JP2002236108A - Method and device for isolating sample - Google Patents
Method and device for isolating sampleInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】この発明は、電気泳動法によ
る試料分取方法及び試料分取装置に関し、更にこの方法
又は装置を次段の分析処理と組み合わせた分析方法及び
装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a sample collecting method and a sample collecting apparatus by an electrophoresis method, and more particularly to an analyzing method and an apparatus in which this method or the apparatus is combined with a subsequent analysis process.
【０００２】[0002]
【従来の技術】キャピラリー電気泳動法（ＣＺＥ法）は
数１０ミクロンの内径のキャピラリー（毛細管）の中の
溶液に電場を印加したり、溶液中の試料の大きさや電気
的性質によって移動度が異なることを応用して混合され
た試料を分離する方法である。ＣＺＥ法は非常に細いキ
ャピラリーを使用するために、分子拡散などによる試料
領域の分散をおさえることができ、非常に高い分解能で
試料成分を分離することができる。また内容量が微小で
あるために微量分析に適している。また、電気クロマト
グラフィーは、キャピラリーなどの内部にクロマトグラ
フィー用樹脂を充填し、極微少量で、溶液試料内の分子
を電気泳動力で駆動して、樹脂表面への分配や吸着など
の相互作用と移動度の違いで、成分を分離する方法で、
キャピラリー電気泳動法とは異なった微量分離法として
注目されている。2. Description of the Related Art In a capillary electrophoresis (CZE) method, an electric field is applied to a solution in a capillary (capillary tube) having an inner diameter of several tens of microns, and the mobility varies depending on the size and electrical properties of a sample in the solution. This is a method of separating a mixed sample by applying the above. Since the CZE method uses a very thin capillary, dispersion of a sample region due to molecular diffusion or the like can be suppressed, and sample components can be separated with very high resolution. Also, since the content is very small, it is suitable for trace analysis. In electrochromatography, a capillary resin or the like is filled with a resin for chromatography, and molecules in a solution sample are driven by electrophoretic force in a very small amount to interact with interactions such as distribution and adsorption on the resin surface. In the method of separating the components by the difference in mobility,
It is attracting attention as a microseparation method different from capillary electrophoresis.
【０００３】この様な電気泳動力で混合物試料から分離
された分子やイオン成分は、泳動電圧を印加していると
きに泳動管の一端から成分毎に時間差をもって排出され
る。分離された成分が泳動管中の特定位置に来たときに
紫外線吸収式などの検出器でその時刻を知ることができ
る。また、検出器を通過した時刻とその成分が泳動管の
一端から排出されるまでの時間（排出時間）は泳動条件
ごとにほぼ一定である。ＣＺＥ法や電気クロマトグラフ
ィーで分離された試料は、試料ごとに分析することによ
って各分離成分の組成や構造が解析される、このとき微
量試料を容器に分注すると、容器壁等に試料が付着して
失われ、分析に使用する試料の量が不足する問題があ
る。[0003] Molecules and ionic components separated from a mixture sample by such an electrophoretic force are discharged from one end of the electrophoresis tube with a time lag between the components when a migration voltage is applied. When the separated component reaches a specific position in the electrophoresis tube, the time can be known by a detector of an ultraviolet absorption type or the like. Further, the time when the light passes through the detector and the time until the component is discharged from one end of the electrophoresis tube (discharge time) are almost constant for each electrophoresis condition. Samples separated by the CZE method or electrochromatography are analyzed for each sample to analyze the composition and structure of each separated component. At this time, when a small amount of sample is dispensed into a container, the sample adheres to the container wall, etc. And the amount of sample used for analysis is insufficient.
【０００４】このため、電気泳動により分離した微量成
分を確実に分注するために、分離した成分を一旦回収液
に溶解させて試験管に分注する技術が、例えば、特開平
６−１９８１７３に開示されている。しかし、この方法
には、多数の成分を対象にする分析の場合、多数の試験
管が必要となり、試験管の識別や取扱いが煩雑になると
いう問題や、試料ごとに分析する前に濃縮操作が必要に
なるという問題がある。一方、電気泳動により分離した
成分をそのまま質量分析装置にかけて分析するための装
置も開発されている（特開平６−１６４７４１）。しか
し、通常このような場合、電気泳動管の開放端の外周を
導電性物質でコーティングしたり、開放端に金属のアッ
タチメントを付けて、電気泳動力を電気泳動管の開放端
まで及ぼさせる工夫をしているが、コーティングの被膜
が剥れたり、アッタチメントの導電性にムラが生じたり
して、泳動された成分を安定して一点に確実に集めるこ
とができないという問題があった。[0004] For this reason, in order to surely dispense a trace component separated by electrophoresis, a technique of once dissolving the separated component in a recovery solution and dispensing it into a test tube is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-198173. It has been disclosed. However, this method requires a large number of test tubes when analyzing a large number of components, which makes identification and handling of the test tubes complicated, and that the concentration operation must be performed before analyzing each sample. There is a problem that it becomes necessary. On the other hand, an apparatus for analyzing components separated by electrophoresis as they are by using a mass spectrometer has been developed (JP-A-6-164741). However, in such a case, usually, a method of coating the outer periphery of the open end of the electrophoresis tube with a conductive substance or attaching a metal attachment to the open end to apply the electrophoretic force to the open end of the electrophoresis tube. However, there has been a problem that the components of the electrophoresis cannot be stably and reliably collected at one point due to peeling of the coating film or unevenness in the conductivity of the attachment.
【０００５】一方、マトリックス支援型レーザー脱離イ
オン化法（ＭＡＬＤＩ法）はマトリックスと呼ばれる非
常に良く光を吸収する分子と試料化合物を混合し、レー
ザー光によって試料をイオン化する方法であり、パルス
レーザー照射により、マトリックス分子に大きなエネル
ギーが与えられ、マトリックスや試料化合物イオンが脱
離する。一方、飛行時間質量分析法（ＴＯＦ／ＭＳ法）
は、このイオンに逆電場を印加し、イオンが電極表面か
ら検出器まで到達する時間を測定することで質量を決定
する。このＭＡＬＤＩ法は試料に大きな負担をかけるこ
となくイオン化できるので、高質量の物質のイオン化が
行え、またＴＯＦ／ＭＳ法は測定の質量範囲に制限がな
いため、これらを組み合わせたマトリックス支援型レー
ザー脱離イオン化−飛行時間質量分析法（以下、「ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法」という。）は高質量の質量分
析に適している。On the other hand, the matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method is a method of mixing a sample compound with a very light-absorbing molecule called a matrix, and ionizing the sample by laser light. As a result, large energy is given to the matrix molecules, and the matrix and sample compound ions are eliminated. On the other hand, time-of-flight mass spectrometry (TOF / MS method)
Determines the mass by applying a reverse electric field to the ions and measuring the time it takes for the ions to reach the detector from the electrode surface. The MALDI method can ionize a sample without imposing a large burden on a sample, so that a high-mass substance can be ionized. In addition, the TOF / MS method has no limitation on the mass range of measurement, and therefore, a matrix-assisted laser desorption method combining these methods can be used. Deionization-time-of-flight mass spectrometry (hereinafter referred to as "MA
LDI-TOF / MS method ". ) Is suitable for mass analysis of high mass.
【０００６】特に、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ等の
生体関連物質を分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／
ＭＳ法は低分子量から高分子量まで迅速に感度良く生体
成分の分析を行うことができるため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯ
Ｆ／ＭＳ法をキャピラリー電気泳動法等の電気泳動法と
組み合わせることで、多種類の物質を分離してから分析
が行える汎用性の高い質量分析法ができると考えられ
る。しかし、従来の電気泳動法によるサンプル分取方法
では微量なサンプルを確実にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ
法に送ることができないという問題があった。更に、Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は試料をマトリックスと混合
してプレート上にロードするという前処理操作が必要な
ために、ＣＥ法と組み合わせたオンライン測定を行うの
は困難であった。電気泳動により分離された試料をＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計に組み合わせる方法として、
エレクトロスプレーイオン化法を用いて、サンプルプレ
ートにスプレーする方法があるが、試料が拡がり、濃く
取れず、特に試料が微量な時には有効でない。[0006] In particular, MALDI-TOF /
The MS method can quickly and sensitively analyze biological components from low molecular weight to high molecular weight, so MALDI-TO
By combining the F / MS method with an electrophoresis method such as a capillary electrophoresis method, a highly versatile mass spectrometry method capable of separating and analyzing various types of substances is considered to be possible. However, in the conventional sample separation method using electrophoresis, a very small amount of sample can be reliably used for MALDI-TOF / MS.
There was a problem that it could not be sent to law. Further, M
Since the ALDI-TOF / MS method requires a pretreatment operation of mixing a sample with a matrix and loading the mixture on a plate, it was difficult to perform online measurement in combination with the CE method. The sample separated by electrophoresis was
As a method of combining with the LDI-TOF mass spectrometer,
There is a method of spraying a sample plate by using an electrospray ionization method. However, the method is not effective when the sample spreads and cannot be concentrated, especially when the amount of the sample is very small.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、電気泳動法
や電気クロマトグラフィーなどのように電気泳動力によ
って分離ないし搬送される試料を、多数の成分であって
も、また微量であっても確実に分取することが可能な、
分取方法および装置を提供することを目的とする。更
に、このような方法及び装置を利用して、電気泳動によ
り分離した成分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法のような
次段階の分析と組み合わせた分析方法及びそのための装
置を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION According to the present invention, a sample separated or conveyed by an electrophoretic force, such as an electrophoresis method or an electrochromatography, can be prepared with a large number of components or in a small amount. It is possible to reliably sort,
It is an object to provide a sorting method and apparatus. It is still another object of the present invention to provide an analysis method in which components separated by electrophoresis are combined with a next-stage analysis such as a MALDI-TOF / MS method using such a method and an apparatus, and an apparatus therefor. .
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、導電性
の分取台に泳動電圧の一方を印加し、これに反対電場の
印加されているガラス細管など電気泳動担体の電場の印
加されていない開放端（泳動担体開放端）を接触あるい
は接近させ、電場で泳動あるいは飛散した溶液が液滴を
形成するか、あるいはあらかじめ分取台の上に準備され
ていた微小体積の液滴との間で、分取台と泳動担体開放
端を液滴で導通するようにして、泳動した溶液ないし成
分をその液滴中に分取することにより、上記の課題を解
決するものである。また、このような分取方法により電
気泳動法により分離された微量な成分について、ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法のような次段階の分析を確実に可
能とするものである。That is, according to the present invention, one of the electrophoresis voltages is applied to a conductive fractionating table, and an electric field of an electrophoretic carrier such as a glass capillary tube to which an opposite electric field is applied is applied thereto. The open end (electrophoresis carrier open end) is brought into contact with or close to the open end, and the solution that has migrated or scattered in the electric field forms a droplet, or contacts with a small-volume droplet prepared in advance on a sorting table. In order to solve the above-mentioned problems, the separation table and the open end of the electrophoresis carrier are electrically connected to each other by droplets, and the electrophoresed solution or component is fractionated into the droplets. In addition, trace amounts of components separated by electrophoresis by such a fractionation method were analyzed by MAL.
This ensures the analysis at the next stage such as the DI-TOF / MS method.
【０００９】即ち、本発明の目的は、導電性の分取台上
に液滴を形成させて、電気泳動管の開放端を該液滴に接
触させることにより該開放端（正確には、電気泳動管内
の泳動液）と該分取台とを導通させ、試料を電気泳動力
により該分取台上に成分別に排出させる試料分取方法を
提供することである。ここで電気泳動管内の泳動液とと
分取台上の液滴とを導通させるわけであるが、この液滴
による導通を確実にするために電気泳動管から分取台上
へ金属繊維やガラス繊維等の導電性又は非導電性の補助
棒を用いてもよい。また、本発明の別の目的は、前記電
気泳動管に泳動する成分を検知する検知器を配置し、該
検知器からの信号により該電気泳動管の末端又は該分取
台を移動させることにより、所望の成分が該分取台の所
望の位置に排出される上記の試料分取方法を提供するこ
とである。本発明の更に別の目的は、前記分取台がＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置用のプレートを兼ね、該分
取台上に上記の試料分取方法により試料が成分別に排出
され、該排出された成分にマトリックスを混合した後Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけられることを特徴とす
る分析方法を提供することである。本発明の更に別の目
的は、前記分取台がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置用
のプレートを兼ね、該分取台上の所定位置に所定量のマ
トリックスが置かれ、このマトリックス上に上記の試料
分取方法により試料が成分別に排出され、該排出された
成分が該マトリックスと混合されてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
質量分析にかけられることを特徴とする分析方法を提供
することである。本発明の試料分取方法によって分取台
に成分別に排出された試料に、必要に応じて、種々の薬
品（例えば、酵素処理、脱塩処理、濃縮処理等の処理を
行うための薬品）を添加若しくは混合してもよい。この
ような操作は微量サンプルを有効に用いることを可能に
するものである。That is, an object of the present invention is to form a droplet on a conductive sorting table, and bring the open end of the electrophoresis tube into contact with the droplet so that the open end (more precisely, the electric It is an object of the present invention to provide a sample sorting method in which an electrophoresis solution in an electrophoresis tube) is electrically connected to the sorting table, and a sample is discharged onto the sorting table for each component by electrophoretic force. Here, the electrophoresis liquid in the electrophoresis tube and the droplets on the sorting table are electrically connected.In order to ensure conduction by the droplets, metal fibers or glass are transferred from the electrophoresis tube onto the sorting table. A conductive or non-conductive auxiliary rod such as a fiber may be used. Another object of the present invention is to dispose a detector for detecting a component to be electrophoresed in the electrophoresis tube, and to move an end of the electrophoresis tube or the sorting table by a signal from the detector. It is an object of the present invention to provide the above-described sample collection method in which a desired component is discharged to a desired position on the collection table. Still another object of the present invention is that the fractionating table is MA
The sample is discharged for each component by the above-described sample collection method on the sorting table, which also serves as a plate for the LDI-TOF mass spectrometer. After mixing the matrix with the discharged component, M
An object of the present invention is to provide an analysis method characterized by being subjected to ALDI-TOF mass spectrometry. Still another object of the present invention is to provide a method in which the sorting table also serves as a plate for a MALDI-TOF mass spectrometer, and a predetermined amount of matrix is placed at a predetermined position on the sorting table. The sample is discharged according to the separation method according to the components, and the discharged components are mixed with the matrix to form MALDI-TOF.
An object of the present invention is to provide an analysis method characterized by being subjected to mass spectrometry. Various chemicals (for example, chemicals for performing an enzymatic treatment, a desalination treatment, a concentration treatment, etc.) may be added to the sample discharged by the component to the fractionation table according to the sample fractionation method of the present invention, if necessary. They may be added or mixed. Such an operation makes it possible to use a small amount of sample effectively.
【００１０】本発明のまた別の目的は、電気泳動管及び
導電性の分取台から成る試料分取装置であって、該分取
台上に液滴を形成させて、電気泳動管の開放端を該液滴
に接触させることにより該開放端（正確には、電気泳動
管内の泳動液）と該分取台とを導通させ、試料を電気泳
動力により該分取台上に成分別に排出させる試料分取装
置を提供することである。本発明の更に別の目的は、更
に前記電気泳動管を泳動する成分を検知する検知器を備
え、該検知器からの信号により該電気泳動管の末端又は
該分取台を移動することが可能な上記の試料分取装置を
提供することである。本発明のまた別の目的は、上記の
試料分取装置とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置とを組
み合わせた分析装置であって、該分取台が該ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ質量分析装置用のプレートを兼ね、該試料分取
装置により該プレート上に試料が成分別に排出され、該
排出された成分がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけら
れることを特徴とする分析装置を提供することである。
本発明の試料分取装置によって分取台に成分別に排出さ
れた試料に、必要に応じて、種々の処理（例えば、酵素
処理、脱塩処理、濃縮処理等）を行う装置を更に付加し
てもよい。このような装置を付加することにより微量サ
ンプルを有効に用いることが可能になる。Still another object of the present invention is a sample sorting apparatus comprising an electrophoresis tube and a conductive sorting table, wherein a droplet is formed on the sorting table to open the electrophoresis tube. By bringing the end into contact with the droplet, the open end (more precisely, the electrophoresis running solution in the electrophoresis tube) is connected to the sorting table, and the sample is discharged onto the sorting table by electrophoresis force. The object of the present invention is to provide a sample collecting device for causing the sample to be collected. Still another object of the present invention is to further include a detector for detecting a component that migrates through the electrophoresis tube, and the terminal from the electrophoresis tube or the sorting table can be moved by a signal from the detector. Another object of the present invention is to provide the above-described sample collection device. Still another object of the present invention is an analyzer combining the above-described sample collection device and a MALDI-TOF mass spectrometer, wherein the separation table is provided with the MALDI-TOF mass spectrometer.
-Provided is an analyzer which also serves as a plate for a TOF mass spectrometer, wherein a sample is discharged on the plate by the sample sorter for each component, and the discharged components are subjected to MALDI-TOF mass spectrometry. It is to be.
A device for performing various treatments (for example, enzyme treatment, desalination treatment, concentration treatment, etc.) is further added to the sample discharged into the fractionation table by the sample fractionation device of the present invention, if necessary. Is also good. By adding such a device, it becomes possible to effectively use a small amount of sample.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】本発明の試料分取方法は、導電性
の分取台上に液滴を形成させて、電気泳動管の開放端を
該液滴に接触させることにより該開放端（正確には、泳
動液）と該分取台とを導通させ、試料を電気泳動力によ
り該分取台上に成分別に排出させる。本発明に用いる分
取台は導電性であり、金属、導電性有機若しくは無機材
料、又は表面を導電性物質でコート若しくはプリントし
た非導電性材料等から成る。この分取台上に形成される
液滴は水溶液又は導電性液体から成り、この液滴は、電
場で泳動あるいは飛散した溶液により形成されたり、又
は予め人手若しくは自動で分取台の上に液滴を形成して
おくことにより準備する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION According to the method for sample collection of the present invention, a droplet is formed on a conductive sorting table, and the open end of the electrophoresis tube is brought into contact with the droplet. Accurately, the electrophoresis liquid) and the sorting table are electrically connected, and the sample is discharged on the sorting table by the electrophoretic force. The sorting table used in the present invention is conductive, and is made of a metal, a conductive organic or inorganic material, a nonconductive material whose surface is coated or printed with a conductive substance, or the like. The droplets formed on the sorting table are composed of an aqueous solution or a conductive liquid, and the droplets are formed by a solution that has been electrophoresed or scattered in an electric field, or is manually or automatically placed on the sorting table in advance. Prepare by forming drops.
【００１２】また、電気泳動管は導電性の極めて低い有
機又は無機材質（例えば、溶融石英キャピラリー）から
成り、電界をかける場としては溶液、濾紙、ゲル状物
質、両性担体などがある。現在の技術では、本発明の電
気泳動にはキャピラリー電気泳動又は電気クロマトグラ
フィーが該当する。本発明においては電気泳動管のこれ
らの物質がその開放端で露出し分取台上の液滴と接触す
ることによりこれらが導通し、電気泳動管の他端の基準
側電極と分取台との間に電界をかけることになり、電気
泳動管中の試料が泳動して分離され成分ごとに分取台上
の一点に確実に排出される。本発明で用いることのでき
る試料は、水溶液中あるいは極性溶媒中で、高圧電場の
印加によって泳動する分子、例えば各種イオン、永久双
極子あるいは誘起双極子を持つ有機分子、界面活性剤な
どの有機イオン会合体の中に分配される有機分子、タン
パク質、核酸、糖あるいは、これらの複合体など、電気
泳動により、分子構造に依存して、電気泳動液の中で、
移動度を変えるものが、全て対象となる。この試料の分
離は上記泳動管中のそれぞれの物質の移動度の違いによ
って定まるため、分取の目的に従って泳動条件を設定
し、物質の移動度の差により排出端に泳動される時間を
適宜設定して、分取することができる。The electrophoresis tube is made of an organic or inorganic material having extremely low conductivity (for example, fused silica capillary), and the field to which an electric field is applied includes a solution, a filter paper, a gel-like substance, and an amphoteric carrier. In the state of the art, capillary electrophoresis or electrochromatography applies to the electrophoresis according to the invention. In the present invention, these substances in the electrophoresis tube are exposed at their open ends and come into contact with the droplets on the sorting table, thereby conducting them, and the reference electrode at the other end of the electrophoresis tube and the sorting table are connected to each other. The sample in the electrophoresis tube is electrophoresed and separated, and each component is reliably discharged to one point on the sorting table. The sample that can be used in the present invention is a molecule that migrates in an aqueous solution or a polar solvent by application of a high piezoelectric field, for example, various ions, an organic molecule having a permanent dipole or an induced dipole, and an organic ion such as a surfactant. Depending on the molecular structure, such as organic molecules, proteins, nucleic acids, sugars, or complexes of these that partition into aggregates, depending on the molecular structure,
Anything that changes mobility is a target. Since the separation of this sample is determined by the difference in the mobility of each substance in the electrophoresis tube, the electrophoresis conditions are set according to the purpose of fractionation, and the time for migration to the discharge end is set appropriately according to the difference in the mobility of the substance. Then, it can be sorted.
【００１３】本発明においては、電気泳動管に検知器を
備えて、泳動する成分を検知してもよい。この検知器と
しては特に制限はないが、泳動に影響を及ぼさないとい
う観点から紫外若しくは可視光吸収検出器又はケイ光検
出器等が挙げられる。また、この検知器を備える位置
は、電気泳動管の排出端に近い側が好ましい。泳動条件
により成分毎の泳動速度は一定であるので、この検知器
で泳動する成分を検知した後、この成分が排出する時間
を正確に予測することができる。従って、電気泳動によ
り分離された成分が所望の分取台上の位置に排出される
ように、分取台又は電気泳動管の末端を適当に移動させ
てもよい。上記検知器からの信号によってこれらを移動
させるために通常の機械工学上の手段を用いればよい。In the present invention, the electrophoresis tube may be provided with a detector to detect a component to be migrated. The detector is not particularly limited, but may be an ultraviolet or visible light absorption detector, a fluorescence detector, or the like from the viewpoint of not affecting electrophoresis. The position where the detector is provided is preferably on the side near the discharge end of the electrophoresis tube. Since the migration speed of each component is constant depending on the migration conditions, after detecting the component to be migrated by this detector, it is possible to accurately predict the time for discharging the component. Therefore, the ends of the sorting table or the electrophoresis tube may be appropriately moved so that the components separated by electrophoresis are discharged to a desired position on the sorting table. Conventional mechanical engineering means may be used to move them according to the signal from the detector.
【００１４】また、泳動管の一端と分取台とを垂直方向
に相対的に移動させることにより、泳動管の開放端と分
取台の接触・離反が可能となる。分取台が泳動電極の一
方を構成しているので、接触ないし接液時は、泳動試料
が分取台に排出される。泳動管と分取台とを離反させる
と、泳動電圧の印加がなくなるので、泳動管中の試料は
泳動と排出が止まる。泳動管の開放端を分取台とを離反
状態で水平方向に相対移動させると、分取台の相異なる
場所に液滴を構成し、成分試料の分注が可能となる。こ
れにより、一つの分取台の上に多成分試料が分注できる
ので、取扱いが容易確実となる。Further, by relatively moving one end of the electrophoresis tube and the sorting table in the vertical direction, contact and separation between the open end of the electrophoresis tube and the sorting table become possible. Since the sorting table constitutes one of the electrophoresis electrodes, the electrophoresis sample is discharged to the sorting table during contact or contact with the liquid. When the electrophoresis tube and the sorting table are separated from each other, the application of the electrophoresis voltage is stopped, so that the sample in the electrophoresis tube stops electrophoresis and discharge. When the open end of the electrophoresis tube is relatively moved in the horizontal direction with the separation table separated from the separation table, droplets are formed at different positions on the collection table, and the component sample can be dispensed. As a result, the multi-component sample can be dispensed onto one sorting table, so that handling is easy and reliable.
【００１５】このようにして本発明の試料分取方法又は
装置により、電気泳動により分離した成分を成分ごとに
確実に分取台上の一点に排出させることが可能になる
が、次段階でこのような成分について様々な操作が可能
であり、また様々な分析装置と組み合わせることにより
様々な連続分析が可能になる。本発明の方法は、プレー
ト上に分離成分をスポットするので、分離後（この手法
の場合、完全分離の他、大まかな分離をも含む。）、消
化酵素による蛋白質や核酸や糖鎖等の切断あるいは断片
化による分子の一次構造解析、蛋白チップなどの抗原抗
体反応あるいは生体分子の選択的結合を利用した、大ま
かな分子分離後の選択的な分子捕捉とマトリックス添加
によるその捕捉分子の脱離と構造解析、大まかな分子分
離後の遺伝子や核酸チップ上での相補的な結合による核
酸のタイピングと、マトリックス添加による脱離後のこ
れら分子の構造解析解析（この時、消化酵素も併用する
場合がある）が、そのままプレート上で出来る。As described above, the sample separation method or apparatus of the present invention makes it possible to reliably discharge the components separated by electrophoresis to a single point on the separation table for each component. Various operations can be performed on such components, and various continuous analyzes can be performed by combining with various analytical devices. According to the method of the present invention, the separated components are spotted on a plate. After separation (this method includes not only complete separation but also rough separation), digestion of proteins, nucleic acids, sugar chains, and the like by digestive enzymes is performed. Alternatively, the primary structure analysis of molecules by fragmentation, the selective binding of biomolecules or the antigen-antibody reaction of a protein chip, etc. Structural analysis, typing of nucleic acids by complementary binding on genes and nucleic acid chips after rough molecular separation, and structural analysis and analysis of these molecules after desorption by matrix addition (At this time, digestive enzymes may be used in combination. Can be done on the plate.
【００１６】また、本発明の試料分取方法又は装置と組
み合わせることのできる分析装置及び方法には、例え
ば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いたプロテイン
シクエンサー、ＤＮＡシークエンサー、生体成分分離同
定システム、又は導電性基材（例えば、ダイアモンド薄
膜等）の上に構成した遺伝子チップ、蛋白チップ若しく
はアフィニティーチップ等が挙げられる。この中で特に
サンプル台が導電性でなければならないものには特に本
発明の方法が好適である。特に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／
ＭＳ法をキャピラリー電気泳動と組み合わせる場合に
は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置用のプレートを兼
ねた分取台に電気泳動により分離した成分を排出させる
が、この分取台上の所定位置に所定量のマトリックスを
予めスポット若しくは噴霧乾燥させて置くか又はマトリ
ックス溶液の液滴を形成しておくと簡便に成分とマトリ
ックスを混合できる。In addition, examples of the analysis apparatus and method which can be combined with the sample collection method or apparatus of the present invention include a protein sequencer using MALDI-TOF mass spectrometry, a DNA sequencer, a biological component separation and identification system, Alternatively, a gene chip, a protein chip, an affinity chip, or the like formed on a conductive substrate (for example, a diamond thin film or the like) can be used. Of these, the method of the present invention is particularly suitable for those in which the sample stage must be conductive. In particular, MALDI-TOF /
When the MS method is combined with capillary electrophoresis, the components separated by electrophoresis are discharged to a preparative stage also serving as a plate for a MALDI-TOF mass spectrometer. If the matrix is previously spotted or spray-dried, or if a droplet of a matrix solution is formed, the components and the matrix can be easily mixed.
【００１７】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳに通常用いられ
るレーザーはＮ２レーザー（３３７ｎｍ）やＥｒ−ＹＡ
Ｇレーザー（２９４０ｎｍ）であるが、Ｎｄ：ＹＡＧ
（１０６４ｎｍ）、色素（可視領域で波長可変）、ＹＡ
Ｇ−ＯＰＯ（６３０ｎｍ）、ＣＯ２（１０６００ｎ
ｍ）、アレキサンドライト（７５５ｎｍ）、Ａｒ（４８
８〜５１４ｎｍ）、ホロミウム−ＹＡＧ（２０１００ｎ
ｍ）などのレーザーも用いることが可能である。マトリ
ックスとしては、励起光源（主に、パルスレーザー）の
光を吸収する有機酸又は有機塩基を用いることができ
る。例えば、Ｎ２レーザー（３３７ｎｍ）には、ＣＨＣ
Ａ(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)、ＤＨＢＡ(2,5-
dihydroxybenzoic acid)、３−ＨＰＡ(3-hydroxypicoli
nic acid)、ＨＡＢＡ(2-(4-hydroxyphenylazo)-benzoic
acid)、シナピン酸(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinnami
c acid)、ピコリン酸(picolinic acid)等の有機酸、Ｈ
ＡＲＭＡＮ(2-methyl-β-carboline; 1-methyl-9H-pyri
do[3,4-b]indole)、ＨＡＲＭＩＮＥ(2-methyl-β-carbo
line; 1-methyl-9-acethyl-pyrido[3,4-b]indole)、Ｈ
ＡＲＭＯＬ(2-methyl-β-carboline; 1-methyl-9-hydro
xy-pyrido[3,4-b]indole)等のβ−カルボリン、ＴＨＡ
Ｐ(2,4,6-trihydroxyacetophenone monohydrate)、ＡＴ
Ｔ(6-aza-2-thiothymine)等のプリン、ピリミジン類
（有機塩基）、コバルト超微細粒子（商品名Co-UFP）、
多孔性シリカなどを用いることができる。また、Ｅｒ−
ＹＡＧレーザー（２９４０ｎｍ）には、グリセロール、
氷、コハク酸などを用いることができる。The laser usually used for MALDI-TOF / MS is N 2 laser (337 nm) or Er-YA.
G laser (2940 nm), but Nd: YAG
(1064 nm), dye (wavelength variable in visible region), YA
G-OPO (630 nm), CO 2 (10600 n
m), Alexandrite (755 nm), Ar (48
8-514 nm), holmium-YAG (20100 n
Lasers such as m) can also be used. As the matrix, an organic acid or organic base that absorbs light from an excitation light source (mainly a pulse laser) can be used. For example, the N 2 laser (337 nm), CHC
A (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), DHBA (2,5-
dihydroxybenzoic acid), 3-HPA (3-hydroxypicoli
nic acid), HABA (2- (4-hydroxyphenylazo) -benzoic
acid), sinapinic acid (3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinnami
c acid), organic acids such as picolinic acid, H
ARMAN (2-methyl-β-carboline; 1-methyl-9H-pyri
do [3,4-b] indole), HARMINE (2-methyl-β-carbo
line; 1-methyl-9-acethyl-pyrido [3,4-b] indole), H
ARMOL (2-methyl-β-carboline; 1-methyl-9-hydro
β-carbolines such as xy-pyrido [3,4-b] indole), THA
P (2,4,6-trihydroxyacetophenone monohydrate), AT
Purines such as T (6-aza-2-thiothymine), pyrimidines (organic bases), cobalt ultrafine particles (Co-UFP),
Porous silica or the like can be used. Also, Er-
Glycerol, YAG laser (2940 nm)
Ice, succinic acid, and the like can be used.
【００１８】マトリックスの量は試料や目的に応じて適
宜定めるが、多くの場合、結晶化を促進するためマトリ
ックスの飽和濃度近くの含有機溶媒溶液として用いる。
このようにプレート上でマトリックスと混合された成分
を自然乾燥させるか又はデシケータ中等で乾燥した後、
そのプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置内に装
着する。このように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法をキ
ャピラリー電気泳動と組み合わせることにより、前分離
による分子同定と分子一次構造解析の同時解析のような
従来考えられなかった高速の分子解析が可能になる。The amount of the matrix is appropriately determined depending on the sample and the purpose, but is often used as an organic solvent solution having a concentration close to the saturation concentration of the matrix to promote crystallization.
After the components thus mixed with the matrix on the plate are air-dried or dried in a desiccator or the like,
The plate is mounted in a MALDI-TOF mass spectrometer. As described above, by combining the MALDI-TOF / MS method with the capillary electrophoresis, it is possible to perform a high-speed molecular analysis, which has not been considered conventionally, such as simultaneous analysis of molecular identification and primary structure analysis by pre-separation.
【００１９】以下、本発明を具体的に例証するが、本発
明を制限する意図ではない。本発明の試料分取装置の一
例を図１に示す。キャピラリー電気泳動において、混合
物の試料、および溶媒（泳動液）は、試料を入れた容器
１から順にキャピラリー３に導入される。このキャピラ
リーの内径は通常３０〜２００μｍ程度である。泳動液
としては、通常揮発性塩の例えば、0.01Ｍアンモニア・
蟻酸アンモニウム緩衝液1マイクロリッターが用いられ
る。そして、正負の電極２と６との間に電圧が印加され
る。この電圧は通常１〜２０ｋＶ程度である。キャピラ
リー３内で混合物が電気泳動することによって、試料中
の成分が分離し、各成分試料が通過したことが検出器４
で検出される。その後一定時間の後に成分試料はキャピ
ラリー３の一端から排出される。位置制御機構８は、上
面に多数の試料載せ部をもったプレート５をＸＹの２軸
方向に位置制御する機能を持っている。位置制御機構７
は、板をＸＹ方向に０．１ｍｍ程度の再現性で、任意の
試料載せ部が作動範囲になるよう位置決めできるもので
あればよい。断続的に出てくる成分の時間間隔が短い場
合があるので、高速で位置決めできるサーボ機構を持つ
ものが好ましい。位置制御機構７は、さらにプレートの
高さを昇降させる機能を持つ。細管とプレートとの関係
が接触と離反の２位置に位置決めできるものであればよ
い。Hereinafter, the present invention will be specifically illustrated, but is not intended to limit the present invention. FIG. 1 shows an example of the sample sorting apparatus of the present invention. In capillary electrophoresis, a sample of the mixture and a solvent (electrophoresis liquid) are introduced into the capillary 3 in order from the container 1 in which the sample is placed. The inner diameter of this capillary is usually about 30 to 200 μm. The electrophoresis solution is usually a volatile salt such as 0.01 M ammonia.
One microliter of ammonium formate buffer is used. Then, a voltage is applied between the positive and negative electrodes 2 and 6. This voltage is usually about 1 to 20 kV. The components in the sample are separated by electrophoresis of the mixture in the capillary 3, and the passage of each component sample is detected by the detector 4.
Is detected by After a certain time, the component sample is discharged from one end of the capillary 3. The position control mechanism 8 has a function of controlling the position of the plate 5 having a large number of sample mounting portions on the upper surface in two directions of XY. Position control mechanism 7
May be used as long as the plate can be positioned so that an arbitrary sample mounting portion is within an operation range with a reproducibility of about 0.1 mm in the XY directions. Since the time interval between components that appear intermittently may be short, it is preferable to use a servo mechanism that can perform high-speed positioning. The position control mechanism 7 has a function of raising and lowering the height of the plate. What is necessary is just to be able to position the relationship between the thin tube and the plate at two positions of contact and separation.
【００２０】計測・制御装置７は、正負の電極間に泳動
電圧を供給する。また、検出器４の出力を変換して、分
離成分の有無と通過時刻を計測する。さらに、位置制御
機構８に指令して、プレートの位置・高さを変更する。
プレート５の一例を図２に示す。このプレートは導電性
の材質（例えば、金メッキステンレス、ステンレス、ダ
イアモンド薄膜等）で作成される。また、負電極６に泳
動電圧配線が接続できるようになっている。この例で
は、５×５＝２５個のくぼみからなる試料載せ部があ
り、一度に混合物の２５成分の連続分析が可能なもので
ある。分取する試料が少量の場合は、くぼみが無くとも
単なる平板でもかまわない。The measurement / control device 7 supplies a migration voltage between the positive and negative electrodes. In addition, the output of the detector 4 is converted, and the presence or absence of a separated component and the passage time are measured. Further, a command is issued to the position control mechanism 8 to change the position and height of the plate.
FIG. 2 shows an example of the plate 5. This plate is made of a conductive material (eg, gold-plated stainless steel, stainless steel, diamond thin film, etc.). In addition, a migration voltage wiring can be connected to the negative electrode 6. In this example, there is a sample mounting portion composed of 5 × 5 = 25 depressions, and continuous analysis of 25 components of the mixture at a time is possible. When the sample to be collected is a small amount, a simple plate may be used even if there is no hollow.
【００２１】本発明の分取方法の一例を、検出器出力
（図３）及び図１を用いて説明する。本発明の分取方法
は、まず分取台の上（Ａ）に導電性の液体（泳動液でよ
い）を液滴状に配置する。泳動用電極の一方を構成する
導電性の分取台を移動させて（または細管の一端を移動
させてもよい）、分取台上の液体と細管の一端を接液さ
せると、電気泳動の電圧が印加されて泳動が始まる。検
出器が成分を検出するまでは、（Ａ）部の液は泳動液だ
けなので、図示しない装置で吸引除去する。最初に必要
な分取成分（ａ）が検出され、排出時間が経過する前に
相対的に移動させて（Ａ）と細管との接液状態を解除す
る。このとき泳動が停止する、分取台または細管の一端
を移動させて、分取台上の別の個所（Ｂ）と細管の一端
を接触させると最初の必要な分取成分（ａ）は液滴
（Ｂ）中に分取される。次に必要な成分（ｂ）が検出さ
れたとき、同様に排出時問が経過する前に接液状態を解
除した後、別の個所（Ｃ）に接触させる。このようにし
て、相対的な移動を繰り返すことにより、複数の成分が
同一の分取台上の相異なる位置に分取される。An example of the fractionation method of the present invention will be described with reference to the detector output (FIG. 3) and FIG. In the sorting method of the present invention, first, a conductive liquid (which may be an electrophoresis liquid) is arranged in a droplet form on the sorting table (A). By moving the conductive fractionation table that constitutes one of the electrodes for electrophoresis (or by moving one end of the capillary) and bringing the liquid on the fractionation table into contact with one end of the capillary, electrophoresis is performed. Electrophoresis starts when a voltage is applied. Until the detector detects the component, the liquid in the part (A) is only the electrophoresis liquid, and is removed by suction using a device not shown. First, the necessary fractionation component (a) is detected, and is relatively moved before the discharge time elapses to cancel the liquid contact state between (A) and the thin tube. At this time, when the electrophoresis stops, one end of the fractionating table or the capillary is moved to bring another end (B) on the fractionating table into contact with one end of the capillary. Dispensed into drops (B). Next, when the necessary component (b) is detected, the liquid contact state is similarly released before the elapse of the discharge time, and then, another part (C) is brought into contact. In this way, by repeating the relative movement, a plurality of components are sorted at different positions on the same sorting table.
【００２２】各分離成分の組成や構造が解析するため
に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を用いる場合には、Ｍ
ＡＬＤＩ用のプレートを本発明のプレートと共用できる
形状としておくことが好ましい。また、予めＭＡＬＤＩ
用のマトリックスを分注位置のプレートに載せておくこ
ともできる。こうすると電気泳動試料はマトリックス上
に分注されるので、質量分析を連続的に行なうことがで
きるので好都合である。本発明の分取された試料は、分
取位置ごとに化学処理することができる。従って、分離
成分ごとにプレート上で異なる処理を行なうことがで
き、自動化にも適している。When the MALDI-TOF / MS method is used to analyze the composition and structure of each separated component, M
It is preferable that the plate for ALDI has a shape that can be shared with the plate of the present invention. In addition, MALDI
Matrix can be placed on the plate at the dispensing position. In this case, since the electrophoresis sample is dispensed onto the matrix, mass spectrometry can be performed continuously, which is convenient. The sample sampled according to the present invention can be subjected to chemical treatment for each sample position. Therefore, different processing can be performed on the plate for each separation component, which is suitable for automation.
【００２３】以上説明したキャピラリー電気泳動は、成
分分離方法の一例として示したものであって、成分が電
気泳動により分離でき時間差を持って排出されるもので
あれば、本発明の方法や装置は電気クロマトグラフィー
等他の分離方法や装置にも適用できる。さらに、本発明
の試料の分取方法は、成分の分離を目的とした装置のみ
ならず、電気泳動力が適用できる場合は微量成分の搬送
にも用いることができる。例えば、図４に示すように、
マイクロピペットなどで吸引した微量試料を細管中に保
持し、細管の一旦を基準電極を設けた溶媒容器に浸漬さ
せ、他端に本発明の分取台を用いれば、吸引試料ごとに
分取台の上に吸引試料を分注することができる。この図
の例では、キャピラリーの先は２連になっているが、連
鎖的に何段階でも続けてサンプルを採取することが可能
であり、キャピラリー先端はガラスキャピラリー全体の
しなりを使うか、又は根本にテフロン（登録商標）チュ
ーブなどを結合して可動部を作って、先端の位置を動か
すことができる。このようにすれば、ピペットの吸引・
排出を毎回同じ口から正逆方向に行なう従来のピペット
採取方法にくらべ、多数の試料を短時間で連続的に分取
することができる。The above-described capillary electrophoresis is shown as an example of a component separation method. If the components can be separated by electrophoresis and discharged with a time lag, the method and apparatus of the present invention can be used. It can be applied to other separation methods and devices such as electrochromatography. Furthermore, the method for separating a sample of the present invention can be used not only for an apparatus for separating components, but also for transporting a trace component when an electrophoretic force can be applied. For example, as shown in FIG.
A small amount of a sample sucked by a micropipette or the like is held in a thin tube, and once the thin tube is immersed in a solvent container provided with a reference electrode. The aspirated sample can be dispensed on the top. In the example of this figure, the tip of the capillary is in duplicate, but it is possible to take samples continuously in any number of stages in a chain, and the tip of the capillary uses the bending of the entire glass capillary, or A Teflon (registered trademark) tube or the like is connected to the root to form a movable part, and the position of the tip can be moved. In this way, pipette suction and
Compared to the conventional pipette collection method in which the discharge is performed in the forward and reverse directions from the same mouth each time, a large number of samples can be continuously collected in a short time.
【００２４】[0024]
【実施例】実施例１ ２種類の蛋白質の電気泳動による分離と分注を行なうた
めに、図１に示す測定系を用いた。容量１．５ｃｃの容
器１に、２種類の蛋白質、ミオグロビン（ウマ、Ｆｗ：
１７．２ｋＤａ）１．７ｍｇとリゾチーム（ニワトリ蛋
白、Ｆｗ：１４．３ｋＤａ）１．４ｍｇとを泳動液（２
０ｍＭピリジン−ＮＨ３溶液（ｐＨ８．０）１ｍｌに混
合溶解させた溶液を用意した。全長約６０ｃｍのキャピ
ラリー３（溶融石英製、内径５０μｍ）の一端を容器１
中に浸す。分取台１として図２に示すような一端に電極
を備えたＭＡＬＤＩ用プレートを用いた。分取台５上の
所望の位置に上記泳動液をスポイトにて一滴垂らし、そ
の液滴にこのキャピラリー３の他端を接液するよう配置
した。またこのキャピラリー１の途中にＵＶ検出器４
（日本分光社製 Ｅ−８００、測定波長２８０ｎｍ）を
配し、キャピラリー１の外部から泳動する蛋白質を検出
できるようにした。試料の導入端から検出器４までのキ
ャピラリーの長さは約４０ｃｍ、ＵＶ検出器４から分取
台５までの長さを約２０ｃｍとした。容器１に正電極２
を差し込み、分取台５から負電極６をとり、その両電極
間に１６７Ｖ／ｃｍの電場を印加した。図３には電場を
印加してからのＵＶ検出器による吸収を示す。図３中、
ａはリゾチーム、ｂはミオグロビンによる吸収ピークで
ある。泳動を開始してからこれら蛋白質がＵＶ検出器４
で検出されるまでの時間から、試料が分取台５に排出さ
れる時刻を予測し、ＵＶ検出器４からの信号を計測・制
御装置７を介することにより、３０秒ごとに分取台５上
の分注位置を位置制御機構８により変更して、蛋白質の
検出が終わるまでの５分間連続して１０区画の分離試料
を作成した。【Example】Example 1 Separation and dispensing of two proteins by electrophoresis
For this, the measurement system shown in FIG. 1 was used. 1.5cc capacity
In vessel 1, two proteins, myoglobin (horse, Fw:
17.2 kDa) 1.7 mg and lysozyme (chicken protein)
White, Fw: 14.3 kDa) and 1.4 mg of the electrophoresis running solution (2
0 mM pyridine-NH3Mix with 1 ml of solution (pH 8.0)
A mixed solution was prepared. Capi with a total length of about 60cm
One end of the rally 3 (made of fused quartz, inner diameter 50 μm)
Soak in. An electrode at one end as shown in FIG.
A plate for MALDI equipped with was used. On the sorting table 5
Drop the electrophoresis running solution at the desired position with a dropper and drop it.
So that the other end of the capillary 3 is in contact with the droplet
did. In the middle of the capillary 1, a UV detector 4
(E-800, manufactured by JASCO Corporation, measurement wavelength: 280 nm)
To detect proteins migrating from outside of Capillary 1
I made it possible. Key from the sample introduction end to detector 4
Capillary length is about 40cm, sampled from UV detector 4
The length up to the table 5 was about 20 cm. Positive electrode 2 in container 1
And take the negative electrode 6 from the sorting table 5
An electric field of 167 V / cm was applied between them. Figure 3 shows the electric field
The absorption by the UV detector after application is shown. In FIG.
a is lysozyme, b is the absorption peak due to myoglobin
is there. After the start of electrophoresis, these proteins are
The sample is discharged to the sorting table 5
The time from the UV detector 4 measurement and control
Through the control device 7, every 30 seconds on the sorting table 5
Is changed by the position control mechanism 8 to
Separated sample of 10 sections continuously for 5 minutes until detection is completed
It was created.
【００２５】実施例２ 実施例１で得た１０区画の分離試料を風乾後、試料溶出
部にマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシシ
アン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）溶液を１μＬ滴下した。この
試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳとしてＰＥＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ社製ＶｏｙａｇｅｒＲＰを用いて測定した。Ｃ
ＺＥによって、図３に示すようにａ、ｂ二つのピークが
分離され、これらピークに相当する試料を質量分析した
結果を図５に示すが、それぞれの質量分析から、最初の
ピークはリゾチーム（ｍ／ｚ １４，３１１）、二番目
のピークはミオグロビン（ｍ／ｚ １７，２３７）が溶
出されたものであることが同定できた。[0025]Example 2 After air-drying the separated sample of 10 sections obtained in Example 1, sample elution
Α-cyano-4-hydroxyc
1 μL of an acid solution (10 mg / mL) was added dropwise. this
Sample was used as MALDI-TOF / MS as PEBiosy
The measurement was performed using Voyager RP manufactured by Stem. C
According to ZE, two peaks a and b are formed as shown in FIG.
Samples separated and corresponding to these peaks were analyzed by mass spectrometry.
The results are shown in FIG. 5, and from each mass analysis, the first
Peak is lysozyme (m / z 14,311), second
Is the peak where myoglobin (m / z 17,237) is dissolved.
It was identified that it was issued.
【００２６】実施例３ また、実施例１と同様に分離した成分ａ及びｂに、それ
ぞれ消化酵素処理を行って、そのマススペクトルからシ
ークエンス解析を行った。後段のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／
ＭＳは実施例２と同様に行った。プレート上に溶出した
試料（ミオグロビン（ａ）、リゾチーム（ｂ））にそれ
ぞれトリプシン及びキモトリプシンを加えて消化酵素処
理を行った後に、マトリックスとしてα−シアノ−４−
ヒドロキシシアン酸（１０ｍｇ／ｍＬ）溶液を１μＬ加
えて、そのマススペクトルデータからシークェンスを行
った。図６及び図７に示す質量分析の結果からミオグロ
ビン及びリゾチームのアミノ酸配列を決定することがで
きた。従来、数種の蛋白質が混合した試料に含まれる各
蛋白質のアミノ酸配列を決定するためには各蛋白を精製
するという別工程を経て質量分析することが必要であっ
たが、本発明の方法を用いることによりこのような従来
の複雑な工程を経ることなく、蛋白質の分離と質量分析
を一工程で行うことが可能になり、更にそのために極微
量の試料によるこのような分析を確実且つ簡便に行うこ
とが可能になった。[0026]Example 3 In addition, components a and b separated in the same manner as in Example 1
Each digestive enzyme treatment is performed, and the mass spectrum
Sequence analysis was performed. MALDI-TOF /
MS was performed in the same manner as in Example 2. Eluted on the plate
Samples (myoglobin (a), lysozyme (b))
Add trypsin and chymotrypsin respectively and digest
After processing, α-cyano-4- was used as a matrix.
Add 1 μL of hydroxycyanic acid (10 mg / mL) solution
A sequence from the mass spectrum data.
Was. From the results of the mass spectrometry shown in FIGS.
The amino acid sequence of bottles and lysozyme can be determined.
Came. Conventionally, each sample contained in a mixed sample of several proteins
Purify each protein to determine the amino acid sequence of the protein
Mass spectrometry through a separate process
However, by using the method of the present invention,
Separation and mass spectrometry without complicated processes
Can be performed in a single step, and
Performing such an analysis with a large amount of sample reliably and simply
And it became possible.
【００２７】以下、図６及び図７に示す質量分析の結果
とそのアミノ酸配列を示す。なお、カッコ内の数字はミ
オグロビン又はリゾチームにおける塩基の順位を示す。 １．ミオグロビンａのトリプシンによる消化酵素処理によるアミノ酸配列決定 m/z (図６） アミノ酸配列 １３３３．５ ＣＫＧＴＤＶＱＡＷＩＲ（１１５−１２５）：配列番号１ １３５２．６ ＶＦＧＲＣＥＬＡＡＡＭＫ（２−１３）：配列番号２ ２．ミオグロビンａのキモトリプシンによる消化酵素処理によるアミノ酸配列決 定 m/z (図６） アミノ酸配列 ６９４．８ ＶＣＡＡＫＦ（２９−３４）：配列番号３ ９５２．０ ＲＧＹＳＬＧＮＷ（２１−２８）：配列番号４ １０８６．２ ＧＩＬＱＩＮＳＲＷ（５４−６２）：配列番号５ １２７２．４ ＧＩＬＱＩＮＳＲＷＷ（５４−６３）：配列番号６ １７３０．０ ＳＬＧＮＷＶＣＡＡＫＦＥＳＮＦ（２４−３８） ：配列番号７ ２１０６．３ ＲＧＹＳＬＧＮＷＶＣＡＡＫＦＥＳＮＦ（２１−３８） ：配列番号８The results of the mass spectrometry shown in FIGS.
And its amino acid sequence. The numbers in parentheses are
Shows the order of bases in oglobin or lysozyme. 1. Amino acid sequence determination of myoglobin a by digestive enzyme treatment with trypsinm / z (Fig. 6) Amino acid sequence 1333.5 CKGTDVQAWIR (115-125): SEQ ID NO: 1 1352.6 VFGRCELAAAMK (2-13): SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence determination of myoglobin a by digestive enzyme treatment with chymotrypsinm / z (Fig. 6) Amino acid sequence 694.8 VCAAKF (29-34): SEQ ID NO: 3 952.0 RGYSLGGNW (21-28): SEQ ID NO: 4 1086.2 GILQINSRW (54-62): SEQ ID NO: 5 1272.4 GILQINSRWW (54-63): Sequence No. 6 1730.0 SLGNWVCAAKFESNF (24-38): SEQ ID NO: 7 216.3 RGYSLGGNWVCAAKFESNF (21-38): SEQ ID NO: 8
【００２８】 ３．リゾチームｂのトリプシンによる消化酵素処理によるアミノ酸配列決定 m/z (図７） アミノ酸配列 ６６１．７ ＡＳＥＤＬＫ（５７−６２）：配列番号９ ７４７．９． ＡＬＥＬＦＲ（１３４−１３９）：配列番号１０ １６０５．９ ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ（１７−３１） ：配列番号１１ １７３０．０ ＨＬＫＴＥＡＥＭＫＡＳＥＤＬＫ（４８−６２） ：配列番号１２[0028] 3. Amino acid sequencing of lysozyme b by digestion with trypsinm / z (Fig. 7) Amino acid sequence 661.7 ASEDLK (57-62): SEQ ID NO: 9 747.9. ALELFR (134-139): SEQ ID NO: 10 1605.9 VEADIAGHGQEVLIR (17-31): SEQ ID NO: 11 1730.0 HLKTEAEMKASEDLK (48-62): SEQ ID NO: 12
【００２９】 ４．リゾチームｂのキモトリプシンによる消化酵素処理によるアミノ酸配列決定 m/z (図７） アミノ酸配列 ８２７．９ ＤＭＡＳＮＹＫ（１４１−１４７）：配列番号１３ ９５６．１ ＫＤＭＡＳＮＹＫ（１４０−１４７）：配列番号１４ １２９８．５ ＬＦＫＧＨＰＥＴＬＥＫ（３２−４２）：配列番号１５ １５０９．７ ＴＥＡＥＭＫＡＳＥＤＬＫＫ（５１−６３）：配列番号１６ １６０７．０ ＨＧＡＴＶＬＴＡＬＧＧＩＬＫＫＫ（６４−７９） ：配列番号１７ １８０１．０ ＧＬＳＤＧＥＷＱＬＶＬＮＶＷＧＫ（１−１６） ：配列番号１８ ２０３５．３ ＦＫＨＬＫＴＥＡＥＭＫＡＳＥＤＬＫ（４６−６２） ：配列番号１９ ２１１９．４ ＧＨＨＥＡＥＩＫＰＬＡＱＳＨＡＴＫＨＫ（８０−９８） ：配列番号２０ ２５５７．０ ＧＨＨＥＡＥＩＫＰＬＡＱＳＨＡＴＫＨＫＩＰＶＫ （８０−１０２） ：配列番号２１ ３９０５．５ ＩＰＶＫＹＬＥＦＩＳＥＣＩＩＱＶＬＱＳＫＨＰＧＤＦ ＧＡＤＡＱＧＡＭＮＫ（９９−１３３） ：配列番号２２[0029] 4. Amino acid sequencing of lysozyme b by digestion with chymotrypsinm / z (Fig. 7) Amino acid sequence 827.9 DMASNYK (141-147): SEQ ID NO: 13 956.1 KDMASNYK (140-147): SEQ ID NO: 14 1298.5 LFKGHPETLEK (32-42): SEQ ID NO: 15 1509.7 TEAEMKASEDLKK (51-63): Sequence No. 16 1607.0 HGATVLTALGGILKKKK (64-79): SEQ ID NO: 17 1801.0 GLSDGEWQLVLNVWGK (1-16): SEQ ID NO: 18 2035.3 FKHLKTEAEMKASEDLK (46-62): SEQ ID NO: 19 2199.4KHEKHAKHEKHAQAHKEHKEHKEHKEHKEHA : SEQ ID NO: 20 2557.0 GHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVK (80-102): SEQ ID NO: 21 3905.5 IPVKYLE FISECIIQVLQSKHPGDF GADAQGAMNK (99-133): SEQ ID NO: 22
【００３０】[0030]
【発明の効果】本発明の試料分取方法および装置によ
り、電気泳動法などによって分離された成分試料を同一
の基盤上に連続的に分取することが可能となり、分取試
料の分析操作が容易になった。また、分取台の位置によ
って試料成分を識別できるので、多数試料でも取扱いが
容易である。更に、顕微鏡下で観察した特定の物質を採
取することができる。また、回収液が不要であり、分離
試料を液滴として直接分取するので、微量成分であって
も確実に分注できる。また、電気泳動力を利用している
ので、微量試料の搬送が容易で確実に分注できる。これ
らは、ごく微量の試料に対応できる。分取された被測定
試料に酵素処理、脱塩処理、濃縮処理等の処理が効果的
にできる。さらに、本発明の試料分取方法および装置を
他の分析装置と組み合わせることにより、超微量の分離
液の分取が非常に簡便且つ確実に可能となり、分離を前
提とした超微量での二次分析が安定且つ簡単に達成でき
る。According to the sample collection method and apparatus of the present invention, component samples separated by electrophoresis or the like can be continuously collected on the same substrate, and the analysis operation of the sample can be performed. It became easier. In addition, since the sample components can be identified by the position of the sorting table, handling of a large number of samples is easy. Furthermore, specific substances observed under a microscope can be collected. In addition, since a recovery liquid is unnecessary and the separated sample is directly collected as a droplet, even a trace component can be reliably dispensed. In addition, since the electrophoretic force is used, a small amount of sample can be easily transported and dispensed reliably. These can correspond to a very small amount of sample. Enzyme treatment, desalination treatment, concentration treatment, and the like can be effectively performed on the collected sample to be measured. Furthermore, by combining the sample separation method and apparatus of the present invention with another analyzer, the separation of an extremely small amount of a separated liquid can be performed very easily and reliably, and the secondary separation in an extremely small amount assuming separation is possible. Analysis is stable and easy to achieve.
【００３１】[0031]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> 試料分取方法及びそのための装置 <130> PS01-966 <160> 21 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 1 Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 2 Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 3 Val Cys Ala Ala Lys Phe 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 4 Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 5 Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 6 Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 7 Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe 1 5 10 15 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 8 Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser 1 5 10 15 Asn Phe <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 9 Ala Ser Glu Asp Leu Lys 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 10 Ala Leu Glu Leu Phe Arg 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 11 Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 12 His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Pro Glu Asp Leu Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 13 Asp Lys Ala Ser Asn Tyr Lys 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 14 Lys Asp Met Ala Ser Asn Tyr Lys 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 15 Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 16 Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 17 His Gly Ala Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 18 Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 19 Phe Lys His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu 1 5 10 15 Lys <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 20 Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 1 5 10 15 Lys His Lys <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 21 Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 1 5 10 15 Lys His Lys Ile Pro Val Lys 20 <210> 22 <211> 35 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 22 Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Cys Ile Ile Gln Val 1 5 10 15 Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gln Ala 20 25 30 Met Asn Lys 35[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Sample collection method and equipment therefor <130> PS01-966 <160> 21 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 1 Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 2 Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 3 Val Cys Ala Ala Ala Lys Phe 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 4 Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 5 Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 6 Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400> 7 Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe 1 5 10 15 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Allus gallus domesticus <400 > 8 Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser 1 5 10 15 Asn Phe <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 9 Ala Ser Glu Asp Leu Lys 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 10 Ala Leu Glu Leu Phe Arg 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Equus caballus < 400> 11 Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 12 His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Pro Glu Asp Leu Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 13 Asp Lys Ala Ser Asn Tyr Lys 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 14 Lys Asp Met Ala Ser Asn Tyr Lys 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 15 Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 16 Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 17 < 211> 16 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 17 His Gly Ala Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 18 Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 19 Phe Lys His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu 1 5 10 15 Lys <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 20 Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 1 5 10 15 Lys His Lys <210> 21 <211> 23 < 212> PRT <213> Equus caballus <400> 21 Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala Gln Ser His Ala Thr 1 5 10 15 Lys His Lys Ile Pro Val Lys 20 <210> 22 <211> 35 <212 > PRT <213> Equus caballus <400> 22 Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Glu Cys Ile Ile Gln Val 1 5 10 15 Leu Gln Ser Lys His Pro Gly Asp Phe Gly Ala Asp Ala Gln Gln Ala 20 25 30 Met Asn Lys 35
【図１】本発明のオンプレート分注法の実施形態を示す
図である。FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of an on-plate dispensing method of the present invention.
【図２】本発明の分取台の一例を示す図である。（ａ）
は正面図、（ｂ）は側面図である。FIG. 2 is a diagram showing an example of a sorting table of the present invention. (A)
Is a front view, and (b) is a side view.
【図３】泳動成分の検出器出力の一例を示す図である。FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a detector output of a migration component.
【図４】本発明のマイクロピペットによる搬送・分取の
一例を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing an example of transport and sorting by the micropipette of the present invention.
【図５】各分画のマススペクトルを示す図である。図
中、ａ及びｂは図３のピークａ及びｂに相当する。FIG. 5 is a diagram showing a mass spectrum of each fraction. In the figure, a and b correspond to peaks a and b in FIG.
【図６】分画ａの消化酵素処理を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing digestion enzyme treatment of fraction a.
【図７】分画ｂの消化酵素処理を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing digestion enzyme treatment of fraction b.
１ 試料の入った容器 ２ 正電極 ３ キャピラリー（細管） ４ 検出器（ＵＶ検出器） ５ 分取台 ６ 負電極 ７ 計測・制御装置 ８ 位置制御機構 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Container containing sample 2 Positive electrode 3 Capillary (capillary tube) 4 Detector (UV detector) 5 Sorting table 6 Negative electrode 7 Measurement / control device 8 Position control mechanism
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/64 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｃ 35/10 ３３１Ｅ ３３１Ｊ 35/06 Ａ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 27/64 G01N 27/26 331C 35/10 331E 331J 35/06 A
Claims (7)
電気泳動管の開放端を該液滴に接触させることにより該
電気泳動管内の泳動液と該分取台とを導通させ、試料を
電気泳動力により該分取台上に成分別に排出させる試料
分取方法。1. forming a droplet on a conductive sorting table,
By bringing the open end of the electrophoresis tube into contact with the droplet, the electrophoresis liquid in the electrophoresis tube and the sorting table are conducted, and the sample is discharged onto the sorting table by the electrophoretic force. How to take.
る検知器を配置し、該検知器からの信号により該電気泳
動管の末端又は該分取台を移動させることにより、所望
の成分が該分取台の所望の位置に排出される請求項１に
記載の試料分取方法。2. A detector for detecting a component to be electrophoresed in the electrophoresis tube is disposed, and a terminal from the electrophoresis tube or the fractionation table is moved by a signal from the detector, whereby a desired component is 2. The sample sorting method according to claim 1, wherein the sample is discharged to a desired position on the sorting table.
析装置用のプレートを兼ね、該分取台上に請求項１又は
２に記載の方法により試料が成分別に排出され、該排出
された成分にマトリックスを混合した後ＭＡＬＤＩ−Ｔ
ＯＦ質量分析にかけられることを特徴とする分析方法。3. The method according to claim 1, wherein the fractionation table also serves as a plate for a MALDI-TOF mass spectrometer, and a sample is discharged on the fractionation table by the method according to claim 1 or 2, and the discharged component is discharged. After mixing the matrix with MALDI-T
An analysis method characterized by being subjected to OF mass spectrometry.
析装置用のプレートを兼ね、該分取台上の所定位置に所
定量のマトリックスが置かれ、このマトリックス上に請
求項１又は２に記載の方法により試料が成分別に排出さ
れ、該排出された成分が該マトリックスと混合されてＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけられることを特徴とす
る分析方法。4. The method according to claim 1, wherein the sorting table also serves as a plate for a MALDI-TOF mass spectrometer, and a predetermined amount of matrix is placed at a predetermined position on the sorting table. The sample is discharged for each component by the method described in the above, and the discharged component is mixed with the matrix to form M
An analysis method characterized by being subjected to ALDI-TOF mass spectrometry.
試料分取装置であって、該分取台上に液滴を形成させ
て、電気泳動管の開放端を該液滴に接触させることによ
り該電気泳動管内の泳動液と該分取台とを導通させ、試
料を電気泳動力により該分取台上に成分別に排出させる
試料分取装置。5. A sample sorting apparatus comprising an electrophoresis tube and a conductive sorting table, wherein a droplet is formed on the sorting table, and an open end of the electrophoresis tube is brought into contact with the droplet. A sample separation device that electrically connects the electrophoresis liquid in the electrophoresis tube to the sorting table and discharges the sample onto the sorting table by electrophoretic force.
知する検知器を備え、該検知器からの信号により該電気
泳動管の末端又は該分取台を移動することが可能な請求
項５に記載の試料分取装置。6. The apparatus according to claim 5, further comprising a detector for detecting a component which migrates through the electrophoresis tube, wherein a terminal from the electrophoresis tube or the sorting table can be moved by a signal from the detector. 2. The sample collection device according to 1.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置とを組み合わせた分析
装置であって、該分取台が該ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分
析装置用のプレートを兼ね、該試料分取装置により該プ
レート上に試料が成分別に排出され、該排出された成分
がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にかけられることを特徴
とする分析装置。7. An analyzer in which the sample sorter according to claim 5 and a MALDI-TOF mass spectrometer are combined, wherein the sorter is a plate for the MALDI-TOF mass spectrometer. Also, an analyzer characterized in that a sample is discharged on the plate by the sample collection device for each component, and the discharged component is subjected to MALDI-TOF mass spectrometry.
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