JP4697982B2 - モジュラートランスフェクション系 - Google Patents
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Description
a)ヌクレオシド三リン酸および/またはヌクレオシド三リン酸類似体
b)少なくとも1つのトランスフェクションされる核酸
c)助剤および添加剤
の少なくとも1つを包含するキットに関する。
ドゥーデンにおいて用いられる略語以外に、以下の略語を使用した:
AMP−PCP アデニリル−(β,γ−メチレン)−ジホスホン酸塩
AMP−PNP S’−アデニリルイミド−二リン酸塩
DEAE ジエチルアミノエタン
DNA デオキシリボ核酸
dYT 2×YT培地
FACScan 蛍光活性化セルスキャニング
FCS ウシ胎児血清
FL 蛍光
FSC 前方散乱
GMP−PNP S’−グアニリルイミド−ジホスホン酸塩
GTP グアノシン三リン酸
H6 ヒスチジン−六量体
Ig 免疫グロブリン
kb キロベース
ml ミリリットル
mM ミリモラー
msec ミリ秒
NCBI 国立バイオテクノロジー情報センター
ng ナノグラム
nm ナノモラー
PBS リン酸緩衝食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
Pi リン酸二水素ナトリウム/リン酸水素二ナトリウム
RNA リボ核酸
RPMI ロスウェルパーク記念研究所
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SV40 シミアンウィルス40
TAE トリス酢酸エチレンジアミン4酢酸
U/mg 単位/ミリグラム
rpm 毎分回転数
ZIバッファー 細胞注入緩衝液
μg マイクログラム
μl マイクロリットル
NPF形成タンパク質としての組換えUvsXの調製
NPF形成タンパク質としては、タンパク質UvsXH6、UvsXH6−2、H6UvsX、およびH6UvsX−2を使用した(図1を参照)。
UvsH6(400アミノ酸):
アミノ酸1−391:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸1−391)、アミノ酸392−394:アミノ酸G392GS394のリンカー、アミノ酸395−400:ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのH395HHHHH400、アミノ酸置換:L43→P。
アミノ酸1−391:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸1−391)、アミノ酸392−394:アミノ酸S392YS394のリンカー、アミノ酸395−400:H395HHHHH400、アミノ酸401−403:アミノ酸M401YS403のC末端。
アミノ酸1−4:アミノ酸M1SYS4のN−末端、アミノ酸5−10:H5HHHHH10、アミノ酸11−13:アミノ酸S11YG13のリンカー、アミノ酸14−404:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸 1−391)、アミノ酸置換:Q340→L。
アミノ酸1−4:アミノ酸M1GYS4のN−末端、アミノ酸5−10:H5HHHHH10、アミノ酸11−13:アミノ酸S11YG13のリンカー、アミノ酸14−404:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸 1−391)。
適切な大腸菌(Escherichia coli)細胞における上記タンパク質の発現のために、lacプロモーターの制御下にUvsXH6、UvsXH6−2、H6UvsX、またはH6UvsX−2のコーディング配列を含有するプラスミドを構成した(pExH−UvsXH6、pExH−UvsXH6−2、pExH−H6UvsX、およびpExH−H6UvsX−2、図1を参照)。これらのプラスミドは2つのPCR生成物の連結によって調製した。第1のPCR生成物はpMCS5(MoBiTec(ドイツ、ゲッティンゲン))によって増幅した。pMCS5はpBluescript SK(−)(ストラタジーン(Stratagene)と同様に構成されており、lacZαフラグメントのコーディング配列5’領域のみが異なる。したがって、pMCS5はlacプロモーター、それに続くlacオペレーターを有し、それによって、挿入されたコーディング配列は、活性があるlacリプレッサーがないときに発現する。いつでも恒常的に発現させるために、lacオペレーターがPCR生成物内にもはや存在しないように増幅プライマーを選択した。その結果得られるPCR生成物は、制限サイトのための張り出しと、992〜664位のpMCS5に対応した。992位(lacプロモーターに対する3’側)の前にはヌクレオチドGAATTC(EcoR I制限酵素切断部位)およびTGTGTGを添加し、664位の後ろにはヌクレオチドACTAGT(Spe I制限酵素切断部位)およびCACACAを添加し、EcoR IおよびSpe Iによる制限消化後の連結を可能にした。UvsXH6、UvsXH6−2、H6UvsX、およびH6UvsX−2のコーディング配列を、好ましい制限酵素切断部位、リボソーム結合部位、および追加のコドンを含有するプライマーで、T4−DNAのPCR増幅によって得た。PCR生成物は、開始コドンの前の5’末端において、追加のヌクレオチド5’−CACACAGAATTCATAAAGGAAGATATCAT−3’、および終止コドンの後の3’−末端において追加のヌクレオチド5’−ACTAGTTGTGTG−3’を含有した。
1.5〜3 lのdYT/アンピシリン(200μg/ml)1:1000培地に、pExH−H6UvsXを含むDH5の一夜培養液を接種し、37℃下に一夜、250RPMで増殖させた。7000×gで収集した培養液は約7〜15gの細菌沈降物を生じた。これを−20℃下に1〜3日間凍結した。この沈降物を氷上で解凍し、10〜20mlの冷却した開始バッファーに再懸濁した。リゾチーム(セルヴァ(Serva)、190,000u/mg)10mgおよびグラスビーズ約4gを用いて、4℃下に1時間ゆっくり攪拌しながら溶解を行った。次いで、DNAseI(セルヴァ(Serva)、2mg/ml)50μlを添加し、さらに30分間インキュベートした。ライセートの遠心分離(4℃下、11,000×gで45分)後、無菌フィルタ(孔径0.45μm)を通じて上清をろ過し、Ni++イオンをプレロードして、平衡化した1mlのHiTrapTMキレートカラム(ファルマシア(Pharmacia)上にロードした。その後の精製ステップは、ヒスチジン6量体を備えたタンパク質に対するファルマシア社のプロトコルに従って行った。異なる溶出画分の一定分量をSDS/Coomassie−ゲル上にロードした。最も純粋な画分を統合し、セントリプラス(Centriplus)YM30カラム(ミリポア(Millipore))でそれぞれのプロトコルに従ってさらに濃縮した。その後、少なくとも1000倍量のZIバッファーで2回の透析(透析チューブ:Spectra/Por、MWCO:25,000)を4℃下にそれぞれ少なくとも1時間行い、次いで4℃下に一夜、ZIバッファー/50%グリセリンで透析した。透析液を30〜50μlの画分に分注し、−80℃下に保存した。
ZIバッファー:76mM K2HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH2PO4、pH=7.2。
開始バッファー:20mM Pi、0.5M NaCl、10mMイミダゾール、pH=7.4。
洗浄バッファー:20mM Pi、0.5M NaCl、20〜50mMイミダゾール、pH=7.4。
溶出バッファー:20mM Pi、0.5M NaCl、100〜500mMイミダゾール、pH=7.4。
UvsX−タンパク質の濃度は、Programm Gene InspectorTM(テクストコ社(Texto,Inc.))で計算された吸光係数を用いて、OD280を測定することによって決定した。H6UvsXの濃度は2.5〜3.5μg/μlであった。
Ni++セファロースで精製したH6UvsXをそれぞれ200ngの1kbのPCR断片と(1mM ATP−γ−Sの存在下および非存在下)でインキュベートした。
機能的構成成分として核局在化シグナルをもつ、NPF形成タンパク質としてのUvsXを用いた、トランスフェクション試薬の調製
実施例1に記載したタンパク質に由来して、さらに核局在化シグナルを含有する、融合タンパク質UvsXH6N2、UvsXH6N2−2、N2H6UvsX、およびN2H6UvsX−2の発現を可能にするプラスミドを、実施例1のようにして調製した(図1を参照)。
UvsH6N2(426アミノ酸):
アミノ酸1−391:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸1−391)、アミノ酸392−394:アミノ酸G392GS394のリンカー、アミノ酸395−400:H395HHHHH400、アミノ酸401−403:アミノ酸G401GS403のリンカー、アミノ酸404−417:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸418−421:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸388−391)のC末端、アミノ酸422−426:アミノ酸K422LVTG426からなるC末端、アミノ酸置換:Y238→V。
アミノ酸1−391:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸1−391)、アミノ酸392−394:アミノ酸S392YS394のリンカー、アミノ酸395−400:H395HHHHH400、アミノ酸401−403:アミノ酸M401YS403のリンカー、アミノ酸404−417:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸418−420:アミノ酸G418YP420のC末端。
アミノ酸1−3:アミノ酸M1SY3のN−末端、アミノ酸4−17:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸18−20:アミノ酸L18YS20のリンカー、アミノ酸21−26:H21HHHHH26、アミノ酸27−29:アミノ酸S27YG29のリンカー、アミノ酸30−420:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸 1−391)、アミノ酸置換:Q356→L。
アミノ酸1−4:アミノ酸M1GYP4のN−末端、アミノ酸5−18:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸19−21:アミノ酸S19YS21のリンカー、アミノ酸22−27:H22HHHHH27、アミノ酸28−30:アミノ酸S28YG30のリンカー、アミノ酸31−421:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸 1−391)。
適切な大腸菌(Escherichia coli)細胞における発現のために、lacプロモーターの制御下にUvsXH6N2、UvsXH6N2−2、N2H6UvsX、またはN2H6UvsX−2のコーデング配列を含有するプラスミドを構築した(pExH−UvsXH6N2、pExH−UvsXH6N2−2、pExH−N2H6UvsX、またはpExH−N2H6UvsX−2、図1を参照)。これらのプラスミドは、実施例1に記載したように、2つのPCR生成物の連結によって調製した(図1を参照)。
UvsXH6N2の精製は、H6UvsXについて実施例1に記載したように行った。
濃度:10〜20μg/μl。
UvsXH6N2は2本鎖DNAに結合する。その結合はATP−γ−Sによって安定化する:
UvsXH6N2のDNAへの結合挙動に対する、様々なATP−類似体の影響を調べるために、まず、1kbのDNA断片および様々なATP−類似体とタンパク質をインキュベートした。次いで、競合のために1.7kbのDNA断片を添加した。ATP−類似体の添加によってDNAへのタンパク質結合の安定化が行われれば、平衡が生じない限り、競合DNA断片にUvsXH6N2が結合する可能性は低いことが予想される。図3に見られるように、1kbのDNA断片およびUvsXH6N2によって生じるタンパク質−DNA複合体は、ATP−γ−Sおよび1.7kbのDNA断片存在下で、使用した他のすべてのATP−類似体に比べ、安定であった。すなわち1.7kbのDNA断片は、観察時間内において、遊離したUvsXH6N2−分子によって占有されないか、またはわずかにしか占有されないと思われる。
修飾および非修飾NPF形成タンパク質の混合によるトランスフェクション試薬の調製
実験の概要:
異なる割合のH6UvsXおよびUvsXH6N2を1kbのDNA断片とインキュベートした。2つのタンパク質が、それらの異なる分子量に基づき、DNAの移動度を様々な度合いで小さくする。(図4の2および3レーンを参照)。タンパク質をDNAへ添加する前に混合すると、UvsXH6N2に対するH6UvsXの割合に応じて中間複合体が生じ、これらはシャープなバンドを生じるとともに、同等の平均分子量を有する。これはDNAが統計的に均一に両方のタンパク質で被覆されていることを示す。
エレクトロポレーション法と組み合せた、UvsX−NLSによるセルライン(NIH3T3)のトランスフェクション
NIH3T3細胞(接着性、70〜80%の集密まで培養)を、マウスMHCクラスIタンパク質H−2KKの重鎖をコードするベクターをトランスフェクションした。1×106細胞に、予め結合バッファー(76mM K2HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH2PO4、5mM MgCl2、pH=7.21)中で、14μgのUvsXまたはUvsX−NLSと、1mM ATP−γ−Sの存在下または非存在下に、室温下に30分間予備インキュベートした25ngのベクターDNAをエレクトロポレーションした。さらに、細胞をエレクトロポレーションバッファー(103mM NaCl、5.36mM KCl、0.41mM MgCl2、23.8mM NaHCO3、5.64mM Na2HPO4、11.2mMグルコース、0.42mM Ca(NO3)2、20mM HEPES、3.25μMグルタチオン)中に総量100μlとして入れ、電極間隔2mmのキュベットでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは240Vの電圧および450μFの電気容量での指数関数的な放電によって行った。電圧降下の半減期は通常、12ミリ秒であった。エレクトロポレーション直後、キュベットから培地(10%FCSを含むRPMI)を用いて細胞を回収し、37℃下に10分間インキュベートし、次いで予め保温した培地を含む培養シャーレに移した。6時間のインキュベーション後、細胞を収集し、PBS中での2回の洗浄後、Cy5結合−抗H−2KK抗体でインキュベートし、フローサイトメトリー(FACScan)により分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞の数を測定した。エレクトロポレーションの6時間後、ベクターDNAのみをトランスフェクションされた細胞の(平均0.25%のバックグラウンドを除き)7.4%ないし8.7%がH−2KKタンパク質を発現する。これに比べて、ベクターUvsXをトランスフェクションされた細胞の発現率は2.9%ないし3.8%であった。ベクターUvsX−NLSのトランスフェクションにおける発現率は19.2%ないし18.9%である(図5a〜5dを参照)
エレクトロポレーション法と組み合せた、UvsXスクランブル化NLSまたはUvsX−NLSのセルライン(NIH3T3)のトランスフェクション
UvsXスクランブル化NLSの作製
トランスフェクションに対する核内移行シグナルの影響を調べるため、その正味電荷においてNLSを含むUvsXタンパク質に対応するが、それ自体は機能的NLSを含有しないUvsX誘導体を比較用に作製した。
マイクロインジェクションと組み合せたセルライン(NIH3T3)のトランスフェクション
1.7kbの発現ベクターDNA断片140ngを、上記のように最終量20μlで結合バッファーおよび1mM ATP−γ−S中で修飾UvsXタンパク質9μgと室温下に30分間インキュベートした。注入マーカーとしては、注入直前に約1μg/μlの濃度でBSA−Cy5を使用した。
NPF形成タンパク質としての組換えSASPの作製
枯草菌(B.subtilis)由来のSASPタンパク質のクローニング、発現、および精製
SASP(small acid−souluble spore protein*)をコードする、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のSspC遺伝子を、8個のオリゴヌクレオチドからコラナ(Kohorana)法(非特許文献50)に従って合成し、プラスミドpARA13のNcol切断部位とBglll切断部位(非特許文献51)との間に連結した。これは、NCBIタンパク質目録番号:NP_389876のタンパク質配列をもとにした。DNAへの逆転写は、大腸菌において強く発現しており非特許文献52に記載されている、遺伝子の使用頻度の高いコドン(codon preferences)を用いて行った。作製したプラスミドpARA13−SASPを、N末端(H6−SASP)またはC末端(SASP−H6)のいずれかが6個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列を有するSASPタンパク質をコードする、2つの別のプラスミドのクローニング用のテンプレートとして使用した(図8)。これらのプラスミドによって大腸菌株BL21(DE3)pLysS(マジソン(Madison)、ノバーゲン社(Novagen)を形質転換し、LB/アンピシリン/グルコース(0.2%)上にプレーティングした。
1.7kbのDNA断片それぞれ125ngを、1×ZIバッファーまたは1/10×ZIバッファー中で、異なる量のSASP−H6タンパク質と室温下に30分間、予備インキュベートし、次いで0.8%TAEアガロースゲルで泳動した。
修飾として核局在化シグナルをもつ、NPF形成タンパク質としてのSASPをもつトランスフェクション試薬の調製
機能的構成成分として核局在化シグナル(NLS)をもつSASPの調製のために、既存のクローンpARA13−SASP−H6(図8を参照)C末端に、核局在化シグナル((WO 00/40742)による「nls−2」、アミノ酸2−15、SEQ IQ NO:9)をコードするDNA配列をPCR増幅によって添加した。その際に、上記のプラスミドをPCRテンプレートとして使用した。作製したプラスミドpARA13−SASP−H6N2(図8を参照)を実施例7において記載されているように形質転換し、タンパク質SASP−H6N2を適切に精製した。
1.7kbのDNA断片それぞれ125ngを、1×ZIバッファー中で異なる量のSASP−H6N2タンパク質と室温下に30分間、予備インキュベートし、次いで0.8%TAEアガロースゲルで泳動した。
機能的構成成分として、細胞表面へ複合体が結合するインテグリン結合モチーフをもつトランスフェクション試薬の調製
インテグリンは細胞表面上の膜固着性の接着タンパク質であり、そのうちの一部は結合相手として3つのアミノ酸(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、つまり「RGD」モチーフ)からなるペプチドモチーフを認識する。その結合により細胞表面上でいくつかのインテグリン分子がクラスターを形成し、エンドサイトーシスが生じる(非特許文献54)。RGDモチーフを用いて、NPF形成タンパク質としてUvsXを修飾することによって、トランスフェクション試薬がインテグリンを介して特異的に細胞のエンドソーム区画に取り込まれることを達成することができる。
使用したタンパク質H6UvsXおよびUvsXH6N2−2は、図1に示されており、実施例1および2に記載されているものと同一である。
UvsX−NLSおよびUvsX−RGDの2本鎖DNAへの結合および混合NPFの形成:
精製された1.6kbのPCR DNA断片それぞれ140ngの沈殿物を、76mM K2HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH2PO4、pH=7.2、5mM MgCl2、および1mM ATP−γ−S中で、H6UvsX*(RGD2)15μgとUvsXH6N2−2 4μgとの混合物、UvsXH6N2−2 4μgのみ、およびH6UvsX*(RGD2)15μgのみと、最終量20μl、室温下に30分間インキュベートし、0.8%のTAE/アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。電気泳動は、1時間、100Vで行った。
インテグリン介在性エンドサイトーシスによる細胞内へのNPFの特異的取り込み
タンパク質の構造
UvsXおよびインテグリン結合RGDモチーフ由来の融合タンパク質の発現を可能にするプラスミドUvsXH6N2NIT−2(図1)を実施例1に示すように組換えて作製した。
蛍光標識DNAおよびUvsX誘導体由来のNPFの結合:
AlexaFluor488標識dUTP(モレキュラー プローブス(Molecular Probes)社(米国、オレゴン州、ユージーン))をdTTPの代わりに含有する、精製された1.6kbのPCR DNA断片それぞれ1μgを、76mM K2HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH2PO4、pH=7.2、5mM MgCl2、および1mM ATP−γ−S中で、精製されたUvsXH6N2またはUvsXH6N2NIT−2 100μgと、最終量200μlで室温下に30分間インキュベートした。次いで、NPF反応物のそれぞれ10μlを、0.8%のTAE/アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。電気泳動を1時間、100Vで行った。図13は、DNAの移動度が完全に遅れていることを示す。したがって、タンパク質のDNA結合は、DNAの蛍光標識によっても妨げられない。
NIH3T3細胞を6穴プレート(穴当たり3×105)に播種し、37℃および5%CO2下に一夜インキュベートし、翌朝に予め保温したFCSが入っていない培地で洗い、次いで2mlのFCSが入っていない培地を加えた。これにNPF反応物(上記参照)190μlを添加し、室温下に30分インキュベートし、上清を除去し、細胞を洗浄し、3mlの培地(10%FCS含有)を添加した。さらに、インキュベーター内で37℃、1時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡下に評価を行った。図14aおよび14bには、それぞれ明視野(下)および明蛍光(上)における写真が示されている。
NPF形成タンパク質としてhRad51を用いたトランスフェクション試薬の調製
NPF形成タンパク質として、タンパク質hRad51H6、およびhRad51H6N2を使用した(図16を参照)。
hRad51H6(352アミノ酸):
アミノ酸1−339:ヒトRad51(NCBIタンパク質目録番号:Q06609、アミノ酸1−339)、アミノ酸340−343:アミノ酸Y340SYG343のリンカー、アミノ酸344−349:ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのH344HHHHH349、アミノ酸350−352:アミノ酸M350YS352のC末端。
アミノ酸1−339:ヒトRad51(NCBIタンパク質目録番号:Q06609、アミノ酸1−339)、アミノ酸340−343:アミノ酸Y340SYG343のリンカー、アミノ酸344−349:ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのH344HHHHH349、アミノ酸350−352:アミノ酸M350YS352のリンカー、アミノ酸353−366:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸367−369:アミノ酸G367YP369のC末端。
適切な大腸菌の細胞における上記のタンパク質の発現のために、lacプロモーターの制御下にhRad51H6、またはhRad51H6N2のコーディング配列を含有するプラスミドを構成した(pExH−hRad51H6、またはpExH−hRad51H6N2、図16を参照)。出発プラスミドとして、pExH−UvsXH6−2、およびpExH−UvsXH6N2−2を使用した(図16を参照)。
UvsXのコーディング領域をそれぞれEcoR VおよびBsiW Iで切断し、同様にして切断したhRad51のコーデング領域のPCR断片によって置き換えた。これは、好ましい制限酵素切断部位を含有するhRad51特異的プライマーを用いて、ヒトcDNAライブラリーから増幅させた。PCR生成物は、開始コドンの前の5’末端において追加のヌクレオチド5’−CACACATCTAGACGTACGGATATCAT−3’、および3’−末端においては、終止コドンの代わりに追加のヌクレオチド5’−TACTCGTACGGAGGTGGCGGCCGCTGTGTG−3’を含有した。
dYT/アンピシリン(100μg/ml)5mlの予備培養液に、pExH−Rad51H6またはpExH−Rad51H6N2をもつDH5を接種し、37℃下に5時間、250rpmで増殖させた。dYT/アンピシリン(100μg/ml)10lにこの予備培養液を接種し、さらに37℃下に24時間、210rPMで増殖させた。7000×gで収集された培養株は約30〜50gの細菌沈降物を生じた。この沈降物を−20℃下に1〜3日間、凍結させた。この沈降物を氷上で解凍し、100mlの冷却した開始バッファーに再懸濁した。その後、B.Braun Labsonic Uを使用して超音波で細胞を可溶化した(大プローブ、パラメータ:300W、毎秒0.5秒のパルス時間、超音波処理8分)。次いで、リゾチーム(セルヴァ(Serva)、190,000u/mg)10mgを加えて4℃下に1時間インキュベートし、さらにDNAseI(セルヴァ(Serva)、2mg/ml)50μlを添加し、30分間、ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。遠心分離(4℃下、18000xgで45分)で溶解物を除いた後、無菌フィルタ(孔径0.45μmおよび0.2μm)を通じて上清をろ過し、Ni++イオンをプレロードして、平衡した1mlのHiTrapTMキレートカラム(ファルマシア(Pharmacia)上にロードした。その後の精製ステップは、ヒスチジン6量体を備えたタンパク質に対する対応するそれぞれのファルマシア社のプロトコルに従って行った。異なる溶出画分の一定分量をSDS/Coomassie−ゲル上にロードした。それぞれ最も純粋な画分を統合し、さらに、セントリプラス(Centriplus)YM30カラム(ミリポア(Millipore))でそれぞれのプロトコルに従って濃縮した。その後、少なくとも1000倍量のZIバッファーで2回の透析(透析チューブ:Spectra/Por、MWCO:25,000)を4℃下にそれぞれ1時間行い、次いで4℃下に一夜、ZIバッファー/50%グリセリンで透析した。透析液を30〜50μlの画分に分注し、−80℃下に保存した。図17は精製されたhRad51−H6およびhRad51−H6N2タンパク質を示す。
実施例1に示す。しかし、異なる溶出バッファー:20mM Pi、0.5M NaCl、100〜1000mMイミダゾール、pH=7.4を用いた。
hRad51−タンパク質の濃度は、Programm Gene InspectorTM(テクストコ社(Texto,Inc.))で計算された吸光係数を用いて、OD280を測定することによって決定した。
NLS修飾hRad51の2本鎖DNAへの結合:
Ni++セファロースで精製したhRad51H6N2をそれぞれ100ngの0.9kbのPCR断片とインキュベートした。
機能的構成成分として非エンドソーム膜通過シグナルおよび核局在化シグナルをもつUvsXを用いたトランスフェクション試薬の調製
実施例2に記載したタンパク質UvsXH6N2−2に由来し、ヒトヘルペスウィルス1由来の外被タンパク質VP22(遺伝子UL49)の一部分を有する融合タンパク質UvsXH6N2VP22c50(図1を参照)の発現を可能にするプラスミドを、実施例1のように調製した。ここで使用したVP22ペプチドは、細胞膜を通る非エンドソーム通過のシグナルとして作用する。したがって、融合タンパク質UvsXH6N2VP22c50は、核内局在化シグナル(NLS)に加えてさらに膜導入シグナルを含有する。
UvsH6N2VP22c50(474アミノ酸):
アミノ酸1−391:T4ファージ由来のUvsX(NCBIタンパク質目録番号:AAD42669、アミノ酸 1−391)、アミノ酸392−394:アミノ酸S392YG394のリンカー、アミノ酸395−400:H395HHHHH400、アミノ酸401−403:アミノ酸M401YS403のリンカー、アミノ酸404−417:核局在化シグナルnls−2((WO 00/40742)のアミノ酸2−15、SEQ ID NO:9)、アミノ酸418−422:アミノ酸G418YPGS422、アミノ酸423−472:ヒトヘルペスウィルス1(NCBIタンパク質目録番号:NP_044651、アミノ酸252−301)の外被タンパク質VP22(遺伝子UL49)の一部、アミノ酸473−474:アミノ酸P473R474のC末端。
適切な大腸菌の細胞における発現のために、pExHUvsXH6N2−2(実施例1および図1を参照)をAcc65 IおよびSpe Iによる制限消化によって切り開き、Acc65 IおよびNhe Iで切断されたPCR生成物と結合した。このPCR生成物は、ヒトヘルペスウィルス1(NCBIタンパク質目録番号:NC_001806、ヌクレオチド105486−106391の相補配列)の外被タンパク質VP22(遺伝子UL49)由来の最後の50個のアミノ酸をコードする配列に加えて、5’末端において追加のヌクレオチド5’CACACAGGTACCCGGGATCC−3’、および3’−末端において追加のヌクレオチド5’−CCTAGGTAATAATAAGCGGCCGCGCTAGCTGTGTG−3’を含有した(図1を参照)。
UvsXH6N2VP22c50の精製を、H6UvsXについて実施例1に記載したように行った(図18Aを参照)。
濃度:1.8μg/μl。
さまざまな修飾UvsX(UvsX−NLS−VP22およびUvsX−NLS)の混合物の、2本鎖DNAへの結合:
精製された1.7kbのPCR断片それぞれ140ngを、精製されたUvsXH6N2VP22c50またはUvsXH6N2−2の図18Bに示された量と、96mM K2HPO4、21.5mM KH2PO4、18mM NaH2PO4、pH=7.2、5mM MgCl2、および1.3mM ATP−γ−S中で、室温下に30分間インキュベートし、次いですべての反応物を0.8%のTAE/アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。2つのタンパク質はその分子量およびその正味電荷において異なり、したがって電気泳動の間にDNAの移動度の抑制が異なり、その際にUvsXH6N2VP22c50を含む複合体は、ゲル孔に残ったままであり、まったく移動することはない(図18Bの1および7レーンを参照)。タンパク質をDNAへの添加前に混合すると、UvsXH6N2VP22c50に対するUvsXH6N2−2の割合に応じて中間複合体が生じ、その移動度は、混合されていない複合体を用いた場合の移動度の間にある(図18B)。これは、DNAが両方のタンパク質で覆われていることを示す。さまざまに修飾された、または、1つまたは2回修飾されたNPF形成タンパク質の混合も可能である。
DNAおよびUvsX−NLS−VP22とUvsX−NLSの混合物の複合体によるセルライン(NIH3T3)のトランスフェクション
実験の概要:
2.5×105細胞(NIH3T3)を6穴プレートの各穴に播種し、翌日、蛍光レポータータンパク質を発現する遺伝子を含有するベクターをトランスフェクションした。これは、さらに、0μg〜1μgの直鎖状または1μgの環状DNAを、36μgのUvsXH6N2VP22c50と、または19μgのUvsXH6N2VP22c50と39μgのUvsXH6N2−2の混合物と、結合バッファー(76mM K2HPO4、17mM KH2PO4、14mM NaH2PO4、5mM MgCl2、および1mM ATP−γ−S、pH7.21)中、室温下に30分間、予備インキュベートし、1mlのRPMIと共に、予めPBS/BSAで一度洗浄した細胞に添加した。インキュベーターで37℃、5%CO2下、1時間のインキュベーションした後、それぞれ1mlのRPMI/20%FCSを添加し、さらにインキュベーターでインキュベートした。その後、4時間後または24時間後に蛍光顕微鏡で細胞を分析した。
Claims (13)
- 核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも1つのタンパク質による細胞のトランスフェクション(但し、ヒトにおけるin vivoのトランスフェンクションを除く)のための方法であって、
前記タンパク質は、トランスフェクションの1つ又は複数のステップに影響する少なくとも二つの機能的構成成分でまず修飾され、
前記タンパク質はUvsXであり、
前記機能的構成成分は核局在化シグナル及びインテグリン結合モチーフRGDであり、
次いでトランスフェクションされる核酸に修飾されたタンパク質を結合し、核酸およびタンパク質がフィラメント状の複合体を形成し、最終的に、この複合体をトランスフェクションされる細胞に添加することを特徴とする、方法。 - アミノ酸および/又はタンパク質ドメインの欠失又は挿入によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- アミノ酸および/又は別の分子群の化学的変化によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、又は他の分子の化学的結合によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記機能的構成成分が細胞表面への前記複合体の会合をもたらすことを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記機能的構成成分が、細胞膜を通っての前記複合体の非エンドソーム通過をもたらすことを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記機能的構成成分が前記複合体のエンドソーム/リソソームからの放出をもたらすことを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記機能的構成成分が前記複合体の細胞核への輸送をもたらすことを特徴とする、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記タンパク質に多数の機能的構成成分を結合することを特徴とする、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- ヌクレオシド三リン酸及び/又はその非加水分解性類似体の添加によって、特にATP(アデノシン三リン酸)及び/又はGTP(グアノシン三リン酸)及び/又はその非加水分解性類似体によって、前記複合体を安定化させることを特徴とする、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 核酸の別の生物学的及び/又は化学的及び/又は物理学的なトランスフェクション方法、特にエレクトロポレーション法と組み合わせて使用することを特徴とする、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 核タンパク質フィラメントを含有し、トランスフェクションされる核酸の少なくとも1つおよび核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも1つのタンパク質から形成されるトランスフェクション試薬であって、
核タンパク質フィラメント形成能を有する前記タンパク質が、トランスフェクション1つ又は複数のステップに影響を与える少なくとも二つの機能的構成成分で修飾され、
前記タンパク質はUvsXであり、
前記機能的構成成分は核局在化シグナル及びインテグリン結合モチーフRGDであることを特徴とするトランスフェクション試薬。 - 前記タンパク質に多数の機能的構成成分が結合されていることを特徴とする、請求項12に記載のトランスフェクション試薬。
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