JP4705137B2 - 塩漬け用キトサン粉末、これを用いた塩漬け物、およびこれを用いて製造したキムチ - Google Patents
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Description
1−1.キトサンの製造
韓国東海で得たベニズワイガニの蟹殻を乾燥させた後、これを5%NaOH水溶液に入れ、100℃で5時間抽出して脱タンパク蟹殻を得た。前記脱タンパク蟹殻を5%HCl水溶液に入れ、常温で5時間抽出して脱カルシウム化させてキチンを得た。その後、反応槽に45%NaOH水溶液を満たし、ここに、前記で得られたキチンを浸漬させた後、温度(80℃、90℃、100℃、110℃)と時間(5、10、15、20、25、30、35、40、50時間)を変化させながら脱アセチル化反応によってキトサンを製造した。前記製造されたキトサンの脱アセチル化度と粘度を測定して表1に示した。脱アセチル化度はコロイド滴定法(pvsk titration method)を用いて測定し、粘度はキトサンを酢酸に溶かして0.5%のキトサン含有酢酸溶液を作り、20℃の恒温槽で2時間保管した後、恒温の下で測定した。
前記1−1で製造したキトサンを規格化するために、脱アセチル化度と粘度の異なる12種の水溶性キトサン(S-1〜S-12)と11種の不溶性キトサン(NS-1〜NS-11)を準備し、これらを下記表2に示した。全てのキトサンは、プラスチック容器に入れて室温で保管しながら使用し、水溶性/不溶性キトサンの抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性を下記実験例1〜4の方法で測定した。前記23種の水溶性/不溶性キトサンのうち抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に優れたキトサンを選別して規格化した。
2−1.キトサン材料
水溶性/不溶性キトサンのうち、抗菌活性、抗酸化活性、抗突然変異効果および抗癌活性に最も優れた水溶性キトサンS-10(脱アセチル化度90%、粘度3cP)と不溶性キトサンNS-8(脱アセチル化度95%、粘度22cP)を4℃で保管しながら使用した。
白菜は韓国の釜山フジョン市場、塩辛は清浄ひしこ液塩辛((株)大商)、赤唐辛子粉はヨンヤン農協清潔赤唐辛子粉加工工場からそれぞれ購入して使用した。大根、ねぎ、大蒜および生姜は釜山フジョン市場からそれぞれ購入した。砂糖は白砂糖、塩は天日塩((株)ゴセン)を使用した。
キムチは、塩漬けにした白菜100重量部に対して赤唐辛子粉3.5重量部、大蒜1.4重量部、生姜0.6重量部、塩辛2.2重量部、ねぎ2.0重量部、大根13.0重量部、砂糖1.0重量部の割合で混合して標準化キムチのレシピを用いて製造した。
不溶性キトサンNS-8を酢酸に溶かして2%のキトサン溶液を製造した。前記キトサン溶液を用いてキトサン含量が塩漬け液の総重量に対して0.05、0.15、0.3、0.5%となるように添加した水に天日塩を加えて10%の塩漬け液を製造した。前記キトサン含有塩漬け液に白菜を10時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で3回洗浄し、3時間水気を切った。その後、大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜をよく混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
不溶性キトサンNS-8を酢酸に溶かして2%のキトサン溶液を製造した。前記キトサン溶液を用いてキトサン含量が濯ぎ液の総重量に対して0.1、0.2、0.3、0.5%となるように水を添加してキトサン含有濯ぎ液を製造した。天日塩で10%塩漬け液を製造した後、この塩漬け液に白菜を10時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で2回洗浄し、最終濯ぎ過程で前記キトサン含有濯ぎ液によって3分間濯いだ後、3時間水気を切った。その後、大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜を混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
天日塩で10%塩漬け液を製造した後、この塩漬け液に白菜を10時間漬け込んだ。こうして塩漬けにした白菜を水道水で3回洗浄し、3時間水気を切った。水溶性キトサン(S-10)粉末と不溶性キトサン(NS-8)粉末を1:1の重量比で混ぜた後、塩漬けにした白菜100重量部に対して0.1.0.25、0.5、1.5重量部のキトサンを副材料として用いて薬味に混ぜ合わせた。大根とねぎを千切りにし、この千切り大根に、水に溶かした赤唐辛子粉を入れて混ぜ合わせた後、さらにひしこ液塩辛、大蒜および生姜をよく混ぜ合わせ、塩度はそれぞれの塩で調節してキムチを製造した。
水溶性/不溶性キトサンの抗菌活性を確認するために、下記の実験を行った。
抗菌活性を検索するための病原性微生物および腐敗微生物としては、9種のグラム陰性菌と6種のグラム陽性菌を使用し、それらを下記表3に示した。
本実験に使用するために、水溶性キトサンは蒸留水に、不溶性キトサンは1%(v/v)酢酸に完全に溶かして1%(w/v)濃度でキトサン貯蔵溶液を製造した。
高い抗菌活性を示す水溶性キトサンS-2、S-9、S-10、S-11、S-12と、高い抗菌活性を示す不溶性キトサンNS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11を選別し、公示菌株15種に対する成長抑制活性を調べた。
高い抗菌活性を示す水溶性キトサンS-2、S-9、S-10、S-11、S-12と、高い抗菌活性を示す不溶性キトサンNS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11を選別し、これらの15種の公示菌株に対する最小成長阻害濃度を測定した。
水溶性/不溶性キトサンの抗酸化活性を確認するために、下記の実験を行った。
水溶性/不溶性キトサンのDPPHに対する電子供与能(electron donating ability)をBlois等による方法によって測定した。メタノールで希釈した水溶性/不溶性キトサン(1mg/mL、0.5mg/mL)10μLを96ウェルプレートに入れた後、60μmのDPPH試液100μLを加え、室温で30分間静置した後、540nmで吸光度を測定した。
1)細胞種類および試薬
LLC−PK1(porcine renal epithelial cell)は、ATCC(Solon、ohio、USA)で、培養のためのDMEM(Dulbecco's modified Eagal medium)とFBS(fetal bovine serum)はInvitogen CO.(Grand Island、NY)から購入して使用した。酸化的ストレスを誘導するために使用したSNPは、Wako(東京、日本)社の製品を、SIN−1(3-morpholinosydnonimine)、AAPH[2,2'-Azobis(2-aminopropane)dihydrochloride]、ピロガロール(pyrogallol)、MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide]は、Sigma Chemical Co.(USA)社の製品を使用した。
LLC−PK1細胞は、100units/mLのフェニシリン−ストレプトマイシンと5%のFBSが含有されたDMEMを用いて37℃、5%CO2培養器で培養した。培養された細胞は1週に2〜3回再給与し、培養6〜7日頃リン酸塩緩衝溶液(phosphate buffered saline;PBS)で1次洗浄した後、0.05%トリプシン−0.02%EDTAで付着細胞を剥がして遠心分離した後、集積された細胞を培地に入れてピペットで細胞が均一に分散するようによく混合し、6〜7日毎に継代培養しながら実験に使用した。継代培養の際に、それぞれの通過回数(passage number)を記録し、通過回数が10回以上のときは新しい細胞を培養して実験を行った。
細胞が集合(confluence)状態になると、96ウェルプレートにウェル当たり1×104cells/mLで植栽して2時間培養した後、酸化的ストレスを誘発するために、ペルオキシルラジカル(LOO−)、ONOO−、NO、O2 −の供与体であるAAPH(10mM)、SIN−1(1mM)、SNP(1.2mM)およびピロガロール(1.2mM)を添加して24時間培養した。酸化的ストレスを誘発した後、S-10およびNS-8を濃度別(50、100、500、1000μg/mL)で処理して24時間培養した後、1mg/mLのMTT溶液を各ウェルに注入して37℃で4時間再培養した後、生成されたホルマザン結晶をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かして540nmで吸光度を測定した(Mosmann、1983)。
水溶性/不溶性キトサンおよびキトサン含有キムチの抗突然変異効果を確認するために、下記の実験を行った。
D−ビオチン、L−ヒスチジン・HCl(一水和物)、D−グルコース−6−ホスフェイト(モノナトリウム塩)、およびNADP(ナトリウム塩)は、Sigma Chemical Co.(USA)から購入し、バクト栄養培養液(脱水した)とビテック寒天(Bitek agar)はDifco Laboratories(USA)から購入した。また、突然変異誘発源としては、直接突然変異源であるMNNG(4-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)をAldrich Chemical Co.(USA)から購入して滅菌蒸留水に溶かして実験に使用し、間接突然変異源であるAFB1(アフラトキシンB1)をSigma Cemical Co.(St.Lous、MO、USA)から購入してDMSOに溶かして使用した。
0.5mLのリン酸緩衝液(直接突然変異源)に一晩培養した菌株(1〜2×109cells/mL)0.1mL、希釈試料50μLおよび突然変異誘発物質50μLを氷浴中のキャップチューブ(cap tube)に添加して軽くボルテキシング(vortexing)し、37℃で30分間予備培養した。ここに45℃のトップアガー(ヒスチジン/ビオチン溶液)2μLを予備培養した各チューブに注ぎ、3秒間ボルテキシングして最小平板培地(minimal glucose agar plate)に塗抹し、37℃で48時間培養した後、復帰突然変異体(revertant)の数を計数した。突然変異抑制率(inhibition rate)は数式1によって計算した。Salmonella typhimurium TA100で直接突然変異源MNNG(0.4μg/plate)によって誘発された突然変異に対する水溶性キトサンおよび不溶性キトサンの抗突然変異効果はそれぞれ表14および表15に示し、キトサン含有キムチのメタノール抽出物の抗突然変異効果は表16および図3に示した。
a:突然変異源によって誘導された復帰突然変異数、
b:試料を処理したときの復帰突然変異数、
c:突然変異源と試料がない場合の自然復帰突然変異の数。
間接突然変異源を活性化させるために、MaronとAmesの方法によって、肝のミクロソーム酵素混合物(microsomal enzyme mixture)であるS9混合物を調製した。約200gの雄性SD(Sprague-Dawley)ラットの肝酵素誘発のために、ポリ塩化ビフェニル(PCB)混合物であるAroclor1254をトウモロコシ油1mL当たり200mgの濃度で希釈して1回腹腔注射し(500mg/kg)、5日後に肝を摘出した。4℃の無菌状態で摘出した肝を0.15M KClで数回洗浄し、肝の重量の3倍量に相当する0.15M KCl溶液を加えて均質化器(Potter-Elvehjem apparatus、USA)で均質化した。これを9000×gで10分間遠心分離して上澄み液としてのS9分画を得た。その後、クリオチューブ(cryo tube)に1〜2mLずつ分注してドライアイスで急速凍結した後、−180℃の液体窒素タンクに保管しながら実験に使用した。前記S9分画(10%)をMgCl−KCl塩(2%)、1Mグルコース−6−ホスフェイト(0.5%)、1M NADP(4%)、0.2Mリン酸塩緩衝液(pH7.4)および滅菌数と混合してS9混合物を調製した。
水溶性/不溶性キトサンおよびキトサン含有キムチの抗癌活性を確認するために、下記の実験を行った。
細胞培養のためにRPMI1640、FBS、0.05%のトリプシン−0.02%EDTAおよび100units/mLのフェニシリン−ストレプトマイシンは、GIBCO社(USA)から購入して使用した。細胞培養には5%CO2培養器(Forma、model MC096、日本)を使用した。AGSヒト胃癌細胞(AGS human gastric adenocarcinoma cell)、HT−29ヒト結腸癌細胞(HT-29 human colon adenocarcinoma cell)は韓国細胞株銀行(ソウル医大)から分譲を受けて培養しながら実験に使用した。
前記培養された癌細胞を96ウェルプレートにウェル当たり1×104cells/mLとなるように180μLずつ分注し、試料を濃度別に20μLずつ添加した後、37℃、5%培養器で72時間培養した。ここに、リン酸生理食塩水に5mg/mLの濃度で製造したMTT(Sigma、USA)溶液20μLを添加し、同一の培養条件で4時間さらに培養した。10分間2000rpmで遠心分離した後、上澄み液を捨て、DMSO150μLを加えた後、30分間プレートを振とうした。この際、生成されたホルマザン結晶をDMSOに溶かしてELISAリーダーによって540nmで吸光度を測定した。細胞毒性率(%)は数式2で計算した。
本発明に係るキトサン含有キムチの貯蔵安定性を確認するために、キムチを4〜15℃で発酵させながら5日毎に発酵特性を観察した。
試料は、実施例2〜5で製造したキトサン含有キムチを搾汁器(NUC、韓国)で搾汁し、その汁液を使用した。pHはpHメーター(Corning220、USA)によって室温で測定した。酸度は試料20mLを蒸留水で20倍に希釈した後、ここから10mLを取ってAOAC方法によって測定した。この際、0.1%フェノールフタレインを指示薬として1mL添加し、0.1N NaOHを滴定して、ピンク色を帯びる点を終末点とした。滴定値は数式3を用いて乳酸に換算し、含量%で表示した。
実施例2〜5で製造したキトサン含有キムチがキムチ乳酸菌、すなわちロイコノストック属(Leuconostoc sp.)およびラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)の成長に及ぼす影響を観察した。
本発明に係るキトサン含有キムチの貯蔵期間中の組織感を確認するために、下記の実験を行った。
本発明に係るキトサン含有塩漬け液で漬けた塩漬け白菜、およびこれを用いて製造したキムチのキトサン含量を確認するために、下記の実験を行った。
Claims (7)
- 90%の脱アセチル化度および1〜5cPの粘度を持つ水溶性キトサン、95%の脱アセチル化度および22cPの粘度を持つ水不溶性キトサン、並びにその食品学的に許容される塩よりなる群から選ばれたいずれか一つまたは一つ以上の組み合わせである、抗菌、抗酸化、抗突然変異および抗癌活性の全部を持つ塩漬け用キトサン粉末。
- 前記食品学的に許容される塩は塩酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および乳酸塩よりなる群から選ばれたいずれか1種であることを特徴とする、請求項1に記載の塩漬け用キトサン粉末。
- 請求項1または2に記載の塩漬け用キトサン粉末を塩漬け液の総重量に対して0.2〜1.0重量%含む塩漬け液。
- 請求項3に記載の塩漬け液に蔬菜類を漬け込んで製造した塩漬け物。
- 前記蔬菜類は白菜、若大根、大根、胡瓜、玉葱、大蒜および唐辛子よりなる群から選ばれた少なくとも1種であることを特徴とする、請求項4に記載の塩漬け物。
- 前記塩漬け物は塩漬け物の総重量に対して0.05〜0.25重量%のキトサンが含浸されたことを特徴とする、請求項4に記載の塩漬け物。
- 請求項1または2に記載の塩漬け用キトサン粉末をキムチの総重量に対して0.01〜1.5重量%含むキムチ。
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