JP4644263B2 - Solid support and method for mass spectrometry by desorption / ionization of a plurality of substances or complexes on the solid support - Google Patents
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Description
本発明は、ゲル中に分離された核酸及びタンパク質等の生体分子を固体支持体に転写し、迅速に質量分析することにより分析及び解析する方法に関する。 The present invention relates to a method for analysis and analysis by transferring biomolecules such as nucleic acids and proteins separated in a gel to a solid support and performing rapid mass spectrometry.
ペプチド、タンパク質、核酸及び糖鎖など生体分子の多くは比較的少数の構成単位が一定の規則で重合してできている。例えば、ペプチドやタンパク質は２０種のＬ-α-アミノ酸がペプチド結合でつながった分子である。これらの構成単位の分子の構造は既にほとんどが明らかになっており、当然、それらの正確な分子量も明らかとなっている。従って、生体分子やその断片の分子量を正確に測定できれば、その構造（配列など）や生体内で受ける様々な修飾反応の解析に大きく寄与しうることから、質量分析法はＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析に欠かせない手段として位置づけられている。質量分析の中でもレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、ＤＮＡ、タンパク質等の巨大高分子をイオン化できるため、生体分子の有用な解析手段として注目されている。 Many biomolecules such as peptides, proteins, nucleic acids and sugar chains are formed by polymerizing a relatively small number of structural units according to a certain rule. For example, peptides and proteins are molecules in which 20 types of L-α-amino acids are linked by peptide bonds. Most of the molecular structures of these structural units have already been clarified, and naturally their exact molecular weights have also been clarified. Therefore, if the molecular weight of biomolecules or fragments thereof can be accurately measured, mass spectrometry can greatly contribute to the analysis of the structure (sequence, etc.) and various modification reactions received in vivo. It is positioned as an indispensable means for molecular structure analysis. Among mass spectrometry, a laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer has attracted attention as a useful means for analyzing biomolecules because it can ionize macromolecules such as DNA and proteins.
レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置においては、分析したい試料部位にレーザを照射し、そこから脱離してきたイオンを電場によって加速する。 In a laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer, a sample site to be analyzed is irradiated with a laser, and ions desorbed therefrom are accelerated by an electric field.
そうすると、ｍ／ｚ値が小さいイオン、すなわち軽いイオンほど高速で飛行して検出器に到着する。レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析は、このような質量電荷比（ｍ／ｚ値）の違いでイオンの飛行時間が異なることを利用して質量分析を行う方法である。 Then, ions having a smaller m / z value, that is, lighter ions fly at a higher speed and arrive at the detector. Laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry is a method of performing mass analysis by utilizing the fact that the time of flight of ions varies depending on such a difference in mass-to-charge ratio (m / z value).
一方、質量分析によるＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析／決定には、分析対象を多数の成分に分離精製し、さらに個々の成分を制限酵素で断片化したものを分析する必要があり、非常に多数の試料を分析しなければならない。また、ＤＮＡ診断においては、多数の人間から得た試料を迅速に処理する必要がある。 On the other hand, in the structural analysis / determination of biomolecules such as DNA and protein by mass spectrometry, it is necessary to separate and purify the analysis target into a number of components, and further analyze the individual components fragmented with restriction enzymes A very large number of samples must be analyzed. In DNA diagnosis, it is necessary to rapidly process samples obtained from a large number of people.
それに対し市販されている一般的なレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、精製したそれぞれの試料をサンプルボードに配置し、これを１個ずつ質量分析していく。すなわちサンプリングした試料各点にレーザを照射し１個ずつ分析していく必要があった。従って、未精製の試料を電気泳動により分離した場合は、泳動後のゲルをバンドごとに切り出してそれぞれ精製してから１個ずつレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置によって質量分析する必要があり、多数の試料を迅速に分析することは非常に困難であった。 On the other hand, a general laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer commercially available places each purified sample on a sample board and performs mass analysis one by one. In other words, it was necessary to irradiate each sampled sample with laser and analyze it one by one. Therefore, when an unpurified sample is separated by electrophoresis, it is necessary to cut out the gel after electrophoresis for each band and purify each, and then perform mass analysis using a laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer. It was very difficult to analyze a large number of samples quickly.
また、電気泳動した生体分子をゲルからニトロセルロース等のメンブレン上に転写してこれを分析する方法も知られているが、メンブレン上の分析においてはレーザを利用した質量分析を行うことはできず、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションを利用した蛍光検出等に限られる。なぜなら、従来使用されているニトロセルロースやＰＶＤＦ等のメンブレンは、レーザを照射するとメンブレン自体の分解が起きる可能性が高いからである。すなわち、これらのメンブレン上に転写された生体分子をそのまま上記のようなレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置で分析することは困難であった。 In addition, a method is also known in which electrophoretic biomolecules are transferred from a gel onto a membrane such as nitrocellulose and analyzed. However, mass spectrometry using a laser cannot be performed for analysis on the membrane. And fluorescence detection using antigen-antibody reaction or nucleic acid hybridization. This is because conventionally used membranes such as nitrocellulose and PVDF are highly likely to decompose when irradiated with a laser. That is, it is difficult to analyze the biomolecules transferred on these membranes as they are with the above-described laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer.
本発明の課題は、多数の試料を迅速に質量分析する手段を提供し、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析を迅速に実施する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a means for rapidly mass-analyzing a large number of samples, and to provide a method for rapidly analyzing biomolecules such as nucleic acids and proteins.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離展開された物質を、表面にカーボン層が形成された固体支持体上に転写し、これを脱離／イオン化して質量分析する方法により、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have separated a substance in a sample by gel electrophoresis, and then separated and developed the substance in the gel, and a solid support having a carbon layer formed on the surface. It has been found that the above problem can be solved by a method of mass spectrometry by transferring it onto and desorbing / ionizing it, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された該物質が転写保持されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（２）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写し、該メンブレン上に転写された物質をさらに転写保持することにより該物質が固定化されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（３）（１）又は（２）に記載の固体支持体上に固定化された物質に、これと相互作用する別の物質を加えて複合体を形成させてなる固体支持体。
（４）溶液中で相互作用する物質同士の複合体を形成させ、該複合体がゲル電気泳動で分離される（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（５）カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である（１）〜（４）のいずれかに記載の固体支持体。
（６）カーボン層の厚みが単分子層〜１００μｍである（１）〜（５）のいずれかに記載の固体支持体。
（７）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（８）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在し該カーボン層と共有結合しているアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（９）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１０）表面にカーボン層を有する固体支持体を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１１）転写保持された物質が核酸、ペプチド又はこれらの複合体である（１）〜（１０）のいずれかに記載の固体支持体。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の固体支持体上に転写保持された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法。
（１３）（１２）に記載の方法において使用するための、表面にカーボン層を有する固体支持体。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A solid support having a carbon layer on the surface, wherein a substance in a sample is separated by gel electrophoresis, and then the substance separated in the gel is transferred and held.
(2) After the substance in the sample is separated by gel electrophoresis, the substance separated in the gel is transferred to the membrane, and the substance transferred on the membrane is further transferred and held to immobilize the substance. A solid support having a carbon layer on the surface.
(3) A solid support obtained by adding another substance that interacts with the substance immobilized on the solid support according to (1) or (2) to form a complex.
(4) The solid support according to (1) or (2), wherein a complex of substances interacting in a solution is formed, and the complex is separated by gel electrophoresis.
(5) The solid support according to any one of (1) to (4), wherein the carbon layer is a diamond-like carbon layer.
(6) The solid support according to any one of (1) to (5), wherein the thickness of the carbon layer is a monomolecular layer to 100 μm.
(7) The solid support according to any one of (1) to (6), further comprising an amino group-containing compound that is present on the carbon layer on the substrate surface but is not covalently bonded to the carbon layer. .
(8) The solid support according to any one of (1) to (6), wherein the solid support further comprises an amino group-containing compound that exists on the carbon layer on the substrate surface and is covalently bonded to the carbon layer.
(9) The solid support according to any one of (1) to (6), obtained by vapor-depositing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group and a carbon compound on a substrate.
(10) The solid support having a carbon layer on the surface thereof is obtained by immersing in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, according to any one of (1) to (6) Solid support.
(11) The solid support according to any one of (1) to (10), wherein the transferred and retained substance is a nucleic acid, a peptide, or a complex thereof.
(12) A method of mass spectrometry by desorption / ionization of a plurality of substances or complexes transferred and held on the solid support according to any one of (1) to (11).
(13) A solid support having a carbon layer on its surface for use in the method according to (12).
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。 According to the method of the present invention, after a large number of substances contained in a sample are separated by electrophoresis, substances contained in individual bands can be transferred and held on a solid support without purifying a plurality of substances. Since mass spectrometry can be performed simultaneously and directly, a large number of samples can be analyzed quickly.
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。 Therefore, the present invention is a very useful means in the analysis of biomolecules such as nucleic acids and proteins.
本発明では、試料をゲル電気泳動で分離し、泳動後のゲルと表面にカーボン層が形成された固体支持体とを密着させることにより、ゲル中に分離展開された分析対象物質を該固体支持体上に転写する。そして、固体支持体上に転写保持された物質を脱離／イオン化することにより複数の物質を質量分析する。 In the present invention, a sample is separated by gel electrophoresis, and the analyte after separation and development in the gel is supported by bringing the gel after electrophoresis into close contact with a solid support having a carbon layer formed on the surface. Transfer on the body. A plurality of substances are subjected to mass spectrometry by desorption / ionization of the substances transferred and held on the solid support.
本発明において、固体支持体に転写保持し、分析できる物質としては、特に制限されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸及びペプチド等の生体分子が挙げられる。本明細書においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。特に高分子量の物質を分析できる点で有利である。これらの物質を含むゲル電気泳動の対象となる試料としては、特に制限されないが、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等が挙げられる。 In the present invention, substances that can be transferred and retained on a solid support and analyzed are not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids such as DNA and RNA, and biomolecules such as peptides. In the present specification, the peptide includes oligopeptides, polypeptides, and proteins. In particular, it is advantageous in that a high molecular weight substance can be analyzed. Samples to be subjected to gel electrophoresis containing these substances are not particularly limited, but include cell extracts, bacterial cell extracts, cell-free synthetic products, PCR (Polymerase chain reaction) products, enzyme-treated products, synthetic DNAs , Synthetic RNA, synthetic peptide and the like.
電気泳動によりゲル中に分離された生体分子等の物質を転写保持するための固体支持体は、基板の表面にカーボン層を有し、これらの生体分子を転写保持できるものであれば特に制限されない。カーボン層に特定の化学修飾を施したものが好ましい。特定の化学修飾を施すことにより分析対象となる物質が保持しやすくなり、また安定に転写保持されるからである。 The solid support for transferring and holding substances such as biomolecules separated in gel by electrophoresis is not particularly limited as long as it has a carbon layer on the surface of the substrate and can transfer and hold these biomolecules. . What gave the carbon layer a specific chemical modification is preferable. This is because by applying a specific chemical modification, the substance to be analyzed can be easily retained, and can be stably transferred and retained.
本発明において基板とはカーボン層を形成させるもととなる基材を意味し、このような基材としては、特に制限されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。ガラス又はプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものを使用することもできる。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。 In the present invention, the substrate means a base material from which the carbon layer is formed, and such a base material is not particularly limited. For example, gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum, chromium, Metals such as platinum, titanium and nickel; alloys such as stainless steel, hastelloy, inconel, monel and duralumin; laminates of the above metals and ceramics; glass; silicon; fibers; wood; paper; plastics such as polycarbonate and fluororesin; Mention may be made of a mixture of plastic and the above metals, ceramics, diamond and the like. What formed the metal layer which consists of platinum, titanium, etc. on the surface of glass or plastic etc. can also be used. The metal layer can be formed by sputtering, vacuum deposition, ion beam deposition, electroplating, electroless plating, or the like.
固定化された物質について、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等によって質量分析を行う場合、固体支持体に高電圧がかかるため、基板は導電性を有するもの、例えば、ステンレス、アルミニウム、チタン等が好ましい。 When mass analysis is performed on the immobilized substance by laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry or the like, since a high voltage is applied to the solid support, the substrate has conductivity, such as stainless steel, aluminum, Titanium or the like is preferable.
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、及びエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。 The carbon layer formed on the substrate in the present invention is not particularly limited, but diamond, diamond-like carbon, amorphous carbon, graphite, hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide. , Tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, vanadium carbide and the like, and a diamond-like carbon (DLC) layer is preferable. The carbon layer has excellent chemical stability and can withstand subsequent chemical modification and reaction in the binding to the analyte, and the binding is flexible because it binds to the analyte by electrostatic binding. This is advantageous in that it has no UV absorption, is transparent to the detection system UV, and can be energized during electroblotting. Further, it is advantageous in that nonspecific adsorption is small in the binding reaction with the analyte.
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。 In the present invention, the carbon layer can be formed by a known method. For example, a microwave plasma CVD (Chemical vapor deposition) method, an ECRCVD (Electrical cyclotron resonance) method, an ICP (Inductive coupled plasma) method, a direct current sputtering method, an ICP (Inductive coupled plasma method) Examples thereof include a vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method.
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。 In the high-frequency plasma CVD method, a source gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by a high frequency to synthesize a DLC (diamond-like carbon) layer on a substrate. In the ionization vapor deposition method, the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a carbon layer is formed on the substrate by a bias voltage. The DLC layer may be formed by ionized vapor deposition in a mixed gas composed of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of remaining methane gas.
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。 In the arc evaporation method, an arc discharge is generated in a vacuum by applying a DC voltage between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode), and a plasma of carbon atoms is generated from the cathode to generate an evaporation source. Further, by applying a negative bias voltage to the substrate, carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a carbon layer.
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。 In the laser vapor deposition method, for example, a carbon layer can be formed by irradiating a graphite target plate with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light and melting it, and depositing carbon atoms on a glass substrate.
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地固体支持体の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。 The thickness of the carbon layer on the surface of the solid support of the present invention is usually a monomolecular layer to about 100 μm, and if it is too thin, the surface of the underlying solid support may be locally exposed. Since productivity deteriorates, it is preferably 2 nm to 1 μm, more preferably 5 nm to 500 nm. Note that all of the solid support may be made of a carbon material.
泳動後のゲルから物質を転写した後、直接レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等を行うため、本発明の固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。 In order to perform direct laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry after transferring the substance from the gel after electrophoresis, the solid support of the present invention preferably has a flat plate shape. The size is not particularly limited, but is usually about 10 to 200 mm wide × 10 to 200 mm long × 0.1 to 20 mm thick.
核酸やペプチド等の生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された基板の表面を化学修飾することにより静電的に帯電させることが好ましい。このような表面静電化は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。 In order to immobilize biomolecules such as nucleic acids and peptides, it is preferable to electrostatically charge the surface of the substrate on which the carbon layer is formed by chemical modification. Such surface electrostaticization can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited, and examples thereof include introduction of an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, and a hydroxyl group. It is also effective to introduce metal chelates such as nickel chelates and cobalt chelates.
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。又は、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。 Introduction of amino groups can be carried out, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in ammonia gas. Alternatively, the reaction can be carried out by reacting a polyvalent amine gas such as methylenediamine or ethylenediamine with a chlorinated carbon layer.
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。 The introduction of the carboxyl group can be carried out, for example, by reacting a suitable polycarboxylic acid with the carbon layer aminated as described above.
エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。 Introduction of an epoxy group can be carried out, for example, by reacting a suitable polyvalent epoxy compound with the carbon layer aminated as described above. Or it can obtain by making an organic peracid react with the carbon = carbon double bond which a carbon layer contains. Examples of the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, performic acid, and trifluoroperacetic acid.
ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。 Introduction of the formyl group can be carried out, for example, by reacting glutaraldehyde with the carbon layer aminated as described above.
ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。 Introduction of hydroxyl groups can be carried out, for example, by reacting water with the carbon layer chlorinated as described above.
ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基を導入するのが好ましい。 When nucleic acids such as DNA and RNA are retained, amino groups, carbodiimide groups, epoxy groups, and formyl groups are preferably introduced.
ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートを導入するのが好ましい。金属キレートを導入した固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。 When holding a peptide, it is preferable to introduce an amino group, a carbodiimide group, an epoxy group, a formyl group, or a metal chelate. When a solid support into which a metal chelate is introduced is used, a peptide having a label having an affinity for a metal ion such as a polyhistidine sequence can be immobilized effectively and stably. The metal chelate can be introduced, for example, by chlorinating the substrate on which the carbon layer is formed and then aminating it, and then adding a halocarboxylic acid such as chloroacetic acid to introduce a chelate ligand. Labels such as polyhistidine sequences can be introduced by methods known to those skilled in the art.
また、上記表面静電化は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。 Further, the surface electrostaticization may be performed by forming an electrostatic layer on the surface carbon layer. The electrostatic layer can be formed using a positively charged compound such as an amino group-containing compound.
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。 Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH 2 ), or an amino group monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (—NHR; R is a substituent), for example, Ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg, ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acid (glycine, alanine) , Valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, histidine , Aniline, or a polymer thereof (for example, polyallylamine, polylysine) or a copolymer; a polyamine (polyvalent amine) such as 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene, spermidine, spermine, or putrescine Is mentioned.
静電層は、基板又はカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板又はカーボン層と共有結合させて形成してもよい。 The electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, or may be formed to be covalently bonded to the substrate or the carbon layer.
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、カーボン層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。 In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, for example, when the carbon layer is formed, the amino group-containing compound is introduced into the film forming apparatus, thereby containing an amino group. A carbon-based film is formed. Ammonia gas may be used as the compound introduced into the film forming apparatus. In addition, the carbon layer may be a multi-layer structure in which a film containing an amino group is formed after the adhesion layer is formed. In this case, the carbon layer may be formed in an atmosphere containing ammonia gas. Film formation can be performed by, for example, a plasma method.
また、静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又はカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。 Further, when the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the carbon layer, the above-mentioned non-existence is formed on the substrate in order to increase the affinity, that is, the adhesion between the electrostatic layer and the substrate or the carbon layer. It is preferable to deposit a compound having a substituted or monosubstituted amino group and a carbon compound. The carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane which are gases at normal temperature are preferable. As a method of vapor deposition, ionized vapor deposition is preferable, and as conditions for ionized vapor deposition, it is preferable that an operating pressure is 0.1 to 50 Pa and an acceleration voltage is in a range of 200 to 1000 V.
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又はカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。 When the electrostatic layer is formed by covalently bonding to the substrate or the carbon layer, for example, the surface of the substrate or the substrate provided with the carbon layer is chlorinated by irradiating ultraviolet rays in chlorine gas, and then the amino group-containing compound. Among them, for example, polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene and other polyvalent amines are reacted to introduce an amino group at the terminal not bonded to the substrate. Thereby, an electrostatic layer can be formed.
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。 When forming an electrostatic layer by immersing the substrate in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, when polyallylamine is used as the amino group-containing compound, the substrate is in close contact with the substrate. This improves the amount of immobilized biomolecules. The electrostatic layer can also be formed by immersing the substrate in a solution in which the silane coupling agent coexists with the amino group-containing compound.
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。 The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.
本発明において試料の分離に使用できる電気泳動法としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法などを挙げることができる。当業者であれば、分離の対象となる物質の種類及び分子量等から使用する電気泳動法の種類を適宜選択することができる。 The electrophoresis method that can be used for separation of the sample in the present invention is not particularly limited. For example, agarose gel electrophoresis, sieving agarose gel electrophoresis, denatured agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, SDS Examples thereof include polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric point gel electrophoresis, and two-dimensional electrophoresis. A person skilled in the art can appropriately select the type of electrophoresis method to be used from the type and molecular weight of the substance to be separated.
アガロースゲル電気泳動法は、核酸を分離するために最もよく利用される手法である。アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較してゲルの網目構造が大きいため、数十〜数百ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを長さや分子構造の違いで分離することができる。ＤＮＡフラグメント全体の荷電状態は主にリン酸基の数に依存するため、移動度はＤＮＡフラグメントの大きさに比例する。電場方向を断続的に変化させて泳動すると酵母染色体などの巨大ＤＮＡを分離することもできる（パルスフィールド電気泳動）。 Agarose gel electrophoresis is the most commonly used technique for separating nucleic acids. Since an agarose gel has a larger network structure than a polyacrylamide gel, DNA fragments of several tens to several hundreds Kbp can be separated by differences in length and molecular structure. Since the charge state of the entire DNA fragment mainly depends on the number of phosphate groups, the mobility is proportional to the size of the DNA fragment. When electrophoresis is carried out by changing the electric field direction intermittently, it is possible to separate large DNA such as yeast chromosomes (pulse field electrophoresis).
核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＤＮＡフラグメントの解析に主に用いられ、ポリアクリルアミドゲルの微細な網目構造を利用して、アガロースゲル電気泳動の場合に比較して短鎖（〜１Ｋｂｐ）のフラグメントを長さと構造に基づいて分離する手法である。ＤＮＡの立体構造（コンフォメーション）の影響を強く受けるため、ＤＮＡ鎖長の推定は二本鎖ＤＮＡを泳動する場合に限られる。一本鎖ＤＮＡは様々な構造を取ることが予想されるので移動度とそのＤＮＡ鎖長との間に相関は見られず、しばしば複数のバンドとして検出されることもある。ＤＮＡ塩基のわずかな違いでも構造変化がおこり、泳動パターンに反映される。これを利用したＤＮＡフラグメント解析手法（ＳＳＣＰ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も開発され遺伝子変異解析に利用されている。特殊な配列（繰返し配列や塩基の偏りなど）を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構造を歪めることが知られており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法はＤＮＡの構造・機能解析にも使用できる。また、尿素などを含む変性ゲル中では、一本鎖ＤＮＡも構造の影響を受けることなく鎖長に応じて分離できる。 Polyacrylamide gel electrophoresis of nucleic acids is mainly used for the analysis of DNA fragments. By using the fine network structure of polyacrylamide gel, fragments of short chains (~ 1 Kbp) compared to agarose gel electrophoresis are used. Is a method of separating the images based on length and structure. Since it is strongly influenced by the three-dimensional structure (conformation) of DNA, the estimation of the DNA chain length is limited to the case of migrating double-stranded DNA. Since single-stranded DNA is expected to have various structures, there is no correlation between mobility and the length of the DNA strand, and it is often detected as a plurality of bands. Even slight differences in DNA bases cause structural changes that are reflected in the electrophoretic pattern. A DNA fragment analysis method (SSCP: Single-Strand Conformation Polymerism) using this has been developed and used for gene mutation analysis. Double-stranded DNA fragments containing special sequences (repetitive sequences, base biases, etc.) are known to distort DNA structures, and polyacrylamide gel electrophoresis can be used for DNA structure / function analysis. In a denaturing gel containing urea or the like, single-stranded DNA can also be separated according to the chain length without being affected by the structure.
ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、目的タンパク質の高次構造を変性して分子量の違いにより分離する手法である。ポリアクリルアミドゲルは、ゲル中の細孔径が密なため１００〜２００ＫＤａ以下のタンパク質やポリペプチドを分離するのに適している。操作が簡便で再現性が高いので、タンパク質の電気泳動では最もよく用いられている手法である。通常は、泳動サンプルの調製時にβ-メルカプトエタノールやＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などの還元剤を添加してタンパク質のＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を切断する。ＳＤＳの結合量によって分子の電荷がほぼ決まるため、電気泳動によりポリペプチド分子を分子量に従って分離することができる。ＳＤＳは強力な陰イオン界面活性剤なので、膜タンパク質などの不溶性タンパク質の可溶化にも適している。 SDS (Sodium dodecyl sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE method) is a technique in which a higher-order structure of a target protein is denatured and separated by a difference in molecular weight. Polyacrylamide gel is suitable for separating proteins and polypeptides of 100 to 200 KDa or less because the pore diameter in the gel is dense. It is the most commonly used technique for protein electrophoresis because of its simple operation and high reproducibility. Usually, when preparing an electrophoresis sample, a reducing agent such as β-mercaptoethanol or DTT (Dithiothreitol) is added to cleave the S—S bond (disulfide bond) of the protein. Since the molecular charge is substantially determined by the amount of SDS bound, the polypeptide molecules can be separated by electrophoresis according to the molecular weight. Since SDS is a strong anionic surfactant, it is also suitable for solubilizing insoluble proteins such as membrane proteins.
等電点電気泳動は、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行う泳動手法である。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はｐＨ条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるｐＨの値が等電点となる。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にｐＨ勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のｐＩと同じｐＨに向かってｐＨ勾配を形成したゲル中を移動する。ｐＨ勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてｐＨ勾配を形成する手法と、様々なｐＩの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する手法（ＩＰＧ法：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）とがあり、プロテオミクス研究では、分離能、再現性、添加許容量ともに優れるＩＰＧ法が主に用いられている。ＩＰＧ法専用のプレキャストゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｇｅｌ）が市販されている。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ｐＨ単位の違いでも分離することができる。 Isoelectric focusing is an electrophoretic technique in which the isoelectric point (pI) of proteins is separated to measure and analyze the isoelectric point of the target protein. The charge at the amino acid side chain, amino terminal, and carboxyl terminal constituting the protein varies depending on the pH condition, and the pH value at which the total charge becomes zero is the isoelectric point. In order to perform isoelectric focusing, it is necessary to create a pH gradient in the electrophoresis gel. When a sample is added to an electrophoresis gel and an electric field is applied, each protein moves through the gel that forms a pH gradient toward the same pH as the unique pI. For the preparation of a pH gradient gel, an amphoteric carrier (carrier ampholite) is added to the gel and an electric field is applied to form a pH gradient, and acrylamide derivatives having various pI side chains are used simultaneously with gel preparation. There is a method of forming a pH gradient (IPG method: Immobilized pH gradient), and in the proteomics research, the IPG method which is excellent in resolution, reproducibility, and addition tolerance is mainly used. A precast gel (Immobiline Dry Strip Gel) dedicated to the IPG method is commercially available. The resolution of isoelectric focusing using carrier ampholite is 0.01 to 0.02 pH unit, and the IPG method can be separated even by a difference of 0.001 pH unit.
二次元電気泳動法は、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する方法である。一般的に一次元目は等電点電気泳動によりタンパク質を分離し、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量で分離する。いずれの手法も分離能が非常に高いので、細胞全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができる。再現性と解像度に優れた固定化ｐＨ勾配法（ＩＰＧ法）を一次元目泳動に用いることが一般的である。また、より多くのスポットを得るために、幅広いｐＨレンジの分離結果を基にしてＮａｒｒｏｗ ｐＨ ＩＰＧゲルで目的ｐＨ部分のみを分離したり、２０ｃｍ以上の大型ゲルを用いて二次元目電気泳動を行うこともできる。 Two-dimensional electrophoresis is a method of separating proteins in two dimensions by two-stage electrophoresis. In general, the first dimension separates proteins by isoelectric focusing, and the second dimension separates by molecular weight by SDS-PAGE. Since both methods have very high resolution, it is possible to separate the whole cell protein into thousands of spots. In general, an immobilized pH gradient method (IPG method) excellent in reproducibility and resolution is used for the first-dimensional electrophoresis. In addition, in order to obtain more spots, only the target pH portion is separated with a narrow pH IPG gel based on the separation results in a wide pH range, or the second dimension electrophoresis is performed using a large gel of 20 cm or more. You can also.
本発明においては、ＤＮＡ、ＲＮＡを分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。これらの電気泳動法は、当技術分野における当業者が通常使用する方法で実施することができる。 In the present invention, agarose gel electrophoresis is preferably used for separating DNA and RNA, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional electrophoresis are used for separating peptides. Is preferred. These electrophoresis methods can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art.
電気泳動後、ゲルを、使用する固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された分析対象物質を本発明の固体支持体上に転写する固体支持体への転写方法としては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法を使用することができる。例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティング及び電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。 After electrophoresis, the gel is cut into a size on the solid support to be used, the gel and the solid support are brought into close contact with each other, and the analyte to be analyzed separated in the gel is transferred onto the solid support of the present invention. The transfer method to the solid support is not particularly limited, and a method usually used in this technical field can be used. For example, capillary blotting using capillary action, vacuum blotting by suction with a pump, and electroblotting using an electrical technique may be mentioned. When transferring nucleic acids, it is preferable to use capillary blotting. When transferring peptides, it is preferable to use electroblotting.
エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式及びセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、当技術分野で通常用いられているエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。 In electroblotting, any of tank type, semi-dry type and semi-wet type can be used, but it is preferable to use semi-dry type electro-blotting from the viewpoint of a small amount of buffer used and a short reaction time. . As a blotting apparatus, an electroblotting apparatus usually used in this technical field can be used. The energization conditions in electroblotting are a constant voltage, 200 V or less, preferably 0.1 to 10 V, and 1 to 500 minutes, preferably 5 to 100 minutes. However, if the voltage is higher than the oxidation potential of the metal substrate, metal elution occurs. Therefore, it is preferable that the voltage be lower than the oxidation potential of the substrate metal.
以下に、試料中のタンパク質を分析する場合の本発明における電気泳動及び転写の一態様を示す。まず、試料中のタンパク質を可溶化する。すなわち、試料に存在するタンパク質分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってタンパク質を効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。続いて、ゲルを陰極側、転写用固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧で一定時間転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、及び陽極と固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、ホウ酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。Ｔｒｉｓ及びε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。 Hereinafter, one embodiment of electrophoresis and transcription in the present invention when analyzing proteins in a sample will be described. First, the protein in the sample is solubilized. That is, heat treatment is performed for a certain period of time in boiling water in order to inactivate the proteolytic enzyme present in the sample and effectively denature the protein with SDS and β-mercaptoethanol. Next, a certain amount is injected into each lane of the SDS-polyacrylamide gel, and electrophoresis is performed at a constant voltage for a certain time using a glycine-Tris buffer containing SDS as a migration buffer. After electrophoresis, the gel is immersed in glycine-Tris buffer (transfer buffer) containing methanol, which has been cooled in advance, for equilibration. Subsequently, the gel is attached to the electroblotting apparatus with the cathode side and the solid support for transfer as the anode side. A transfer buffer is added to the transfer tank, and transfer is performed at a constant voltage for a certain time under ice cooling. At this time, from the viewpoint of increasing the transfer efficiency, it is preferable to dispose a filter paper containing a buffer or ion exchange water between the cathode and the gel and between the anode and the solid support. Examples of the buffer contained in the filter paper on the cathode side include those containing Tris, ε-aminocaproic acid, acetic acid, EDTA, phosphoric acid, boric acid, tartaric acid, SDS and the like. When using a buffer containing Tris and ε-aminocaproic acid, the concentration of ε-aminocaproic acid is usually 1000 mM or less, preferably 1 μM to 1000 mM, more preferably 1 to 300 mM. The filter paper on the anode side preferably contains ion exchange water.
本発明の別の態様においては、対象物質を電気泳動後のゲルから従来技術において使用されるようなメンブレンに転写し、さらに該メンブレンから本発明の固体支持体上に転写することにより、ゲル中に分離された物質を固体支持体上に転写保持することもできる。この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロン及びポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写及びメンブレンから固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから固体支持体への転写においては、エレクロトブロッティング装置を利用するのが好ましい。 In another aspect of the present invention, the target substance is transferred from the gel after electrophoresis to a membrane as used in the prior art, and further transferred from the membrane onto the solid support of the present invention. It is also possible to transfer and hold the separated material on the solid support. Examples of membrane materials that can be used in this case include nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride), nylon, and positively charged nylon. In protein transcription, PVDF having the highest protein binding ability is preferably used, and in nucleic acid transcription, PVDF with less non-specific adsorption of nucleic acid is preferably used. Transfer of the electrophoretic substance from the gel to the membrane and transfer from the membrane to the solid support can be carried out by the same method as described above. In the transfer from the gel to the membrane, electroblotting is preferably used, and the energization conditions in electroblotting are 0.1 to 50 V, preferably about 5 to 120 minutes. In the transfer from the membrane to the solid support, an electroblotting device is preferably used.
本発明の別の態様においては、電気泳動によって分離された物質を固体支持体上に転写保持し、この物質と相互作用する物質を反応させて複合体を形成し、形成した複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。既に述べたような方法により、タンパク質が固体支持体上に転写保持される場合は、該タンパク質に対する抗体を反応させて複合体を形成し、該複合体にレーザに照射等を行ってイオン化することにより質量分析を行うことができる。また、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸が固体支持体上に転写保持される場合は、該核酸に対して相補的な核酸を固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせ、形成した二本鎖をイオン化して質量分析を行うことができる。その他の相互作用としては、例えば、酵素反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等を利用することができる。相互作用によって形成した複合体の質量分析を行うことにより、プローブ分子に特異的に相互作用したターゲット分子の塩基配列或いはアミノ酸配列を解析することができる。 In another aspect of the present invention, a substance separated by electrophoresis is transferred and held on a solid support, a substance that interacts with the substance is reacted to form a complex, and the formed complex is ionized. Therefore, mass spectrometry can be performed. As a mass spectrometric method, a technique of analyzing atomic / molecular ions based on a difference in mass using electrical interaction can be used. Such a mass spectrometer has three different functions of ion generation / separation / detection. When a protein is transferred and held on a solid support by the method described above, a complex is formed by reacting an antibody against the protein, and the complex is ionized by irradiating a laser or the like. Thus, mass spectrometry can be performed. When a nucleic acid such as DNA or RNA is transferred and held on a solid support, a nucleic acid complementary to the nucleic acid is hybridized to the nucleic acid on the solid support, and the formed double strand is ionized. Mass spectrometry can be performed. As other interactions, for example, an enzyme reaction, biotin-streptavidin interaction, or the like can be used. By performing mass spectrometry of the complex formed by the interaction, the base sequence or amino acid sequence of the target molecule that specifically interacts with the probe molecule can be analyzed.
本発明の別の態様においては、相互作用する物質を分析することを目的として、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を固体支持体上に転写保持し、固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。 In another embodiment of the present invention, for the purpose of analyzing interacting substances, a complex of interacting substances in solution is formed and then subjected to electrophoresis and separated by electrophoresis. Mass spectrometry can also be performed by transferring and holding the complex on a solid support and ionizing the complex on the solid support. Since such an analysis method performs complex formation in a solution, it is advantageous for an analysis that needs to maintain a high degree of three-dimensional structure of a substance to be analyzed, such as protein analysis.
固体支持体上に固定化された物質は、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等の手段によりそのまま質量分析を実施することができる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなα又はβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、単一又は多重四重極、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオン捕獲、高周波ならびにイオン捕獲／飛行時間等が挙げられ、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、高周波及びイオン捕獲／飛行時間を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式もしくはそれらの組合せを含む分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。生体分子などの高分子物質をイオン化し、及び固体支持体上の複数の物質を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析を利用するのが好ましい。 The substance immobilized on the solid support can be directly subjected to mass spectrometry by means such as laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry. Examples of ionization methods that can be used for mass spectrometry include matrix-assisted laser desorption (MALDI), electron impact ionization (EI), photoionization, and large LET α or β rays emitted from radioisotopes. Ionization method using a secondary ionization method, fast atom collision ionization method, field ionization ionization method, surface ionization ionization method, chemical ionization (CI) method, field ionization (FI) method, ionization method by spark discharge, etc. The matrix-assisted laser desorption (MALDI) method and the ionization (EI) method by electron impact are preferable. In addition, separation modes include linear or nonlinear reflection time-of-flight (TOF), single or multiple quadrupole, single or multiple magnetic sector, Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR), ion capture, radio frequency and ion capture / flight. Examples include time or the like, and those using linear or non-linear reflection time of flight (TOF), high frequency and ion capture / time of flight are preferred. Mass spectrometry can be performed by combining ionization methods such as those described above with separation modes including separation modes or combinations thereof, electrical recording and detection modes such as photographic recording. Such a mass spectrometer has three different functions of ion generation / separation / detection. From the viewpoint of ionizing a macromolecular substance such as a biomolecule and analyzing a plurality of substances on a solid support, it is preferable to use laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry.
以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた質量分析の手順を説明する。 Hereinafter, as one embodiment of the present invention, a mass spectrometric procedure using MALDI-TOF MS will be described.
分析対象物質が固定化された本発明の固体支持体に、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などのマトリックスを添加し、乾燥させる。次ぎに該固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセス及びデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。このデータから相互作用したタンパク質の正確な質量を求めることができる。 A matrix such as α-cyanohydroxycinnamic acid and sinapinic acid is added to the solid support of the present invention on which the substance to be analyzed is immobilized, and dried. Next, this solid support body is installed in the flat target of MALDI-TOF MS. Then, mass spectrometry is started using MassLynx software or the like. MassLynx can control all measurements and analyses. At the time of measurement, a parameter file for automatic measurement, a process file for data processing and database analysis performed after measurement, a sample list, and the like are created. Data processing can be performed on MassLynx using ProteinLynx software. A mass spectrum is created from the acquired data, and the created spectrum is converted to monoisotopic peak data after the accuracy is improved by MaxEnt 3 software (Micromass). Subsequently, calibration is performed to obtain final data with a mass error of about 50 ppm. From this data, the exact mass of the interacting protein can be determined.
質量分析に続いてタンパク質のアミノ酸配列分析及び同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、相互作用したタンパク質のアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、タンパク質を同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳに分析対象物質が固定化された固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、相互作用したタンパク質を同定することができる。 Mass spectrometry can be followed by amino acid sequence analysis and identification of the protein. The analysis mode of MALDI-TOF MS is changed to a mode capable of detecting a post-source decay (PSD) spectrum, and the amino acid sequence of the interacted protein is analyzed. Subsequently, the SWISSPROT database is searched based on the amino acid sequence data to identify the protein. Alternatively, a solid support on which a substance to be analyzed is immobilized is placed on MALDI-TOF / TOF MS or MALDI Q-TOF MS, and the amino acid sequence is analyzed to identify the interacted protein.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１）Ｔｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
固体支持体の作成
７６ｍｍ×２６ｍｍ×１．１ｍｍのスライドガラスにＴｉ層及びその上にＰｔ層をマグネトロンスパッタリングにより形成した。スパッタリングの条件は以下の通りである。生成した金属層の厚みは、Ｔｉ層及びＰｔ層それぞれが１００ｎｍであった。
Example 1 Protein Transfer to Ti-Pt-DLC Solid Support
Preparation of solid support A Ti layer and a Pt layer thereon were formed by magnetron sputtering on a 76 mm × 26 mm × 1.1 mm glass slide. The sputtering conditions are as follows. The thickness of the generated metal layer was 100 nm for each of the Ti layer and the Pt layer.
そして、金属層を形成した基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。 Then, a diamond-like carbon layer was formed on the substrate on which the metal layer was formed. The diamond-like carbon layer was formed by the ionization vapor deposition method under the following conditions. The thickness of the produced diamond-like carbon layer was 20 nm.
上記のようにして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成した後、表面を塩素ガス中で１分間紫外線を照射することにより塩素化し、アンモニアガス中で１０分間紫外線を照射することによりアミノ化して固体支持体１を作成した。 After the diamond-like carbon layer is formed on the substrate 1 as described above, the surface is chlorinated by irradiating ultraviolet rays in chlorine gas for 1 minute, and aminated and solidified by irradiating ultraviolet rays in ammonia gas for 10 minutes. A support 1 was prepared.
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳動
Ｃｙ３-プロテインＡ（１．５μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）、大腸菌タンパク質（０．５μｇ）及びマーカー（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、０．５μｌ、ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を試料として用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−７３００型）を用いて電気泳動を行った。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファー（ｐＨ８.３）を用い、泳動は２００Ｖで３５分間行った。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。
SDS-PAGE electrophoresis Cy3-protein A (1.5 μg, manufactured by SIGMA), E. coli protein (0.5 μg) and marker (Prestained Broad Range, 0.5 μl, manufactured by BIO RAD) were used as samples. -Electrophoresis was performed using a device for PAGE (AE-7300, manufactured by ATTO). A 10% polyacrylamide gel was used as the gel for electrophoresis. The electrophoresis buffer was glycine-Tris buffer (pH 8.3) containing 0.1% SDS, and electrophoresis was performed at 200 V for 35 minutes. After the completion of electrophoresis, the sample was stained with CBB for 15 minutes, destained, and then imaged with LAS1000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 1). A Cy3-Protein A band was detected in the vicinity of about 50 kDa.
エレクトロブロッティング
泳動後のポリアクリルアミドゲルを、あらかじめ冷却しておいた転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％メタノール）に３０分間浸漬し、平衡化した。次いで、ポリアクリルアミドゲルを固体支持体１に載る大きさに切り取って、該固体支持体と密着させ、ポリアクリルアミドゲルを陰極、固体支持体を陽極に設置し、下記条件で通電した。
The polyacrylamide gel after the electroblotting electrophoresis was immersed in a transfer buffer (25 mM Tris, 5% methanol) cooled in advance for 30 minutes to equilibrate. Next, the polyacrylamide gel was cut to a size on the solid support 1 and brought into close contact with the solid support, and the polyacrylamide gel was placed on the cathode and the solid support was placed on the anode, and energized under the following conditions.
蛍光強度の測定
タンパク質転写後の固体支持体１の蛍光強度をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で測定したところ、蛍光強度が２８２７０として測定され、Ｃｙ３−プロテインＡが固体支持体表面に固定化されたことが確認された（図２）続いて、該固体支持体をＰＢＳで１０分間洗浄した後、同様に蛍光強度を測定したところ、蛍光強度は９７６６であり、約１／３程度まで低下した（図３）。ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）で１時間ブロッキングし、蛍光強度を測定したところ蛍光強度に変化はなかった。次ぎに、５００μｌの０．０５μｇ／μｌ Ｃｙ３−ＩｇＧを添加して室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで室温にて１２時間洗浄し、蛍光強度を測定した（図４）。蛍光強度は１６４４８であり、増加していることから、プロテインＡとＩｇＧが結合したこと、すなわち、転写保持されたタンパク質の結合能が維持されたことがわかる。
Measurement of fluorescence intensity When the fluorescence intensity of the solid support 1 after protein transfer was measured with FLA8000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.), the fluorescence intensity was measured as 28270, and Cy3-Protein A was immobilized on the surface of the solid support. Subsequently, the solid support was washed with PBS for 10 minutes, and the fluorescence intensity was measured in the same manner. The fluorescence intensity was 9766, which was reduced to about 1/3. (FIG. 3). When blocking with a blocking reagent (Roche) for 1 hour and measuring the fluorescence intensity, there was no change in the fluorescence intensity. Next, 500 μl of 0.05 μg / μl Cy3-IgG was added and reacted at room temperature for 1 hour, then washed with PBS for 12 hours at room temperature, and the fluorescence intensity was measured (FIG. 4). Since the fluorescence intensity is 16448 and increases, it can be seen that protein A and IgG were bound, that is, the binding ability of the transcriptionally retained protein was maintained.
（実施例２）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
ステンレス−ＤＬＣ固体支持体の作成
ステンレス基板にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ステンレス基板は、平滑性と蛍光バックグラウンドを下げるために、予めバフ研磨後、更に電解研磨を施した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。また、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入することにより固体支持体２を作成した。
(Example 2) Transfer of protein to stainless steel-DLC solid support
Preparation of stainless steel-DLC solid support A diamond-like carbon layer was formed on a stainless steel substrate. The stainless steel substrate was subjected to electrolytic polishing after buffing in advance in order to lower the smoothness and the fluorescent background. The diamond-like carbon layer was formed by the ionization vapor deposition method under the following conditions. The thickness of the produced diamond-like carbon layer was 20 nm. Moreover, the solid support body 2 was created by introduce | transducing an amino group by carrying out ammonia plasma processing.
Ｃｙ３−プロテインＡ（０．２μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図５）。 Cy3-Protein A (0.2 μg, manufactured by SIGMA) was electrophoresed by SDS-PAGE (AE-6530, manufactured by ATTO) in the same manner as in Example 1, and after completion of the electrophoresis, CBB staining was performed for 15 minutes, followed by destaining. Then, an image was taken with LAS1000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 5).
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファーＢ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体２の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｃ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を図６のように重ねてセミドライブロッティング装置に設置し、８Ｖ、４ｍＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた後、転写後の固体支持体とゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図７）。 After the electrophoresis, the gel was taken out, cut into a size to be placed on the solid support 2, and then immersed in transfer buffer B (25 mM Tris, 5% methanol). Filter papers (manufactured by ATTO) previously cut to the size of the solid support 2 were transferred to transfer buffer A (0.3 M Tris, 5% methanol) and C (25 mM Tris, 40 mM ε-aminocaproic acid, 5%, respectively. Methanol) or ion-exchanged water. Subsequently, the filter paper, the gel, and the solid support were overlapped as shown in FIG. 6 and placed in a semi-driving device so that air bubbles would not enter, and the protein was transferred to the solid support 2 by applying current at 8 V and 4 mA for 60 minutes. . The solid support 2 after the transfer was washed with ion-exchanged water at room temperature for 30 minutes and dried, and then the solid support and the gel after the transfer were photographed with FLA8000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 7). ).
(1)は、陰極側及び陽極側のろ紙の双方にイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルからほとんど抜け出ておらず、また固体支持体にも転写保持されていなかった。 (1) is the result when transfer is performed with ion-exchanged water included in both the cathode-side and anode-side filter papers. Cy3-Protein A hardly escaped from the gel and was not transferred and retained on the solid support.
(2)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙IIに転写用バッファーＢ、ろ紙IIIに転写用バッファーＡを含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルから多少減少しているが、固体支持体には転写保持されていなかった。 (2) shows the results when transfer is performed with the filter paper I containing the transfer buffer C, the filter paper II containing the transfer buffer B, and the filter paper III containing the transfer buffer A. Cy3-Protein A was somewhat reduced from the gel, but was not transferred and retained on the solid support.
(3)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。ゲルは、固体支持体に重ねる前に、水分をふき取った。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上には形状は良くないが転写保持が見られた。 (3) shows the results when transfer was performed with filter paper I containing transfer buffer C and filter papers II and III containing ion-exchanged water. The gel was wiped off moisture before being overlaid on the solid support. As a result, it was confirmed that Cy3-Protein A was not uniform but escaped from the gel. Further, although the shape was not good on the solid support, transfer holding was observed.
(4)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませ、ゲルの水分をふきとらずに固体支持体に重ねて転写を行った場合の結果である。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上にはＣｙ３−プロテインＡが形状良く転写保持されていた。 (4) shows the results when the transfer paper C contains transfer buffer C, and the filter papers II and III contain ion-exchanged water, and the transfer is performed on the solid support without wiping off the moisture of the gel. As a result, it was confirmed that Cy3-Protein A was not uniform but escaped from the gel. Cy3-protein A was transferred and held in a good shape on the solid support.
以上から、ゲル中のタンパク質の固体支持体への転写においては、陰極側のろ紙には転写用バッファーを、陽極側のろ紙にはイオン交換水を含ませ、泳動後のゲルの水分をふきとることなく転写を行うことが好ましいと考えられる。 From the above, when transferring the protein in the gel to the solid support, the filter paper on the cathode side should contain the transfer buffer, and the filter paper on the anode side should contain ion-exchanged water, and wipe off the moisture of the gel after electrophoresis. It is considered preferable to perform the transfer without any problems.
（実施例３）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）及びＣｙ３−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図８）。なお、Ｃｙ３-ＩｇＡの泳動については、１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
(Example 3) Transfer of protein to stainless steel-DLC solid support Cy3-Protein A (50 ng, manufactured by SIGMA) and Cy3-IgA (100 ng, manufactured by SIGMA) were subjected to SDS-PAGE method in the same manner as in Example 1 ( AE-6530 (manufactured by ATTO), and after completion of the electrophoresis, CBB staining was performed for 15 minutes, and after destaining, an image was taken with LAS1000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 8). For the migration of Cy3-IgA, a 12% polyacrylamide gel was used. Further, a solid support 2 was prepared in the same manner as in Example 2.
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）、Ｃ２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１又はＣ２を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図９）。 The gel after the electrophoresis was taken out, cut into a size to be placed on the solid support 2, and then immersed in a transfer buffer (25 mM Tris, 5% methanol). Filter papers (manufactured by ATTO) cut in advance to the size of a solid support were transferred to transfer buffers C1 (25 mM Tris, 40 mM ε-aminocaproic acid, 5% methanol) and C2 (25 mM Tris, 400 mM ε-aminocaproic acid), respectively. 5% methanol) or ion-exchanged water. Subsequently, the filter paper, the gel, and the solid support were stacked in the same manner as in FIG. At this time, the three filter papers on the cathode side contained transfer buffer C1 or C2, and the three filter papers on the anode side contained ion exchange water. Then, electricity was applied at 2 V and 2 μA for 60 minutes to transfer the protein to the solid support 2. The solid support 2 after the transfer was washed with ion exchange water at room temperature for 30 minutes and dried. The solid support and the gel after transfer were photographed with FLA8000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 9).
その結果、固体支持体への転写の際に陰極側のろ紙に含ませる転写用バッファーは、Ｃ１、すなわち、ε−アミノカプロン酸の濃度が４０ｍＭのものの方が転写保持効率がよいことが分かった。 As a result, it was found that the transfer buffer contained in the cathode-side filter paper at the time of transfer to the solid support had better transfer retention efficiency when C1, that is, the concentration of ε-aminocaproic acid was 40 mM.
（実施例４）ＰＶＤＦメンブレンからＴｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質転写
実施例１と同様にして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成し、イオン化蒸着装置を用いてアンモニアプラズマ中で処理することにより表面をアミノ化して固体支持体３を作成した。
(Example 4) Protein transfer from PVDF membrane to Ti-Pt-DLC solid support A diamond-like carbon layer is formed on the substrate 1 in the same manner as in Example 1, and is processed in ammonia plasma using an ionization deposition apparatus. Thus, the solid support 3 was prepared by amination of the surface.
また実施例１と同様にしてポリアクリルアミドゲルでＣｙ３−プロテインＡを電気泳動した。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影を行った（図１０）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。 Further, Cy3-protein A was electrophoresed on a polyacrylamide gel in the same manner as in Example 1. After completion of the electrophoresis, CBB staining was performed for 15 minutes, and after destaining, images were taken with LAS1000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 10). A Cy3-Protein A band was detected in the vicinity of about 50 kDa.
転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｂ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）及びＣ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）を調製した。泳動後のゲルを取り出し、約２００ｍｌの転写用バッファーＢに浸して、５分間軽く振盪した。予めゲルの大きさに切っておいたＰＶＤＦメンブレン（ＡＴＴＯ社製）を少量のメタノールに５秒間浸した後、約１００ｍｌの転写用バッファーＢに浸し、５分以上振盪した。転写用バッファーＡ、Ｂ又はＣの各２００ｍｌに、予めゲルの大きさに切っておいたろ紙をそれぞれ２枚、１枚及び３枚ずつ浸した。続いて、セミドライブロッティング装置（日本エイドー）に、上記のろ紙、ゲル及びＰＶＤＦメンブレンを、気泡が入らないように図１１のように重ね合わせて設置し、電圧１５Ｖで６０分間通電した。転写後、ＰＶＤＦメンブレンを２００ｍｌのＰＢＳに浸して、５分間浸透した。 Transfer buffers A (0.3 M Tris, 5% methanol), B (25 mM Tris, 5% methanol) and C (25 mM Tris, 40 mM ε-aminocaproic acid, 5% methanol) were prepared. The gel after electrophoresis was taken out, immersed in about 200 ml of transfer buffer B, and gently shaken for 5 minutes. A PVDF membrane (manufactured by ATTO) that had been cut into a gel size in advance was immersed in a small amount of methanol for 5 seconds, then immersed in about 100 ml of transfer buffer B, and shaken for 5 minutes or more. Two, one, and three filter papers that had been cut to the size of the gel in advance were immersed in 200 ml each of the transfer buffer A, B, or C. Subsequently, the filter paper, the gel and the PVDF membrane were placed on a semi-driving device (Nippon Aido) so as not to enter bubbles as shown in FIG. 11, and energized for 60 minutes at a voltage of 15V. After the transfer, the PVDF membrane was immersed in 200 ml of PBS and permeated for 5 minutes.
転写後のＰＶＤＦメンブレンを固体支持体３に載る大きさに切り、図１２のような順番で重ね合わせ、３５ｇ／ｃｍ2の重しを載せた。室温にて１時間置き、メンブレン上のＣｙ３−プロテインＡを固体支持体３上に転写した。続いて該固体支持体３を、ＰＢＳで室温にて２０分間洗浄した後、乾燥させた。そして、固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。撮影画像を図１３に示す。画像中に囲った部分がメンブレンを密着させた部分である。対応する位置に蛍光が検出されたことから、Ｃｙ３-プロテインＡが固体支持体上に転写保持されていることがわかる。 The PVDF membrane after the transfer was cut into a size to be placed on the solid support 3 and overlapped in the order as shown in FIG. 12, and a weight of 35 g / cm 2 was placed. After standing at room temperature for 1 hour, Cy3-protein A on the membrane was transferred onto the solid support 3. Subsequently, the solid support 3 was washed with PBS at room temperature for 20 minutes and then dried. The solid support was imaged with FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.). A captured image is shown in FIG. The part enclosed in the image is the part where the membrane is in close contact. Since fluorescence was detected at the corresponding position, it can be seen that Cy3-protein A was transferred and held on the solid support.
（実施例５）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３ラベルした酵母タンパク質（３００μｇ／レーン）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（１））。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
(Example 5) Transfer of protein to stainless steel-DLC solid support Cy3-labeled yeast protein (300 µg / lane) was electrophoresed in the same manner as in Example 1 using the SDS-PAGE method (AE-6530, manufactured by ATTO). After completion of the electrophoresis, images were taken with FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 14 (1)). Further, a solid support 2 was prepared in the same manner as in Example 2.
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、固体支持体２にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せた。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２を超純水で洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（２））。
その結果、転写効率が約４０％であり、十分転写ができていることが判明した。
After the electrophoresis, the gel was taken out, cut into a size to be placed on the solid support 2, and the gel was washed with 10% methanol, then replaced with fresh 10% methanol, and further washed for 30 seconds. After washing, the gel was placed on the solid support 2, and a dialysis membrane and a filter paper containing 1M H 3 BO 3 buffer (pH 8.0) were placed thereon. Then, electricity was applied at 2 V for 60 minutes to transfer the protein complex to the solid support 2. The solid support 2 after the transfer was washed with ultrapure water and dried. The solid support was imaged with FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) (FIG. 14 (2)).
As a result, the transfer efficiency was about 40%, and it was found that the transfer was sufficient.
（実施例６）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）とＣｙ５−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液中で混合し、実施例１と同様にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
(Example 6) Transfer of protein to stainless steel-DLC solid support Cy3-Protein A (50 ng, manufactured by SIGMA) and Cy5-IgA (100 ng, manufactured by SIGMA) were mixed in a solution, and the same as in Example 1 The sample was electrophoresed using a Native-PAGE method (AE-6530, manufactured by ATTO). After the electrophoresis was completed, an image was taken using FLA8000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.). Further, a solid support 2 was prepared in the same manner as in Example 2.
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。
その結果、転写後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度は、泳動終了後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度に比べて約３５％であった。
The gel after the electrophoresis was taken out, cut into a size to be placed on the solid support 2, and then immersed in a transfer buffer (25 mM Tris, 5% methanol). Filter paper (manufactured by ATTO) that had been cut in advance to the size of a solid support was immersed in transfer buffer C1 (25 mM Tris, 40 mM ε-aminocaproic acid, 5% methanol) or ion-exchanged water, respectively. Subsequently, the filter paper, the gel, and the solid support were stacked in the same manner as in FIG. At this time, the three filter papers on the cathode side contained transfer buffer C1, and the three filter papers on the anode side contained ion-exchanged water. Then, the protein complex was transferred to the solid support 2 by applying electricity at 2 V and 2 μA for 60 minutes. The solid support 2 after the transfer was washed with ion exchange water at room temperature for 30 minutes and dried. The solid support and the gel after transfer were photographed with FLA8000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
As a result, the fluorescence intensity of the image taken with the FLA8000 after the transfer was about 35% compared to the fluorescence intensity of the image taken with the FLA8000 after completion of the electrophoresis.
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。 According to the method of the present invention, after a large number of substances contained in a sample are separated by electrophoresis, substances contained in individual bands can be transferred and held on a solid support without purifying a plurality of substances. Since mass spectrometry can be performed simultaneously and directly, a large number of samples can be analyzed quickly.
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。また、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成することができるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。 Therefore, the present invention is a very useful means in the analysis of biomolecules such as nucleic acids and proteins. In addition, since a complex of substances that interact in a solution can be formed, it is advantageous for analysis that requires a high degree of retention of the three-dimensional structure of the substance to be analyzed, such as protein analysis.
Claims (7)
試料中の物質をゲル電気泳動で分離する工程、
ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写する工程、及び
該メンブレン上に転写された物質を、表面にカーボン層を有する固体支持体に転写保持する工程を含み、表面にカーボン層を有する固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む、前記方法。 A method for mass spectrometry of a substance in a sample,
Separating the substances in the sample by gel electrophoresis,
A step of transferring the separated material in the gel to a membrane, and the transferred material on the membrane, seen including the step of transferring the holding to a solid support with a carbon layer on the surface, the solid having a carbon layer on the surface support is present on the carbon layer on the substrate surface is further including an amino group-containing compound which is not covalently bonded to the carbon layer, said method.
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