平衡化バッファーII(6M 尿素、0.375M Tris pH8.8、2% SDS、20% グリセロール、2.5%(w/v)ヨードアセテアミド;BIO−RAD社製)にてさらに10分間穏やかに振とうすることにより平衡化を行った。平衡化を行ったIPG ReadyストリップゲルをPIIレディーゲル(8−16%;BIO−RAD社製)の上に1%(v/w)ローメルトアガロース(BIO−RAD社製)を用いて密着させた。40mA定電流(初期電圧値135V、最終電圧値400V)でおよそ3時間電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをBio−Safe(BIO−RAD社製)にて染色し、タンパク質スポットのパターン解析を行った(図5)。
2次元電気泳動後、タンパク質スポットをPVDFメンブラン(Hybond−P;アマシャムバイオサイエンス社製)にトランスファーし、メンブランをブロッキング液(5%スキムミルク添加PBST(PBSに終濃度0.1%になるようにTween20を加えたもの))中で4℃にて一晩放置した。メンブランをPBSTで10分間洗浄したのち、イヌ血清または血漿をブロッキング液で10倍希釈しメンブランに添加し室温にて3時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を3回行った後、ビオチン標識したイヌFcεRIαをブロッキング液で希釈しメンブランに添加し室温にて2時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を3回行った後、PBSTで10,000倍に希釈したストレプトアビジン−HRPコンジュゲート(アマシャムバイオサイエンス社製)をメンブランに添加し室温にて1時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を5回行った後、ECL Plusウエスタンブロティング検出システム(アマシャムバイオサイエンス社製)反応液をメンブラン上に添加し5分間室温にて反応させた後、X線フィルム(Hyperfilm ECL;アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量が150kDa〜250kDaの間で、pHがおよそ4.5に強く反応するスポットを検出し、本発明のアレルゲンタンパク質(Zen1)スポットを得た(図6)。図6中左上の図(6−1)は、コナヒョウダニの2次元電気泳動パターン(pH4〜7)を示し、右上の図(6−2)は、コナヒョウダニ陽性アトピー性皮膚炎発症イヌ患畜血清を用いたウエスタンブロット解析(pH4〜7)を示し、左下の図(6−3)は、コナヒョウダニの2次元電気泳動パターン(pH3.9〜5.1)を示し、右下の図(6−4)は、コナヒョウダニ陽性アトピー性皮膚炎発症イヌ患畜血清を用いたウエスタンブロット解析(pH3.9〜5.1)の反応スポット(図中上部に黒い円形のスポットとしてみえる矢印の部分)を2次元電気泳動パターンに照らし合わせたものである。矢印のスポットに強い反応が認められた。
常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得られる生ダニ虫体を飽和食塩水約2.0Lに入れ、良くかき回した後30分間放置した。上清のダニ虫体を茶漉しを用いてすくい取り、生理食塩水を用いて洗浄した後乾燥させた。ダニ虫体1.0gをFastTrack 2.0 kit(インビトロジェン社製)を用いてそのマニュアルに従って全RNAの抽出とダニポリ(A)mRNAの分離を行った。
実施例8にて分離したダニポリ(A)mRNAのうち100ngを鋳型とし、cDNA合成キット(ReverTraAce−α−;TOYOBO社製)を用いてそのマニュアルに従って逆転写反応を行った。
Zen1タンパク質のN末端アミノ酸配列をもとにプライマーN−1(5’−GAYGAYGTNTTRAARCARACNGARGAR−3’(配列番号20):Y=C or T,N=A or C or G or T,R=A or G,)とN−2(5’−GAY GAY GTN CTN AAR CAR ACN GAR GAR−3’(配列番号21):Y=C or T,N=A or C or G or T,R=A or G,)を設計し、それぞれセンスプライマーとした。また、de novo sequencing法により得られたアミノ酸配列をもとに12のプライマー(配列番号22から33)を設計し(表4)、それぞれリバースプライマーとした。実施例9にて合成したダニcDNAを鋳型とし、1.0μgを使用しEx taqポリメラーゼ(TaKaRaバイオ社製)を用い、マニュアルに従ってサンプルを調整し、94℃にて2分間熱変性処理した後、94℃1分間、65℃2分間、72℃3分間を1サイクルとし、これを35回行った後、72℃9分反応後、4℃に保存するサイクルで行った。リバースプライマー415−4(5’−RTTNAGNAGRTCYTTNGCRTCYTT−3’(配列番号25):N=A or C or G or T,R=A or G,Y=C or T,)を用いてPCRを行った際におよそ1,000bpを、また491−2(5’−RTT RTC NGC NAG RTC YTT RTT−3’(配列番号29):N=A or C or G or T,R=A or G,Y=C or T,)を用いてPCRを行った際におよそ880bpのDNA断片を得た。
実施例10にてプライマーN−1と415−4を用いて増幅したDNA断片をアガロースゲルより回収し(TaKaRa社製SUPREC−01)、pGEM−T Easy Vector(Promega社製)のクローニングサイトにT4 DNAリガーゼを用いて結合させ、宿主大腸菌TOP10(Invrirogen社製)を形質転換した。すなわち、大腸菌コンピテントセルとプラスミドを混和後、氷上で30分、42℃で30秒、氷上で2分の温度処理を行い、SOC培地(2% Trypton、0.5% yeast extract、0.05% NaCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM Glucose)に浮遊して37℃で1時間インキュベートした。その後50μg/mlアンピシリンを添加したLB寒天培地上(1% yeast extract、0.5% trypton、1% NaCl)に形質転換した大腸菌を37℃、一晩培養後に大腸菌コロニーを得た。白色の挿入断片を含むと考えられるクローンを選択し、一晩50μg/mlアンピシリンを添加したLB培地で培養後、プラスミドDNAをGFX(登録商標)Micro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience社製)により精製した。アマシャム社製のダイプライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、蛍光DNAシークエンサー(島津製作所社製)により塩基配列の解析を行った。なお、最終的な塩基配列の決定は、3クローンの塩基配列解析を行い、各クローンの塩基配列の完全一致をもって決定とした(図7−1および図7−2)。
実施例11にてクローニングしたZen1遺伝子の遺伝子解析をGenetyx−win ver.6ソフトウェア(ソフトウェア開発社製)を用いて実施した。塩基数は1020bpでアミノ酸残基は340であった(図7−1および図7−2、配列番号1および2)。本遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列に関してBLASTサーチを実施したが、明確なヒットは得られず、本Zen1遺伝子は新規のものと考えられた。
完全長のcDNAの単離はRapid Amplification of cDNA Ends(RACE)法を用いた。実施例8において使用したダニ虫体よりSV Total RNA Isoration Kit(Promega社製)を用いて全RNAを抽出した後、GeneRacer(登録商標)Kit(Invitrogen社製)を用いてRACE用のテンプレートをマニュアルに従って作製した。また、実施例12において得られたZen1の部分配列をもとに5’及び3’末端を増幅するための1st PCR及びNested PCR用のプライマーを合成した(表5)。5’及び3’末端の増幅反応は、上記において作製したRACE用のテンプレートを1.0μLとり、GeneRacer(登録商標)Kitに付属の5’及び3’用プライマーを各3.0μL、dNTPミックス溶液(10mM each)を1.0μL、Advantage cDNA polymerase Mix(CLONTECH社製)に付属の10×cDNA PCR reaction bufferを5.0μl、Advantage cDNA polymerase Mixを1.0μL、10μMに調整した上記において合成した1st PCR用の遺伝子特異的プライマーを1.0μL加え、滅菌蒸留水にて50.0μLに調整した。遺伝子の増幅はTouchdown PCR法を用いた。調整したサンプル液を94℃にて1分間熱変性処理した後、94℃で30秒間、72℃で4分間を1サイクルとしたものを5回行い、つづいて94℃で30秒間、70℃で4分間を1サイクルとしたものを5回行い、最後に94℃で30秒間、68℃で4分間を1サイクルとしたものを25回行った後、4℃に保存するサイクルで行った。1st PCRが終了した後、5’及び3’末端の増幅反応液からそれぞれ1.0mLとり、GeneRacer(登録商標)Kitに付属のNested PCR用の5’及び3’用プライマーを各1.0μL、dNTPミックス溶液(10mM each)を1.0μL、Advantage cDNA polymerase Mix(CLONTECH社製)に付属の10×cDNA PCR reaction bufferを5.0μl、Advantage cDNA polymerase Mixを1.0μL、10μMに調整した上記において合成した1st PCR用の遺伝子特異的プライマーを1.0μL加え、滅菌蒸留水にて50.0μLに調整した。遺伝子の増幅は上記のTouchdown PCR法を用いた。得られた5’及び3’末端の増幅断片を1.0%のアガロースゲルにて電気泳動により確認した後、これらを切り出して回収し(TaKaRa社製SUPREC−01)、pGEM−T Easy Vector(Promega社製)のクローニングサイトにT4 DNAリガーゼを用いて結合させ、宿主大腸菌TOP10(Invrirogen社製)を形質転換した。すなわち、大腸菌コンピテントセルとプラスミドを混和後、氷上で30分、42℃で30秒、氷上で2分の温度処理を行い、SOC培地(2% Trypton、0.5% yeast extract、0.05% NaCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM Glucose)に浮遊して37℃で1時間インキュベートした。その後50μg/mlアンピシリンを添加したLB寒天培地上(1% yeast extract、0.5% trypton、1% NaCl)に形質転換した大腸菌を37℃、一晩培養後に大腸菌コロニーを得た。白色の挿入断片を含むと考えられるクローンを選択し、一晩50μg/mlアンピシリンを添加したLB培地で培養後、プラスミドDNAをGFX(登録商標)Micro Plasmid Prep Kit(Amersham Bioscience社製)により精製した。アマシャム社製のダイプライマーサイクルシークエンスキットを用いてシークエンス反応を行い、蛍光DNAシークエンサー(島津製作所社製)により塩基配列の解析を行った。なお、最終的な塩基配列の決定は、3クローンの塩基配列解析を行い、各クローンの塩基配列の完全一致をもって決定とした。その結果、Zen1の5’及び3’末端の塩基配列を決定することが出来た(図8−1から図8−4、配列番号34および35)。
実施例13にて得られたZen1のcDNAを制限酵素BamHI及びXhoI部位を付加したかたちでPCRにて増幅し、大腸菌発現プラスミドベクターpGEX4T−1(アマシャムバイオサイエンス社製)のBamHI及びXhoI部位にT4−DNAリガーゼで連結し、得られた組換えプラスミドをE.coli TOP10株(インビトロジェン社製に形質転換した。この形質転換株をアンピシリン100μg/mLを含有するLB培地中、37℃で一晩培養した後、少量を新たなLB培地に継代し、600nmのODが1.0になるまで培養した。ついで、最終濃度1mMになるようにIPTG(isopropyl−1−thio−β−D−galactoside)を添加した後3時間目に集菌し、PBS(pH7.4)で1回洗浄した。再度集菌した細胞をPBS(pH7.4)中で超音波処理することにより溶解し、遠心により不溶画分を除去し、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(GST)と融合したZen1を含む可溶性画分を回収した。次いで、この可溶化画分からグルタチオンセファロース4Bカラム(アマシャムバイオサイエンス社製)によりGSTと融合したZen1を得た。精製したGSTと融合したZen1を含む溶液にこの融合タンパク濃度のおよそ1/100重量のThrombin(アマシャムバイオサイエンス社製)を加え、22℃にて20時間反応させることによりGSTとZen1とを切り離した。その後、Benzamidin Sepharose(アマシャムバイオサイエンス社製)によりThrombinを除去し、リコンビナントZen1を精製した。得られた精製Zen1はSDS−PAGEにおいておよそ60kDaの単一のバンドを呈することを確認した(図9)。
実施例14において精製したリコンビナントZen1をマウス(BALB/c、メス、4週齢)6頭に1週間隔にて5回免疫し、その後これらのマウスから採血して血清を分離し、ELISAにてIgG抗体の反応を解析した。ELISAは、イムノプレート(ナルジェヌンク社製)にリコンビナントZen1 1.0μg及びコナヒョウヒダニ抽出抗原(GREER社製)4.0μgをそれぞれ固相化し、ブロッキング液(10% FBS添加PBSに終濃度0.05%になるようにTween20を加えたもの)にて37℃で1時間ブロッキングした後、マウス血清をブロッキング液にて1000倍に希釈したものを室温で1時間反応させた。イムノプレートを洗浄した後、ブロッキング液にて2000倍希釈したHRP標識したヤギ抗マウスIgGモノクローナル抗(ZYMED社製)を反応させ、イムノプレートを洗浄した後、酵素基質溶液(ABTS液)100μLを各ウエルに添加、37℃10分間反応させた。酵素反応は各ウエルに100μLの0.32%フッ化ナトリウム溶液を添加して停止させた。各ウエルの414nmの吸光度をイムノリーダー(BioRad社)で測定した。本ELISAにてIgGが反応することを確認した上で、Zen1に対するポリクローナル抗体とした。
本ポリクローナル抗体のリコンビナントZen1及びダニ虫体におけるマウスIgGの反応性はウエスタンブロットにおいて解析した。50μg/mLに調整したリコンビナントZen1タンパク液100.0μLとコナヒョウヒダニ抽出抗原液100.0μLにβ−メルカプトエタノールを終濃度50.0μL/mLになるように添加したLaemmliサンプルバッファー(BIO−RAD社製)200μLを加え、100℃で5分間熱処理した後、ゲル濃度5〜20%のポリアクリドアミドゲル(PAGEL;ATTO社製)にアプライし、電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、PVDFメンブラン(Hybond−P;アマシャムバイオサイエンス社製)にトランスファーし、メンブランをブロッキング液(5%スキムミルク添加PBST(PBSに終濃度0.1%になるようにTween20を加えたもの))中で4℃にて一晩放置した。メンブランをPBSTで10分間洗浄したのち、HRP標識したヤギ抗マウスIgGモノクローナル抗体(ZYMED社製)をPBSTで20,000倍希釈しメンブランに添加し室温にて2時間反応させた。PBSTで10分間洗浄を5回行った後、ECL Plusウエスタンブロティング検出システム(アマシャムバイオサイエンス社製)反応液をメンブラン上に添加し5分間室温にて反応させた後、X線フィルム(Hyperfilm ECL;アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてシグナルを検出した。その結果、分子量およそ60kDaのリコンビナントZen1に反応するシグナルと分子量150kDaから250kDaの間に反応する天然型のZen1のシグナルを検出した(図10)。このことにより、実施例13において単離した完全長のZen1 cDNAは、ダニ虫体中の分子量が150kDaから250kDaの間のアレルゲンタンパク質をコードしているということを確認したこととなる。
実施例14において精製したリコンビナントZen1のアレルゲン性の評価をELISAにて実施した。イムノプレート(ナルジェヌンク社製)にリコンビナントZen1 1.0μgを固相化し、ブロッキング液(10% FBS添加PBSに終濃度0.05%になるようにTween20を加えたもの)にて37℃で1時間ブロッキングした後、9頭のコナヒョウヒダニ陽性イヌ血清(コナヒョウヒダニ抗原液(GREER社製)を生理食塩水にて50倍に希釈したものを用いた皮内反応によりコナヒョウヒダニに陽性を呈したイヌ血清)と陰性コントロールイヌ血清を反応させ、ビオチン標識したGST−FcεRIαを加え、さらにペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン(Jackson Immuno Research社製)及び酵素基質溶液(ABTS液)添加による発色反応を行い、酵素反応を各ウエルあたり100μLの0.32%フッ化ナトリウム溶液を添加することにより停止させた。各ウエルの414nmの吸光度をイムノリーダー(BioRad社)で測定した。すなわち、この操作により皮内反応にてダニに陽性と確認されたイヌ9頭及び陰性イヌ(control)の血清中のIgEのリコンビナントZen1に対する反応をリコンビナントイヌFcεRIαを用いたELISA系にて解析した。その結果、陰性イヌの値(点線)を上回る値が確認された。このことにより、リコンビナントZen1がIgEに反応するアレルゲンタンパク質であることを確認した(図11)。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
Claims (26)
- 以下の(a)又は(b)の組換えダニアレルゲン。
(a) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
(b) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン - 以下の(a)又は(b)の組換えダニアレルゲン。
(a) 配列番号35で表わされるアミノ酸配列を含む組換えダニアレルゲン
(b) 配列番号35で表わされるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する組換えダニアレルゲン - コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)由来のダニアレルゲンであって、以下の(i)〜(iv)の特性を有するダニアレルゲン:
(i) SDS-PAGEで測定した場合に150kDa〜200kDaの分子量を有する;
(ii) N末端アミノ酸配列が配列番号19に表される;
(iii) 配列番号4及び10で表される部分アミノ酸配列を有する;及び
(iv) コナヒョウヒダニ抗原に対するIgEに反応する。 - 配列番号35で表わされるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有する、請求項3記載のダニアレルゲン。
- さらに、以下の特性(v)を有する請求項3又は4に記載のダニアレルゲン:
(v) 等電点電気泳動及びSDS-PAGEの2次元電気泳動を行った場合に、分子量が150kDa〜250kDaで、pHが4.5のスポットに検出される。 - 以下の(a)又は(b)のダニアレルゲンをコードする遺伝子。
(a) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
(b) 配列番号2で表わされるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン - 以下の(a)又は(b)のダニアレルゲンをコードする遺伝子。
(a) 配列番号35で表わされるアミノ酸配列を含むダニアレルゲン
(b) 配列番号35で表わされるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつダニアレルゲン活性を有するダニアレルゲン - 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号1で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号1の塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号34で表される塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号34の塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ダニアレルゲン活性を有するタンパク質をコードするDNA - 請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンをコードするDNAを含む遺伝子。
- 請求項8または9に記載の遺伝子によりコードされる、組換えダニアレルゲン。
- 請求項6から10のいずれか1項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項1または2に記載の組換えダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質。
- 請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンと他のタンパク質との融合タンパク質。
- 請求項12記載の発現ベクターで形質転換された細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞。
- 請求項15記載の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
- 請求項15記載の細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合している他のタンパク質を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲンの製造方法。
- 請求項1または2に記載の組換えダニアレルゲンまたは請求項13記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
- 請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンまたは請求項14記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤。
- 請求項1または2に記載の組換えダニアレルゲンまたは請求項13記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
- 請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンまたは請求項14記載の融合タンパク質を有効成分とするダニアレルギー疾患診断薬。
- 請求項1または2に記載の組換えダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
- 請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
- 請求項11に記載の組換えダニアレルゲンに対するモノクローナル抗体。
- 請求項22から24のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を用いる屋内塵中の請求項3から5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
- ELISAである請求項25記載の屋内塵中の請求項3〜5のいずれか1項に記載のダニアレルゲンの免疫学的測定方法。
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