JP4728965B2 - プロテインキナーゼモジュレーターとしての二環ピラゾロ−縮合化合物 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その各々を全ての目的において参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2003年12月17日に出願された米国仮出願第60/530,111号、および2004年8月2日に出願された米国仮出願第60/598,221号の利益を主張する。
哺乳動物プロテインキナーゼは細胞機能の重要なレギュレーターである。プロテインキナーゼ活性における機能障害はいくつかの病気および障害と関連付けられてきたので、プロテインキナーゼは薬物開発の標的である。
チロシンキナーゼ受容体、FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)は、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、および脊髄形成異常のような白血病を含む癌に関連する。AML患者の約1/4〜1/3はFLT3突然変異を有し、これは、キナーゼおよび下流シグナリング経路の構成的活性化に導く。正常なヒトにおいては、FLT3は正常な骨髄系およびリンパ系先祖細胞によって主として発現されるが、FLT3はAMLおよびALLを持つ患者の70〜80%の白血病細胞で発現されている。FLT3を標的とする阻害剤は、突然変異したおよび/または構成的に活性なFLT3を発現する白血病細胞に対して毒性であると報告されている。従って、白血病のような病気および障害を治療するのに用いることができる優れたFLT3阻害剤を開発する要望が存在する。
Abelson非受容体チロシンキナーゼ(c−Abl)は、その基質タンパク質のリン酸化を介してシグナル変換に関与する。該細胞においては、c−Ablは細胞質および核の間を行き来し、その活性は、通常、多数の多様なメカニズムを介して密接に調節される。Ablは成長因子およびインテグリンシグナリング、細胞周期、細胞分化および神経形成、アポトーシス、細胞接着、細胞骨格構造、およびDNA損傷および酸化的ストレスに対する応答の制御に関連付けられてきた。
c−Ablタンパク質はN末端キャップ領域、SH3およびSH2ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、核局所化配列、DNA結合ドメイン、およびアクチン結合ドメインに組織化されたほぼ1150アミノ酸残基を含有する。
慢性骨髄性白血病(CML)は、染色体9および22の間の、フィラデルフィア染色体トランスローケーションに関連付けられる。このトランスローケーションは、bcr遺伝子およびc−Ablをコードする遺伝子の間で異常な融合を発生する。得られたBcr−Abl融合タンパク質は構成的に活性なチロシンキナーゼ活性を有する。上昇したキナーゼ活性は、CMLの一次的原因因子であると報告されており、細胞形質転換、成長因子依存性の喪失、および細胞増殖を担う。
(STI−571、CGP57148、またはGleevecともいわれる)2−フェニルアミノピリミジン化合物イマチニブは、Bcr−Abl、ならびに2つの他のチロシンキナーゼ、c−kitおよび血小板由来成長因子受容体の特異的かつ優れた阻害剤として同定された。イマチニブはこれらのタンパク質のチロシンキナーゼ活性をブロックする。イマチニブは、CMLの全ての段階の治療用の効果的な治療剤であると報告されている。しかしながら、進行した段階または芽細胞危機CMLを持つ患者の大部分は、当該薬物に対する抵抗性の発生のため、継続するイマチニブ療法にもかかわらず再発に悩んでいる。しばしば、この抵抗性に対する分子的基礎はBcr−Ablのキナーゼドメインのイマチニブ抵抗性変種の出現である。最も普通に観察される基礎となるアミノ酸置換はGlu255Lys、Thr315Ile、Tyr293Phe、およびMet351Thrを含む。
METは、N−メチル−N’−ニトロ−ニトロソグアニジンで治療されてきたヒト骨肉腫細胞系においてDNA再構成(TPR−MET)を変換するものとして最初に同定された(Cooper et al.1984)。(肝細胞成長因子受容体、HGFR、METまたはc−Metとしても既知の)MET受容体チロシンキナーゼおよびそのリガンド肝細胞成長因子(「HGF」)は、増殖、生存、分化および形態形成、分岐管形成、細胞運動および侵入性増殖の刺激を含む多数の生物学的活性を有する。病理学的には、METは腎臓癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、および乳癌を含む多くの異なる形態の癌の成長、侵入および転移に関連付けられてきた。METにおける体細胞活性化突然変異はヒト癌腫転移、および乳頭状腎臓細胞癌腫のような散在性癌で見出されてきた。METが転移に対する長い間求められてきた癌遺伝子制御進行の1つであり、従って、非常に興味深い標的であるという証拠が増大しつつある。癌に加えて、METの阻害がリステリア侵入、多発性骨髄腫に関連する骨溶解、マラリア感染、糖尿病性網膜障害、乾癬および関節炎を含む種々の適応症の治療において価値を有することができるという証拠がある。
チロシンキナーゼRONはマクロファージ刺激性タンパク質に対する受容体であり、受容体チロシンキナーゼのMETファミリーに属する。METのように、RONは胃癌および膀胱癌を含むいくつかの異なる形態の癌の成長、侵入および転移に関連付けられる。
キナーゼは癌のような多数の病気および疾患に関連付けられてきたので、治療に用いることができる新しくかつ優れたプロテインキナーゼ阻害剤を開発する要望がある。本発明は当分野におけるこれらおよび他の要望を満たすものである。ある種のプロテインキナーゼは本明細書中で具体的に命名されるが、本発明はこれらのキナーゼの阻害剤に限定されるものではなく、その範囲内には、関連するプロテインキナーゼの阻害剤、および相同タンパク質の阻害剤を含む。
驚くべきことに、二環ピラゾロ化合物を用いてキナーゼ活性を変調し、キナーゼ活性によって媒介される病気を治療することができることが判明した。これらの新規な二環ピラゾロキナーゼモジュレーターは後に詳細に記載する。加えて、選択された化合物の阻害活性は本明細書中に開示する。
1つの態様において、本発明は式:
Figure 0004728965
を有する二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを提供する。
式(I)において、Xは−S−、−O−、または−N(R10)−である。R10は水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
1は−C(Z)−、または−SO2−である。Zは=O、=S、または=NR11である。R11は水素、−OH、シアノ、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
1は水素、−CF3、アミノ、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR12、または−NR1314である。R12、R13、およびR14は、独立して、水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択される。
2は置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリールまたは置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
もう1つの態様において、本発明は、本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを用いてプロテインキナーゼ活性を変調する方法を提供する。該方法はプロテインキナーゼを二環ピラゾロキナーゼモジュレーターと接触させることを含む。
もう1つの態様において、本発明は生物においてキナーゼ活性によって媒介される病気を治療する方法を提供する。該方法は治療上有効量の本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを患者に投与することを含む。
もう1つの態様において、本発明は、医薬上許容される賦形剤と混合した二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
定義
本明細書中で用いる略語は、化学および生物学分野におけるその従来の意味を有する。
置換基が左側から右側に書かれたその従来の化学式によって特定される場合、それらは、右側から左側に構造を書く結果として化学的に同一の置換基を等しく含む、例えば、−CH2O−は−OCH2−と等しい。
用語「アルキル」は、それ自体、またはもう1つの置換基の一部として、特に断りのない限り、直鎖(すなわち、非分岐)または分岐鎖、または環状炭化水素基、またはその組合せを意味し、これは、十分に飽和されたモノまたはポリ不飽和であってよく、示した炭素原子の数を有するジ−および多価基を含むことができる(すなわち、C1−C10は1〜10の炭素を意味する)。飽和炭化水素基の例は、限定されるものではないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、t−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、シクロヘキシル(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えば、n−ペンチル、n−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチルなどのホモログおよび異性体のような基を含む。不飽和アルキル基は1以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、限定されるものではないが、ビニル、2−プロペニル、クロチル、2−イソペンテニル、2−(ブタジエニル)、2,4−ペンタジエニル、3−(1,4−ペンタジエニル)、エチニル、1−および3−プロピニル、3−ブチニル、およびより高級のホモログおよび異性体を含む。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」といわれる。
用語「アルキレン」は、それ自体、またはもう1つの置換基の一部として、限定されるものではないが、−CH2CH2CH2CH2−によって例示されるアルキルに由来する二価基を意味する。典型的には、アルキル(またはアルキレン)基は1〜24の炭素原子を有し、10以下の炭素原子を有する基が本発明で好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に、8以下の炭素原子を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体、またはもう1つの用語と組み合わせて、特に断りのない限り、少なくとも1つの炭素原子、およびO、N、P、SiおよびSからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子よりなる安定な直鎖または分岐鎖、もしくは環状炭化水素基、またはその組合せを意味し、ここに、窒素および硫黄原子は任意で酸化されていてもよく、窒素へテロ原子は任意で第四級化されていてもよい。ヘテロ原子O、N、PおよびSおよびSiはヘテロアルキル基のいずれかの内部位置、またはアルキル基が分子の残りに結合した位置に位置することができる。その例は、限定されるものでないが、−CH2−CH2−O−CH3、−CH2−CH2−NH−CH3、−CH2−CH2−N(CH3)−CH3、−CH2−S−CH2−CH3、−CH2−CH2、−S(O)−CH3、−CH2−CH2−S(O)2−CH3、−CH=CH−O−CH3、−Si(CH33、−CH2−CH=N−OCH3、−CH=CH−N(CH3)−CH3、O−CH3、−O−CH2−CH3、および−CNを含む。2つまでのヘテロ原子は、例えば、−CH2−NH−OCH3および−CH2−O−Si(CH33のように連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体、またはもう1つの置換基の一部として、限定されるものではないが、−CH2−CH2−S−CH2−CH2−および−CH2−S−CH2−CH2−NH−CH2−によって例示される、ヘテロアルキルに由来する二価基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子は鎖末端のいずれかまたは双方を占有することもできる(例えば、アルキレンオキソ、アルキレンジオキソ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど)。なおさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基では、連結基の向きは、連結基の式を書いた方向によって示されない。例えば、式−C(O)OR’ −は−C(O)OR’−および−R’OC(O)−を共に表す。前記したように、本明細書中で用いるヘテロアルキル基は、−C(O)R’、−C(O)NR’、−NR’R”、−OR’、−SR’、および/または−SO2R’のようなヘテロ原子を介して分子の残りに結合した基を含む。「ヘテロアルキル」が引用され、続いて、−NR’R”などのように特異的へテロアルキル基が引用される場合、用語へテロアルキルおよび−NR’R”は冗長または相互に排除するものではないことは理解されよう。むしろ、特異的へテロアルキル基が引用されて、明瞭性を加える。従って、用語「ヘテロアルキル」は、−NR’R”などのように、具体的へテロアルキル基を排除するとここで解釈されるべきではない。
本明細書中で用いるように、「アルキルエステリル」とは、式R’−C(O)O−R”を有する部分をいい、R’はアルキレン部分であって、R”はアルキル部分である。
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体、または他の用語と組み合わせて、特に断りのない限り、各々、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。加えて、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は該複素環が分子の残りに結合した位置を占めることができる。シクロアルキルの例は、限定されるものではないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、1−シクロヘキセニル、3−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを含む。ヘテロシクロアルキルの例は、限定されるものではないが、1−(1,2,5,6−テトラヒドロピリジル)、1−ピペリジニル、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−モルホリニル、3−モルホリニル、テトラヒドロフラン−2−イル、テトラヒドロフラン−3−イル、テトラヒドロチエン−2−イル、テトラヒドロチエン−3−イル、1−ピペラジニル、2−ピペラジニルなどを含む。用語「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」とは、各々、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルの二価誘導体をいう。
用語「シクロアルキルアルキル」とは、置換されていないアルキレン基を介して分子の残りに結合した3〜7員シクロアルキル基をいう。炭素原子の具体的数の引用(例えば、C1−C10シクロアルキルアルキル)は、アルキレン基中の炭素原子の数をいう。
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それ自体、またはもう1つの置換基の一部として、特に断りのない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」のような用語はモノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ(C1−C4)アルキル」は、限定されるものではないが、トリフルオロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、4−クロロブチル、3−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
用語「アリール」は、特に断りのない限り、単一の環、あるいは一緒に縮合し、または共有結合により連結した複数環(好ましくは1〜3の環)であり得るポリ不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」とは、N、OおよびSから選択される1〜4のヘテロ原子を含有するアリール基(または環)をいい、窒素および硫黄原子は任意で酸化されていてもよく、窒素原子は任意で第四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的例はフェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、4−ビフェニル、1−ピロリル、2−ピロリル、3−ピロリル、3−ピラゾリル、2−イミダゾリル、4−イミダゾリル、ピラジニル、2−オキサゾリル、4−オキサゾリル、2−フェニル−4−オキサゾリル、5−オキサゾリル、3−イソオキサゾリル、4−イソオキサゾリル、5−イソオキサゾリル、2−チアゾリル、4−チアゾリル、5−チアゾリル、2−フリル、3−フリル、2−チエニル、3−チエニル、2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−ピリミジル、4−ピリミジル、5−ベンゾチアゾリル、プリニル、2−ベンズイミダゾリル、5−インドリル、1−イソキノリル、5−イソキノリル、2−キノキサリニル、5−キノキサリニル、3−キノリル、および6−キノリルを含む。前記したアリールおよびヘテロアリール環系の各々についての置換基は後記した許容される置換基の群から選択される。用語「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」とは、各々、アリールおよびヘテロアリールの二価誘導体をいう。
簡潔にするために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いる場合(例えば、アリールオキソ、アリールチオキソ、アリールアルキル)、前記定義のアリールおよびヘテロアリール環を共に含む。従って、用語「アリールアルキル」は、炭素原子(例えば、メチレン基)が、例えば、酸素原子で置き換えられたアルキル基(例えば、フェノキシメチル、2−ピリジルオキシメチル、3−(1−ナフチルオキシ)プロピルなど)アルキル基を含めた、アリール基がアルキル基に結合した基(例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)を含むことを意味する。しかしながら、用語「ハロアリール」は、本明細書中で用いるように、1以上のハロゲンで置換されたアリールのみをカバーすることを意味する。
本明細書中で用いるように、用語「オキソ」は、炭素原子に二重結合した酸素を意味する。
前記用語(例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、および「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、ならびにそれらの二価基誘導体)の各々は、示された基の置換されたおよび置換されていない双方の形態を含むことを意図する。基の各タイプについての好ましい置換基は後に提供する。
(しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルといわれる基を含む)アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルの一価および二価誘導体基のための置換基は、限定されるものではないが、0〜(2m’+1)(式中、m’は基中の炭素原子の合計数である)の数の範囲の、−OR’、=O、=NR’、=N−OR’、−NR’R”、−SR’、−ハロゲン、−SiR’R”R”’、−OC(O)R’、−C(O)R’、−CO2R’、−C(O)NR’R”、−OC(O)NR’R”、−NR”C(O)R’、−NR’−C(O)NR”R”’、−NR”C(O)OR’、−NR−C(NR’R”)=NR”’、−S(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)2NR’R”、−NRSO2R’、−CNおよび−NO2から選択される種々の基の1以上であり得る。R’、R”、R”’およびR””は、各々、好ましくは独立して、水素、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール(例えば、1〜3のハロゲンで置換されたアリール)、置換されたまたは置換されていないアルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基をいう。本発明の化合物が1を超えるR基を含む場合、例えば1を超える基が存在する場合の各R’、R”、R”’およびR””基のように、R基の各々は、独立して選択される。R’およびR”が同一の窒素原子に結合する場合、それらは窒素原子と組み合わされて、4−、5−、6−または7−員の環を形成することができる。例えば、−NR’R”は、限定されるものではないが、1−ピロリジニルおよび4−モルホリニルを含むことを意味する。置換基の前記定義から、当業者であれば、用語「アルキル」は、ハロアルキル(例えば、−CF3および−CH2CF3)およびアシル(例えば、−C(O)CH3、−C(O)CF3、−C(O)CH2OCH3など)のような、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。
前記したアルキル基につき記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基(ならびにそれらの二価誘導体)についての例示的置換基は変化し、例えば、−0から、芳香族環基上の開いた原子化の合計数の数の範囲の、ハロゲン、−OR’、−NR’R”、−SR’、−ハロゲン、−SiR’R”R”’、−OC(O)R’、−C(O)R’、−CO2R’、−C(O)NR’R”、−OC(O)NR’R”、−NR”C(O)R’、−NR’−C(O)NR”R”’、−NR”C(O)OR’、−NR−C(NR’R”R”’)=NR””、−NR−C(NR’R”)=NR”’、−S(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)2NR’R”、−NRSO2R’、−CNおよび−NO2、−R’、−N3、−CH(Ph)2、フルオロ(C1−C4)アルコキソ、およびフルオロ(C1−C4)アルキルから選択され;R’、R”、R”’およびR””は、好ましくは、独立して、水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、および置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が1を超えるR基を含む場合、例えば、1を超えるこれらの基が存在する場合の各R’、R”、R”’およびR””基のように、R基の各々は独立して選択される。
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2つは、任意で、式−T−C(O)−(CRR’)q−U−の環を形成してもよく、TおよびUは独立して−NR−、−O−、−CRR’−または単結合であり、およびqは0〜3の整数である。別法として、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2つは、任意で、式−A−(CH2r−B−の置換基で置換されていてもよく、AおよびBは、独立して、−CRR’、−O−、−NR−、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、−S(O)2NR’−または単結合であり、およびrは1〜4の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合の1つは、任意で、二重結合で置き換えられていてもよい。別法として、アリールまたはヘテロアリール環を隣接する原子上の置換基の2つは、任意で、式−(CRR’)s−X’−(C”R”’)d−の置換基で置換されていてもよく、sおよびdは、独立して、0〜3の整数であり、およびX’は−O−、−NR’、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、または−S(O)2NR’−である。置換基R、R’、R”およびR”’は、好ましくは独立して、水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、および置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択される。
本明細書中で用いるように、用語「ヘテロ原子」または「環へテロ原子」は酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)、リン(P)、およびケイ素(Si)を含むことを意味する。
本発明の化合物は塩として存在することができる。本発明はそのような塩を含む。適用可能な塩の形態の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩(例えば、(+)−酒石酸塩、(−)−酒石酸塩、またはラセミ混合物を含むその混合物)、コハク酸塩、安息酸塩、およびグルタミン酸のようなアミノ酸との塩を含む。これらの塩は当業者に既知の方法によって調製することができる。また、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様な塩のような塩基付加塩も含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、純物または適当な不活性溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。許容される酸付加塩の例は塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸モノ水素、リン酸、リン酸モノ水素、リン酸ジ水素、硫酸、硫酸モノ水素、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタルスルホン酸などのような有機酸に由来する塩を含む。また、アルギン酸塩などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる。本発明のある種の具体的化合物は、化合物を塩基または酸付加塩いずれかに変換するのを可能とする塩基性および酸性官能基を共に含有する。
化合物の中性形態は、好ましくは、慣用的手法で、塩を塩基または酸と接触させ、次いで、親化合物を単離することによって再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解性のようなある種の物理的特性において種々の塩形態とは異なる。
本発明のある種の化合物は、溶媒和していない形態、ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は溶媒和していない形態と同等であり、本発明の範囲内に含まれる。本発明のある種の化合物は複数結晶またはアモルファス形態で存在することができる。一般に、全ての物理的形態は本発明によって考えられる使用で同等であり、本発明の範囲内にあることを意図する。
本発明のある種の化合物は不斉炭素原子(光学中心)または二重結合を保有する;アミノ酸に対する(R)−または(S)−として、(D)−または(L)−として絶対立体化学の点で定義することができるエナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体形態、および個々の異性体は本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物は、あまりにも合成するのに、および/または単離するのに不安定であることが当分野で公知のものは含まない。本発明は、ラセミおよび光学的に純粋な形態の化合物を含むことを意味する。光学的に活性な(R)−および(S)−、または(D)−および(L)−異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を用いて調製することができるか、あるいは慣用的技術を用いて分解することができる。本明細書中に記載される化合物がオレフィン結合、または幾何不斉の他の中心を含有する場合、特に断りのない限り、当該化合物はEおよびZ幾何異性体を含むことを意図する。
本明細書中で用いるように、用語「互変異性体」とは、平衡で存在し、かつ容易に1つの異性体形態からもう1つの異性体形態に変換される2以上の構造異性体の1つをいう。
本発明のある種の化合物は互変異性体形態で存在することができることが当業者に明らかであり、化合物の全てのそのような互変異性体の形態は本発明の範囲内にある。
特に断りのない限り、本明細書中に記載された構造は、当該構造の全ての立体化学形態;すなわち、各不斉中心についてのRおよびS立体配置を含めることも意図する。従って、本発明の化合物の単一立体化学異性体、ならびにエナンチオマーおよびジアステレオマー混合物は本発明の範囲内のものである。
特に断りのない限り、本明細書中に示される構造は、1以上の同位体が豊富化された原子の存在においてのみ異なる化合物を含むことを意味する。例えば、ジュウテリウムまたはトリチウムによる水素の置換、または13C−または14C−豊富化炭素による炭素の置換を除いて、本構造を有する化合物は本発明の範囲内のものである。
また、本発明の化合物は、そのような化合物を構成する1以上の原子における天然ではない割合の原子同位体も含有することができる。例えば、化合物は、例えば、トリチウム(3H)、ヨウ素−125(125I)または炭素−14(14C)のような放射性同位体で放射標識することができる。本発明の化合物の全ての同位体変種は、放射性であるか否かにかかわらず、本発明の範囲内に含まれる。
用語「医薬上許容される塩」は、本明細書に記載される化合物で見出される特定の置換基部分に応じて、比較的非毒性酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、塩基付加塩は、そのような化合物の中性形態を、純物または適当な不活性の溶媒中の十分な量の所望の塩基と接触させることによって得ることができる。医薬上許容される塩基付加塩の例はナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩を含む。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、酸付加塩は、そのような化合物の中性形態を、純物または適当な不活性な溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。医薬上許容される酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸モノ水素、リン酸、リン酸モノ水素、リン酸ジ水素、硫酸、硫酸モノ水素、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的非毒性有機酸に由来する塩を含む。また、アルギン酸塩などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる(例えば、Berge et al.,「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1−19参照)。本発明のある種の具体的化合物は、化合物を塩基または酸付加塩いずれかに変換するのを可能とする塩基性および酸性官能基を共に含有する。
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書中に記載された化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学的変化を受けて、本発明の化合物を提供する化合物である。加えて、プロドラッグは、化学的または生化学的方法によってエクスビボ環境において本発明の化合物に変換することができる。例えば、適当な酵素または化学的試薬と共に経皮パッチ貯蔵器に入れた場合に、プロドラッグは本発明の化合物にゆっくりと変換することができる。
用語「ある」は、本明細書中において置換基の群を参照する場合に用いる場合、少なくとも1つを意味する。例えば、化合物を「ある」アルキルまたはアリールで置換する場合、当該化合物は任意で少なくとも1つのアルキルおよび/または少なくとも1つのアリールで置換される。さらに、部分がR置換基で置換されている場合、該基は「R−置換基」ということができる。部分がR−置換されている場合、該部分は少なくとも1つのR置換基で置換されており、各R置換基は任意で異なっている。
本発明の化合物の記載は、当業者に公知の化学結合の原理によって制限される。従って、基が1以上の数の置換基によって置換できる場合、そのような置換基は、化学結合の原理に適合し、固有に不安定ではなく、および/または水性、中性、生理学的条件のような雰囲気条件下で不安定であるらしいことが当業者に公知の化合物を与えるように選択される。
特定の病気を参照する場合の用語「治療する」または「治療」は、病気の予防を含む。
I.二環ピラゾロキナーゼモジュレーター
1つの態様において、本発明は式:
Figure 0004728965
を有する二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを提供する。
式(I)においては、Xは−S−、−O−、または−N(R10)−である。R10は水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
1は−C(Z)−、または−SO2−である。Zは=O、=S、または=NR11である。R11は水素、−OH、シアノ、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
1は水素、−CF3、アミノ、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR12、または−NR1314である。R12、R13、およびR14は、独立して、水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択される。R13およびR14が連結して、それらが結合する窒素とで環を形成してよく、該環は置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
2は置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
いくつかの実施形態において、R2は炭素原子を介して当該分子の残りに結合して、炭素−炭素結合を形成する。
他の実施形態において、R2が置換されていないフェニルであり、XがSであり、L1が−C(Z)−であって、Zが=Oであれば、R1は置換されていないフェニルである。もう1つの実施形態において、R2が置換されていないアリールであり、XがSであり、L1が−C(Z)−であって、Zが=Oであれば、R1は置換されていないアリールではない。他の実施形態において、R2が置換されたまたは置換されていないフェニルであり、XがSであり、L1が−C(Z)−であって、Zが=Oであれば、R1は置換されたまたは置換されていないフェニルではない。もう1つの実施形態において、R2およびR1は同時には置換されていないフェニルではない。もう1つの実施形態において、R2およびR1は同時には置換されていないアリールではない。もう1つの実施形態において、R2およびR1は同時には置換されたまたは置換されていないフェニルではない。
例示的な実施形態において、Xは−S−である。関連する実施形態において、Zは=Oである。
2は置換されたまたは置換されていないC1−C20アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜20員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C8シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜8員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり得る。また、R2は置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり得る。
いくつかの実施形態において、R2は(1)置換されていないC1−C10アルキル;(2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;(3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;(4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;(5)置換されていないアリール;(6)置換されていないヘテロアリール;(7)置換されたC1−C10アルキル;(8)置換された2〜10員へテロアルキル;(9)置換されたC3−C7シクロアルキル;(10)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;(11)置換されたアリール;または(12)置換されたヘテロアリールである。関連する実施形態において、(7)、(8)、(9)または(10)(すなわち、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L22−C(O)R3、−L22−OR4、−L22−NR45、OR4、または−L22−S(O)m6で置換されている。もう1つの関連する実施形態において、R2が(11)または(12)(すなわち、アリールまたはヘテロアリール)である場合は、(11)または(12)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L22−C(O)R3、−L22−OR4、−L22−NR45、または−L22−S(O)m6で置換されている。
いくつかの実施形態において、(11)または(12)がR21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキルで置換されている場合、該ヘテロシクロアルキルはジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである。他の実施形態において、(11)または(12)がR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールで置換されている場合、該ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、またはチエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである。
3は水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR31、または−NR3233である。R31、R32、およびR33は、独立して、水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
4およびR5は、独立して、水素、−CF3、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、または−C(O)R4である。R41は水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
6は水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
22は結合、置換されていないC1−C10アルキレンまたは置換されていないヘテロアルキレンである。記号mは整数0、1または2を表す。
21はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、アミノ、ハロゲン、R23−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R24−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR24−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。R22は−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、R23−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R24−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR24−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
いくつかの実施形態において、R21またはR22が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルであれば、該ヘテロシクロアルキルはヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである。
他の実施形態において、R21またはR22が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであれば、該ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである。
23はオキソ、−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。R24は−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、置換されていないヘテロアリールである。
いくつかの実施形態において、R2は置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。他の実施形態において、R2は置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアルキル、または置換されたまたは置換されていないヘテロアルキルである。
2が置換されている場合(例えば、置換されたアリールまたはヘテロアリール)、置換基(本明細書ではR2置換基ともいわれる)は、(1)置換されていないC1−C10アルキル;(2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;(3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;(4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;(5)置換されていないアリール;(6)置換されていないヘテロアリール;(7)ハロゲン;(8)−OH;(9)アミノ;(10)−CF3;(11)置換されていないC1−C10アルキルで置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;または(12)置換されていないアリールで置換されたC1−C10アルキルであり得る。いくつかの関連する実施形態において、R2は置換されたアリールまたは置換されたヘテロアリールである。
もう1つの実施形態において、R2置換基は(1)ハロゲン;(2)−L22−C(O)R3;(3)−L22−OR4;(4)−L22−NR45;または(5)−L22−S(O)m6である。R3は水素、置換されていないC1−C10アルキル、−OR31、または−NR3233であり得る。R31、R32およびR33は、独立して、水素、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていないC3−C7シクロアルキルであり得る。L22は置換されていないC1−C10アルキレンであり得る。R4は水素、−CF3、−CHF2、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていないC1−C10シクロアルキルアルキル、または−C(O)R41であり得る。R41は水素、または置換されていないC1−C10アルキルであり得る。R4およびR5は、独立して、水素、置換されていないC1−C10アルキル、または−C(O)R41であり得る。R41は、独立して、水素、または置換されていないC1−C10アルキルであり得るか、あるいはR7は水素または置換されていないC1−C10アルキルであり得る。
いくつかの実施形態において、R2が置換されたまたは置換されていないアリールである場合、該アリールはフェニル、ベンズ[cd]インドール−2(1H)−オン−イル、オキシインドリル、インダゾリノニル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、ベンゾジオキサニル、クマリニル、クロモニル、ベンゾピラジル、ナフチル、キノリル、またはイソキノリルである。
他の実施形態において、R2が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである場合、該ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、ピリダジニル、ヒアダントイン、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、チアジアゾリルである。
ある実施形態において、R2が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルである場合、該ヘテロシクロアルキルはヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである。
1は水素、アミノ、置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり得る。
例示的実施形態において、R1は(1)−CF3;(2)置換されていないC1−C10アルキル;(3)置換されていない2〜10員へテロアルキル;(4)置換されていないC3−C7シクロアルキル;(5)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;(6)置換されていないアリール;(7)置換されていないヘテロアリール;(8)置換されたC1−C10アルキル;(9)置換された2〜10員へテロアルキル;(10)置換されたC3−C7シクロアルキル;(11)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;(12)置換されたアリール;または(13)置換されたヘテロアリールである。関連する実施形態において、(8)、(9)、(10)または(11)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L11−C(O)R100、−L11−OR104、−L11−NR104105、または−L11−S(O)q−R107で置換されている。もう1つの関連する実施形態において、(12)または(13)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L11−C(O)R100、−L11−OR104、−L11−NR104105、または−L11−S(O)q−R107で置換されている。
100は水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR101、または−NR102103である。R101、R102、およびR103は、独立して、水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
104およびR105は、独立して、水素、−CF3、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員ヘテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、または−C(O)R106である。R106は、独立して、水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
107は水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
11は結合、置換されていないC1−C10アルキレンまたは置換されていないヘテロアルキレンである。記号qは整数0、1または2を表す。
15はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、R17−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R17−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR18−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。R16は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、R17−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R17−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR18−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである。
17はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。R18は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。
いくつかの実施形態において、R15はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員へテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。他の実施形態において、R16は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。
ある実施形態において、R15またはR16が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルである場合、該ヘテロシクロアルキルはヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである。
他の実施形態において、R15またはR16が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである場合、該ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、またはチエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである。
1は、(1)置換されていないC1−C10アルキル;(2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;(3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;(4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;(5)置換されたC1−C10アルキル;(6)置換された2〜10員へテロアルキル;(7)置換されたC3−C7シクロアルキル;(8)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;(9)置換されたフェニル;または(10)置換されたヘテロアリールである。いくつかの関連する実施形態において、(5)、(6)、(7)、または(8)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、またはR15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されている。他の関連する実施形態において、(9)または(10)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、またはR15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されている。
15はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルであり得る。
例示的な実施形態において、R1は(1)置換されていないC1−C10アルキル;(2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;(3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;(4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;(5)オキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員へテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールで置換されたC1−C10アルキル;(6)オキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員へテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールで置換された2〜10員へテロアルキル;(7)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたC3−C7シクロアルキル;(8)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;(9)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたフェニル;または(10)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたヘテロアリールである。
もう1つの例示的な実施形態において、R1が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである場合、該ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである。
いくつかの実施形態において、R1が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルである場合、該ヘテロシクロアルキルはヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである。
いくつかの実施形態において、R1が置換されている場合、置換基(本明細書ではR1置換基ともいう)は(1)ハロゲン;(2)−L11−C(O)R100;(3)−L11−OR104;(4)−L11−NR104105;または(5)−L11−S(O)q107である。関連する実施形態において、R15はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールであり、R16は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである。
II.例示的合成
本発明の化合物は、一般的に周知の合成方法の適当な組合せによって合成される。本発明の化合物を合成するのに有用な技術は容易に明らかであり、かつ関連分野の当業者が利用でき、参照して全ての目的でその全体を組み込む、Elnagdi,et al.,J.Heterocyclic Chem.,16:61−64(1979),Pawar,et al.,Indian J.Chem.,28B:866−867(1989),Chande,et al.,Indian J.Chem.,35B:373−376(1996)、および以下の特許DE2429195(1974)、US6566363(2003)に開示された技術を含む。以下の議論は、本発明の化合物の組立に用いる際に利用可能な多様な方法のあるものを説明するために掲げる。しかしながら、該議論は、本発明の化合物を調製する際に有用な反応または反応順序の範囲を定義する意図ではない。本発明の化合物は、以下の実施例セクションに開示された手法および技術によって、ならびに公知の有機合成技術によって製造することができる。
以下の例示的合成において、記号X、R10、L1、R1、R2、R11、R13およびR14は、特記しない限り、「二環ピラゾロキナーゼモジュレーター」と題されたセクションにおいて上に定義されたものである。
一般的スキームI
Figure 0004728965
一般的スキームIの工程Aにおいて、必要なハロゲン化中間体(b)、または環化中間体(d)または(m)の合成は、−10℃〜100℃の範囲の温度にて、酢酸、DMF、エーテル性溶媒、またはハロゲン化炭化水素のような適当な溶媒中で、塩素、臭素またはヨウ素、あるいはIC1、N−クロロスクシンイミド、N−ブロモスクシンイミド、N−ヨードスクシンイミド、あるいは三臭化ベンジルトリメチルアンモニウムのような三臭化物源のような適当なハロゲン含有試薬のような適当なハロゲン化試薬と、各々、誘導体(a)、(c)または(k)とを反応させることによって達成される。
工程Bは、ハロゲン化種(b)を、ベンゾイルイソチオシアネートまたはフラン−2−カルボニルイソチオシアネートのようなアシルイソチオシアネート試薬と反応させ、任意で、20℃〜180℃の範囲の温度にて、エーテル性溶媒、DMF、ピリジンまたはDMSOのような適当な溶媒中で、Lawessonの試薬のような硫黄求核試薬の源でさらに処理することによって目的生成物への環化を例示する。
工程Cにおいて、必要なチオ尿素(c)または尿素(e)の合成は、誘導体(a)をチオホスゲンまたはチオカルボニルジイミダゾールのようなチオカルボニル試薬、またはホスゲン、チオホスゲンまたはカルボニルジイミダゾールのようなカルボニル試薬と反応させ、続いて、−30℃〜50℃の範囲の温度にて、ハロゲン化炭化水素、エーテル性溶媒、THF、DMF、およびその水混合物のような適当な溶媒中で、アンモニア、または水酸化アンモニウムのようなアンモニウム源で処理することによって行われる。
工程Dは、20℃〜200℃の範囲の温度にて、エーテル性溶媒、DMF、DMSOのような適当な溶媒中で、任意でNH部位で保護された中間体(d)を、酸塩化物、イソシアネート、イソチオシアネート、塩化スルホニル、塩化イミドイル、イミドエートエステルまたはイソチオ尿素のような適当な求電子試薬と反応させ、続いて、0℃〜100℃の範囲の温度にて、アルコール、エーテル性溶媒、DMF、およびその水混合物のような適当な溶媒中で、水酸化ナトリウムまたはトリエチルアミンのような塩基で塩基性加水分解することによって、一般式(I)の目的生成物の合成を例示する。
工程Eにおいて、必要な硝酸化中間体(f)の合成は、−78℃〜50℃の範囲の温度にて、水、酢酸、ハロゲン化炭化水素のような適当な溶媒中、硫酸またはルイス酸触媒の存在下または非存在下にて、誘導体(e)を硝酸、ニトロニウム塩、硝酸エチルまたは二酸化窒素のような適当な硝酸化試薬と反応させることによって達成される。
工程Fは、20℃〜200℃の範囲の温度にて、水、アルコール、DMF、またはエーテル性溶媒のような適当な溶媒中、パラジウムまたはHClのような触媒の存在下または非存在下にて、誘導体(f)を水素ガス、亜鉛、鉄、塩化スズ、または硫化ナトリウムのような適当な還元剤と反応させることによって、必要な中間体(g)の例示的合成を示す。
工程Gにおいて、必要なジアゾニウム中間体(h)、またはニトロソ中間体(j)の合成は、−78℃〜50℃の範囲の温度にて、水、またはアルコールのような有機溶媒との混合物、エーテル性溶媒、またはDMFのような適当な溶媒中、各々、誘導体(g)または(i)を亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸イソアミルのような酸性媒体中の適当な亜硝酸試薬と反応させることによって達成される。
工程Hは、20℃〜100℃の範囲の温度にて、アルコール、エーテル性溶媒、ハロゲン化炭化水素、またはDMFのような適当な溶媒中、誘導体(h)に250W水銀ランプのような適当な光源を照射することによる必要な環化中間体(d)の合成を例示する。
工程Iは、50℃〜180℃の範囲の温度にて、ピリジンのような適当な溶媒中で誘導体(j)を加熱することによる必要な環化中間体(k)の合成を示す。
工程Jにおいて、必要な中間体(d)の合成は、20℃〜180℃の範囲の温度にて、ハロゲン化炭化水素、アルコール、エーテル性溶媒、またはDMFのような適当な溶媒中、誘導体(m)をアンモニア、または水酸化アンモニウムのようなアンモニウム源と反応させることによって行われる。
前記した一般的スキームIに加えて、以下の例示的スキームは、本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを合成する方法をさらに説明するために掲げる。
Figure 0004728965
スキーム1において、メチルエステル(a)を低温でリチウム化アセトニトリルと反応させて、プロピオニトリル(b)を得る。次いで、化合物(b)をヒドラジンで処理して、アミノピラゾール(c)を得る。
Figure 0004728965
スキーム2においては、商業的に入手可能であるか、あるいはスキーム1に記載したように合成により調製したアミノピラゾール(a)を酢酸中の臭素の溶液で臭素化する。次いで、臭素化ピラゾール(b)をベンゾイルイソチオシアネートまたはフラン−2−カルボニルイソチオシアネートのようなアシルイソチオシアネートで処理して、(1)を得る。環化反応は、熱条件下でジオキサンにて、またはマイクロ波条件下でピリジンにて達成される。
Figure 0004728965
代替方法において、スキーム3に示すように、ジオキサン/水混合液中にて、酸化マグネシウムおよび炭酸水素ナトリウムの存在下でアミノピラゾール(a)をチオホスゲンで処理し、続いて、水酸化アンモニウムで処理して、モノ置換チオ尿素(b)を得る。酢酸中の臭素での(b)の引き続いての処理により環化生成物(c)が得られる。化合物(c)を還流温度にて過剰の塩化アシルと反応させ、続いて、水酸化ナトリウム(またはTHF/H2O中のEt3Nのような他の塩基性加水分解条件)で処理して、Lawesson試薬の処理の後に(la)または(lb)を得る。
Figure 0004728965
スキーム4においては、ピラゾロチアゾールアミン(a)を塩化ベンゾイルでベンズアミドとして保護して、(b)が得られる。イソシアネート、イソチオシアネート、または塩化スルホニル試薬での引き続いての処理、その後の、水酸化ナトリウムでの塩基性加水分解により(lc)が得られる。同様に、保護されたピラゾロチアゾールアミン(b)を塩化イミドイル(またはイミドエートエステル同等体)またはメチルイソチオ尿素のような試薬と反応させて、(ld)が得られる。
本発明の化合物は化学合成の分野で一般的に既知の1以上の保護基を用いて合成することができる。用語「保護基」とは、化合物のいくらかまたは全ての反応性部分をブロックし、保護基が除去されるまで化学反応にそのような部分が参画するのを妨ぐ化学部分をいい、例えば、Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd ed. John Wiley & Sons(1999)に列挙され記載されている部位をいう。異なる保護基が使用される場合、各(異なる)保護基は異なる手段によって除去できるのが有利であろう。全く別々の異なる反応条件下で切断される保護基は、そのような保護基の異なる除去を可能とする。例えば、保護基は酸、塩基および水素添加分解によって除去することができる。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびt−ブチルジメチルシリルのような基は酸不安定であって、それを用いて、水素添加分解によって除去できるCbz基、および塩基不安定性であるFmoc基で保護されたアミノ基の存在下でカルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護することができる。カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分は、カルバミン酸t−ブチルのような酸不安定基で、または酸および塩基双方に対して安定であるが、加水分解的に除去できるカルバメートでブロックされたアミンの存在下で、限定されるものではないが、メチル、エチルおよびアセチルのような塩基不安定基でブロックすることができる。
また、カルボン酸およびヒドロキシ反応性部分はベンジル基のような加水分解的保護基でブロックすることもでき、他方、酸と水素結合することができるアミン基はFmocのような塩基不安定性基でブロックすることができる。カルボン酸反応性部分は2,4−ジメトキシベンジルのような酸化的に除去可能な保護基でブロックすることができ、他方、共存するアミノ基はフッ化物不安定性カルバミン酸シリルでブロックすることができる。
アリルブロッキング基は酸−および塩基保護基の存在下で有用である。というのは、前者は安定であって、金属またはpi−酸触媒によって引き続いて除去できるからである。例えば、アリルでブロックしたカルボン酸は、酸不安定性カルバミン酸t−ブチルまたは塩基−不安定性アセテートアミン保護基の存在下でパラジウム(0)触媒反応で脱保護することができる。保護基のなおもう1つの形態は、化合物または中間体に結合させることができる樹脂である。残基が該樹脂に結合する限り、その官能基はブロックされ、反応することができない。一旦該樹脂から放出されると、官能基は反応するのに利用できる。
典型的なブロッキングまたは保護基は例えば:
Figure 0004728965
を含む。
III.キナーゼを阻害する方法
もう1つの態様において、本発明は、本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを用いてプロテインキナーゼ活性を変調する方法を提供する。本明細書中で用いる用語「キナーゼ活性を変調する」は、プロテインキナーゼの活性が、本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターと接触した場合に、二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの非存在下での活性に対して増大しまたは減少することを意味する。従って、本発明は、プロテインキナーゼを本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターと接触させることによってプロテインキナーゼ活性を変調する方法を提供する。
例示的な実施形態において、二環ピラゾロキナーゼモジュレーターはキナーゼ活性を阻害する。キナーゼ活性への言及で本明細書中で用いる用語「阻害する」は、キナーゼ活性が、二環ピラゾロキナーゼモジュレーターと接触させた場合に、二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの非存在下における活性に対して減少することを意味する。従って、本発明は、さらに、プロテインキナーゼを本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターと接触させることによってプロテインキナーゼ活性を阻害する方法を提供する。
ある実施形態において、プロテインキナーゼはタンパク質チロシンキナーゼである。本明細書中で用いるように、タンパク質チロシンキナーゼとは、リン酸ドナー(例えば、ATPのようなヌクレオチドリン酸ドナー)でタンパク質中のチロシン残基のリン酸化を触媒する酵素をいう。タンパク質チロシンキナーゼは、例えば、Abelsonチロシンキナーゼ(「Abl」)(例えば、c−Ablおよびv−Abl)、Ron受容体チロシンキナーゼ(「RON」)、Met受容体チロシンキナーゼ(「MET」)、Fms様チロシンキナーゼ(「FLT」)(例えば、FLT3)、src−ファミリーチロシンキナーゼ(例えば、lyn、CSK)、およびp21−活性化キナーゼ−4(「PAK」)、FLT3、aurora−Aキナーゼ、B−リンパ系チロシンキナーゼ(「Blk」)、サイクリン依存性キナーゼ(「CDK」)、(例えば、CDK1およびCDK5)、src−ファミリー関連タンパク質チロシンキナーゼ(例えば、Fynキナーゼ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ(「GSK」)(例えば、GSK3αおよびGSK3β)、リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ(「Lck」)、リボソームS6キナーゼ(例えば、Rsk1、Rsk2、およびRsk3)、***チロシンキナーゼ(例えば、Yes)、およびチロシンキナーゼ活性を呈するそのサブタイプおよびホモログを含む。ある実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼはAbl、RON、MET、PAK、またはFLT3である。他の実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼはFLT3またはAblファミリーメンバーである。
もう1つの実施形態において、キナーゼは突然変異体AblキナーゼまたはFLT3キナーゼのような突然変異体キナーゼである。有用な突然変異体Ablキナーゼは、例えば、以下の突然変異:Glu255Lys、Thr315Ile、Tyr293Phe、またはMet351Thrの1以上を有するBcr−AblおよびAblキナーゼを含む。いくつかの実施形態において、突然変異体AblキナーゼはY393F突然変異またはT315I突然変異を有する。もう1つの例示的な実施形態において、突然変異体AblキナーゼはThr315Ile突然変異を有する。
いくつかの実施形態において、該キナーゼは(「相同キナーゼ」とも本明細書ではいう)公知のキナーゼに対して相同である。相同キナーゼの生物学的活性を阻害するのに有用な化合物および組成物は、例えば、結合アッセイで最初にスクリーニングすることができる。相同酵素は、全長の既知のキナーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一である、あるいは既知のキナーゼ活性ドメインに対して70%、80%、または90%相同性である同一の長さのアミノ酸配列を含む。相同性は、例えば、限定されるものではないが、Altschul,et al.,Nuc.Acids Rec.25:3389−3402(1997)に記載されたもののようなPSI BLASTサーチを用いて決定することができる。ある実施形態において、配列の少なくとも50%、または少なくとも70%をこの分析において整列させる。整列を行うための他のツールは、例えば、該整列のPostScriptバージョンを生じさせるのに用いることができるDbClustalおよびESPriptを含む。Thompson et al.,Nucleic Acids Research,28:2919−16,2000;Gouet,et al.,Bioinformatics,15:305−08(1999)参照。ホモログは、例えば、FLT3、Abl、またはもう1つの既知のキナーゼ、またはFLT3のいずれかの機能的ドメイン、Abl、またはもう1つの既知のキナーゼとで少なくとも100アミノ酸にわたって1×10-6のBLAST E−値を有することができる(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389−402(1997)。
また、相同性は、既知のキナーゼの活性部位結合ポケットと、酵素の活性部位結合ポケットとを比較することによって決定することもできる。例えば、相同酵素においては、分子またはホモログのアミノ酸の少なくとも50%、60%、70%、80%または90%は、約1.5Å、約1.25Å、約1Å、約0.75Å、約0.5Å、およびまたは約0.25Åまでのα炭素原子の標準偏差を有するキナーゼドメインとサイズが匹敵するドメインのアミノ酸構造座標を有する。
本発明の化合物および組成物は、キナーゼ活性を阻害するのに、およびATPに結合する他の酵素を阻害するのに有用である。従ってそれらは、そのようなATP結合酵素活性を阻害することによって軽減することができる病気および障害の治療に有用である。そのようなATP結合酵素を測定する方法は当業者に知られたもの、相同酵素の選択に関してここで議論するもの、およびタンパク質ファミリーまたはドメインのシグネチャー、配列パターン、モチーフ、またはプロフィールを含有する酵素を同定することができるデータベースPROSITEの使用によるものを含む。
本発明の化合物、およびそれらの誘導体はキナーゼ結合剤として用いることもできる。結合剤としては、そのような化合物および誘導体は、アフィニティークロマトグラフィー適用のための連結された基質として安定な樹脂に結合させることができる。本発明の化合物、およびそれらの誘導体を、それらを、酵素またはポリペプチドの特徴付け、構造および/または機能の調査で利用するために修飾する(例えば、放射標識するする、またはアフィニティー標識するなど)こともできる。
例示的な実施形態において、本発明の二環ピラゾロキナーゼモジュレーターはキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、キナーゼ阻害剤は1μM未満の阻害定数(Ki)のIC50を有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は500μM未満のIC50または阻害定数(Ki)を有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は10μM未満のIC50またはKiを有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は1μM未満のIC50またはKiを有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は500nM未満のIC50またはKiを有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は10nM未満のIC50またはKiを有する。もう1つの実施形態において、キナーゼ阻害剤は1nM未満のIC50またはKiを有する。
IV.治療の方法
もう1つの態様において、本発明は、生物(例えば、ヒトのような哺乳動物)においてキナーゼ活性によって媒介される病気(キナーゼ媒介病気または障害)を治療する方法を提供する。「キナーゼ−媒介」または「キナーゼ関連」病気は、病気または兆候がキナーゼ活性を阻害することによって軽減することができる病気を意味する(例えば、キナーゼが病気プロセスのシグナリング、媒介、変調または調節に関与する場合)。「病気」は病気または病気の兆候を意味する。
キナーゼ関連病の例は癌(例えば、白血病、腫瘍、および転移)、アレルギー、喘息、炎症(例えば、炎症気道病)、閉塞性気道病、自己免疫疾患、代謝病、感染(例えば、細菌、ウイルス、酵母、真菌)、CNS病、脳腫瘍、変性神経病、心血管病、および脈管形成、血管新生および血管形成に関連する病気を含む。例示的な実施形態において、化合物は白血病を含む癌、および異常な細胞増殖に関係する他の病気または障害、骨髄増殖障害、血液学的障害、喘息、炎症病または肥満を治療するのに有用である。
本発明の化合物で治療される癌のより具体的な例は、乳癌、肺癌、黒色腫、結直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、扁平細胞癌、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、および白血病(例えば、骨髄性、慢性骨髄性、急性リンパ芽球性、慢性リンパ芽球性、ホジキン、および他の白血病および血液学的癌)を含む。
本発明の化合物または組成物による治療が治療または予防に有用な病気または障害の他の具体的例は、限定されるものではないが、移植拒絶(例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺、島細胞、膵臓、骨髄、角膜、小腸、皮膚同種移植片または異種移植片および他の移植)、移植片対宿主病、骨関節炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、糖尿病性網膜障害、炎症性腸病(例えば、クローン病、潰瘍性結腸炎、および他の腸病)、腎臓病、悪液質、敗血症ショック、紅斑、重症筋無力症、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏症、アルツハイマー病、パーキンソン病、化学療法の間の幹細胞保護、自己または同種異系骨髄移植についてのエクスビボ選択またはエクスビボ浄化、眼病、網膜障害(例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜障害、および他の網膜障害)、角膜病、緑内障、感染(例えば、細菌、ウイルスまたは真菌)、限定されるものではないが再狭窄を含む心臓病を含む。
V.アッセイ
本発明の化合物は容易にアッセイして、プロテインキナーゼを変調し、プロテインキナーゼを結合し、および/または細胞の成長または増殖を妨げるそれらの能力を決定することができる。いくつかの有用なアッセイの例を下記に示す。
A.キナーゼ阻害および結合アッセイ
種々のキナーゼの阻害は、本明細書中に示した種々の方法、およびUpstate KinaseProfilerアッセイプロトコル2003年6月公表で議論されたもののような当業者に知られた方法によって測定される。
例えば、インビトロアッセイを行う場合、キナーゼを典型的には適当な濃度まで希釈して、キナーゼ溶液を形成する。キナーゼ基質、およびATPのようなリン酸ドナーをキナーゼ溶液に加える。キナーゼはリン酸をキナーゼ基質に移して、リン酸化基質を形成する。リン酸化基質の形成は放射能(例えば、「γ−32P−ATP」)、または検出可能な二次抗体(例えば、ELISA)の使用のようないずれかの適当な手段によって直接検出することができる。別法として、リン酸化基質の形成はATP濃度の検出のようないずれかの適当な技術を用いて検出することができる(例えば、Kinase−Glo(登録商標)アッセイシステム(Promega))。キナーゼ阻害剤は、テスト化合物の存在下および非存在下でリン酸化された基質の形成を検出することによって同定される(以下の実施例セクション参照)。
細胞中のキナーゼを阻害する化合物の能力は、当分野で周知の方法を用いてアッセイすることもできる。例えば、キナーゼを含有する細胞を、キナーゼを活性化する(成長因子のような)活性化剤と接触させることができる。テスト化合物の非存在下および存在下で形成された細胞内リン酸化基質の量は、細胞を溶解し、いずれかの適当な方法(例えば、ELISAによってリン酸化基質の存在を検出することによって測定することができる。テスト化合物の存在下で生じたリン酸化基質の量がテスト化合物の非存在下で生じた量に対して減少する場合、キナーゼ阻害が示される。より詳細な細胞キナーゼアッセイは後に実施例セクションで議論する。
化合物のキナーゼへの結合を測定するには、当業者に既知のいずれかの方法を用いることができる。例えば、Discoverx(Fremont,CA)社製のテストキット、ED−スタウロスポリン(NSIP(商標)酵素結合アッセイキット(米国特許第5,643,734号参照)を用いることができる。また、キナーゼ活性は2003年7月8日に発行された米国特許第6,589,950号におけるようにアッセイすることもできる。
適当なキナーゼ阻害剤は、例えば、本明細書に参照して全ての目的でその全体を組み込む、Antonysamy,et al.のPCT公開番号WO03087816A1に開示されているように、タンパク質結晶学スクリーニングを介して本発明の化合物から選択することができる。
本発明の化合物は、コンピューターによりスクリーニングして、種々のキナーゼに結合し、および/またはそれを阻害するそれらの能力をアッセイし、それらを可視化することができる。構造は本発明の複数の化合物でコンピューターによりスクリーニングして、種々の部位におけるキナーゼに結合するそれらの能力を決定することができる。そのような化合物を医薬化学の努力において標的またはリードとして用いて、例えば、潜在的治療重要性の阻害剤を同定することができる(Travis,Science,262:1374,1993)。そのような化合物の三次元構造は、キナーゼ、またはその活性部位または結合ポケットの三次元表示に重ねて、該化合物が表示に、従って、タンパク質に空間的にフィットするか否かを評価することができる。このスクリーニングにおいて、結合ポケットに対するそのようなエンティティーまたは化合物のフィットの質は形状相補性によって、または見積もられた相互作用エネルギーによって判断することができる(Meng,et al.,J.Comp.Chem.13:505−24,1992)。
本発明に従ってキナーゼに結合し、および/またはそれを変調する(例えば、キナーゼを阻害または活性化する)本発明の化合物のスクリーニングは、一般には、2つの因子を考慮することを含む。まず、化合物は物理的にかつ構造的にキナーゼと共有結合的にまたは非共有結合的に会合できなければならない。例えば、共有結合相互作用はタンパク質の不可逆的または自殺阻害剤を設計するのに重要であろう。キナーゼと化合物との会合で重要な非共有結合分子相互作用は水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス、および疎水性相互作用を含む。第二に、化合物は、それをキナーゼと会合できるようにする、結合ポケットに対する立体配座および配向ができなければならない。化合物のある部分はキナーゼとのこの会合に直接的には参画しないが、それらの部分は分子の総じての立体配座に依然として影響するかも知れず、効力に対して大きな影響を与え得る。立体配座要件は、結合ポケットの全てまたは一部に対する化学基または化合物の総じての三次元構造および向き、またはキナーゼと直接的に相互作用するいくつかの化学基を含む化合物の官能基の間のスペーシングを含む。
例えば、DOCK、またはGOLDのような本明細書中に記載されたドッキングプログラムは、活性部位および/または結合ポケットに結合する化合物を同定するのに用いられる。タンパク質の異なる分子動的立体配座を考慮して、タンパク質構造の1を超える結合ポケット、または同一タンパク質についての1を超える座標の組に対して化合物をスクリーニングすることができる。次いで、共通スコアリングを用いて、タンパク質に対する最良のフィットである化合物を同定することができる(Charifson,P.S.et al.,J.Med.Chem.42:5100−9(1990))。1を超えるタンパク質分子構造から得られたデータを、「Computer Systems and Methods for Virtual Screening of Compounds」と題された2002年5月3日に出願されたKlingler et alの米国出願に記載された方法に従ってスコア取りすることもできる。次いで、最良フィットを有する化合物は化学ライブラリーの生産者から得られ、あるいは合成し、および結合アッセイおよびバイオアッセイで用いる。
コンピューターモデリング技術を用いて、キナーゼに対する化学化合物の潜在的変調または結合効果を評価することができる。コンピューターモデリングが強力な相互作用を示すならば、次いで、分子を合成し、キナーゼに結合し、およびその活性を(阻害または活性化することによって)影響するその能力につきテストすることができる。
キナーゼの変調または他の結合化合物は、一連の工程によってコンピューターにより評価することができ、化学基または断片が、キナーゼの個々の結合ポケットまたは他の領域と会合するそれらの能力につきスクリーニングし、選択する。このプロセスは、例えば、キナーゼ座標に基づいてコンピュータースクリーン上の活性部位の目視検査によって開始することができる。次いで、選択された断片または化学基をキナーゼの個々の結合ポケット内で、種々の配向に位置させ、またはドッキングさせることができる(Blaney,J.M.and Dixon,J.S.,Perspectives in Drug Discovery and Design,1:301,1993)。手動のドッキングは、Insight II(Accelrys,San Diego,CA)、MOE(Chemical Computing Group,Inc.,Montreal,Quebec,Canada);およびSYBYL(Tripos,Inc.,St.Louis,MO,1992)のようなソフトウェア、続いて、CHARMM(Brooks,et al.,J.Comp.Chem.4:187−217,1983)、AMBER(Weiner,et al.,J.Am.Chem.Soc.106:765−84,1984)およびC2 MMFF(Merck Molecular Force Field;Accelrys,San Diego,CA)のような、標準分子メカニクス力場でのエネルギー最小化および/または分子ダイナミックスを用いて達成することができる。より自動化されたドッキングは、DOCK(Kuntz et al.,J.Mol.Biol.,161:269−88,1982;DOCKはUniversity of California,San Francisco,CAから入手できる);AUTODOCK(Goodsell & Olsen,Proteins:Structure,Function,and Genetics: 8:195−202,1990;AUTODOCKはScripps Research Institute,La Jolla,CAから入手できる);GOLD(Cambridge Crystallographic Data Centre(CCDC);Jones et al.,J.Mol.Biol.245:43−53,1995);およびFLEXX(Tripos,St.Louis,MO;Rarey M.,et al.,J.Mol.Biol.261:470−89,1996)のようなプログラムを用いて達成することができる。他の適当なプログラムは、例えば、Halperin,et al.に記載されている。
前記方法による化合物の選択の間に、その化合物がキナーゼに結合することができる効率をテストし、コンピューター評価によって最適化することができる。例えば、キナーゼ阻害剤として機能するように設計され、または選択された化合物は、天然基質が結合する場合に活性部位残基によって占められる容量と重複しない容量を占めることができ、しかしながら、当業者であれば、幾分柔軟性があり、主鎖および側鎖の再配置を可能とすることを認識するであろう。加えて、当業者であれば、例えば、誘導されたフィットをもたらすような結合に際してのタンパク質再編成できる化合物を設計できる。効果的なキナーゼ阻害剤はその結合および遊離状態の間でエネルギーの比較的小さな差を示すことができる(すなわち、それは、結合に際して、結合の小さな変形エネルギーおよび/または低い立体配座歪みを有しなければならない)。従って、最も効果的なキナーゼ阻害剤は、例えば、10kcal/モル以下、7kcal/モル以下、5kcal/モル以下、または2kcal/モル以下の結合の変形エネルギーでもって設計すべきである。キナーゼ阻害剤は、総じての結合エネルギーが類似する1を超える立体配座においてタンパク質と相互作用することができる。それらの場合、結合の変形エネルギーは、阻害剤が酵素に結合する場合に観察される遊離化合物のエネルギーおよび立体配座の平均エネルギーの間の差であるとされる。
具体的なコンピューターソフトウェアは当分野で入手でき、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価する。そのような使用のために設計されたプログラムの例は、Gaussian 94,改訂C(Frisch,Gaussian,Inc.,Pittsburgh,PA,1995年);AMBER,バージョン7(Kollman,University of California at San Francisco,2002年);QUANTA/CHARMM(Accelrys,Inc.,San Diego,CA,1995年);Insight II/Discover(Accelrys,Inc.,San Diego,CA,1995年);DelPhi(Accelrys,Inc.,San Diego,CA,1995年);およびAMSOL(University of Minnesota)(Quantum Chemistry Program Exchange,Indiana University)を含む。これらのプログラムは、例えば、当業者に周知のように、コンピューターワークステーション、例えば、LINUX,SGIまたはSunワークステーションを用いて実行することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者に知られている。
当業者であれば、当分野で知られた方法、および本明細書に開示する方法を用いてキナーゼタンパク質を発現させることができる。本明細書に記載された天然および突然変異したキナーゼポリペプチドは、当分野で周知の技術を用いて全部または一部を化学的に合成することができる(例えば、Creighton,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman & Co.,NY,1983参照)。
遺伝子発現系は、天然および突然変異したポリペプチドの合成に用いることができる。当業者に知られた、天然または突然変異したポリペプチドをコードする配列および適当な転写/翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法はインビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,2001,およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989に記載された技術を参照されたい。
宿主発現ベクター系を用いてキナーゼを発現させることができる。これらは、限定されるものではないが、組換えバクテリオファージDNA、コード配列を含有するプラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物;コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母;コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させた、またはコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;または動物細胞系を含む。タンパク質は、例えば、タンパク質を発現させて、個体におけるタンパク質の量を増大させ、または作成された治療タンパク質を発現させることを含む、ヒト遺伝子治療系で発現させることもできる。これらの系の発現エレメントはそれらの強度および特異性が変化する。
特異的に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞のような宿主の間のDNAの行き来を可能とする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製用の複製起点、1以上の選択マーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数に対する潜在能力、および活性なプロモーターを含有することができる。プロモーターは、RNAポリメラーゼを指令して、DNAに結合させ、RNA合成を開始させるDNA配列として定義される。強力なプロモーターはmRNAを高い頻度で開始させるものである。
発現ベクターは、例えば、構成的および誘導性プロモーターを含む、転写および翻訳に影響する種々のエレメントを含むこともできる。これらのエレメントは、しばしば、宿主および/またはベクター依存性である。例えば、細菌系においてクローニングする場合には、T7プロモーター、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp−lacハイブリッドプロモーター)などのような誘導性プロモーターを用いることができ;昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを用いることができ;植物細胞系でクローニングする場合、植物細胞のゲノムから(例えば、熱ショックプロモーター;RUBISCOの小サブユニットについてのプロモーター;クロロフィルa/b結合タンパク質についてのプロモーター)、または植物ウイルスから(例えば、CaMVの35S RNAプロモーター;TMVのコートタンパク質プロモーター)由来するプロモーターを用いることができ;哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター;SV40プロモーター;ウシパピローマウイルスプロモーター;およびエプスタインバールウイルスプロモーター)を用いることができる。
種々の方法を用いて、ベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、および電気泳動。発現ベクター含有細胞はクローン的に増殖させ、個々に分析して、それらが適当なポリペプチドを生産するか否かを決定する。例えば、抗生物質耐性を含む種々の選択方法を用いて、形質転換されている宿主細胞を同定することができる。ポリペプチド発現宿主細胞クローンの同定は、限定されるものではないが、抗キナーゼ抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞会合活性の存在を含むいくつかの手段によってなすことができる。
また、cDNAの発現はインビトロで生産された合成mRNAを用いて行うこともできる。合成mRNAは、限定されるものではないが、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効果的に翻訳することができ、ならびに限定されるものではないがカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションを含む細胞ベースのシステムで効果的に翻訳することができる。
最適レベルの活性および/またはタンパク質を生じさせるcDNA配列を決定するには、修飾されたcDNA分子を構築する。修飾されたcDNAの非限定的例は、cDNAにおけるコドン用法が宿主に対して最適化されている場合であり、cDNAは発現される。宿主細胞をcDNA分子で形質転換し、キナーゼRNAおよび/またはタンパク質のレベルを測定する。
宿主細胞中のキナーゼタンパク質のレベルは、免疫アフィニティーおよび/またはリガンドアフィニティー技術、キナーゼ特異的アフィニティービーズのような種々の方法によって定量され、あるいは特異的抗体を用いて、35Sメチオニン標識または未標識タンパク質を単離する。標識された、または標識されていないタンパク質をSDS−PAGEによって分析する。標識されていないタンパク質は、特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ELISAまたはRIAによって検出される。
組換え宿主細胞におけるキナーゼの発現に続き、ポリペプチドを回収して、活性形態のタンパク質を提供することができる。いくつかの精製手法が利用でき、用いるのに適している。組換えキナーゼキナーゼを、当分野で知られた分別、またはクロマトグラフィー工程の種々の組合せ、または個々の適用によって細胞溶解物から、または条件培養培地から精製することができる。
加えて、組換えキナーゼは、全長の裸のタンパク質またはそのポリペプチド断片に対して特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体で作成したイムノアフィニティーカラムを用いることによって他の細胞タンパク質から分離することができる。当分野で知られた他のアフィニティーベースの精製技術を用いることもできる。
別法として、ポリペプチドは、例えば、細菌の封入体から折り畳まれていない不活性な形態にて宿主細胞から回収することができる。この形態で回収されたタンパク質は、変性剤、例えば、グアニジニウム塩酸を用いて可溶化し、次いで、透析のような当業者に知られた方法を用いて活性形態に再度折り畳む。
B.細胞成長アッセイ
種々の細胞成長アッセイが当分野で知られており、細胞の成長および/または増殖を阻害(例えば、低下)することができる二環ピラゾロ化合物(すなわち、「テスト化合物])を同定するのに有用である。
例えば、種々の細胞は、成長および/または増殖に特異的キナーゼを必要することが知られている。テスト化合物の存在下で成長するそのような細胞の能力を評価し、テスト化合物の非存在下における成長と比較し、それにより、テスト化合物の抗増殖特性を同定することができる。このタイプの1つの通常の方法は、トリチウム化チミジンのような標識が、***する細胞のDNAに取り込まれる度合いを測定することである。別法として、細胞増殖の阻害は、細胞数に相関する代理マーカーで細胞の全代謝活性を測定することによって評価することができる。細胞は、テスト化合物の存在下および非存在下において代謝インジケーターで処理することができる。生細胞は代謝インジケーターを代謝し、それにより、検出可能な代謝産物を形成する。検出可能な代謝産物のレベルがテスト化合物の非存在に対してテスト化合物の存在下で減少する場合、細胞の成長および/または増殖の阻害が示される。例示的な代謝インジケーターは、例えば、テトラゾリウム塩およびAlamorBlue(登録商標)を含む(後の実施例セクション参照)。
細胞移動を刺激するキナーゼについてのアッセイはスクラッチアッセイである。このアッセイは、創傷治癒のような事象を模倣することによってキナーゼの阻害剤を評価するのに用いられる。MET阻害剤をテストするのに用いられるこのアッセイの1つの変形において、細胞の密集単層を細胞プレート上に形成させる。単層の形成後、単層上の直線状創傷を、単層を機械的に掻き下ろし、それにより、無細胞チャネルを形成することによって作り出す。細胞成長のためのキナーゼによって要求される成長因子を、テスト化合物の存在下または存在下で加える。テスト化合物の存在下におけるチャネルの閉鎖は、キナーゼを阻害し、それにより、細胞の移動および成長がチャネルを閉じるテスト化合物の失敗を示す。逆に、テスト化合物を加えた後におけるチャネルの存在は、テスト化合物がキナーゼを阻害し、それにより、細胞の成長を妨げることを示す。適当な細胞、成長条件および成長因子の選択は当業者の能力内のものである(後の実施例セクション参照)。
VI.医薬組成物および投与
もう1つの態様において、本発明は、医薬上許容される賦形剤と混合した二環ピラゾロキナーゼモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。当業者であれば、医薬組成物が前記した二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの医薬上許容される塩を含むことを認識する。
治療的および/または診断的適用において、本発明の化合物は、全身および局所または局所化投与を含む、種々の投与形態用に処方することができる。技術および処方は、一般には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.)Lippincott,Williams & Wilkins(2000)で見出すことができる。
本発明による化合物は広い用量範囲にわたって効果的である。例えば、成人ヒトの治療において、1日当たり0.01〜1000mg、0.5〜100mg、1〜50mg、および1日当たり5〜40mgの用量は、用いることができる用量の例である。最も好ましい用量は1日当たり10〜30mgである。正確な用量は、投与の経路、化合物が投与される形態、治療すべき対象、治療すべき対象の体重、および主治医の好みおよび経験に依存する。
医薬上許容される塩は一般には当業者に周知であり、その例として、限定されるものではないが、アセテート、ベンゼンスルホネート、ベスレート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビタルタレート、ブロマイド、エデト酸カルシウム、カルンシレート、カルボネート、シトレート、エデテート、エディシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルタメート、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、イオダイド、イセチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、パモエート(エンボネート)、パントテネート、ホスフェート/ジホスフェート、ポリガラクツロネート、サリシレート、ステアレート、スバセテート、スクシネート、スルフェート、タンネート、タルトレート、またはテオクレートを含むことができる。他の医薬上許容される塩は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20版)Lippincott,Williams & Wilkins(2000)に見出すことができる。好ましい医薬上許容される塩は、例えば、アセテート、ベンゾエート、ブロマイド、カルボネート、シトレート、グルコネート、臭化水素酸塩、塩酸塩、マレエート、メシレート、ナプシレート、パモエート(エンボネート)、ホスフェート、サリシレート、スクシネート、スルフェートまたはタルトレートを含んでよい。
治療すべき具体的疾患に応じて、そのような剤は液体または固体投与形態に処方することができ、全身または局所投与することができる。該剤は、当業者に知られたように、例えば、時間−または維持−低放出形態で送達することができる。処方および投与のための技術はRemington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)Lippincott,Williams & Wilkins(2000)で見出すことができる。適当な経路は経口、バッカル、吸入スプレイ、舌下、直腸、経皮、膣、経粘膜、鼻腔内または腸投与;筋肉内、皮下、脊髄内注射、ならびにクモ膜下口内、直接的心室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑液包内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射を含む非経口送達、または他の送達態様を含むことができる。
注射では、本発明の剤は、ハンクス溶液、リンゲル液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合するような水溶液に処方し、希釈することができる。そのような経粘膜投与では、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は一般に当分野で知られている。
全身投与に適した用量へ本発明の実施のために開示された化合物を処方するための医薬上許容される不活性な担体の使用は、本発明の範囲内のものである。担体および適当な製造プラクティスの適切な選択により、本発明の組成物、特に、溶液として処方されたものは静脈内注射によるように非経口投与することができる。化合物は、当分野で周知の医薬上許容される担体を用いて経口投与に適した用量に容易に処方することができる。そのような担体は本発明の化合物が、治療すべき患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方されるのを可能とする。
鼻腔内または吸入送達のためには、本発明の剤は当業者に知られた方法により処方することもでき、例えば、限定されるものではないが、食塩水のような可溶化、希釈または分散物質、ベンジルアルコールのような保存剤、吸収プロモーター、およびフルオロカーボンの例を含むことができる。
本発明で用いるのに適した医薬組成物は、有効成分がその意図した目的を達成するのに効果的な量で含有される組成物を含む。有効量の決定は、特に、本明細書中で提供する詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力内のものである。
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬的に用いることができる製剤への有効な化合物の加工を容易とする賦形剤および補助剤を含む適当な医薬上許容される担体を含有することができる。経口投与のために処方された製剤は錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または溶液の形態とすることができる。
経口使用のための医薬製剤は、活性な化合物を個体賦形剤と合わせて得、任意で、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を、必要に応じて適当な補助剤を加えた後に加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖のような充填剤;セルロース調製物、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース(CMC)、および/またはポリビニルピロリドン(PVP:ポビドン)である。必要に応じて、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、あるいはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えることができる。
糖衣錠コアに適当なコーティングを設ける。この目的では、濃縮した糖溶液を用いることができ、これは任意でアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール(PEG)、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。染料または色素を識別するために、あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加える。
経口で用いることができる医薬製剤はゼラチンで作成されたプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作成されたソフトなシールされたカプセルを含む。該プッシュ−フィットカプセルはラクトースのような充填剤、澱粉のような結合剤、および/またはタルクまたはステアリン酸のような滑沢剤および、任意で、安定化剤と混合した有効成分を含有することができる。ソフトカプセルにおいては、活性化合物を脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール(PEG)のような適当な液体に溶解し、または懸濁させることができる。さらに安定化剤が加えられる。
治療または予防すべき特定の疾患、または病気状態に応じて、通常に投与されてその疾患を治療または予防する更なる治療剤を本発明の阻害剤と共に投与することができる。例えば、化学療法剤または他の抗増殖剤を本発明の阻害剤と組み合わせて、増殖性の病気および癌を治療することができる。公知の化学療法剤の例は、限定されるものではないが、アドリアマイシン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、トポテカン、タキソール、インターフェロン、および白金誘導体を含む。
本発明の阻害剤と組み合わせることもできる剤の他の例は、限定されるものではないが、コルチコステロイド、TNFブロッカー、IL−1RA、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジンのような抗炎症剤;サイクロ(登録商標)スポリン、タクロリムス、ラパマイシン、マイコフェノレートモフェチル、インターフェロン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、およびスルファサラジンのような免疫変調および免疫抑制剤;アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、MAO阻害剤、インターフェロン、抗痙攣剤、イオンチャネルブロッカー、リルゾール、および抗パーキンソン剤のような神経栄養因子;ベータ−ブロッカー、ICE阻害剤、利尿剤、ニトレート、カルシウムチャネルブロッカー、およびスタチンのような心血管病を治療するための剤;コルチコステロイド、コレスチラミン、インターフェロン、および抗ウイルス剤のような肝臓病を治療するための剤;コルチコステロイド、抗白血病剤、および成長因子のような血液障害を治療するための剤;インスリン、インスリンアナログ、αグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、およびインスリン感受性剤のような糖尿病を治療するための剤;およびγグロブリンのような免疫不全障害を治療するための剤を含む。
これらの更なる剤は阻害剤含有組成物とは別々に、複数投与計画の部分として投与することができる。別法として、これらの剤は、単一組成物中の阻害剤と一緒に混合した、単一投与形態の部分とすることができる。
本発明は、本発明の単一態様の説明を意図する、例示された実施形態によって範囲が限定されない。事実、本明細書中に記載したものに加えて本発明の種々の修飾は、これまでの記載から当業者に明らかとなる。そのような修飾は本発明の範囲内であることを意図する。さらに、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明のいずれかの実施形態のいずれかの1以上の特徴を本発明のいずれかの他の実施形態のいずれかの1以上の他の特徴と組み合わせることができる。例えば、二環ピラゾロキナーゼモジュレーターのセクションに記載された二環ピラゾロキナーゼモジュレーターは治療の方法、および本明細書中に記載されたキナーゼを阻害する方法に等しく適用できる。本出願を通じて引用された文献は当分野の技術のレベルの例であり、本明細書に参照して、既に具体的に組み込まれたか否かを問わず、全ての目的のためにその全体を組み込む。
実施例
以下の実施例は特許請求する発明を説明するために掲げるためのものであり、限定されるものではない。本発明の実施形態の調製は以下の実施例に記載する。当業者であれば、供される化学反応および合成方法を修飾して本発明の他の多くの化合物を調製することができるのを理解するであろう。本発明の化合物が例示されていない場合、当業者は、これらの化合物は本明細書中に示される合成方法を修飾することにより、かつ当分野で知られた合成方法を用いることにより調製することができるのを認識するであろう。
実施例1:化合物の合成
3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンの合成
ジオキサン(100mL)中の5−アミノ−3−フェニルピラゾール(5g,31.4ミリモル)の攪拌溶液にMgO(1.27g,31.4ミリモル)および炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(100mL)を加えた。不均一な混合物を30分間攪拌し、次いで、チオホスゲン(2.65mL,34.6ミリモル)を滴下し、完了するまで反応混合物をさらに激しく15分間攪拌した。水酸化アンモニウム(25mL)を次いで滴下し、反応混合物をさらに20分間攪拌した。クエン酸の10%水溶液を加えて、pHを6まで下げ、混合物を酢酸エチル(3回)で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、シリカゲルに吸着させた。溶離剤としてヘキサン中の10〜80%酢酸エチルでのシリカゲル上の精製により、6.22g(91%)の(5−フェニル−2H−ピラゾール−3−イル)−チオ尿素を黄色フォームとして得た。
該黄色フォーム(6.2g,28.4ミリモル)をAcOH(125mL)に溶解させ、AcOH中の臭素の1.5M溶液(20.8mL,31.2ミリモル)を激しく攪拌しつつ30分間にわたって滴下した。得られた不均一混合物を80℃にて2.5時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、真空中で濃縮した。残渣を水に懸濁させ、4NのNaOH水溶液をpH7まで加えた。酢酸エチルでの抽出の後、有機層をシリカゲル上に吸着させた。溶離剤としてのCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、3.26gの黄色固体が得られ、これをイソプロピルアルコールから更に再結晶して、2.81g(45%)の純粋な3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを灰色がかった白色結晶として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:12.8および12.9(2 ブロードs,1H. NH+互変異性体),7.60(ブロードs,0 2H),7.55(ブロードs,2H,NH2),7.48(ブロードs;2H),7.33(t,1H);HPLC/MSm/z:217[MH]+
N−(3−チオフェン−2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−ベンズアミドの合成
THF(10mL)中の5−アミノ−3−(2−チエニル)ピラゾール(500mg,3.03ミリモル)の攪拌溶液にN−ブロモスクシンイミド(592mg,3.33ミリモル)を一度に加えた。反応混合物を室温で3時間攪拌し、次いで、溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に採った。有機層を順次1Mチオ硫酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で2回、およびブラインで洗浄し、次いで、それを硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、シリカゲルに吸着させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、686mg(93%)の4−ブロモ−5−チオフェン−2−イル−2H−ピラゾール−3−イルアミンを暗色フォームとして得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.9および12.4(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),7.4−7.65(m,2H),7.05−7.2(m,1H),4.8および5.3(2ブロードs,2H,NH2+互変異性体)。
ジオキサン(1mL)中の4−ブロモ−5−チオフェン−2−イル−2H−ピラゾール−3−イルアミン(50mg,0.205ミリモル)の攪拌溶液にベンゾイルイソチオシアネート(30μL,0.225ミリモル)を滴下した。反応混合物を90℃にて17時間攪拌した。次いで、それを室温まで冷却し、酢酸エチルおよび炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液の間に分配した。有機層を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で2回、次いで、ブラインで洗浄し、シリカゲル上に吸着した。溶離剤としてヘキサン中の0〜80%酢酸エチルでのシリカゲル上での精製により、54mg(80%)のN−(3−チオフェンのー2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−ベンズアミドをベージュ色個体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.5および13.6(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),12.9(ブロードs,1H,NH),8.1(d,2H),7.68および7.85(2 dd,1H,互変異性体),7.66(t,1H),7.58(t,2H),7.34および7.53(2d,1H,互変異性体),7.17および7.22(2t,1H,互変異性体);HPLC/MSm/z:327[MH]+
N−[3−(3−クロローフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]―ベンズアミドの合成
無水エタノール(20mL)中の3−(3−クロロフェニル)−3−オキソ−プロピオニトリル(2g,11.1ミリモル)の攪拌溶液にヒドラジン水和物(3.24mL,67ミリモル)を加えた。反応混合物を80℃にて15分間攪拌し、室温まで冷却し、真空中で濃縮し、シリカゲル上に吸着させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、1.53g(70%)の5−(3−クロローフェニル)−2H−ピラゾール−3−イルアミンを緑色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.6および11.9(2ブロードs,1H、NH+互変異性体),7.69(s,1H),7.60(d,1H),7.38(t,1H),7.29(d,1H),5.77(ブロードs,1H),4.98(ブロードs,2H,NH2)。
THF(32mL)中の5−(3−クロローフェニル)−2H−ピラゾール−3−イルアミン(1.53g,7.9ミリモル)の攪拌溶液にN−ブロモスクシンイミド(1.55g,8.7ミリモル)を加えた。反応混合物を室温にて5時間攪拌し、次いで、シリカゲル上に吸着させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、1.73g(80%)の4−ブロモ−5−(3−クロロ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イルアミンを茶色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:12.2および12.4(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),7.77(s,1H),7.73(ブロードs,1H),7.48(ブロードs,1H),7.43(ブロードs,1H),5.30(ブロードs,1H,NH),4.82(ブロードs,1H,NH);HPLC/MS m/z:272 [MH]+
ジオキサン(1mL)中の4−ブロモ−5−(3−クロロ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イルアミン(50mg,0.183ミリモル)の攪拌溶液にベンゾイルイソチオシアネート(27μL,0.202ミリモル)を加えた。反応混合物を90℃にて一晩攪拌し、室温にて冷却し、酢酸エチルおよび炭酸水素ナトリウムの間に分配した。有機層を単離し、シリカゲルに吸着させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、10.8mg(17%)のN−[3−(3−クロロ8−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]―ベンズアミドを白色固体として得た。1HNMR(d6−DMSO)δ:13.70および13.72(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),12.9(ブロードs,1H,NH),8.12(d,2H),7.81および7.85(2ブロードs,1H,互変異性体),7.65−7.74(m,2H),7.54−7.62(m,3H),7.45(m,1H);HPLC/MS m/z:355 [MH]+
N−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−ベンズアミドの合成
アセトニトリル(0.87mL)を、−78℃にて、n−ブチルリチウム(ヘキサン中2.5M,6.64mL)およびTHF(15mL)の混合物に滴下した。混合物を1時間攪拌した。THF(15mL)中のエチルピコリネート(2.7g,15.1ミリモル)の溶液を滴下し、温度を−78℃に維持した。攪拌を−78℃にて更に2時間継続した。混合物を室温まで温め、攪拌をさらに90分間継続した。反応を水(20mL)の添加によってクエンチした。溶液のpHをHClの1N水溶液で4に調整し、水溶液をEtOAcで抽出した。合わせた有機抽出物をMgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。租生成物をAcOH(8mL)に溶解させ、Br2(0.22mL,4.6ミリモル)を滴下した。混合物を1時間の間にわたって攪拌した。濾過、続いてのEt2Oでの洗浄により、500mg(10%)の4−ブロモ−5−ピリジン−2−イル−2H−ピラゾール−3−イルアミン臭化水素酸塩を暗色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:9.12(s,1H),8.82(m,1H),8.76(m,1H),8.04(m、1H);HPLC/MS m/z:239 [MH]+
4−ブロモ−5−ピリジン−2−イル−2H−ピラゾール−3−イルアミン臭化水素酸塩(300mg,0.94ミリモル),ベンゾイルイソチオシアネート(0.15mL,1.12ミリモル)、ピリジン(0.24mL,2.97ミリモル)、1.4−ジオキサン(2mL)、およびDMSO(2mL)の混合物を95℃にて一晩加熱した。混合物を過剰の水に加え、得られた沈殿を濾過し、EtOHから再結晶して、190mg(63%)のN−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−ベンズアミドを灰色がかった白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:8.85(s、1H),8.02(m,4H),7.51(m,3H),7.21(m,1H);HPLC/MS m/z:322[MH]+
N−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−イソニコチンアミドの合成
THF(0.5mL)中の3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−チアゾール−5−イルアミン(20mg,0.092ミリモル)およびピリジン(52μL,0.65ミリモル)の攪拌溶液に、塩化イソニコチノイル塩酸塩(82mg,0.46ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて22時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、MeOH(1mL)およびNaOHの4N水溶液(0.25mL)で処理した。反応混合物を室温にて4時間更に攪拌し、次いで、HClの1N水溶液を加えてpHを7に調整し、混合物をCH2Cl2中の10%MeOHで抽出した(3回)。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、12.5mg(42%)のN−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−イソニコチンアミドをベージュ色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.5および13.7(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),13.2(ブロードs,1H,NH),8.83(d、2H),7.99(d,2H),7.80(m,2H,互変異性体),7.55(m,2H,互変異性体),7.40(m,1H,互変異性体;HPLC/MS m/z:322[MH]+
フラン−2−カルボン酸(3−tert−ブチル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アミドの合成
THF(0.75mL)中の3−tert−ブチル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.153ミリモル)およびピリジン(74μL,0.92ミリモル)、あるいは別法としてPS−DMAP(Argonaut樹脂,6等量)の攪拌溶液に塩化フラン−2−カルボニル(75μL,0.76ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて23時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、THF(1mL)およびPS−トリスアミン(Argonaut樹脂,20等量)で2時間処理した。樹脂を濾過し、DMFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。残渣をMeOH(1mL)およびNaOHの4N水溶液(0.25mL)で処理し、溶液を室温にて2時間攪拌した。反応混合物をHClの1N水溶液でpH7に中和し、酢酸エチルで抽出した(3回)。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、36mg(82%)のフラン−2−カルボン酸(3−tert−ブチル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アミンを灰色がかった白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:12.8(ブロードs,1H,NH),12.7(ブロードs,1H,NH),8.03(d,1H),7.69(ブロードs,1H),6.74(dd,1H),1.36(s,9H);HPLC/MS m/z:291 [MH]+
2−(2−メトキシ−エトキシ)−N−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アセトアミドの合成
3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.139ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(2mL)および塩化2−(2−メトキシエトキシ)アセチル(106μL,約5等量)を加えた。反応混合物を70℃にて24時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂20等量)を1.5時間処理した。樹脂を濾過し、THFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。残渣をTHF/H2O/Et3N(2mL)の(5:1:1)混合物で50℃にて24時間処理し、次いで、溶液をシリカゲルに直接吸着させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、30mg(65%)の2−(2−メトキシ−エトキシ)−N−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アセトアミドの合成を白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.5および13.6(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),12.2(ブロードs,1H,NH),7.74(m,2H,互変異性体),7.54(m,2H,互変異性体),7.38(m,1H,互変異性体),4.28(s,2H),3.68(t,2H,)3.51(t,2H),3.29(s,3H);HPLC/MS m/z:333[MH]+
フラン−2−カルボン酸(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アミドの合成
4−ブロモ−5−ピリジン−2−イル−2H−ピラゾール−3−イルアミン臭化水素酸塩(193mg,0.60ミリモル)、フラン−2−カルボニルイソチオシアネート(0.07mL)、ピリジン(0.1mL)、およびDMSO(2mL)の混合物をスミスプロセルバイアルに入れた。反応をPersonal Chemistry SmithCreatorマイクロ波中で160℃にて5分間実行した。反応混合物を次いで過剰の水に加え、得られた沈殿を濾過した。分取用HPLCによる精製により、10mgのフラン−2−カルボン酸(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アミドを白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:8.60(dd,1H),7.92(m,2H),7.80(d,1H),7.46(d,1H),7.26(m,2H),6.60(dd、1H);HPLC/MS m/z:312 [MH]+
2−クロロ−4−メチル−チアゾール−5−カルボン酸(3−フェニル−1H―ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)アミドの合成
テフロン(登録商標)キャップを備えたバイアルに2−ブロモ−4−メチル−チアゾール−5−カルボン酸(350mg,1.576ミリモル)、塩化チオニル(3mL)およびDMF(0.02mL)を加えた。反応混合物を85℃にて3時間攪拌し、次いで、過剰の塩化チオニルを真空中で蒸発させ、乾燥トルエンを加え、溶媒を真空中で蒸発させた。乾燥トルエン(3mL)を加えて、塩化2−クロロ−4−メチル−チアゾール−5−カルボニルの溶液(約0.52M)が生成され、これをそれ自体次の工程で用いた。
3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.139ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,558mg,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(2mL)、およびトルエン中の塩化2−クロロ−4−メチル−チアゾール−5−カルボニル溶液(0.52M,1.3mL,約5等量)を加えた。反応混合物を70℃にて18時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,674mg,20等量)で2時間処理した。樹脂を濾過し、THFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。得られた粗混合物をMeOH(1mL)およびNaOHの4N水溶液(0.25mL)で処理した。反応混合物を室温にて2時間更に攪拌し、次いで、HClの1N水溶液を加えてpHを7に調整し、混合物をEtOAcで抽出した(3回)。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、11mg(21%収率)の2−クロロ−4−メチル−チアゾール−5−カルボン酸(3−フェニル−1H―ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)アミドを灰色がかった白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ: 7.75(d,2H),7.54(t,2H),7.39(t,1H),2.65(s,3H);HPLC/MS m/z:376.0[MH]+
N−[3−4−(メトキシ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]アセトアミドの合成
無水エタノール(21mL)中の3−(4−メトキシフェニル)−3−オキソ−プロピオニトリル(2.0g,11.4ミリモル)の溶液にヒドラジン水和物(3.32mL,68.3ミリモル)を加えた。反応混合物を80℃にて15時間攪拌し、次いで、それを真空中で濃縮し、溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、2.02g(97%収率)の5−アミノ−3−(4−メトキシフェニル)ピラゾールを白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.69(s,1H),7.55(d,2H),6.92(s,2H),5.66(s,1H),4.62(ブロードs,2H),3.75(s,3H);HPLC/MS m/z:190.1[MH]+
THF(50mL)中の5−アミノ−3−(4−メトキシフェニル)ピラゾール(2.5g,13.2ミリモル)の溶液にベンゾイルイソチオシアネート(1.96mL,14.5ミリモル)を滴下した。反応混合物を室温で45分間攪拌し、次いで、NaOHの4N水溶液(10mL)を加え、反応混合物を55℃にて1時間更に攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、HCIの1N水溶液でpH8まで中和し、EtOAcで抽出した(3回)。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させ、真空中で乾燥して、4.28gの橙色−黄色固体を得た。該固体を氷酢酸(300mL)に溶解させ、AcOH中の臭素の1.5M溶液(8.8mL,13.2ミリモル)を激しく攪拌しつつ滴下した。得られた不均一混合物を室温にて1時間、次いで、80℃にて1時間攪拌した。反応を室温まで冷却し、Et2O(500mL)を加えた。得られた沈殿を濾過し、Et2Oで洗浄し、真空中で乾燥して2.93g(68%収率)の3―(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを淡黄色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:7.57(d,2H),7.09(d,2H),3.80(s,3H);HPLC/MS m/z:247.1[MH]+
3―(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(100mg,0.306ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,1.2g,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(3mL)および塩化アセチル(110μL,1.53ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて1時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,1.1g,20等量)で1時間処理した。樹脂を濾過し、THFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。得られた粗製物をMeOHに懸濁させ、ヒドラジン一水和物(0.06mL)で30分間処理した。沈殿を濾過し、濾液を、溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHを用いるシリカゲルで直接精製して、12.5mg(14%収率)のN−[3−(4−メトキシ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]−アセトアミドを灰色がかった白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.4(ブロードs,1H),12.3(ブロードs,1H),7.66(ブロードs,2H),7.09(ブロードs,2H),3.80(s,3H),2.18(s,3H);HPLC/MS m/z:289.0[MH]+
2−メトキシ−N−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アセトアミドの合成
3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.139ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,0.56g,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(2mL)および塩化2−メトキシアセチル(63μL,0.694ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて3.5時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,0.51g,15等量)で50℃にて3時間処理した。樹脂を濾過し、THFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上の精製により、15mg(37%収率)の2−メトキシ−N−(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル)−アセトアミドを白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.6(ブロードs,1H),12.3(ブロードs,1H),7.73(ブロードs,2H),7.53(ブロードs,2H),7.37(ブロードs,1H),4.20(s,2H),3.37(s,3H),2.18(s,3H);HPLC/MS m/z:289.1[MH]+
5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸[3−(2−ブロモ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]―アミドの合成
窒素下、ジクロロメタン中の5−(クロロメチル)−2−フラン−カルボン酸エチル(0.5mL,3.25ミリモル)およびEt3N(0.9mL,6.5ミリモル)の溶液にモルホリン(284μL,3.25ミリモル)および触媒量のKIを滴下した。反応混合物を45℃にて24時間攪拌し、次いで、それを真空中で濃縮した。残渣をEtOAcに溶解させ、有機層を水(2回)、次いで、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、真空中で乾燥して、520mg(67%収率)の5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸エチルエステルを明るい茶色油として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:7.22(d,1H),6.51(d,1H),4.25(9,2H),3.54(m,6H),2.37(ブロードs,4H),1.27(t,3H)。
MeOH(20mL)中の5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸エチルエステル(510mg,2.13ミリモル)の溶液にAmberlyst A26(OH)(10g,21.3ミリモル)を加え、反応混合物を24時間振盪した。樹脂を濾過し、MeOHで洗浄し、次いで、MeOH中の1.25M HCl(50mL)に採った。樹脂を濾過し、MeOHで洗浄し、溶液を蒸発乾固して、421mg(80%収率)の5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸塩酸塩をフォームとして得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.54(ブロードs,1H),7.26(d,1H),6.92(d,1H),4.49(ブロードs、2H),3.93(ブロードs,2H),3.74(ブロードs、2H),3.27(ブロードs,2H),3.09(ブロードs,2H)。
二滴のDMFを含む塩化チオニル中の5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸塩酸塩の懸濁液をN2下で3時間還流し、次いで、室温まで冷却した。乾燥CH2Cl2を加え、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をCH2Cl2で粉砕し、得られた固体を濾過し、乾燥CH2Cl2で洗浄し、真空中で乾燥して、373mg(83%収率)の塩化5−モルホリン−4−イルメチルーフラン−2−カルボニル塩酸塩を白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.54(ブロードs,1H),7.26(d,1H),6.92(d,1H),4.49(s,2H),3.94(m,2H),3.74(m,2H),3.28(m,2H),3.09(ブロードs,2H)。
2下、乾燥THF(50mL)中のNaH(60%分散液,1.14g,28.4ミリモル)の懸濁液にCH3CN、続いて、2−ブロモ−安息香酸メチルエステル(2mL,14.2ミリモル)を加えた。反応混合物を1.5時間還流し、次いで、0℃まで冷却し、水(1mL)でクエンチし、真空中で濃縮した。残渣を水で希釈し、水性層をヘキサンで抽出し(2回)、次いで、HCLの1N水溶液でpH3〜4に酸性化した。乳白色の水性層をCHCl3で抽出し(3回)、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。溶離剤としてヘキサン中の0〜35%EtOAcでのシリカゲル上での精製により、1.89g(59%収率)の3−(2−ブロモ−フェニル)−3−オキソ−プロピオニトリルを黄色油として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.8(ブロードm,1H,互変異性体),7.73(ブロードs,1H),7.42(m,3H),4.99(s,0.3H,互変異性体),4.64(s,0.6H,互変異性体);HPLC/MS m/z:223.9,225.9[MH]+
無水EtOH(25mL)中の3−(2−ブロモ−フェニル)−3−オキソ−プロピオニトリル(1.8g,8.03ミリモル)の溶液にヒドラジン水和物(2.3mL,48.2ミリモル)を加えた。反応混合物を23時間還流し、次いで、冷却し、溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでシリカゲル上で直接精製して、1.33g(70%収率)の5−アミノ−3−(2−ブロモフェニル)ピラゾールを粘調な油として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.7(ブロードm,1H,互変異性体),7.20−7.70(ブロードm,4H)、5.76(ブローm,1H),5.03(ブロードs,1H),4.60(ブロードs,1H);HPLC/MS m/z:238.0,240.0[MH]+。
THF(20mL)中の5−アミノ−3−(2−ブロモフェニル)ピラゾール(1.3g,5.46ミリモル)の溶液にベンゾイルイゾチオシアネート(0.81mL,6.0ミリモル)を滴下した。反応混合物を室温にて3時間攪拌し、次いで、NaOH(4mL)の4N水溶液を加え、反応混合物を50℃にて2時間更に攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、NH4Clの飽和溶液でpH7に中和し、EtOAcで抽出した(3回)。合わせた有機層を,溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでシリカゲル上にて直接精製して、1.62g(定量的)の[5−(2−ブロモ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イル]―チオ尿素を黄色味がかったフォームとして得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:12.8(ブロードs,1H),10.4(ブロードs,1H),8.99(ブロードs,1H),8.52(ブロードs,1H),7.76(d,1H),7.50(m,2H),7.36(t,1H),6.24(ブロードs,1H)。
氷酢酸(200mL)中の[5−(2−ブロモ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イル]−チオ尿素(1.6g,5.38ミリモル)の溶液に、激しく攪拌しつつ、AcOH中の臭素の1.5M溶液(3.59mL,5.38ミリモル)を加えた。得られた不均一混合物を室温にて2時間、次いで、80℃にて1時間攪拌した。反応を室温まで冷却し、濃縮乾固した。水を加え、続いてNaOHの1N水溶液を加えて、pH7に中和した。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥した。次いで、固体をMeOH中で2時間還流し、濾過し、MeOHで洗浄して、588mgの純粋な3−(2−ブロモ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを灰色がかった白色固体として得た。濾液を、溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでシリカゲル上にて更に精製して、更に460mgの3−(2−ブロモ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを合計1.408g(88%収率)で得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.1および12.6(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),7.73(d,1H),7.61(ブロードm,1H),7.48(m,3H),7.34(t,1H);HPLC/MS m/z:294.9,296.9[MH]+
3−(2−ブロモ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.135ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,0.54g,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(1.5mL)および塩化5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボニル塩酸塩(180mg,0.675ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて17時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,0.76g,20等量)で50℃にて8時間処理した。樹脂を濾過し、DMFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜8%MeOHでのシリカゲル上の精製により、18mg(27%収率)の5−モルホリン−4−イルメチル−フラン−2−カルボン酸[3−(2−ブロモ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]アミドを白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.7および13.5(2ブロードs,1H,NH+互変異性体),12.8(ブロードs,1H,NH),7.65−7.82(m,3H),7.49および7.55(2t,1H,互変異性体),7.36および7.41(2t,1H,互変異性体),6.58(d,1H),3.59(s,2H),3.56(t,4H),2.41(ブロードs,4H);HPLC/MS m/z:488.0,490.0[MH]+
シクロプロパンカルボン酸[3−(4−ヒドロキシ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]−アミドの合成
−78℃にて、CH2Cl2(2mL)中の3−(4−メトキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(100mg,0.41ミリモル)の攪拌懸濁液に、CH2Cl2中のBBr3の1M溶液を滴下した。反応混合物を室温まで一晩ゆっくりと温め、次いで、それを水でクエンチし、反応混合物をNaOHの1N水溶液でpH6に中和した。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥して、70mg(74%収率)の3−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを灰色がかった白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:9.8(ブロードs,1H),7.57(ブロードs,2H),7.42(d,2H),6.85(d,2H);HPLC/MS m/z:233.0[MH]+
3−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(60mg,0.259ミリモル)、PS−DMAP(Argonaut樹脂,1.05g,6等量)、および攪拌棒を充填したバイアルにTHF(2.5mL)およびシクロプロパン−塩化カルボニル(118μL,1.29ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて15時間攪拌し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,1.26g,20等量)で50℃にて48時間処理した。樹脂を濾過し、DMFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。溶離剤としてCH2Cl2中の0〜8%MeOHでのシリカゲルでの精製により、32mg(41%収率)のシクロプロパンカルボン酸[3−(4−ヒドロキシ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イル]−アミドを白色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:13.3(ブロードs、1H),12.6(ブロードs,1H),9.80(ブロードs,1H),7.52(d,2H),6.88(d,1H),1.98(m,1H),0.93(m,4H);HPLC/MS m/z:301.0[MH]+
(S)−酢酸1−[3−(2−クロロ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルカルバモイル]―エチルエステルの合成
無水エタノール(21mL)中の3−(クロロフェニル)−3−オキソ−プロピオニトリル(4.0g,22.2ミリモル)の溶液にヒドラジン水和物(6.5mL,134ミリモル)を加えた。反応混合物を80℃にて15時間攪拌し、次いで、それを真空中で濃縮し、溶離剤としてCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲル上で精製して、3.8g(87%収率)の5−アミノ−3−(2−クロロフェニル)ピラゾールを黄色固体として得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:11.7(ブロードs,1H),7.66(d,1H),7.48(d,1H),7.35(t,1H),7.30(t,1H),5.83(s,1H),4.84(ブロードs,2H);HPLC/MS m/z:194.1[MH]+
THF(150mL)中の5−アミノ−3−(2−クロロフェニル)ピラゾール(3.8g,19.6ミリモル)の溶液にベンゾイルイソチオシアネート(2.9mL,21.56ミリモル)を滴下した。反応混合物を室温にて4時間攪拌し、次いで、NaOHの4N水溶液(8mL)を加え、反応混合物を室温にて17時間更に攪拌した。反応混合物をHClの1N水溶液でpH7に中和し、EtOAcで抽出した(3回)。合わせた有機層を、溶離剤としてのCH2Cl2中の0〜10%MeOHでのシリカゲルで直接精製して、3.47g(72%収率)の[5−(2−クロロ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イル]−チオ尿素を黄褐色固体として得た。
氷酢酸(900mL)中の[5−(2−クロロ−フェニル)−2H−ピラゾール−3−イル]−チオ尿素(2.25g,8.9ミリモル)の溶液に、激しく攪拌しつつ、AcOH(20mL)中の臭素の1.5M溶液を加えた。得られた不均一混合物を室温にて2時間攪拌し、次いで、それを濃縮乾固した。水を加え、続いて、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液を加え、pH7に中和した。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空中で乾燥した。イソプロピルアルコールからの再結晶により、1.48g(66%収率)の3−(2−クロロ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミンを黄褐色固体として得た。1H−NMR(d4−MeOH)δ:7.64(ブロードs,1H),7.53(s,1H),7.42(m,2H);HPLC/MS m/z:251[MH]+
3−(2−クロロ−フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]チアゾール−5−イルアミン(30mg,0.12ミリモル)およびPS−DMAP(Argonaut樹脂,450mg,5等量)を充填したバイアルにTHF(0.8mL)および(S)−(−)−2−アセトキシプロピオニルクロライド(126mg,0.84ミリモル)を加えた。反応混合物を70℃にて一晩振盪し、次いで、室温まで冷却し、PS−トリスアミン(Argonaut樹脂,1.03g,30等量)で50℃にて4時間処理した。樹脂を濾過し、DMFで洗浄し、溶媒を蒸発させた。逆相調整用HPLCによる精製により、21mg(48%収率)の標記化合物を得た。1H−NMR(d6−DMSO)δ:7.78(ブロードm,1H),7.61(ブロードm,1H),7.47(ブロードm,2H),5.13(q,1H),2.09(s,3H),1.44(d,3H);HPLC/MS m/z:365.0[MH]+
二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの他の実施例
本明細書中に提供される方法によって製造された二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの更なる例を表1、および5〜10に記載する。
Figure 0004728965
本発明に含まれる二環ピラゾロキナーゼモジュレーターの他の実施例は以下の表2および3に記載される。
Figure 0004728965
Figure 0004728965
Figure 0004728965
実施例2:バイオアッセイ
当業者に知られたキナーゼアッセイを用いて、本発明の化合物および組成物の阻害活性を評価することができる。キナーゼアッセイは、限定されるものではないが、以下の実施例を含む。
これらのアッセイの目的では、キナーゼを以下の緩衝液中に10×仕上げ濃度まで予め希釈する。Blk、CSKおよびLynについては、緩衝液の組成は50mMトリスpH7.5、0.1mM EGTA、0.1mM Na3VO4、0.1%β−メルカプトエタノール、および1mg/ml BSAである。Abl、CDK1、CDK5、Aurora−A、cSRC、Flt3、Fyn、GSK3α、GSK3β、Lck、Rsk1、Rsk2、Rsk3、およびYesについては、緩衝液の組成は20mM MOPS、pH7.0、1mM EDTA、0.1%β−メルカプトエタノール、0.01%Brij−35.5%グリセロール、および1mg/ml BSAである。
キナーゼは、5〜10mUのキナーゼを含む25μlの最終反応容量でアッセイし、反応は必要であればほぼ500cpm/pmol濃度の特異的活性を有する(最終濃度)10mM酢酸マグネシウムおよび[γ−32P−ATP]のMgATPミックスの添加によって開始される。反応を室温にて40分間インキュベートし、次いで、5μlの3%リン酸溶液を加えることによって停止される。次いで、10μlの反応ミックスをFiltermat Aフィルターにスポットし、次いで、75mMリン酸中で5分間3回洗浄し、メタノール中で1回洗浄する。次いで、フィルターを乾燥し、シンチレーションカウントする。反応は、さらに、以下の表4に示すように反応用液およびペプチドを含む。
Figure 0004728965
FLT3アッセイ
本実施例はFLT3キナーゼドメインの使用を示すが、キナーゼアッセイは、例えば、全分子、キナーゼドメイン、またはその部分を含むFLT3の種々の形態を用いることができる。
材料:基質ペプチド=ポリ(Glu,Tyr)4:1=ポリEY(Sigma P−0275);βNADH(Sigma CAT#N−8129,FW=709.4);2M MgCl2;1M HEPES緩衝液,pH7.5;ホスホエノールピルベート=PEP(Sigma CAT#P−7002,FW=234);乳酸デヒドロゲナーゼ=LDH(Worthington Biochemical CAT#2756);ピルビン酸キナーゼ=PK(Sigma CAT#P−9136);ATP(Sigma CAT#A−3377,FW=551);Greiner 384−ウェルUVスタープレート;および精製され、自動リン酸化されたFLT3キナーゼドメイン(FLT3KD)。
ストック溶液:毎日新たに作製した10mM NADH(ミリQH2O中7.09mg/mL);−20℃にて貯蔵した1mg/mLのポリEY(ミリQH2O中);1mM DTTを補足した200mM HEPES緩衝液,pH7.5(10ml 1Mストック+40ml ミリQH2O);100mM MgCl2(5mL+95ml dH2O);−20℃で貯蔵した100mM PEP(dH2O中23.4mg/mL);−20℃で貯蔵した10mM ATP(dH2O中5.51mg/mL)(1mLを合計10mLのミリQH2Oに毎日希釈=1mM ATP作業ストック);液体N2下でフラッシュ凍結し、−80℃で貯蔵した1000U/mL PK(U/mgはロットで変化する);液体N2下でフラッシュ−凍結し、−80℃で貯蔵した1000U/mL LDH(U/mgはロットで変化する)。
384ウェルフォーマット(50μl反応)についての標準アッセイ設定:300μM NADH;10mM MgCl2;2mM PEP;45U/mL PK;60U/mL LDH;1mg/mLポリEY;2.5μLテスト化合物(DMSO中);10μg/mL自動リン酸化FLT3キナーゼドメイン;250μM ATP*;100mM HEPES緩衝液;50μLまでミリQdH2OでQS。陽性対照はテスト化合物を含まないDMSOを含有した。陰性対照は5μlの0.5M EDTA(アッセイ中50mM)を含有した。キナーゼ反応はATPの添加によって時刻t=0で開始した。
生産された未リン酸化FLT3KDは、自動リン酸化および十分なキナーゼ活性を可能とするためにMgATPとのプレインキュベーションを必要とした。自動リン酸化反応はATPおよびMgCl2を、各々、2mMおよび10mMの最終濃度まで添加することによって、100mM HEPES緩衝液、1mM DTT、および1mg/mL FLT3KDにおいて行った。反応を室温で90分間進行させ、次いで、EDTAを50mMまで添加することによってクエンチした。次いで、自動リン酸化タンパク質をアリコットし、用いるために液体N2中にフラッシュ凍結した。
活性は、340nmにおける吸光度スペクトロスコピーによるNADHの時間依存性喪失に従って測定した。得られた進行曲線の直線部分を、次いで、直線回帰によって分析して、その最良フィット線の傾きとして吸光度単位/時間で表した活性を得た(モル/単位時間は、340nm、6250M-1cm-1におけるNADHについてのモル消光係数を用いることから計算することができる)。
データは、方程式:Z’=1−[3*(σ++σ-)/|μ+−μ-|]を用いて分析し、μは平均を示し、σは標準偏差を示す。添え字は陽性または陰性対照を示す。頑強なスクリーニングアッセイについてのZ’スコアは≧0.50とすべきである。典型的な閾値はμ+−3*σ+である。閾値未満のいずれの値も「hit」と表した。
用量応答は方程式:y=min+{(max−min)/(1+10[化合物]-logIC50)}を用いて測定し、yは観察された初期傾きであり、maxは阻害剤の非存在下における傾きであり、minは無限阻害剤における傾きであって、IC50は合計観察振幅(振幅=max−min)の1/2に対応する[化合物]である。IC50は以下の方程式:IC50=Ki(1+[ATP]/Km)によってKiに関連する。
FLT3KDの変調、活性化または阻害を測定するために、テスト化合物をある範囲の濃度においてアッセイに加えた。阻害剤は、μMの範囲、nMの範囲および、例えば、サブナノモラーの範囲においてIC50でFLT3KD活性を阻害することができる。
化合物のFLT3またはFLT3KDへの結合を測定するためには、Discoverx(Fremont,CA)によって製造されたテストキット、ED−スタウロスポリンNSIP(商標)酵素結合アッセイキット(米国特許第5,643,734号参照)を用いた。
結果を以下の表5および6に示す。
Figure 0004728965
表5においては、Aは<1μMであり、Bは1〜10μMであって、Cは11〜100μMである。
Figure 0004728965
表6においては、AはIC50<0.1μMであり;Bは0.1μM<IC50<1μMであり;およびCはIC50>1μMである。
Ablアッセイ
本実施例はAbl T315I 0−Pの突然変異体形態のキナーゼドメインの使用を表すが、キナーゼアッセイは、例えば、全分子、キナーゼドメイン、またはその部分を含む、突然変異体および野生型Ablの種々の形態を用いることができる。アッセイで用いるキナーゼは種々のリン酸化状態のものであってもよい。本実施例においては、ゼロリン酸化状態における突然変異体キナーゼを用いた。
材料:Abl基質ペプチド=EAIYAAPFAKKK−OH(Biopeptide,SD CA);βNADH(Sigma CAT#N−8129,FW=709.4);2M MgCl2; 1M HEPES緩衝液,pH7.5;ホスホエノールピルベート=PEP(Sigma CAT#P−7002,FW=234);乳酸デヒドロゲナーゼ=LDH(Worthington Biochemical CAT#2756);ピルビン酸キナーゼ=PK(Sigma CAT#P−9136);ATP(Sigma CAT#A−3377,FW=551);Greiner 384ウェルUVスタープレート;および精製された未リン酸化T315I Ablキナーゼドメイン(クローン5582d42PPt6p6)。
ストック溶液:毎日新たに作製した10mM NADH(ミリQH2O中の7.09mg/mL);−20℃で貯蔵した10mM Abl基質ペプチド(ミリQH2O中13.4mg/mL);100mM HEPES緩衝液,pH7.5(5mL 1Mストック+45mL ミリQH2O);100mM MgCl2(5mL 2M MgCl2+95ml dH2O);−20℃で貯蔵した100mM PEP(dH2O中23.4mg/mL);−20℃で貯蔵した10mM ATP(dH2O中5.51mg/mL)(50μLを合計10mLミリQH2Oに毎日希釈=50μM ATP作業ストック);液体N2下でフラッシュ凍結し、−80℃で貯蔵した1000U/mL PK(U/mgはロットで変化する);および液体N2下でフラッシュ凍結し、−80℃で貯蔵した1000U/mL LDH(U/mgはロットで変化する)。
384ウェルフォーマット(50μL反応)についての標準アッセイ設定:300μL NADH;10mM MgCl2;2mM PEP;45U/mL PK;60U/mL LDH;200μM Abl基質ペプチド;2.5μLテスト化合物(DMSO中);2μg/mL Ablキナーゼドメイン;10μM ATP;100mM HEPES緩衝液;ミリQ dH2Oで50μLでQS;陽性対照はテスト化合物を含まないDMSOを含有した。陰性対照は5μLの0.5m EDTA(アッセイ中50mM)を含有した。c−Abl T315I突然変異体の脱リン酸化形態を生化学スクリーニングアッセイで用いた。キナーゼ反応はATPの添加によって時刻t=0において開始した。
活性は、340nmにおける吸光度スペクトロスコピーによってNADHの時間依存性喪失に従うことによって測定した。得られた進行曲線の直線部分を、次いで、直線回帰によって分析して、その最良のフィット線の傾きとして報告された、吸光度単位/時間で表した活性を得た(モル/単位時間は、340nm,6250M-1cm-1におけるNADHについてのモル消光係数を用いることから計算することができる)。
データは方程式:Z’=1−[3*(σ++σ-)/|μ+−μ-|]を用いて分析し、μは平均を示し、σは標準偏差を示す。添え字は陽性または陰性対照を示す。頑強なスクリーニングアッセイについてのZ’スコアは≧0.50とすべきである。典型的な閾値はμ+−3*σ+である。閾値未満のいずれの値も「hit」と表した。
用量応答は方程式:y=min+{(max−min)/(1+10[化合物]-logIC50)}を用いて測定し、yは観察された初期傾きであり、maxは阻害剤の非存在下における傾きであり、minは無限阻害剤における傾きであって、IC50は合計観察振幅(振幅=max−min)の1/2に対応する[化合物]である。
AblKDの変調、活性化または阻害を測定するためには、テスト化合物をある範囲の濃度にてアッセイに加えた。阻害剤は、μMの範囲、nMの範囲、例えば、サブnMの範囲において、IC50でAblKD活性を阻害することができる。
AblまたはAblKDへの化合物の結合を測定するために、Discoverx(Fremont、 CA)によって製造されたテストキット、ED−スタウロスポリンNSIP(登録商標)酵素結合アッセイキット(米国特許第5、643、734号)を用いた。結果を以下の表7および8に示す。
Figure 0004728965
表7において、Aは<1μMであり、Bは1〜10μMであって、Cは11〜100μMである。
Figure 0004728965
表8において、AはIC50<0.5μMであり;Bは0.5μM<IC50<1μMであり;CはIC50>1μMである。
METおよびRONアッセイ
本実施例は野生型METおよびRON M1243Tの使用を示すが、キナーゼアッセイは、例えば、全細胞内ドメイン、キナーゼドメイン、またはその部分を含む、突然変異体および野生型RONまたはMETの種々の形態を用いることができる。該アッセイで用いられるキナーゼもまた種々のリン酸化状態のものであってもよい。RONの場合には、ゼロリン酸化状態における突然変異体キナーゼを用いた。
METおよびRONアッセイでは、Kinase−Glo(商標)アッセイシステム(Promega)を用い、キナーゼ反応に従ってATPの量を検出するためにホタルルシフェラーゼを使用する。このアッセイシステムは2つの工程を有する。まず、キナーゼ反応を指定された時間の間実行する。次に、等しい容量のKinase−Glo試薬を加えて、キナーゼ反応をクエンチし、試料に残存するATPを検出する。合計光出力をプレート−リーディングルミノメーターによって読みとり、得られたシグナルは4時間安定である。キナーゼ活性の阻害はより低いATP消費、従って、検出工程の間のより高い光出力に翻訳される。
材料:ポリEY4:1(Sigma);MgCl2(Lab Supportから入手可能な2Mストック);HEPES緩衝液、 pH7.5;ウシ血清アルブミン(Roche 92423420);ATP(Sigma CAT#A−3377、 FW=551);White Costar384ウェル平底プレート(VWR 29444−088); およびSGX RONキナーゼクローン(M1254T活性化ループ突然変異体)またはSGX METキナーゼクローン。
MET酵素ミックス:100mM HEPES pH7.5、 10mM MgCl2、 0.3mg/mLポリEY、 0.1%BSA、 および0.4μg/mL METキナーゼ。
RON酵素ミックス:100mM HEPES pH7.5、 10mM MgCl2、 1mg/mLポリEY、 0.1%BSA、 および3〜5μg/mL RONキナーゼ(酵素製剤に依存)。
マルチウェルプレートの各ウェルに15μLの酵素ミックス、所望の最終アッセイ濃度の20倍の1μLの化合物(または陽性対照のためのDMSO、または陰性対照のための200μMスタウロスポリン)、および4μLの50μM ATPを加えて、反応を開始させた。キナーゼの反応をMETアッセイのために室温にて60分間進行させた。RONアッセイでは、反応を(酵素製剤に応じて)室温にて60分〜120分間進行させた。次いで、20μLのKinase−Glo試薬を各ウェルに加えた。プレートを読みとる前に、試薬を少なくとも10分間インキュベートした。
Ablアッセイにおいて前記したもの(Firepower(商標)、 Exegetix)と同様な方法を用いてデータの分析を行った。
アッセイの結果を以下の表9に示す。
Figure 0004728965
表9においては、AはIC50<5uMであり、Bは5uM<IC50<20uMであって、CはIC50>20uMである。
実施例3:選択されたキナーゼの調製および発現
ヒトFLT3の調製
バイオアッセイのためのFLT3キナーゼドメインは、例えば、以下のようにして調製した。製造業者の指示に従って、標準的なcDNA合成キットを用いてヒト肝臓cDNAを合成した。cDNA合成用の鋳型は、標準的なRNA単離キットを用いてHepG2細胞[ATCC HB−8065]から単離されたmRNAであった。FLT3キナーゼドメイン(FLT3KD)用のオープンリーディングフレームは、以下のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応(PCR)によってヒト肝臓cDNAから増幅した。
順方向プライマー:CACAAGTACAAAAAGCAATTTAGGTATG
逆方向プライマー:CCGAATCTTCGACCTGAG。
PCR生成物(予測された840塩基対)を1.2%E−ゲル(カタログ番号G5018−01、 Invitrogen Corporation)での電気泳動に付し、適当なサイズのバンドをゲルから切り出し、標準的なゲル抽出キットを用いて溶出させた。溶出させたDNAを、Invitrogen Corporationによって適合された慣用的TOPOであるGATEWAY(登録商標)(Invitrogen Corporation)適合pcDNA6 AttB HisCベクターにTOPO連結した。停止部位を介する開始配列からの、ベクターにTOPO連結された後の、遺伝子の得られた配列は以下の通りであった:ATG GCC CTT 3’[FLT3KD]5’AA GGG CAT CAT CAC CAT CAC CAC TGA。このベクターを用いて発現されたFLT3KDはN末端メチオニン、FLT3KDのキナーゼドメイン、およびC末端6× His−タグを有した。
TOPO連結インサートを含有するプラスミドを化学的にコンピテントTOP 10細胞(Invitrogen Corporation、 カタログ番号C4040−10)に形質転換した。次いで、コロニーを正しい向きのインサートにつきスクリーニングし、製造業者の指示に従い、標準キットを用い、2ml培養からの「ミニプレップ」手法を用いて少量のDNAを精製した。これに続いての標準的分子生物学プロトコルについては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,2001,およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989に記載された技術も参照されたし。次いで、「正しい」向きにあるDNAを配列確認した。
標準的なGATEWAY(登録商標)BP組換えをpDONR201(Invitrogen Corporation、 カタログ番号11798014、 Gateway technology カタログ番号11821014)に行い、組換え反応を化学的にコンピテントなTOP 10細胞(Invitrogen Corporation、 カタログ番号C4040−10)に形質転換し、選択培地上で平板培養した。1つのコロニーをミニプレップに拾い、DNAが得られた(「エントリーベクター」)。
「エントリーベクター」DNAを、pDEST8(登録商標)(Invitrogen Corporation、 カタログ番号11804010)での標準GATEWAY(登録商標)LR組換えで用い、化学的にコンピテントTOP 10細胞(Invitrogen Corporation、 カタログ番号C4040−10)に形質転換し、選択培地上で平板培養した。1つのコロニーをミニプレップに拾い、DNAが得られた(「目的地ベクター」)。
次いで、「目的地ベクター」を、部位特異的トランスポジションを用いて、外来性遺伝子をE.coli中で増殖したバクミドに挿入するDH10 BAC化学的コンピテント細胞(Invitrogen Corporation、 カタログ番号10361012)に形質転換した。次いで、形質転換を選択培地上で平板培養した。1〜2のコロニーをミニプレップに拾った。Nautilus Genomicミニプレップキット(Active Motif、 カタログ番号5005。)を用いて、バクミドDNAを精製した。次いで、PCRによってバクミドを確認した。
以下の標準Bac〜Bacプロトコル(Invitrogen Corporation、 カタログ番号10359−016)を用いて、プラスミドをトランスフェクトし、SF9細胞で発現させた。
0日目:1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen Corporation、 カタログ番号15140122)を含有する2ml Sf−900II SFM(Invitrogen Corporation、 カタログ番号10902−104)中の35mmウェル(6ウェルプレートの)当たり9×10E5細胞を接種した。細胞を27℃にて1時間結合させた。Falcon 2059ポリプロピレンの12×75mmチューブ中で、以下の溶液を調製した。5μlのFLT3KDミニプレップバクミドDNA(Active Motif、 Nautilus Genomic DNAミニキット カタログ番号50050)を、ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない100μlのSf−900II SFMに希釈した。6μlのCellFECTIN試薬(Invitrogen Corporation、 カタログ番号10362−010)を、ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない100μlのSf−900II SFMに希釈した。2つの溶液を一緒に合わせ、室温にて30分間インキュベートした。古い培地を吸引し、ペニシリン/ストレプトマイシンを含まないSf−900II SFMを加えることによって、細胞を1回洗浄した。培地を除去し、ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない0.8mlのSf−900II SFMを各ウェルに加えた。脂質/DNAをウェルに加えた。27℃のインキュベーター中で5時間インキュベートした。培地を除去し、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する2mlのSf−900II SFMで置き換えた。27℃のインキュベーター中に入れた。
3日目、P1〜P2:T75組織培養フラスコ中で、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する合計容量14mlのSf−900II SFM中に6×10E6 SF9細胞を接種した。1時間結合させた。5mlのピペットを用い、感染性P1 FLT3KDバキュロウィルス粒子を含有する上清を6ウェルのトランスフェクトされたウェルから除去し、T75フラスコに直接移した。27℃のインキュベーターに入れた。
10日目、P2〜P3:10日目において、培地を激しくピペッティングして、細胞をフラスコの壁から取り出すことによって、FLT3KDバキュロウィルス上清および細胞を収穫した。培地および細胞を15mlの滅菌したコニカルチューブにピペットで入れ、2000rpmにて、室温で5分間チューブを遠心した。上清を保存した(P2)。ウェスタンブロットによるタンパク質発現につき細胞を分析した。
P3感染:合計容量100mlにおいて、ml当たり2×10E6細胞にて、SF21細胞を500mlの懸濁フラスコに接種した。P2発現からの感染性FLT3KD上清(14ml)を懸濁フラスコに加えた。27℃にてインキュベートし、120〜130rpmで振盪した。72時間タンパク質を発現させた。
1mlの細胞を収穫し、ウェスタンブロットして、発現を測定した:室温における15分間の3000rpm遠心によってP3上清を収穫した。ウィルス上清を滅菌濾過した。
FLT3KDスケールアップ:2リットルの懸濁フラスコ中1リットルの細胞にて、ml当たり2×10E6細胞で6リットルのSF21細胞を接種した。リットル当たり15mlのP3 FLT3KDバキュロウィルスで細胞を感染させた。27℃にてインキュベートし、120〜130rpmで振盪した。48時間タンパク質を発現させた。各リットルから1ml細胞を収穫し、ウェスタンブロットして、発現を測定した。残存する細胞を遠心によって収集し、ペレットを−80℃で貯蔵した。室温で解凍した後、細胞をクラッキンング緩衝液(50mM トリス−HCl、pH8.0;200mMアルギニン;150mM NaCl;10%グリセロール;0.1%Igepal630)に溶解させ、遠心して、細胞デブリスを除去した。可溶性画分を、ニッケルを充填したIMACカラム(Pharmacia、 Uppsala、 Sweden)で精製し、50mMトリスpH7.8、10mMメチオニン、10%グリセロール中の400mMイミダゾールの工程グラジエントを用いる天然条件下で溶出させた。次いで、GF4緩衝液(10mM HEPES、 pH7.5、 10mMメチオニン、 500mM NaCl、 5mM DTT、 および10%グリセロール)中で平衡化したSuperdex200分取用グレードカラムを用いるゲル濾過によって、FLT3KDタンパク質を精製した。精製されたFLT3キナーゼドメインを含有する画分をプールし、1〜5mg/mlまで濃縮した。
Flt3、または例えばキナーゼドメインのようなその部分も、当業者に知られた方法に従って精製することができる。アッセイ用のFlt3を得るのに用いる方法の例は、限定されるものではないが、Weisberg,Ellen,et al.,Cancer Cell 1:433−43,(2002)に示されているものを含む。
前記プロテインキナーゼ発現方法をFLT3の発現を記載することによって例示したが、同様な方法、または当分野で一般的に知られた方法を用いて他のプロテインキナーゼ(例えば、MET、およびRON)を発現させた。
ヒトAbl調製
ラムダホスファターゼ共発現プラスミドを以下のようにして構築した。
以下のプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応(PCR)によって、AuroraキナーゼについてのオープンリーディングフレームをHomo sapience(ヒト)HepG2 cDNA ライブラリー(ATCC HB−8065)から増幅した。
順方向プライマー:TCAAAAAAGAGGCAGTGGGCTTTG
逆方向プライマー:CTGAATTTGCTGTGATCCAGG。
PCR生成物(予測された795塩基対)を以下のようにゲル精製した。PCR産物をTAE緩衝液にての1%アガロースゲル上の電気泳動に付し、適当なサイズのバンドをゲルから切り出し、標準的なゲル抽出キットを用いて溶出させた。溶出させたDNAをトポイソメラーゼで室温にて5分間pSB2−TOPOに連結させた。ベクターpSB2−TOPOはpET26bのトポイソメラーゼ活性化修飾バージョン(Novagen、 Madison、 Wisconsin)であり、以下の配列がNdeI部位に挿入されており:CATAATGGGCCATCATCATCATCATCACGGT GGTCATATGTCCCTT、および以下の配列がBamHI部位に挿入されている:AAGGGGGATCCTAAACTGCAGAGATCC。「元の」NdeI部位、停止部位および「元の」BamHI部位を通じシャイン−ダルガルノ配列からの、得られたプラスミドの配列は以下の通りである:
AAGGAGGAGATATACATAATGGGCCATCATCATCATCATCACGGTGGTCATATGTCCCTT[ORF]AAGGGGGATCCTAAACTGCAGAGATCC。このベクターを用いて発現されたAuroraキナーゼはN末端に付加された14アミノ酸(MetGlyHisHisHisHisHisHisGlyGlyHisMetSerLeu)およびC末端に付加された4つのアミノ酸(GluGlyGlySer)を有する。
次いで、ラムダバクテリオファージからのホスファターゼ遺伝子を前記プラスミド(Matsui T,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2001,284:798−807)に挿入することによって、ホスファターゼ共発現プラスミドを作成した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、鋳型ラムダバクテリオファージDNA(HinDIII digest、 New England Biolabs)からPCRを用いてホスファターゼ遺伝子を増幅した:
順方向プライマー(PPfor):GCAGAGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACGGATGGAGTGAAAGAGATGCGC
逆方向プライマー(PPrev):GGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATCATGCGCCTTCTCCCTGTAC。
PCR産物(予測された744塩基対)をゲル精製した。次いで、精製されたDNAおよび非共発現プラスミドDNAをSacIおよびXhoI制限酵素で消化した。次いで、消化されたプラスミドおよびPCR産物双方をゲル精製し、T4 DNAリガーゼで16℃にて8時間一緒に連結し、標準的な手法を用いてTop10細胞に形質転換した。共発現プラスミドにおけるホスファターゼ遺伝子の存在を配列決定によって確認した。ここに従う標準的な分子生物学プロトコルについては、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,2001,および Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989に記載された技術も参照されたし。
該共発現プラスミドが、各々がそれ自身のリボソーム結合部位を持つ、lacプロモーターの制御下にあるAuroraキナーゼおよびラムダホスファターゼ遺伝子を共に含有する。標的遺伝子の下流の、多重クローニング部位の中央にホスファターゼをクローニングすることによって、便宜な制限部位が、ホスファターゼを他のプラスミドにサブクローニングするのに利用できる。これらの部位はキナーゼおよびホスファターゼの間にSacI、SalIおよびEcoRI、およびホスファターゼの下流にHinDIII、NotIおよびXhoIを含む。
プロテインキナーゼ発現
以下のプライマーを用いるPCRによって、商業的に入手可能なキット(Invitrogen)を用いて新たに収穫されたマウス肝臓から調製されたMus musculus(マウス)cDNAライブラリーから、c−Ablについてのオープン−リーディングフレームを増幅した。
順方向プライマー:GACAAGTGGGAAATGGAGC
逆方向プライマー:CGCCTCGTTTCCCCAGCTC。
PCRクリーンアップキット(Qiagan)を用い、PCR産物(予測された846塩基対)をPCR反応混合物から精製した。精製されたDNAをトポイソメラーゼで室温にて5分間pSGX3−TOPOに連結した。ベクターpSGX3−TOPOはpET26b(Novagen、 Madison、 Wisconsin)のトポイソメラーゼ活性化修飾バージョンであり、以下の配列がNdeI部位に挿入されており:CATATGTCCCTT、かつ以下の配列がBamHI部位に挿入されている:AAGGGCATCATCACCATCACCACTGATCC。停止部位およびBamHI部位を通じてシャイン−ダルガルノ配列からの、得られたプラスミドの配列は以下の通りである:AAGGAGGA GATATACATATGTC CCTT[ORF]AAGGGCATCATCACCATCACCACTGATCC。このベクターを用いて発現されたc−AblはN末端に付加された3つのアミノ酸(Met Ser Leu)、およびそのC末端に付加された8つのアミノ酸(GluGlyHisHisHisHisHisHis)を有した。
次いで、実施例1のAurora共発現プラスミドからのホスファターゼを前記プラスミドにサブクローニングすることによって、c−Abl/ホスファターゼ共発現プラスミドを作製した。Aurora共発現プラスミドおよびAbl非共発現プラスミドを共に制限酵素EcoRIおよびNotIで3時間消化した。DNA断片をゲル精製し、Auroraプラスミドからのホスファターゼ遺伝子を、消化されたc−Ablプラスミドと16℃にて8時間連結し、Top10細胞に形質転換した。得られた構築体におけるホスファターゼ遺伝子の存在は、制限消化分析によって確認した。
このプラスミドがc−Ablおよびラムダホスファターゼ共発現につきコードする。それは、他の標的タンパク質をこのホスファターゼ共発現プラスミドにサブクローニングするのに用いることができる標的遺伝子の上流の、2つの独特の制限部位XbaIおよびNdeIのさらなる利点を有する。
Abl T315Iのためのプラスミドは、製造業者の提唱する手法および以下のオリゴヌクレオチドと共にQuick Change突然変異誘発キット(Stratagene)を用いてAblプラスミドを修飾することによって調製した。
Mm05582dS4 5’−CCACCATTCTACATAATCATTGAGTTCATGACCTATGGG−3’
Mm05582dA4 5’−CCCATAGGTCATGAACTCAATGATTATGTAGAATGGTGG−3’。
ホスファターゼ共発現プラスミドからのタンパク質は以下のようにして精製した。非共発現プラスミドを化学的にコンピテントBL21(DE3)Codon+RIL(Stratagene)細胞に形質転換し、共発現プラスミドをBL21(DE3)pSA0145(ラムダファージの溶解遺伝子を発現し、凍結および解凍に際して溶解する株(Crabtree S、 Cronan JE Jr. J Bacteriol 1984 Apr;158(1):354−6))に形質転換し、カナマイシンと共にLB寒天を含有するペトリー皿に平板培養した。単離された単一コロニーを中期log相まで増殖させ、15%グリセロールを含有するLB中で−80℃で貯蔵した。このグリセロールストックをカナマイシンを含むLB寒天プレート上で画線培養し、単一コロニーを用いて、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むLBの10ml培養を接種し、これを振盪しつつ30℃にて一晩インキュベートした。この培養を用いて、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む500mlのLBを含有する2Lフラスコを接種し、これを37℃にて中期log相まで増殖させ、0.5mM最終濃度までのIPTGの添加によって誘導した。誘導の後、振盪しつつフラスコを21℃にて18時間インキュベートした。
c−Abl T315I KDは以下のようにして精製した。細胞を遠心によって収集し、超音波処理を用いて希釈されたクラッキング緩衝液(50mMトリスHCl、 pH7.5、 500mM KCl、 0.1%Tween20、 20mMイミダゾール)に溶解させ、遠心して、細胞デブリスを除去した。可溶性画分を、ニッケルを充填したIMACカラム(Pharmacia、 Uppsala、 Sweden)で精製し、50mMトリス、pH7.8、500mM NaCl、10mMメチオニン、10%グリセロール中の20mM〜500mMイミダゾールの匂配にて、天然条件下で溶出させた。次いで、GF5緩衝液(10mM HEPES、 pH7.5、 10mMメチオニン、 500mM NaCl、 5mM DTT、 および10%グリセロール)中で平衡化したSuperdex75分取用グレードカラムを用いるゲル濾過によって、タンパク質をさらに精製した。精製されたc−Abl T315I KDキナーゼドメインを含有する画分をプールした。得られたタンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって判断して98%純度であった。精製されたタンパク質の質量分光分析は、それが圧倒的に単一にリン酸化されていることを示した。次いで、以下の条件:100Uエビアルカリ性ホスファターゼ/mgのc−Abl T315I KD、100mM MgCl2、および250mMのさらなるNaCl下で、タンパク質をエビアルカリ性ホスファターゼ(MBI Fermentas、 Burlington、 Canada)で脱リン酸化した。反応を23℃にて一晩行った。タンパク質は質量分光分析によってリン酸化されていないと判断された。いずれの沈殿も回転させ、可溶性画分を、GF4緩衝液(10mM HEPES、 pH7.5、 10mMメチオニン、 150mM NaCl、 5mM DTT、 および10%グリセロール)中で平衡化させたSuperdex75分取用グレードカラムを用いるゲル濾過によって反応体から分離した。
実施例4:細胞アッセイ
Flt3細胞系の選択は、以下の2つの公知の方法に従って行った:Kelly,et al.,Cancer Cell 1:421−32(2002);およびYe,et al.,Blood 100:2941−2949(2002)。MV4−11およびTHP細胞を、10%胎児ウシ血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したIscoveの修飾されたダルベッコ培地中に維持し、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび5ng/ml組換えマウスIL3を補足したRPMI 1640にBa/F3細胞を維持した。
細胞の生存アッセイ
化合物は三連にて以下のアッセイの双方でテストした。
96ウェルXTTアッセイ:細胞を、96ウェルプレートにて、種々の濃度の化合物(三連)を含有するそれらの増殖培地中で37℃にて72時間増殖させる。出発細胞数はウェル当たり8000細胞であって、容量は120μlである。72時間のインキュベーションの最後に、40μlのXTT標識混合物(3’−[1−(フェニルアミノカルボニル)−3、4−テトラゾリウム]−ビス(4−メトキシ−6−ニトロ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物および電子カップリング試薬:PMS(N−メチルジベンゾピラジンメチルスルフェート)の50:1溶液)をプレートの各ウェルに加える。37℃におけるさらに2時間のインキュベーションの後、650nmにおいてバックグラウンドを修正した405nmにおける吸光度の読みとりを、スペクトロフォトメーターを用いて行う。
384ウェルAlamarBlueアッセイ:DMSO中の0.5μlの化合物またはDMSOのみを予めプリントした384ウェルプレートの各ウェルに90μlの細胞懸濁液を平板培養する。出発細胞数はウェル当たり4000細胞である。72時間のインキュベーションの後、次いで、10μlのAlamarBlue溶液(PBS中440μMレサズリン)をプレートの各ウェルに加える。37℃におけるさらに2時間のインキュベーションの後、535nmにおける励起および591nmにおける発光でのTECANプレートリーディングを用い、蛍光を測定する。
結果を以下の表10に示す。
Figure 0004728965
表10において、Aは<1μMであり、Bは1〜10μMであって、Cは11〜100μMである。
細胞スクラッチアッセイ
表11は、本細胞スクラッチアッセイで用いた試薬を示す。
Figure 0004728965
MDCK、A549、A431、T24、H441およびSW579細胞系を、24時間後に融合性単層を与えるであろう密度にて、+/−HGFおよび+/−化合物につき三連で、6ウェルトレイに平板培養した。融合性単層をさらに48時間インキュベートして、細胞間結合を成熟させ、その後、24時間血清−飢餓とした。200μlのピペット先端の先端で掻き取ることによって、直線状の創傷を単層上に生じさせた。
結合しなかった細胞をPBSおよびアッセイ培地(1%ピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%NEAA、90ng/mlおよび+/−化合物における+/−肝細胞成長因子(「HGF」)を含むOpti−MEM)で洗浄除去した。24時間後、テスト化合物の存在下または非存在下でHGFを細胞に加えた。細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、細胞を固定し、PBS中の10%ホルマリンおよび0.2%クリスタルバイオレットで室温にて10分間染色した。次いで、ウェルを、1mlのPBSを各ウェルに加えてPBSで5回洗浄し、写真を撮影した。写真を精査して、テスト化合物が直線状の創傷領域内で細胞成長を低下させることに成功したか否かを判断した。
以下の化合物は、細胞スクラッチアッセイにおいて阻害特性を呈することが示された。
Figure 0004728965
および
c−MET ホスホ−ELISAアッセイ
表12は、本c−Metホスホル−ELISAアッセイで用いた試薬を示した。
Figure 0004728965
細胞を10mlの合計容量中で3×105細胞/ml(合計3×106)にて細胞を平板培養し、二連にて100mm皿に入れ、5%CO2にて37℃で一晩インキュベートした。アッセイの前日、細胞をPBSで1回洗浄し、10mlのアッセイ培地(Opti−MEM I、1%NEAA、1%ピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む還元血清培地)を細胞の各プレートに加えた。
プレートの適当なウェルに90ng/mlのHGFを加え、続いて、5%CO2下で37℃において10分間インキュベートした。10分間のインキュベーションの最後に、溶解緩衝液をプレート上の各ウェルに加えて、氷上にてμl当たり2×10e4の最終細胞密度とした。細胞を細胞スクレーパーで掻き取り、エッペンドルフチューブにピペットでいれ、氷上で15分間インキュベートした。細胞を14,000gにて5分間遠心した。150μlの溶解物を、プレートの列を横切る連続希釈のために、プレート上のウェルにピペットで入れた。ELISAプレートを作成するために、商業的に入手可能なウサギ抗Met抗体を、コーティング緩衝液(0.1M炭酸ナトリウム、 pH9.5)中で0.125μg/mlのα−c−MetAbの濃度で調製し、プレート当たり10ml平板培養した(12.5μl 100μg/ml Ab/10ml)。高結合マルチウェルプレートにおいて、コーティング緩衝液中の100μlのAbを各ウェルに加え、各プレートをプレートシーラーで被覆し、4℃にて一晩インキュベートした。
過剰の抗体を除去し、ELISAプレートを200μlの洗浄緩衝液(PBS中0.05%Tween、 pH7.4)で4回洗浄した。150μlの溶解物をウェル当たり加え、プレートの列を横切って、連続的に希釈した。プレートをシールし、室温にて2時間インキュベートした。検出抗体(α−p−Y 4G 10、 Upstate)をアッセイ希釈剤中で調製した。抗体をアッセイ希釈剤中で1:1000希釈し(ストック=2μg/μl、 100μl中200μg;f.c.=2μg/ml)、プレート当たり10mlの希釈された抗体を加えた。溶解物をELISAプレートから取り出し、ウェル洗浄緩衝液当たり200μlでウェルを4回洗浄した。100μlの検出抗体を各ウェルに加えて、被覆し、室温にて1時間インキュベートした。過剰の検出抗体をELISAプレートから除去し、洗浄緩衝液当たり200μlでウェルを4回洗浄した。
2次抗体、ヤギ抗ウサギHRPをアッセイ希釈剤中に1:3000希釈し(10ml希釈剤当たり3.33μl)、プレート当たり10mlの希釈された抗体にて加えた。過剰の2次抗体をELISAプレートから除去し、洗浄緩衝液のウェル当たり200μlでプレートを4回洗浄した。
基質試薬Aおよび基質試薬B(カタログ番号37070、 Pierceからの SuperSignal ELISA Pico化学発光基質)を使用直前に加えた(プレート当たり10mlの得られた溶液)。ウェル当たり100μlの基質を加え、1分間混合し、ルミノメーターで可視化した。

Claims (27)

  1. 式:
    Figure 0004728965
    [式中、
    xは−S−であり
    1は−C(Z)−、または−SO2−であり、
    ここで、Zは=O、=S、または=NR11であり、
    ここで、R11は水素、−OH、シアノ、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり;そして
    1は水素、−CF3、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR12、または−NR1314であり、ここで、
    12は、水素、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択され、
    13およびR14は、独立して、置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールから選択され、ここで
    13およびR14は、任意で、連結して、それらが結合する窒素と共に環を形成してもよく、ここで、前記環は置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり;
    2は置換されたまたは置換されていないアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロアルキル、置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    ここで、R2は炭素原子を介して前記分子の残りに結合して、炭素−炭素結合を形成し、そして
    2が置換されていないフェニルであり、XがSであり、L1が−C(Z)−であって、Zが=Oであれば、R1は置換されていないフェニルではない]
    を有する化合物。
  2. Xが−S−であって、L1が−C(Z)−であり、ここで、Zが=Oである、請求項1に記載の化合物。
  3. 2が置換されたまたは置換されていないC1−C20アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜20員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C8シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜8員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである、請求項1に記載の化合物。
  4. 2が置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである、請求項1に記載の化合物。
  5. 2が、
    (1)置換されていないC1−C10アルキル;
    (2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;
    (3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;
    (4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (5)置換されていないアリール;
    (6)置換されていないヘテロアリール;
    (7)置換されたC1−C10アルキル;
    (8)置換された2〜10員ヘテロアルキル;
    (9)置換されたC3−C7シクロアルキル;
    (10)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (11)置換されたアリール;または
    (12)置換されたヘテロアリールであり;
    ここで、
    (7)、(8)、(9)、または(10)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L22−C(O)R3、−L22−OR4、−L22−NR45、OR4、または−L22−S(O)m6で置換されており、
    (11)または(12)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L22−C(O)R3、−L22−OR4、−L22−NR45、または−L22−S(O)m6で置換されており、
    3が水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR31、または−NR3233であり、ここで、
    31、R32、およびR33は、独立して、水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    4およびR5が、独立して、水素、−CF3、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、R22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、または−C(O)R41であり、ここで、
    41は水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    6が水素、R21−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R21−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R22−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    22は結合、置換されていないC1−C10アルキレン、または置換されていないヘテロアルキレンであり、
    mは0、1または2であり、
    21はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、アミノ、ハロゲン、R23−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R24−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR24−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    22は−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、R23−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R23−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R24−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR24−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    23はオキソ、−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、置換されていないヘテロアリールであり、そして
    24は−OH、−COOH、アミノ、ハロゲン、−CF3、置換されていないC1-C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、置換されていないヘテロアリールである、請求項1に記載の化合物。
  6. 21またはR22が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルであれば、前記ヘテロシクロアルキルがヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである、請求項5に記載の化合物。
  7. 21またはR22が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであれば、前記ヘテロアリールがピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである、請求項5に記載の化合物。
  8. 2が置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである、請求項5に記載の化合物。
  9. 2が置換されたまたは置換されていないシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアルキル、または置換されたまたは置換されていないヘテロアルキルである、請求項5に記載の化合物。
  10. 2は、
    (1)置換されていないC1−C10アルキル、
    (2)置換されていない2〜10員へテロアルキル、
    (3)置換されていないC3−C7シクロアルキル、
    (4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、
    (5)置換されていないアリール、
    (6)置換されていないヘテロアリール、
    (7)ハロゲン、
    (8)−OH、
    (9)アミノ、
    (10)−CF3
    (11)置換されていないC1−C10アルキルで置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル、または
    (12)置換されていないアリールで置換されたC1−C10アルキル
    により置換されている、請求項8に記載の化合物。
  11. 2は、
    (1)ハロゲン、
    (2)−L22−C(O)R3
    (3)−L22−OR4
    (4)−L22−NR45、または
    (5)−L22−S(O)m6
    により置換されている、請求項8に記載の化合物。
  12. 2置換基が、
    (1)−L22−C(O)R3、ここで、
    3は水素、置換されていないC1−C10アルキル、−OR31、−NR3233であり、ここでR31、R32、およびR33は独立して水素、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていないC3−C7シクロアルキルであり、そして
    22は置換されていないC1−C10アルキレンであり、
    (2)−L22−OR4、ここで、
    4が水素、−CF3、−CHF2、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていないC1−C10シクロアルキルアルキル、または−C(O)R41であり、ここで、R41は水素、または置換されていないC1−C10アルキルであり、
    (3)−L22−NR45、ここで、
    4およびR5は、独立して、水素、置換されていないC1−C10アルキル、または−C(O)R41であり、
    ここで、R41は独立して水素、または置換されていないC1−C10アルキルであり、または
    (4)−L22−S(O)m−R6、ここで、
    7は水素または置換されていないC1−C10アルキルである、
    請求項8に記載の化合物。
  13. 2が置換されたまたは置換されていないアリールであれば、前記アリールがフェニル、ベンズ[cd]インドール−2(1H)−オン−イル、オキシインドリル、インダゾリノニル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、ベンゾジオキサニル、クマリニル、クロモニル、ベンゾピラジル、ナフチル、キノリル、またはイソキノリルであり;
    2が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであれば、前記ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、チアジアゾリルであり、または
    2が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルであれば、前記ヘテロシクロアルキルがヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである、請求項5に記載の化合物。
  14. (11)または(12)が、R21−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキルで置換されていれば、前記ヘテロシクロアルキルはジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルであり;または
    (11)または(12)がR22−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールで置換されていれば、前記ヘテロアリールはピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、またはチエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである、請求項5に記載の化合物。
  15. 1が水素、置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されたまたは置換されていないアリール、または置換されたまたは置換されていないヘテロアリールである、請求項1に記載の化合物。
  16. 1が、
    (1)−CF3
    (2)置換されていないC1−C10アルキル;
    (3)置換されていない2〜10員へテロアルキル;
    (4)置換されていないC3−C7シクロアルキル;
    (5)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (6)置換されていないアリール;
    (7)置換されていないヘテロアリール;
    (8)置換されたC1−C10アルキル;
    (9)置換された2〜10員へテロアルキル;
    (10)置換されたC3−C7シクロアルキル;
    (11)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (12)置換されたアリール;または
    (13)置換されたヘテロアリールであり;
    ここで、
    (8)、(9)、(10)または(11)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L11−C(O)R100、−L11−OR104、−L11−NR104105、または−L11−S(O)q−R107で置換されており、
    (12)または(13)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−L11−C(O)R100、−L11−OR104、−L11−NR104105、または−L11−S(O)q−R107で置換されており、
    100は水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、−OR101、または−NR102103であり、ここで、
    101、R102、およびR103は、独立して、水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    104および105は、独立して、水素、−CF3、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、R16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、または−C(O)R106であり、ここで、
    106は、独立して、水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10−アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    107は水素、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R15−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R16−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR16−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    11は結合、置換されていないC1−C10アルキレン、または置換されていないヘテロアルキレンであり、
    qは0、1または2であり、
    15はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、R17−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R17−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR18−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    16は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、R17−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、R17−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていないC3−C7シクロアルキル、R17−置換されたまたは置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、R18−置換されたまたは置換されていないアリール、またはR18−置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであり、
    17はオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールであり、そして
    18は−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである、請求項1に記載の化合物。
  17. 15またはR16が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルであれば、前記ヘテロシクロアルキルがヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである、請求項16に記載の化合物。
  18. 15またはR16が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであれば、前記ヘテロアリールがピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピラジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、またはチエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである、請求項16に記載の化合物。
  19. 15がオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールであり、そして
    16が−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである、請求項16に記載の化合物。
  20. 1が、
    (1)置換されていないC1−C10アルキル;
    (2)置換されていない2〜10員へテロアルキル;
    (3)置換されていないC3−C7シクロアルキル;
    (4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (5)置換されたC1−C10アルキル;
    (6)置換された2〜10員へテロアルキル;
    (7)置換されたC3−C7シクロアルキル;
    (8)置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (9)置換されたフェニル;または
    (10)置換されたヘテロアリールであり;
    ここで、(5)、(6)、(7)または(8)はオキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、またはR15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されており、そして
    ここで、(9)または(10)は−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、R15−置換されたまたは置換されていないC1−C10アルキル、またはR15−置換されたまたは置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されている、請求項1に記載の化合物。
  21. 15がオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルである、請求項20に記載の化合物。
  22. 1が、
    (1)置換されていないC1−C10アルキル、
    (2)置換されていない2〜10員へテロアルキル、
    (3)置換されていないC3−C7シクロアルキル、
    (4)置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (5)オキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールで置換されたC1−C10アルキル;
    (6)オキソ、−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールで置換された2〜10員へテロアルキル;
    (7)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたC3−C7シクロアルキル;
    (8)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換された3〜7員ヘテロシクロアルキル;
    (9)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたフェニル;または
    (10)−OH、−CF3、−COOH、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、または置換されていない2〜10員へテロアルキルで置換されたヘテロアリールである、
    請求項1に記載の化合物。
  23. 1が置換されたまたは置換されていないヘテロアリールであれば、前記ヘテロアリールがピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、ピリダジニル、チアゾリル、イソチオアゾリル、トリアゾリル、チエニル、トリアジニル、またはチアジアゾリルである、請求項16に記載の化合物。
  24. 1が置換されたまたは置換されていないヘテロシクロアルキルであれば、前記ヘテロシクロアルキルがヒダントイニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、トリオキサニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピロリジニル、モルホリノ、ピペリジニル、またはピペラジニルである、請求項16に記載の化合物。
  25. 1は、
    (1)ハロゲン、
    (2)−L11−C(O)R100
    (3)−L11−OR104
    (4)−L11−NR104105、または
    (5)−L11−S(O)q107
    により置換されている、請求項16に記載の化合物。
  26. 15がオキソ、−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員へテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールであり;そして
    16が−OH、−COOH、−CF3、ハロゲン、置換されていないC1−C10アルキル、置換されていない2〜10員へテロアルキル、置換されていないC3−C7シクロアルキル、置換されていない3〜7員ヘテロシクロアルキル、置換されていないアリール、または置換されていないヘテロアリールである、請求項25に記載の化合物。
  27. 医薬上許容される賦形剤と混合した請求項1の化合物を含む医薬組成物。
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