JP4638146B2 - 医薬化合物をスクリーニングするためのシステムと方法 - Google Patents

Description

関連する出願の相互参照
本出願は、2001年8月14日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第60/312,322号の恩恵を主張する。なおこの出願は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。

本発明は、医薬化合物をスクリーニングするためのシステムと方法に関する。さらに詳細には、本発明は、組織モデルにおいて医薬化合物をスクリーニングするためのシステムと方法に関する。

効率的にテストせねばならない医薬化合物の数が非常に増加している。その主な原因は、並行コンビナトリアル化学合成法によって大きな化合物ライブラリが得られることにある。それに対応して、機能的ゲノミクスを応用して同定される治療標的（例えば受容体や細胞内調節タンパク質）の数も大きく増加している。したがって医薬化合物が特定の細胞応答を誘起する能力をスクリーニングし、医薬候補となるリード化合物を同定するための迅速かつ定量的な方法が必要とされている。

大きな化合物ライブラリに対する最初のスクリーニングは、溶液中で実施できるアッセイ法を利用して標的分子に特異的に結合するかどうかをテストするというものである。シンチレーション近接アッセイや蛍光検出法に基づいた高スループットの方法が開発されている（Sundberg、2000年）。これらの方法では1日に数千種類の化合物をスクリーニングできるが、化学的相互作用の強さと特異性に関する情報が得られるだけで、細胞応答についての情報は得られない。したがって溶液中で標的に結合できる能力に基づいて最初に選択した化合物を再度スクリーニングし、望む細胞応答を引き出す能力を調べる必要がある。このように2回目、3回目のスクリーニングを行なうと、有望な医薬化合物またはリード医薬化合物を検出するプロセスに余分なコストと時間がかかることになる。

受容体が刺激を受けたかどうかやイオン・チャネルが活性化したかどうかは、蛍光法を利用して例えばカルシウム・イオンの濃度、膜電位、pHの変化を検出することによって調べられている（Sundberg、2000年）。イオン濃度や輸送状態のこのような変化は、シグナル伝達プロセスの比較的早い段階でしばしば起こり、その後に、より特異的な最終応答（例えば特定の酵素の活性化）が起こる。したがってこのような応答を測定しても、テスト医薬化合物によって活性化されるか抑制されるかという最終的な細胞応答に関する情報が得られるとは限らない。

一実施態様では、薬剤に対する多細胞組織モデル系の応答を得るための方法であって、組織モデルを薬剤と接触させ、その接触に対する細胞の機械的応答として、収縮力と組織弾性のうちの少なくとも一方を明らかにする操作を含む方法が提供される。

別の実施態様では、薬剤に対する組織モデル系の応答を得る方法であって、組織モデル系を構成し、薬剤を提供し、この薬剤が組織モデル系と接触したときの細胞の機械的応答として収縮力とヒステリシスのうちの少なくとも一方を測定する操作を含む方法が提供される。

さらに別の実施態様では、再構成した筋組織モデルと非筋組織モデルが薬剤と接触したときの応答に関する機械的測定結果に基づいて機械的応答プロファイルを得るためのシステムであって、コラーゲン中に再構成した細胞を含む組織モデル系を構成し、この再構成した細胞を薬剤と接触させる操作を含むシステムが提供される。

さらに別の実施態様では、医薬品のスクリーンング法であって、コラーゲン中に再構成された細胞を含む組織モデルを有効量の医薬化合物と接触させ、その医薬化合物に対する細胞応答として収縮力と組織弾性の少なくとも一方を測定する操作を含む方法が提供される。

さらに別の実施態様では、1種類以上の医薬品または医薬化合物のライブラリを管理する方法であって、1つの医薬品を組織モデルと接触させたときの機械的応答のプロファイルを取得し、そのプロファイルをデータベースに記憶させ、そのデータベース内に別の医薬品に関する少なくとも1つの追加プロファイルを記憶させ、2つ以上のプロファイルを別のプロファイルと比較する手段を設け、あらかじめ確立した、または手順が整った標準式／ヒエラルキー式比較法に基づき、第1の医薬品のプロファイルを第2の医薬品のプロファイルと比較し、組織モデルに対する機械的効果に関する活性の順序に従って各医薬品をランク付けする操作を含む方法が提供される。

さらに別の実施態様では、組織モデルを医薬品と接触させたときの細胞応答を測定することにより、組織モデルに関する多パラメータ機械的応答のプロファイルを得る方法が提供される。

さらに別の実施態様では、コンピュータに電気的に接続された等尺式力変換器を備えるシステムに取り付けられたリング状組織を含む組織モデルが提供される。この組織モデルは、等尺式力変換器に張り渡されており、コンピュータ制御のステッピング・モータがその組織を引っ張って歪みを与える。

さらに別の実施態様では、再構成した組織からなる膜をフレームで支持したものを含む組織モデルが提供される。再構成した組織からなる膜の機械的特性は、等尺式力変換器に取り付けられたプローブに対してその組織を移動させたときの引っ張りに対する抵抗力から明らかになる。

さらに別の実施態様では、組織モデルの調製方法であって、支持体上に自己集合化組織をある形状に配置し、成形されたその組織を押すことによって引っ張り力を加える操作を含む方法が提供される。

さらに別の実施態様では、医薬品の機械的応答プロファイルを確立する方法であって、組織モデルを医薬品と接触させ、あるいは組織モデルを医薬品で弛緩させ、その組織モデルの機械的応答として収縮力と弾性の少なくとも一方を明らかにする操作を含む方法が提供される。

別の特徴によると、繊維芽細胞によって条件付けた培地を用いて心臓組織を培養する方法が提供される。

別の特徴によると、本発明には、組織に対する薬剤の効果を同定する方法であって、本発明を利用して組織を処理し、その結果として得られる効果を測定した後、その測定した効果を、同じ組織または同様の組織に対する標準薬の効果と比較する操作を含む方法が含まれる。

別の特徴によると、本発明には、医薬部分ライブラリから組織内で活性な部分に関するデータを探索するため、本発明を利用して組織を処理し、その結果得られた効果を測定する操作を含む方法が含まれる。オプションとして、測定されたその効果を、同じ組織または似た組織に対して標準薬が及ぼす効果を同様にして測定した結果と比較することができる。

別の特徴によると、本発明には、心臓組織の増殖に影響を与えるさまざまな付加的因子（例えば増殖因子）、マトリックス・タンパク質、ホルモンを本発明の組織モデルに対して追加することにより、組織培養条件を最適化して移植可能な人工心臓組織を構成する方法が含まれる。

この明細書では、“アゴニスト”という用語に、細胞応答を活性化する化学物質が含まれる。

発明の詳細な説明
ヒトの身体には20〜30兆個の細胞があり、それらが特徴や機能が異なる組織に分かれていると推定されている。そのような細胞には、筋細胞と非筋細胞が含まれる。筋細胞は収縮力を増大させる。筋細胞は、収縮力の発生を調節するメッセンジャー（例えばカルシウム・イオンやサイクリックAMP）を出す神経信号に応答する。非筋細胞（例えば繊維芽細胞や内皮細胞）は、アクティベータ（ポリペプチド増殖因子やホルモン）に応答して収縮力を発生させる。

この明細書では、“…で処理した”、あるいは“…と接触させた”という表現に、…に曝露したり、…に接触させたり、…と接触した状態にしたりすることが含まれる。この明細書では、“組織モデル”という用語に、生細胞や細胞外マトリックス材料から再構成した細胞や組織が含まれる。この明細書では、“等尺力”という用語に、組織の長さまたは組織の物理的大きさが実質的に変化することのない力の変化が含まれる。この明細書では、“細胞外マトリックス（ECM）”という用語に、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニンのほか、これらに似た構成要素／成分や合成材料（例えばポリアクリル酸、ポリグリコール酸）が含まれる。

細胞や細胞外マトリックス（ECM）から再構成された組織モデル（例えば人工バイオ組織）は天然の組織を刺激する。このような組織モデルは、均一な、あるいは実質的に均一なコラーゲン性マトリックスの中に生細胞が多分散または単分散された集団を提供する。

細胞骨格とマトリックス・タンパク質は、組織モデルによって及ぼされる力と組織モデルの弾性を制御する。細胞は、細胞骨格構造を調節するとともにECMをリモデルするため、組織が増殖して傷が治る間に機械的な変化が起こる。

収縮力は、筋肉以外のミオシンの活性化によって発生する。活性化後、時間経過とともに増大する収縮力は、筋細胞および非筋細胞から再構成した組織の中で測定することができる。細胞がこのように応答すると、細胞内の細胞骨格が再構成されたり、細胞が埋め込まれている細胞外マトリックス（ECM）が再構成されたりする可能性がある。収縮力の増大や、細胞骨格やマトリックスが再構成されることの機械的効果は、医薬候補に対する細胞応答の指標となる。収縮力と弾性は、細胞のミオシンの活性化または不活性化によって、あるいは細胞骨格に対するこれ以外の擾乱によって、あるいは細胞が埋め込まれている細胞外マトリックスの擾乱によって生じる。

再構成した組織を用いて組織モデルを構成し、特別に単離したタイプの細胞を用いて、あるいはさまざまなタイプの細胞の組み合わせを用いてその組織モデルをテストすることができる。したがって医薬候補に対する再構成した組織の応答がこれらのタイプの細胞についての機械的測定結果を与える。このとき、天然の組織に一般に存在している他のタイプの細胞の寄与が混じることはない。特定のタイプの細胞と、その細胞に薬剤が接触したときに生じる力および弾性の変化を機械的に測定した結果のプロファイルとの間に関係が確立される。

収縮力と組織の弾性は、再構成した組織内の細胞が薬剤と効果的に接触したときに収縮したり弛緩したりすることにより変化する。この明細書では、“薬剤”という用語に、1種類以上の医薬候補が含まれる。その医薬候補には、何らかの薬理活性または細胞応答があってもなくてもよい。薬剤には、アクティベータ、アンタゴニストなども含まれる。この明細書では、“効果的な接触”という用語は、有効量のアクティベータを組織モデルと接触させることを意味する。そのためには、例えば薬剤を組織モデルに添加する。この明細書では、“医薬品”という用語は、動物またはヒトに影響を与える薬と関係があることを意味する。

組織系として使用する組織モデルから医薬候補に対する応答に関する組織特異的情報を得るため、使用する細胞はさまざまな組織供給源から取得する。

この明細書では、“組織の弾性”という用語は、組織を所定量引き伸ばすのに必要な力を意味する。言い換えるならば、組織の弾性は、組織に加えた力を組織が引き伸ばされた程度で割った値である。弾性物体を引き伸ばすのに必要な力は、その物体を引き伸ばす程度（“歪み”）が大きくなるにつれて増大する。しかし生物組織は粘弾性である。すなわち引っ張り率に依存する粘性力も、引っ張りに対する抵抗に寄与する。粘性力の寄与は、弾性が引っ張り率にどのように依存しているかから明らかにすることができる。線形な弾性を示す材料では、力が歪みに対して線形に増加する。すなわち弾性は、歪みとは独立に一定である。生物組織や再構成した組織モデルは機械的に非線形であり、組織の弾性は歪みの増大とともに大きくなる。ある範囲の力では、その力が組織内で発生した場合でも外部から加えられた場合でも、弾性が力に対して線形に変化する。この線形な変化は、力が歪みの指数関数であることを意味する。

組織の弾性を測定する1つの方法として、組織モデル系の組織に対して比較的大きな安定した引っ張り力を加え、歪みが大きくなったときの力の変化を観察するという方法がある。組織の弾性をこのようにして測定すると、ヒステリシス（面積）、位相の遅れ、動的弾性などのパラメータを測定して明らかにすることができる。

組織の弾性を測定している間に歪みがあらかじめ決めた値に達すると、今度は引っ張りの程度（歪み）を同じ速度で小さくして歪みと弾性を最初の値に戻す。歪みが小さくなるときの力を歪みの関数としてプロットした曲線（負荷解除曲線）は、歪みを大きくしていくときの力のレベル（負荷曲線）よりも常に下にある。これら2本の曲線に囲まれた面積がヒステリシス面積であり、組織の粘性の指標となる。ヒステリシス面積は、1回ごとの負荷-負荷解除サイクルの間に組織において失われるエネルギーを表わす。

組織の弾性を測定する別の方法では、振動性引っ張りが利用される。すなわち、実験者が選択した所定の周波数（例えばサイン曲線）で歪みを周期的に増減させる。力は対応するように同じ周波数で増減するが、位相のずれ、すなわち位相の遅れがおそらく伴う。位相のずれ、すなわち位相の遅れは、組織モデルの粘性に関する別の指標である。振動性引っ張りによって測定されるタイプの組織の弾性は、“動的弾性”である。動的弾性は、組織モデルが非線形であるため引っ張りの大きさに依存するとともに、組織が実際には粘性を有するため振動の周波数にも依存する。

本発明の実施態様では、再構成した組織モデルに対して機械的測定を行なう。本発明により、1種類以上のアクティベータとの接触に応答した後の一軸性引っ張り測定を通じ、結合組織モデル（例えば繊維芽細胞マトリックス（FPM））の機械的特性を定量化する方法が提供される。

結合組織モデル（選択した生細胞と、ECM（すなわち人工バイオ系で、通常はタイプIのコラーゲン）との複合体）は、収縮力を活性化するアクティベータと接触するために硬化するという応答を示す。本発明の組織モデル系に関する一実施態様では、組織をリングの形状にして系に取り付ける。この系では、収縮力と歪みを測定するため、組織が等尺式力変換器とコンピュータ制御されるステッピング・モータに張り渡される。

高スループットのスクリーニングに特に適した本発明の別の実施態様では、マルチウエル・プレート・システムを用いて組織の硬化を押し込み法で測定する。押し込み法では、収縮力を（最大応力として）測定するとともに組織の弾性を測定する。そのとき収縮力は、組織モデルと接触するプローブによって押されたときの組織モデルの抵抗力として記録する。プローブは力変換器に取り付ける。この実施態様では、試薬に対する多数の組織複合体の機械的応答を迅速に（高スループットで）テストすることができる。このシステムは、少量の組織モデルおよび試薬を使用するのに適したサイズと設計になっている。

よく特性のわかった活性剤によって引き起こされる硬化応答を妨げる能力に関して医薬候補をスクリーニングし、収縮応答を抑制するものを見つけることができる。さらに、細胞にコラーゲンをリモデルさせることによりコラーゲンを硬化または軟化させる候補試薬を、この明細書に開示した本発明の方法を利用してテストすることができる。

本発明により、再構成した組織モデルが1種類以上の薬剤と接触したときの機械的応答の特徴とプロファイルを明らかにするためのシステムと方法が提供される。本発明により、細胞の収縮、細胞骨格の変化、細胞-マトリックス相互作用、マトリックスのリモデリングに関する潜在的な多数のアクティベータまたは阻害剤を迅速かつ定量的にスクリーニングすることができる。本発明の方法により、組織の弾性が定量的に読み出される。それを較正することにより、ミオシンによる細胞骨格成分の変化の程度、細胞-マトリックス相互作用の活性化または抑制の程度、マトリックスそのものの特性に関する定量的データを提供することができる。

この明細書と請求項に記載したシステムと方法が、この明細書に記載した特定の実施態様に限定されることはない。さらに、各システムの要素とそれぞれの方法は、この明細書に記載した他の要素および方法と独立かつ別々に実施することができる。それぞれの要素と方法は、他の要素および方法と組み合わせて利用することができる。

有用なコラーゲンとしてはクラス1〜4のコラーゲンが挙げられる。その中には、タイプI〜XIIIのすべてとその組み合わせが含まれる。

アクティベータとして有用な薬剤としては、ウシ胎仔血清（FBS）、リゾホスファチジン酸（LPA）、トロンビン、増殖因子（例えば上皮増殖因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF））、アンギオテンシンII、エンドセリン-1、バソプレッシン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

阻害剤としては、細胞表面の受容体に作用する阻害剤（例えばアンギオテンシンII受容体に対する受容体アンタゴニスト）と、細胞内で作用する阻害剤が挙げられる。この明細書で有用な阻害剤はシグナル伝達プロセスを阻害する阻害剤であり、例えばゲニステイン、ハービマイシン、細胞骨格に作用する薬剤などが挙げられる。細胞骨格に作用する薬剤としては、サイトカラシンD、ラトルンクリンB、パクリトキソール、ノコダゾール、カリクリンA、ブタン-ジオン-モノオキシム（BDM）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

再構成した細胞に加える薬剤の量は、一般にはナノモル〜約100ミリモルの範囲の有効量である。有効量とは、組織モデルから応答を引き出すのに十分な量である。

本発明の実施態様を利用して明らかにすることのできる機械的パラメータがいくつかある。
リング・タイプの系：
ベースラインとなる力 歪み0で測定した力（引っ張り力なし）。
動的弾性 サイン曲線化型引っ張り力に対する力の応答の振幅を、加えた振動性歪みの振幅で割った値。測定は、さまざまなレベルの歪みに対して行なう。動的弾性は、ランプ状引っ張り力を加えている間に得ることもできる。
位相角 位相角は、サンプルの時間依存した粘性を示す。位相角は、力の応答とサイン形駆動関数の間の位相が角度にしてどれだけずれているかから得られる。測定は、通常は歪み0で行なわれるが、力の平均レベルが短時間で安定状態に達するのであれば、さまざまな歪みで測定することもできる。
*貯蔵弾性率、G' サイン曲線型引っ張り力に対する応力（力をサンプルの断面積で割った値）の同相成分を歪みで割った値。
*損失弾性率、G" サイン曲線型引っ張り力に対する応力の位相はずれ成分を歪みで割った値。
最大応力 ランプ状引っ張り力に応答する最大応力。
ヒステリシス曲線の面積ヒステリシス曲線は、ランプ状引っ張り力に応答した力を歪みに対してプロットしたものである。サンプルを引っ張っている間の力の応答は、サンプルを収縮させている間の力の応答よりも常に大きい。2本の曲線で囲まれた面積が、サンプルの粘性と関係している。
組織を押す手続き：
最大応力 組織を押したときに応答する最大応力。
ヒステリシス曲線の面積ヒステリシス曲線は、組織を押したときに応答した力をプロットしたものである。押している（負荷をかけている）の間の力の応答は、力を緩める（負荷解除の）間の力の応答よりも常に大きい。2本の曲線で囲まれた面積が、サンプルの粘性と関係している。
*G'とG"は、サンプルの断面積がわかると動的弾性と位相角から計算することができる。G'とG"は、サンプルのサイズや形状とは無関係にサンプルの機械的特性を示すパラメータである。

さらに詳しいことは、図1〜図15を参照して以下に説明する。この明細書では組織モデルを利用する方法とシステムの特別な具体例について記述するが、この方法とシステムがそのような特別な具体例に限定されることはない。

さらに詳しい説明に入る。図1は、（リングの形状になった）FPMを調製して測定するためのリング法の概略図である。一実施態様では、CEF（2）とコラーゲン・モノマー（4）をDMEM（6）の中でpH7にて混合し、懸濁液（8）にする。この懸濁液（8）を、心棒（12）を有する鋳型用ウエル（10）に注ぎ、37℃にて重合させる。鋳型用ウエル（10）を1日以上の期間にわたってインキュベートすると、その間に細胞が圧縮され、重合したコラーゲン・マトリックスになる。インキュベーションの後、心棒（12）を鋳型用ウエル（10）から外し、FPMリング（14）を心棒（12）からそっと外す。FPMリング（14）を、力測定装置（等尺式力変換器）（16）と、組織の歪みを制御するステッピング・モータ（18）とに取り付ける。

図2は、FPMを引っ張ったときに応答する力をどのようにして測定するかを示している。1つのFPMに対して4回の引っ張りサイクルを適用して得られた典型的な力の応答の時間変化を追跡した。（パネルaに示した）第1の引っ張りサイクルでは、以後のサイクルよりも実質的に大きな最大応力が生まれる。以後のそれぞれのサイクルでは、最大応力のはるかに小さな低下（約6％）が見られる（パネルa）。図2のパネルbには、2つのFPMでの引っ張りシークエンス（実線とグレイの破線）が描かれており、測定に再現性のあることがわかる。20％コウシ血清（収縮性を増大させる）と2μMのサイトカラシンD（組織の能動的収縮を阻害する）の両方で処理した効果はどちらのFPMでもほとんど同じである。このテストでは、追加のテスト操作を行なえるようにするため、1サイクルの時間を以前の60分間ではなく30分間に設定した。（しかし1サイクルの時間が30分間でも60分間でも力-歪み曲線と弾性-歪み曲線はほとんど同じである。）

図3は、弾性の測定データを細胞から発生した力と比較して示したものである。このテストでは、組織モデルを1Hzのサイン曲線に従って0.3％だけ引っ張った。弾性は、（この時間スケールにおける軌跡の幅によって近似される）力のピーク-ピーク間の変化として測定した。弾性を表わすそれぞれの点は、弾性を5秒間平均した値を表わしている。

図3のグラフ（a）は、弾性の大きさと時間変化が、FBS（5％）で刺激している間の力と似ていることを示している。図3のグラフ（b）は、サイトカラシンD（2μM）によってアクチン・フィラメントが破壊されることを示している。図3（a）と同様、弾性は、力が変化することに対応して変化する。

図3のグラフ（c）は、図3のグラフ（a）とグラフ（b）に示した測定データに関し、弾性を力の関数としてプロットしたものである。FBSを添加した後の力の増大に関する力-弾性の関係（●）は、サイトカラシンDを添加した後の力の低下に関する力-弾性の関係（△）と非常に似ている。この図のそれぞれの●と△は、力と弾性の両方を表わしている。弾性は力に対してほぼ線形に増大する。

図4は、力と動的弾性がCDとLA-Bの濃度に依存することを示している。力と動的弾性は、CDの濃度が2nMのときに有意に減少し、CDの濃度が増大するにつれて減少を続けた（A、B）。それとは対照的に、LA-Bについては、力と動的弾性は、濃度が40nMに達したときにようやく減少を始め、濃度が約600nMのときに最小値に達した（C、D）。この図は、この測定法が、アクチン細胞骨格に変化を引き起こさないような低濃度のCDにおいて力と動的弾性の変化を検出できる感度を有することを示している。なおアクチン細胞骨格の変化は、光顕微鏡法で検出することができる。

図10は、再構成した組織を用いてリング法で測定した組織モデルの弾性に関するデータ（左側の棒グラフ）と、個々の細胞を押すことによって測定した細胞の弾性に関するデータ（右側の棒グラフ）の違いを比較した結果を示している。再構成した組織は、単一の細胞での測定と比べて少ないデータ数で統計的に有意なデータを提供することができる。統計的に有意なデータを得るのに必要な測定の数は、単一の細胞を用いるよりも組織モデルを用いる場合のほうが少ない。それは、単一のタイプの培養細胞群においてさえ、多数の実験パラメータに関して細胞間で実質的に違いが存在しているからである。したがって個々の細胞での測定を多数平均してその集団を特徴づける必要がある。それゆえ単一の細胞群で化合物の生物活性を測定する高スループットのスクリーニング装置では、統計的に有意なデータを得るのに多数の測定を行なう必要がある。しかしテストした組織モデルは少なくとも10,000個の細胞を含んでいたため、それぞれの測定はその組織内の多数の細胞の平均になっている。したがって組織モデルに関する高スループット・スクリーニングの効率は、単一の細胞群の場合よりも改善される。

図11は、押し込み法を利用してこの組織系の機械的応答を測定する場合の高スループット・スクリーニング・システムを示している。

直径1mmのステンレス鋼製ワイヤーでできた三角形のフレームが、再構成する組織を表面に形成するための足場となる。図示した例では、ウエルを底部に向けてわずかに先細にし、フレームをウエルの底から1mm上方にしっかりと固定する（細胞と上記の適切な細胞培地を含む重合していないコラーゲンの溶液をウエルに注ぎ、底から3mmのレベルまで満たす（図11a））。96ウエルのプレートを5％CO₂のもとで37℃にてインキュベートする。培養中に細胞がコラーゲン・マトリックスを圧縮して液体を押し出し、全体積が約10分の1になる。

ワイヤー・フレームがないと、再構成される組織は収縮して小さな球になり、組織培地内を浮遊する。コラーゲン・マトリックスは、さまざまな形状のフレーム（例えば円形や長方形になったワイヤー・フレームなどの支持体）を用いて圧縮することにより、いろいろな形にすることができる。支持体は、金属、非金属、プラスチックのいずれかにすることができる。一実施態様では、システムは自己集合化細胞系であり、細胞がフレームまたは支持体の形状に一致した組織モデルを形成する。

三角形のワイヤー・フレームに対し、細胞が3つの辺にまたがる膜を形成する。その様子を図11aに示してある。図11bに示したような別の形状のワイヤー・フレームだと、幅と形状が異なる組織ストリップが形成された。非ステンレス鋼からなる多孔性でないワイヤーの表面に組織を付着させる場合でさえ、組織を容易に付着させるのに多孔性支持体材料（例えばベルクロ社のファスナー）は使用しなかった。コラーゲンは、膜またはストリップの外側部分でより多く圧縮された。したがって膜のこの外側部分は、細胞によって生じる応力に耐えることができ、ワイヤー・フレームから膜を引きちぎろうとする応力の発生を防止することができる。

図12は、図11に示した上記のシステムを用いて得られたデータを示している。このデータは、最大応力が安定なレベルに達した後、サンプルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で刺激することを示している（図12aの矢印を参照のこと）。この量のFBSによって繊維芽細胞の非筋肉ミオシンが活性化されて収縮力が生まれ、再構成した組織が硬化する。FBSを添加した約10分後、次の押し込みによる最大応力が約25％増加する（図12a）。培地に40nMのCDを添加（この図の矢印bを参照のこと）した約15分後、次の押し込みによる最大応力が最初のレベルから約40％低下した（図12）。2μMのCDを添加した20分後に最大応力のさらなる低下が記録された。図12bは、図12aに示したのと同じデータをプロットしたものであるが、図12bでは、図12aと同じ条件における力と押し込みの深さの関係が示してある。

図13は、上に示した図12のデータを取得したテストの間の最大応力とヒステリシスの面積を比較したグラフである。図13（a）は、FBSで処理する前（FBSなし）、20％FBSで処理した後、40nMのCDで処理した後、2μMのCDで処理した後に測定した最大応力（ダイン）を示している。図13（c）は、最大応力とヒステリシスの面積がFBSで処理しない場合の値と比べてどれだけ変化したかを示している。

ヒステリシスの面積は、刺激を与えたりCDを添加したりするとより大きく変化する。したがってヒステリシスの面積は、組織モデルの機械的特性の変化をモニターするためのパラメータとしては最大応力よりも感度がよい。

図14は、再構成した組織のミニチュア版の機械的特性を96ウエルのプレートを用いて測定した結果を示している。このシステムは、高スループット・スクリーニングで使用することができる。というのも、マルチウエル・プレートを用いて複数の測定を迅速に並行して実施できるからである。

図14は、96ウエルのプレートを用いて力を測定した結果を時間軸に沿って示したグラフである。再構成した組織からなる小さな膜をステンレス鋼製ワイヤー・フレームで支持する。等尺式力変換器に取り付けた鉛直な棒を膜に押し込み、その押し込みに抵抗する力を測定する。10％FBSを添加すると力のピークが30％大きくなる。CDを添加するとピークの高さが60％低下した。

96ウエルのプレート・システムを用いてこの手続きを自動化することにより、あるいはより高度な並行処理を行なうことにより、本発明を利用して基本的アイディアを高スループットの用途へと拡張することができる。組織モデルを利用することにより、化合物ライブラリをその生物活性に基づいてスクリーニングして管理することができる。

一般に、収縮力は、薬剤を組織モデル系に接触させてから数分の間に急速に大きくなる。収縮力は、最大値に達した後、1時間以上の期間にわたってその値を維持するか、あるいはアクティベータや細胞のタイプに固有の速度で低下する可能性がある。力が緩和する理由は重要ではないが、そこから力と弾性の応答を明らかにするための情報とデータがさらに得られる。

活性化の間、細胞表面の受容体で受信したシグナルがさまざまな経路を通じて細胞内へと伝達され、収縮力が発生する。したがって収縮力の増大および維持は、外来性アクティベータとの接触によって細胞表面の受容体の伝達経路が作動してミオシンの活性化に至るという細胞の特異的応答の指標（プロファイル）となる。非筋細胞のプロファイルとしては、収縮力の最大値、収縮力の維持などが挙げられる。

以下の実施例の中で本発明をさらに詳しく説明する。なお本発明がこれら実施例に限定されることはない。

組織モデルの調製

生きた人工バイオ組織モデルを、細胞と細胞外マトリックス（ECM）から再構成して調製した。このモデルは天然の組織を刺激する。

11日目のニワトリ胚から単離したニワトリ胚の繊維芽細胞（CEF）（スパファス社、プレストン、コネティカット州）を、10％ウシ胎仔血清（FCS）と、50単位/mlのペニシリンと、50μg/mlのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の中に維持した。組織モデルを作るのに使用するCEFは、初代培養物から1回または2回継代培養した。0.02Mの酢酸に溶かしたコラーゲン・モノマー（アップステート・バイオテクノロジー社、レーク・プラシド、ニューヨーク州）を4℃にて0.1NのNaOHを用いて中和し、濃縮DMEMストックと混合し、通常濃度のDMEMを最終的に得た。トリプシンによって分散した繊維芽細胞（図1a）をこのコラーゲン溶液と混合し（図1b）、この細胞懸濁液をテフロン製鋳型用ウエルに注ぎ（図1c）、ウエルを37℃にて5％CO₂の状態でインキュベートした（図1d）。コラーゲンが15〜30分で重合し、水和したコラーゲン・ゲルの内部に繊維芽細胞を捕獲した。コラーゲン・ゲルは、円筒形ウエルの内壁と中心にある心棒の間にリング（厚さ3mm、直径3cm）を形成した。培養物中で細胞がこのリングを圧縮している間に体積が約10分の1に減少した（厚さ200〜300μm）。次に、リングを心棒から取り外し（図1e、図1f）、測定装置に取り付けた（図1g）。それについて以下に説明する。

再構成する組織を形成するのに使用できる細胞のタイプがCEFに限られることはない。機械的測定に適した組織を形成するのに使用されてきた細胞のタイプとしては、ニワトリ胚の繊維芽細胞、ニワトリ胚の心臓繊維芽細胞、ニワトリ胚の心臓ミオサイト、ラットの心臓繊維芽細胞、マウスの筋管、マウスの骨格筋C2/C12細胞系、正常なマウスの乳腺（NMuMG）細胞系、このマウスでα1インテグリンとα2インテグリンが欠如した突然変異系、マウスの繊維芽細胞とその突然変異細胞系、REF52繊維芽細胞、A7R5平滑筋細胞、CCL39繊維芽細胞、NR6繊維芽細胞、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。細胞は、ニワトリ胚から単離すること、あるいはアメリカ培養物コレクション（マナサス、ヴァージニア州）から入手することが可能である。

リング系に関する測定とリング系の組み立て

リング系を用いて物理的測定を行なった。培養を2日間にわたって行なった（最後の12〜16時間は血清欠乏状態にした）後、鋳型用ウエルから心棒を取り外し、リング状組織モデルを心棒からそっと取り外した。図1に示したように、リング状組織モデルは、可撓性のある細い金の鎖により、等尺式力変換器（モデル52-9545、ハーヴァード・アパレイタス社、サウス・ナティック、マサチューセッツ州）に取り付けられた三角形のフックにループにして引っかけた。サンプルの応力と動弾性率を測定するため、このリングは、滑動部材に取り付けられた水平な棒に対してもループにして引っかけられている。なお滑動部材は、マイクロ-ステッピング・ドライバ（IM483、インテリジェント・モーション・システムズ社）によって制御されるステッピング・モータ（P/N 1-19-3400 24V DC ステップ・サイズ1.8°、ハワード・インダストリー社、セントルイス、ミズーリ州）によって鉛直方向に直線状に移動可能になっている。マイクロ-ステッピング・ドライバは、パーソナル・コンピュータを用いて制御した。このコンピュータにインストールしたソフトウエアのおかげでステッピング・モータは滑らかな動きをすることができた。コンピュータに接続したアナログ・ディジタル信号変換器（CIO-DAS1602/16、コンピュータ・ボーズ社、マンスフィールド、マサチューセッツ州）を用いて等尺式力変換器からの電圧信号をディジタル信号に変換し、データ記録装置に記録した。ステッピング・モータによって組織の引っ張り具合を制御した。組織から及ぼされる力、あるいは組織に対して及ぼす力は、金の鎖を通じて力変換器に伝えた。

組織サンプルを、37℃に維持した温度制御式有機浴（ハーヴァード・アパレイタス社、サウス・ナティック、マサチューセッツ州）に入れた50mlのヘペス緩衝DMEM（pH7.4）に浸した。ループになったリングが引っかけられる水平な2本の棒が、最初はリングを（心棒の周囲長に対応する）元の長さになった状態で保持するように設定した。

組織モデル系のテスト

一般に、弾性を測定するには組織モデルに対して一連の引っ張りサイクルを適用する。それぞれのサイクルにおいて、ステッピング・モータを作動させて組織モデルを30分間かけてゆっくりと0〜20％引っ張った後、同じ速度で元の長さに戻す。第1回目の引っ張りの間における収縮力の増加は、以後の引っ張りにおける収縮力よりも実質的に大きい（図2a）。第1回目の引っ張りの後、それぞれの引っ張りにおいて最大収縮力がさらに少し低下するが、この低下は、予備的な引っ張りを十分に行なった後には無視できる程度になる。組織モデルは、血清による繊維芽細胞の活性化に応答して収縮力を発生させた。この収縮力は、アクチン細胞骨格をサイトカラシンD（2μM）で破壊することによって消えた（図2b）。

応答した力の振幅を引っ張りの振幅で割った値は、あらかじめ選択したサイン曲線型の長さ変化をさせたサンプルの動的弾性に対応した。動的弾性は、さまざまな周波数と振幅で測定することができる。サンプルを歪みが20％になるまで一定速度（10μm/分）で伸ばしたり縮めたりすることに加え、サイン曲線型の長さ変化（典型値は、振幅が20μm、歪み0.5％、周波数0.5Hz）をさせることにより、FPMの動的弾性と張力をさまざまなレベルの歪みで測定した。装置は、組織の長さが所定の速度と振幅で変化するように設定する。

弾性は、得られる機械的応答プロファイルにおいて細胞とマトリックスの寄与を分離することによって明らかにすることができる。というのも、細胞、マトリックス、細胞とマトリックスの相互作用のすべてが、再構成した組織モデルの組織の弾性に寄与するからである。

図3に示したように、動的弾性は等尺力にほぼ比例する（図3c）。動的弾性と等尺力については、元の長さの組織がFBSによる刺激とCDの添加に応答した変化を測定した（図3a、図3b）。したがって等尺力と動的弾性の両方とも、再構成した組織の機械的特性のよい指標である。この方法を適用すると、異なる2種類の薬剤を用いてアクチン細胞骨格を破壊することにより引き起こされる組織モデルの力と動的弾性の低下が、投与量に依存していることが明らかになる。それについて以下に説明する。実施例からのデータにより、一軸性引っ張り測定を通じた結合組織モデル（例えば繊維芽細胞マトリックス（FPM））の機械的特性が明らかになる。組織モデルは、歪みの大きさが所定の値であるとき、応力が歪みの指数関数になるという点と、弾性が力に比例するという点で、天然の組織と似ている。

組織モデルの機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与をリング系を用いて明らかにする。

再構成した細胞のアクティベータに対する応答のより具体的なプロファイルを得ることが大いに望ましいため、再構成した組織モデルの機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与を明らかにした。ウシ胎仔血清によって細胞の収縮力を増大させ、CDによってF-アクチンを破壊すると、能動成分と受動成分が得られる。それぞれの成分には、機械的特性に対する細胞とマトリックスの寄与が強く表われている。図19には、20％CSで活性化させることによりあらかじめ引き伸ばした組織モデルについて、力と歪みの関係（a）、動的弾性と歪みの関係（b）が、“合計”と表記した実線で示してある。2μMのCDで処理した後に得られる力と動的弾性の関係を表わす曲線は、“受動”と表記した破線で示してある。合計と受動の曲線の差が“能動”であり、点線で表わしてある。すべての曲線がヒステリシスを示す。“能動”曲線は、歪みの増大ともにほぼ直線的に増加する。“受動”曲線は、ほぼ指数関数的に増大する。動的弾性は0.5Hzで測定した（b）。動的弾性と力が歪みに関してほぼ同じように変化することに注意されたい。第1回目の引っ張りと第2回目の引っ張りで大きな差が出ることを避けるため、これらの測定は、予備引っ張りサイクルを1回だけ行なった後に行なった（図2を参照のこと）。“能動”曲線と“受動”曲線が組織モデルの主として細胞部分とマトリックス部分に依存していることが明らかになった。

細胞とマトリックスの寄与を別々に（かつ十分に）調べる。細胞の寄与は、有効量のアクチン・フィラメント破壊剤を添加することによって細胞の弾性を低下させ、細胞をマトリックスから効果的に分離することによって除かれる。これは、（例えば）破壊剤としてCDを添加することによって実現される。CDは細胞内のアクチン・フィラメント構造を破壊する。これについては後で詳しく説明する。したがって、特に細胞またはマトリックスに対するアクティベータと阻害剤の効果を明らかにすることができる。これら2つの機械的システムを別々に調べられることが、この方法の別の特徴になっている。

CDとラトルンクリンB（LA-B）はアクチン・フィラメント細胞骨格を破壊する2つの薬剤であるため、両方とも収縮力の増大を阻止し、細胞の機械的特性を弱める。CDとLA-Bに対する組織モデルの応答（例えば投与量に依存した機械的特性）を明らかにした。

この明細書では、“等尺力”という用語に、組織の長さまたは組織の物理的サイズが実質的に変化しない力の変化が含まれる。

製造後2日間経った（実験を行なう前の16時間にわたって血清を欠乏させた）組織モデルの等尺力と動的弾性を、ある範囲の濃度のCDについて測定した。測定は、それぞれの組織モデルについて、最低濃度のCDから順番に行なった。それぞれの組織モデルに関し、CDを添加し、力と弾性を測定し、次いでCDの濃度を大きくして次の測定を行なった（図4A、図4B）。CDはDMSOに溶かした。組織モデルを含む有機浴に添加したDMSOの合計量は、DMEMの合計体積の0.1％未満であった。この量のDMSOだと、FPMの力と弾性に有意な効果をもたらすことはなかった。図示したデータは、4つのサンプルについての平均であり、同じ実験を少なくとも2回繰り返した。力と動的弾性は、CDの濃度が2nMと低いときに有意に低下した。共焦点顕微鏡を用いて観察したところ、この濃度では、単層細胞培養物中のローダミン・ファロイジンで染色したアクチン細胞骨格にいかなる効果も観察されなかった。力と動的弾性の両方とも、CDの濃度が2μMになるまで低下を続けた。この濃度で力はほぼゼロになり、弾性はほぼ最小値に達した。CDの濃度が2μMを超えると、弾性がそれ以上大きく低下することはなかった（データは示さず）。力と動的弾性を50％低下させるのに必要なCDの濃度は、ほぼ0.25μMであった。

組織モデルの力学にLA-Bが及ぼす効果を測定することにより、アクチン細胞骨格に対するLA-Bの作用メカニズムとCDの作用モードの違いが明らかになった。LA-Bを増加させつつ添加し、CDの場合のようにして組織モデルに関する物理的測定を順番に行なった。データは少なくとも3つのサンプルについて平均し、同じテストを少なくとも2回繰り返した。FPMの張力と弾性に対して有意な効果をもたらすのに必要なLA-Bの濃度は、必要なCDの濃度よりもはるかに大きかった（図4C、図4D）。

力と弾性は、LA-Bの濃度に対してS字形の依存を示した。力と弾性の値を半分に低下させるための推定濃度は、それぞれ53nMと68nMであった。張力と弾性のLA-Bに依存した低下がLA-Bの濃度の1桁の範囲に限られていたのに対し、CDに対する応答はほぼ3桁にわたっていた。これは、CDとLA-Bが異なるメカニズムで作用してアクチン細胞骨格を破壊することを強く示唆している。CDとLA-Bの上限濃度において、力の値に小さな違いが観察された（図4）。

粘弾性系の場合には、動的弾性は引っ張りに対する弾性抵抗と粘性抵抗の両方に依存する。粘性の寄与は、力と歪みの間の位相角δを測定することによって明らかにできる。

これらのテストでは、アクチン細胞骨格が破壊されるため、位相角δの変化は小さかった（データは示さず）。したがってこの系では、CDとLA-Bは組織の粘性に比較的小さな効果しか及ぼしていなかった。それゆえ組織モデルの力と弾性に対する細胞の粘性の寄与も小さいと仮定することが合理的である。これらの測定からは、力と弾性の測定結果が、アクチン・フィラメント系に対する効果を通じてこれら“阻害剤”の効果をいかに迅速かつ感度よく示しているかがわかる。

マルチウエル・プレート系における押し込み法を利用した本発明の一実施態様では、機械的応答パラメータを、少なくとも100,000個の細胞に関して平均して決定した。再構成した組織モデルに関してこの系を用いて得られた測定結果を、個々の細胞の押し込みによって得られた結果（Petersen他、1982年；Zahalak他、1990年）と比較した。例えば再構成した組織の弾性は、リング系を用いると、個々の細胞に細胞に対して押し込み測定を行なう場合に必要な測定点の10分の1で統計的に有意な測定ができた（図10）。

多くのシグナル伝達経路が、収縮力、細胞骨格の組織化、細胞外マトリックスの完全性を調節することにより、再構成した組織の機械的特性に寄与している。したがって、再構成した組織の機械的特性に対するシグナル伝達経路の効果を本発明を利用して明らかにすることにより、細胞内および細胞外の広範な標的分子を調べることができる。

本発明により再構成した組織モデル中の細胞は、天然の組織および器官の中にあるときの条件と似た環境にある。したがってこの方法を用いたアッセイの結果は、動物モデルを用いた場合に得られるのと似た結果になる。動物でのテストの一部は、組織モデルで代替することができる。例えば皮膚に作用する薬剤のテストの一部は、生きた人工組織を用いて行なうことができる。

一実施態様では、上記の方法を利用して、再構成した組織の機械的特性に毒性物質が及ぼす効果を検出することもできる。例えば本発明の発明者は、10％エタノール溶液が組織モデルの力と弾性を有意に低下させることを見いだした。発明者は、組織モデル中の細胞がウイルスに感染すると、力と弾性が低下する可能性のあることを観察した。したがって上記の方法を利用し、物質と生物材料の毒性効果を明らかにすることができる。

心臓組織モデル

ニワトリ胚から単離した心臓ミオサイトを用いた組織モデルは、自発的に収縮する。自発的に収縮する人工心臓組織を形成するのにニワトリ胚抽出物（CEE、ライフ・テクノロジーズ社、ロックヴィル、メリーランド州）が必要であることが知られている（FASEB J.、1997年7月、第11巻（8）、683〜694ページ；FASEB J.、2000年4月、第14巻（5）、669〜679ページ）。CEEの代わりに心臓繊維芽細胞で条件付けた培地を用いることができる。このならし培地（CM）は、10％FBSを添加したDMEMとともに2日間にわたってあらかじめインキュベートした100mmの皿の中で集密的細胞単層の心臓繊維芽細胞をインキュベートすることによって得た。この培地を無血清DMEMに変更し、24〜48時間にわたってインキュベートすることによりCMにした。10％FBSを添加したCMとともに培養した心臓組織モデルは、CEEをまったく添加しなくても4〜5日後に自発的に収縮を始める。組織モデルの中で増殖した心臓ミオサイト（図5A）は、10％FBSだけを含むDMEMで培養したもの（図5B）よりはるかによく広がる。同様の違いが、組織培養皿で増殖する細胞でも観察される。CMの中で培養した心臓ミオサイト（図5C）は、10％FBSだけを添加したDMEMで培養したもの（図5D）よりも広がり、より広い面積をカバーする。これは、繊維芽細胞から分泌された因子が、心臓ミオサイトの広がりを促進することと、自発的な収縮を促進することを示唆している。心臓ミオサイトを広がらせて自発的に収縮させる培地の条件付けは、心臓組織モデルを培養する組織培養皿の底部で単層の心臓繊維芽細胞と共存培養することによっても実現できる。心臓組織モデルの自発的収縮を促進する培地の条件付けは、心臓繊維芽細胞を含む結合組織モデルと共存培養することによっても実現できる。繊維芽細胞をミオサイトと混合して心臓組織モデルを形成することもできる。すると4〜5日後に強い収縮が起こるが、培養後7〜8日という早い段階で自発的収縮が停止する。図5に付属する表に示したさまざまな条件に関する説明を参照のこと。

マウスの細胞を含む心臓組織

胚段階の心臓をE17-E19段階のマウス胚から取り出す。37℃にて15分間にわたってトリプシン（0.25％）で処理した後にコラゲナーゼ（167μg/ml）で何回か消化せさせることにより、心臓ミオサイトを単離する。心臓から単離した細胞を組織培養グレードのプラスチック製の皿で1時間にわたって培養し、その組織培養グレードの皿への接着速度を手がかりにして非筋細胞を取り除く（非筋細胞は筋細胞よりもはるかに早く接着する）。接着しない細胞を培地とともに取り除き、低速の遠心分離で15分間にわたって沈殿させる。人工組織1mlにつき100万個のミオサイトを、適切な量のNaOH（0.1N）を添加することによって中和した酢酸（0.02N）の中に入れたラットの尾のコラーゲン0.75mg、およびリン酸緩衝溶液に入れたフィブリノーゲン0.25mgと混合した。培地の最終濃度を通常の値に維持するため、より大きな濃度（1倍超）の組織培地（DMEM）をサンプル溶液に添加する。トロンビン1ml（1単位/ml）も溶液に添加し、フィブリンの形成を開始させる。フィブリノーゲンが変化したフィブリンがコラーゲンと重合し、より強いゲルを形成する。そのためサンプルの取り扱いが容易になる。サンプル溶液0.5mlを上記の鋳型に注ぎ、組織培養インキュベータ（5％CO2、37℃）の中で30分間にわたってインキュベートする。ゲルを鋳型から取り出し、スペーサとともに培養する。スペーサは、ステンレス鋼製のブロックによって隔てられたステンレス鋼製の2本の棒（直径約1mm）である（図6）。5〜7日間にわたってインキュベートした後、胚ミオサイトをコラーゲン／フィブリン・ゲルの中に広げ、自発的に収縮させる。細胞が互いに接触し、同期した収縮が始まる。

マウス胚の心臓組織を撮影した一連の画像を図7に示してある。画像内の特徴的な暗い部分を長方形の枠で囲んである。それぞれの画像の枠は固定されている。特徴的な部分が周期的に枠の外に移動することが画像10と28に白い矢印で示してあるが、これは、心臓ミオサイトによってサンプルが収縮することを意味している（図7）。

マウスの細胞を用いてマウスの心臓組織の機械的特性を真似るように作ったインビトロの組織モデルは、医薬候補の効果を評価するのに有効なテスト系である。マウスの特定の遺伝子をノックアウトするというよく確立された方法により、心臓のいろいろな機能を調節する特定の分子が欠けた変異マウスが大量に作り出されている。例えばタイプ1のNOシンターゼが欠けたマウスを用いた研究（Circulation、2002年6月25日、第105巻（25）、3011〜3016ページ）、コネキシン43が欠けたマウスを用いた研究（Development、2002年4月、第129巻（8）、2031〜2042ページ）、家族性肥大型心筋症と関係のあるミオシン結合タンパク質Cが欠けたマウスを用いた研究（Circ. Res.、2002年3月22日、第90巻（5）、594〜601ページ）は、2002年に発表されたほんのわずかな例である。ノックアウト・マウスからの細胞を用いて心臓組織モデルを作り、心臓の発達と機能に関する特定のタンパク質分子の役割を研究することができる。多くのノックアウト・マウスは、誕生後生き延びることがない。あるいは所定の胚段階を超えて生き延びることがない場合さえある。したがってこれらノックアウト・マウスの心臓機能の研究には限界がある。マウス胚または新生マウスから単離した細胞を用いて機能的組織を作ることができるため、完全な組織または一匹の動物全体を用いた場合には不可能な分子の機能をこの系を用いて研究することができる。ノックアウト・マウスの研究は、インビトロで遺伝子治療の効果を研究するのに役立つ。

組織モデルのミニチュア化

通常使用される鋳型（図8Aと図8Bの右側）の代わりにそれよりも小さな鋳型（図8Aと図8Bの左側）を用いてサンプルをミニチュア化する。サンプルのサイズは、心棒の直径とウエルの内径によって決まる。部品を組み立てる前の鋳型（A）と組み立てた後の鋳型（B）を図8に示してある。小さなサイズの鋳型とレギュラー・サイズの鋳型の心棒の直径は、それぞれ3/16インチと3/8インチである。小さなサイズのウエルとレギュラー・サイズのウエルの内径は、それぞれ9/32インチと17/32インチである。小さな鋳型を用いることにより、組織のサイズが体積にして5分の1になる（1mlが0.2mlになる）（図8Cと図8Dの*は、組織サンプルを示している）。組織モデルをミニチュア化することにより、レギュラー・サイズのサンプルを用いた図2、図3、図4、図15、図16、図17、図18、図19、図20、図21、図23に示したのと同様のテストをより少量の培地を用いたはるかに小さな有機浴の中で行なうことができるため、テストで使用する化合物はわずかしか消費されない。サンプルの体積を少なくとも5分の1にすることができる。

この考え方が正しいことを確かめるため、血清とY27632による処理に対する心臓組織モデルの機械的応答を観察した（図9）。レギュラー・サイズの鋳型を用いてニワトリの心臓細胞で組織モデルを作った（図9a）。この組織モデルは、全体として図8Dに示した組織モデル（*で示す）と似ている。図9bにも、図8Cにおけるのと似たミニチュア化した組織で得られた力についての似たような軌跡が示してある。両方のサイズの組織において、20％(v/v)コウシ血清に応答して力が増大し、Y27632で処理することによって力が低下する。組織のサイズが異なっていても、これら薬剤に応答した変化の大きさの違いは2倍を超えない。これは、ミニチュア化した系が、医薬候補によって誘導される変化を検出するのに十分な大きさのシグナルを有することを示している。ミニチュア化した系でも、機械的引っ張りに対する力応答曲線は、レギュラー・サイズの組織の力応答曲線と似たものになる。ニワトリの心臓細胞を用いたミニチュア化サンプルは収縮力を示す。したがってこのシステムを用い、心臓の機能不全を治療するための医薬候補の効果をテストすることができる（図9bの中の挿入図）。

複数細胞押し込みシステムにおける組織モデルの測定（マルチウエル・プレートを使用）

再構成した組織サンプルのミニチュア版を製造して測定を行なった。そのとき、再構成した組織からなる膜とストリップを96ウエル・プレート・システムのウエルに入れたものを用いた。

マルチウエル・プレート・システムの組み立て

直径1mmのステンレス鋼製ワイヤーでできた三角形のフレームを足場として用い、その上に再構成した組織を形成した。ウエルを底部に向けてわずかに先細にし、フレームをウエルの底から1mm上方にしっかりと固定する（図11a）。細胞と上記の適切な細胞培地を含む重合していないコラーゲンの溶液をウエルに注ぎ、底から3mmのレベルまで満たした（図11b）。96ウエルのプレートを5％CO2のもとで37℃にてインキュベートした。培養中に細胞が多孔性コラーゲン・マトリックスから液体を押し出してそのコラーゲン・マトリックスを圧縮した。ワイヤー・フレームがないと、再構成した組織は収縮して小さな球になり、組織培地内を浮遊する。コラーゲン・マトリックスは、さまざまな形状のワイヤー・フレームを用いて圧縮することにより、フレームの形状に対応した形にできることがわかった。例えば三角形のワイヤー・フレームの三辺に膜がまたがっている様子が図11aに示してある。図11bに示したようにワイヤー・フレームが別の形だと、異なる幅の組織ストリップになった。非ステンレス鋼からなる多孔性でないワイヤーの表面に組織を付着させる場合でさえ、組織を容易に付着させるのに多孔性支持体材料（例えばベルクロ社のファスナー）は必要でなかった。コラーゲンは、膜またはストリップの外側部分でより多く圧縮された。したがって膜のこの外側部分は、細胞によって生じる応力に耐えることができ、ワイヤー・フレームから膜を引きちぎろうとする応力の発生を防止することができる。

（ウエル・プレート・システムにおいて）押し込み法を利用した、膜またはストリップの力、弾性、ヒステリシスの測定

テスト薬剤に対する組織モデル・サンプルの応答を調べるため、力変換器に接続されたプローブを用い、引っ張りに対する組織サンプルの抵抗力を測定する。組織の弾性は、プローブが組織と接触したときにそのプローブを所定の量だけ移動させるのに必要な力と関係している。先端部を火仕上げすることによって滑らかにした鉛直なガラス管からなるプローブは、等尺式力変換器に取り付ける（既述）。プローブの直径は約2〜3mmであり、その先端部の形状は平坦または半球形にすることができる。このプローブは、梁にしっかりと取り付け、梁は力変換器に接着剤またはワックスで付着させる（図11a）。力変換器は静止フレームに取り付ける。96ウエルのプレートを、鉛直方向に移動するステージの上に載せる。このステージは、本発明の方法の正しさを証明するためのものであり、マイクロメータを利用している。このマイクロメータは、コンピュータ制御されたステッピング・モータによって駆動されて、所定の増加率でステージを上下させる。この実施態様では、ステージの運動範囲は、500μm/秒の最大速度で0mm〜15mmである。組織の物理的測定を大規模に行なうのに同じ装置が利用されている。力の測定に関しては、次のセクションでさらに詳しく説明する。

（ウエル・プレート・システムにおいて）押し込み法を利用するための組織系サンプルの調製

組織形成中と組織モデルの培養を継続している間、サンプルを、10％FBSと、ペニシリンと、ストレプトマイシンを添加した炭酸水素塩緩衝DMEMとともに、5％CO2の状態になったインキュベータの中で37℃に維持した。力を測定するため、培地を変更して150μlの無血清ヘペス緩衝DMEMにした。温度制御された循環浴に接続された加熱プレートの上にウエルを置くことにより、培地の温度を37℃に維持した。

（ウエル・プレート・システムにおいて）組織押し込み法を利用した測定

プローブの先端が再構成した組織からなる膜またはストリップと接触するまでステージを上昇させる。先端がサンプルと接触したことは、等尺式力変換器に記録される力が突然大きくなることによってわかる。次にステージを5μm下げる。すなわち、先端をサンプルとの接触位置から引っ込める。次に、ステージを鋸歯波形に従って3.3μm/秒の速度で鉛直方向に100μmの振幅で移動させる。このような軌跡を描いている間に先端が組織サンプルと接触してサンプルを引っ張ると、力がデータ記録装置に連続的に記録される。速度は、測定の感度が最適な状態でサンプルの粘性が測定できるように変えることができる。

最大応力が安定レベルに達した後、サンプルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で刺激する（図12aの矢印）。この量のFBSによって繊維芽細胞の非筋肉ミオシンが活性化されて収縮力が生まれ、再構成した組織が硬化する。FBSを添加した約10分後、次の押し込みによる最大応力が約25％増加する（図12a）。培地に40nMのCDを添加（矢印b）した約15分後、次の押し込みによる最大応力が最初のレベルから約40％低下した（図12）。2μMのCDを添加した20分後に最大応力のさらなる低下が記録された。

膜が引っ張られている間の押し込みの深さと力の関係をプロットした曲線は、プローブがサンプルから離れることによって応力が解放されるときに見られるのとは異なった軌跡を描く。そのため2本の曲線の間にヒステリシス領域ができる。図12bでは、FBSまたはCDを添加したときのヒステリシス領域の違いを比較してある。上記実験中の最大応力とヒステリシスの面積の違いを図13に比較して示してある。ヒステリシスの面積は、ミオシンの活性化とCDの添加によって硬化が起こったときに大きく変化する。したがってヒステリシスの面積は、サンプルの機械的特性の変化をモニターするためのパラメータとしては最大応力よりも感度がよい。

引っ張りなしで力の応答を活性化させるための生理学的アクティベータを用いたテスト

ラット胚の繊維芽細胞に由来する細胞系（REF52）を用いて作ったリング状サンプルを、すでに説明したようにして調製した。テスト中、組織の長さを一定に維持した。図15に示したそれぞれの薬剤を単一のリング状組織に添加した。トロンビン、バソプレッシン、リゾホスファチジン酸（LPA）、ブラジキニン、エンドセリンがリングと接触すると、異なる応答時間で異なる力が発生した（図15）。ノルエピネフリンとフェニルエフリンはリングの収縮を緩和させた。すなわちノルエピネフリンとフェニルエフリンは、それぞれのテストの開始時に現われる組織の力の初期ベースライン値を低下させた（図15）（使用した試薬はシグマ社、セントルイス、ミズーリ州から入手する）。

ニワトリ胚の心臓繊維芽細胞（CECF）と成熟ラットの心臓繊維芽細胞（RACF）を用いて作ったリング状サンプルにさまざまなアゴニストを適用し、収縮力の応答プロファイルを得た。それを図16a〜図16dと、図16e〜図16hにそれぞれ示してある。

RACFはバソプレッシン（図16f）とアンギオテンシンII（図16g）に反応したのに対し、CECFはバソプレッシン（図16a）とアンギオテンシンII（図16c）には反応しなかった。CECFは、投与量に関係なくEGFによる刺激に反応しなかった（図16d）。エンドセリンの刺激により、CECF（図16b）で作ったリングとRACF（図16h）で作ったリングの両方が収縮した。FBS（20％v/v）の添加後に時間変化する力のプロファイルは、どのようなアゴニストで予備処理するかによって異なっていた。

例えばEGFで予備処理した後には、FBSを添加することにより力にピークが2つ現われた（図16d）。アンギオテンシンIIで予備処理したシステムにFBSを添加した後は力のレベルが維持される。しかしバソプレッシンとエンドセリンで処理した後には、力のレベルがFBSで刺激したときのピークのレベルから低下を始めた（図16a、図16b）。

本発明は、単一の化合物のプロファイルだけでなく、同時または異なるときに適用された多数の化合物の組み合わせのプロファイルを管理するのに役立つ。多数の医薬品の組み合わせのプロファイルを管理しておくと、スクリーニングを行なう上でも、多数の医薬品の組み合わせによって起こる予想外の結果を明らかにする上でも役に立つ。

ミオシンのATPアーゼ阻害剤であるBDMは、以前に添加した20％FBSによる十分に活性化された収縮力を投与量に依存した形で低下させる（図17）。

マトリックスがリモデルし圧縮されている間にリング状サンプルから発生する収縮力は、すでに説明したように、コラーゲンがゲル化してから約1〜2時間以内にそのリングを力測定装置に接続することによって測定できる。細胞は、この時間が経過した後にマトリックスに力を及ぼし始める。次に、組織が増殖している間（リモデリングと圧縮の間）の力の増加を、時間を追って観察する。

リング状組織が増殖している間に測定した力のプロファイルを図18aに示してある。一般に15〜20時間以内に力が最大値に達する。図18b、図18c、図18dに示したように、このプロセスはいくつかの阻害剤によって阻止された。tチロシンキナーゼ阻害剤であるハービマイシンA（図18b）は、微小管を破壊するノコダゾールという試薬（図18c）と同様、力の最大値を低下させる。サイトカラシンD（2μM）は、テストの最初から力の増加を完全に抑えた。

本発明には広い用途がある。例えば本発明を利用した医薬品の高スループット・スクリーニングや治療法のテストがある。例えば再構成した組織を膜またはストリップの形状にしたものを大量生産して均一な96個のサンプルにし、そのそれぞれを96ウエルのプレートの各ウエルに供給することができよう。4台以上の力変換器を用いて力の測定を同時に行なうこともできよう（図11）。96ウエルのプレートを、押し込み測定のためにサンプルを正確な位置に配置するx-yステージに載せる。力変換器に接続したプローブは、サンプルを押すために鉛直方向に移動する（図11a）。x-yステージを用いて96ウエルのプレートを再配置することにより、単一の力変換器を用いて短時間のうちにいくつかのサンプルを押すことができる。サンプルに対する化合物と小さなペプチドの添加、ステージの移動、力変換器はすべて、パーソナル・コンピュータで自動化して制御することができる。コンピュータは、データベースへのデータの記憶と、そのデータの解析にも使われる。

この明細書で利用可能なさまざまな方法を利用し、薬剤としての遺伝子とタンパク質を、再構成した組織の細胞に届けることができる。

プレート1つ当たりのウエルの数は、押し込み装置で使用する系のサイズに応じて異なっていてもよい。一般に、プレート1つ当たりのウエルの数は約2〜約1000であるが、約50〜約500であることが好ましい。

この方法の応用としては、薬剤のスクリーニングに加え、遺伝子を薬剤として細胞に届けるための方法のテストがある。細胞および組織の機械的特性に寄与する遺伝子が欠けた細胞を用いて再構成した組織サンプルを作ることができる。したがって正常な組織の機械的特性が回復することで、遺伝子が効果的に届いたことがわかる。

リング状組織モデル系は、コラーゲン・マトリックスの圧縮およびリモデリングの間と、コウシ血清に応答している間の両方で、細胞が力を発生させる能力に遺伝子の欠失が及ぼす効果を検出することができる。細胞は、その表面の膜に存在する特定のヘテロ二量体受容体（インテグリンと呼ばれる）を通じてさまざまなECMの構成要素と相互作用してその構成要素に接着する。それぞれのインテグリンは、1つのαサブユニットと1つのβサブユニットで構成されている。コラーゲンへの結合に関与するインテグリンは、α1β1とα1β2である。NMuMGは、不死化されているが悪性ではないマウス乳腺上皮細胞系であり、α1インテグリンとα2インテグリンを発現しない。したがってこの細胞はコラーゲン・マトリックスと相互作用するとしても弱く相互作用するため、力をECMに伝達して組織の弾性を生じさせてその弾性を維持することはできない。図20から、α1インテグリンとα2インテグリンがない細胞は、組織の増殖中にベースライン以上の力を出すことがなく、コウシ血清（CS）に反応して力を増大させることもないことがわかる（図20a、図20b）。また、正常なα2インテグリンを再び発現させることにより、これら2つの機能が回復することも示されている。α2遺伝子を含む細胞はマトリックスに正常に接着してマトリックスを圧縮し、CSに反応する（図20a、図20b）。この例は、遺伝子の発現を示す機械的応答のプロファイルを発生させて管理するのに本発明を有効に利用できることを示している。したがって本発明は、遺伝子型の指標および遺伝子治療の結果（例えば遺伝子を到達させるさまざまな方法の効率）の指標として機械的応答のプロファイルを管理するのに役立つ。

再構成した組織モデルは、異なった多数のクラスの潜在的医薬品、毒物、病原体が薬剤として細胞やマトリックスの機械的特性に及ぼす効果を定量的かつ迅速に評価するのに用いることができる。機械的特性は、機械的システムとしての細胞の全体構造（特に細胞骨格）の一般的な指標、シグナル伝達経路の動作の一般的な指標、組織が増殖しているときに細胞がマトリックスに取らせる構造の一般的な指標となる。したがって機械的特性を広範な疾患で利用できる可能性がある。

潜在的医薬候補をテストした実施例

高血圧の治療において有望なY27632を用い、再構成した組織において応力が投与量に依存して緩和されることを確かめた。

NIH 3T3細胞を用いて作った結合組織モデルをさまざまな量の薬剤候補Y27632で処理した。ρキナーゼ特異的阻害剤Y27632はこれまでにテストされており、平滑筋ストリップ（例えばウサギの大動脈輪）の張力を低下させることがわかっている（Nature、第239巻、1997年、990〜993ページ）。Y27632は、高血圧を治療するための将来的に有望な薬剤候補の1つである。組織の収縮を刺激するのにどのアゴニストを用いるかに応じ、歪低下の程度が異なる（図21）。Y27632は、投与量に依存した形で結合組織モデルの張力を低下させる（図21）。これは、この方法が医薬候補をスクリーニングするのに有効であることを示している。

組織内のコラーゲンは、マトリックス・メタロプロテアーゼ（MMP）と呼ばれる酵素ファミリーによって分解されてリサイクルされる。この酵素は、潜在的なプロ酵素として分泌されるが、アミノ末端領域がタンパク質分解によって開裂することにより活性化する。その活性は、Zn²⁺とCa²⁺が存在しているかどうかに依存する。MMP-2の活性は、腫瘍細胞の浸潤においてある役割を果たしていることが知られている。プロ形態であれ活性化形態であれ、MMPが存在していることは、一般にザイモグラフィとして知られる方法で検出される。ニワトリの心臓繊維芽細胞を、コウシ胎仔血清なしのDMEM、または0.5％コウシ胎仔血清を添加したDMEMとともに2日間にわたって培養する。MMP-2とMMP-9が細胞から分泌されて培地に入るため、その存在がザイモグラフィによって検出される。図22では、対照レーン11〜15にMMP-2とMMP-9のプロ酵素を精製したものを充填してある。この図は、少なくとも0.5ngの酵素（レーン11）があればアッセイによって検出可能であることを示している（図22）。より少量の活性な酵素がプロ酵素よりも前の位置に存在し、活性な酵素のバンドが、不活性なMMP-2のバンドよりも下の位置に出現している。コーティングなしの組織培養皿、あるいはフィブロネクチンまたはコラーゲンによるコーティングのある組織培養皿の上で増殖している細胞によって条件付けられた培地では、活性な酵素のバンドがまったく現われない。3Dコラーゲン・マトリックス（すなわち組織モデル）中で増殖する細胞で条件付けられた培地では、活性なMMP-2のバンドが見られる（レーン9と10）。これは、2D基板上の細胞は不活性な酵素を培地の中に分泌するが、その酵素の活性化は起こらないことを示している。酵素は、細胞が3次元マトリックスの中で増殖するのでなければ決して活性化されることがない。したがって、腫瘍が浸潤している間などに細胞外マトリックスの分解に影響を与えるMMPの活性を調べるには、モデル系として、例えば細胞が3次元マトリックスの中で増殖する組織モデルが必要である。これは、MMPの阻害剤を発見する上で特に重要である。

MMPの一般的な阻害剤であるGM6001（バイオモル・リサーチ・ラボラトリーズ社、プリマス・ミーティング、ペンシルヴェニア州）（N-[(2R)-2-(ヒドロキサミドカルボニルメチル)-4-メチルペンタノイル]-L-トリプトファンメチルアミド）が人工組織の機械的特性に及ぼす効果がこれまでに調べられている。心臓繊維芽細胞を用いて作った組織モデルを50μMのGM6001とともに6日間にわたってインキュベートする。組織培養培地に対し、GM6001を含む新鮮な培地を2日ごとに補充する。リング状組織モデルに対して上記のような機械的テストを行なう。GM6001で処理したサンプル（図23の破線）では、対照（実線）と比べて機械的特性が有意に低下する。さまざまなMMPに関するGM6001のKi値はほぼナノモル/lであるが、動物におけるGM6001の効果は、この阻害剤が高濃度（0.1ミリモル/lのオーダー）のときにだけ観察することができる（Circ. Res.、1996年1月、第78巻（1）、38〜43ページ）。これは、精製した系で測定したKi値が、生きた被験対象（例えば動物や組織モデル）における薬剤の抑制効果とは直接関係していないことを示唆する。さまざまな組織モデルの機械的特性に影響を与えるMMP阻害剤は、高スループットの系を用いると効率的に発見することができる。

本発明には他の多くの用途がある。心臓疾患を治療するためのガイドにするため、心臓ミオサイトおよび／または心臓繊維芽細胞から再構成した組織モデルを利用し、過大な圧力によって発生する細胞やマトリックスのリモデリング・プロセスに対して医薬候補が及ぼす効果や、外傷や梗塞に応答して起こる組織の再構成に対して医薬候補が及ぼす効果をテストすることができる。本発明は、歯の結合組織の疾患、がんの転移（収縮、細胞の運動性における牽引力）、糖尿病（コラーゲンの架橋による結合組織や皮膚の硬化）、肺疾患（例えば気腫）、慢性の炎症（好中球から分泌されるエラスターゼ）、筋ジストロフィー、皮膚の老化を治療するためのガイドとして利用することができる。

本発明には、医薬品のライブラリを管理する方法も含まれる。この方法は、医薬品を組織モデルと接触させることによりその医薬品を組織モデル系と接触させたときの機械的応答のプロファイルを取得し、そのプロファイルをデータベースに記憶させ、組織モデル系における別の医薬品の少なくとも1つの追加プロファイルをそのデータベースに記憶させ、1つのプロファイルを別のプロファイルと比較するための手段を設定し、あらかじめ確立した比較法または手順が整った標準的な比較法に基づき、第1の薬剤のプロファイルを第2の薬剤のプロファイルと比較する操作を含んでいる。医薬品は、それぞれのプロファイルに基づき、組織モデル系に対する機械的効果に関する活性の順序に従ってランク付けする。

曲線を分析するための可能なパラメータ

アゴニストの添加によって始まる力の応答を時間軸に従ってプロットしたグラフは、曲線の形を記述するいくつかのパラメータを用いて表わすことができる。F0とΔFmaxは、それぞれ、アゴニストを添加する前の最初の力のレベルと力の変化の最大値を表わしている。ΔTmaxは、力のレベルが変化し終わるまでに要する時間を表わす。力曲線の時間微分は、力の時間変化率を表わす。dF/dtの最大値Vmaxは、力曲線の最大勾配を表わす。これらのパラメータは、医薬候補について、人工組織の張力レベルの変化に関するプロファイルを作るのに役立つ（図24）。

一実施態様では、医薬候補のプロファイルを既知の医薬品のプロファイルと比較し、その比較結果に基づいてランキングの作成または評価を行ない、医薬候補が効果的な医薬品になりそうかどうかの情報およびガイダンスを提供する。

さらに、望むのであれば、本発明に従ってテストを行ない、特定の疾患に関与することが知られている特定の細胞系に関して医薬候補を評価する。この実施態様では、本発明のシステムを用いた細胞応答を利用し、医薬候補が特定のタイプの細胞に対して示すはずの活性の指標を提供する。さらに別の実施態様では、医薬品を組織モデル系において評価し、特定の疾患を治療するのに有効であることが知られている医薬品の評価と比較する。

さらに別の実施態様では、既知の医薬品のプロファイルは、既知の疾患に対して有効な治療法となることがわかっているプロファイルである。この実施態様では、特定の疾患に関係することが知られている細胞でその医薬品を評価して比較を行なう。この実施態様は、ある医薬品が、例えば心臓疾患、高血圧、老化を治療する上で潜在的に有効であるかどうかを明らかにするのに役立つ。

高血圧は、血管の収縮性と弾性が大きくなることによって発生する。高血圧のための薬剤は、本発明を利用して同定することができる。そのような薬剤を用いると、動物の血圧を低下させたり、動物から取り出した血管の張力や弾性を低下させたりすることができる。本発明では、培養した細胞や細胞外マトリックスからなる組織を用いて血管を模倣した人工組織を利用する。そのため本発明の方法をモデル動物または移植された組織の代わりに用いることができる。

特定の生物機能またはさまざまなタイプの器官や組織（例えば皮膚、筋肉、心臓、血管）を模倣した人工組織を作ったり、単一の人工組織の中で異なったタイプの細胞を共存培養することでより複雑な組織を模倣した人工組織を作ったりする。組織の機械的特性は、本発明を利用して構造の完全性と関係付けることができるため、組織または器官の生物機能を示す重要なパラメータである。

さらに、本発明を利用すると、人工組織の機械的特性に影響を与える生物活性に基づいて化合物を素早くスクリーニングすることができる。例えば96ウエルのプレートのウエル（直径4mm、高さ6mm）の1つにフィットするような小さなサイズの人工組織を作る。非常にミニチュア化したサンプルを調製すると、それぞれのテストで使用する化合物の量が、既知の方法（例えば大動脈輪を用いた方法）と比べて少なくとも90％少なくなる。動物の組織は動物から外科的に取り出すため、サイズにしても薬剤に対する応答にしても、必ずしも再現性のあるものにならない。

本発明の方法を利用すると、医薬化合物の毒性を明らかにすることができる。例えばさまざまな量のエタノールは、生細胞によって維持されている力のベースラインを低下させる。

別の実施態様では、組織モデルを含む細胞やマトリックスの生物学的特性を例えば蛍光マーカーを用いて光学的に測定する。

本発明を利用すると、生きた人工組織の機械的特性に及ぼす効果に基づいて医薬品のプロファイルの新しいライブラリを作ることができる。押し込みシステムを用いた本発明によって作られるライブラリに含まれる活性化合物の数は、試験管に基づく従来のスクリーニング・システムで作られたライブラリに含まれる活性化合物の数よりも少なくなる可能性が大きい。化合物のスクリーニングによって選択される化合物の中には、生理学的応答を誘導する多数の化合物が含まれている可能性がある。

人工組織をベースとした系によってスクリーニングした化合物は、動物やヒトの本物の組織や器官の機械的特性に対して同様の効果をもたらす可能性がより高くなろう。したがって、高スループット・スクリーニングに基づいた人工組織を用いると、薬剤をスクリーニングして最適なものを見つける段階でモデル動物を利用することが顕著に少なくなる可能性がある。培養細胞から構成した生理学的応答システムを本発明で提供することにより、動物でのテストに代えることができる。

別の実施態様では、スクリーニングの結果を利用して1つ以上の医薬候補または薬剤を同定し、その医薬候補または薬剤に対してさらにテストまたは評価を行なう段階へと進む。その結果、その医薬候補または薬剤を市販できるようになる可能性もある。別の実施態様では、医薬品または医薬候補に関するテストまたはスクリーニングを終了させるために、あるいはテストまたはスクリーニングの方法を変更するために、スクリーニングの結果を利用する。別の実施態様では、この明細書に記載した方法と装置を利用し、薬剤または医薬候補の標的または到達位置を評価し確認する。

本発明を具体的なさまざまな実施態様に関して説明してきたが、当業者であれば、請求項の精神ならびに範囲を逸脱することなく、本発明に対して変更をなしうることが理解できよう。

参考文献：
1．Petersen, N.O.、W.B. McConnaughey、E.L. Elson、1982年、「局所的に測定した細胞変形性が、細胞上の位置、温度、サイトカラシンBにどのように依存するか」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、第79巻、5327〜5331ページ。
2．Sundberg, S.A.、2000年、「高スループット・スクリーニングと超高スループット・スクリーニング：溶液をベースとした方法と細胞をベースとした方法」、Curr. Opin. Biotechnol.、第11巻、47〜53ページ。
3．Zahalak, G.I.、W.B. McConnaughey、E.L. Elson、1990年、「細胞を押すことによる細胞の機械的特性の測定と、白血球への応用」、Journal of Biomechanical Engineering、第112巻、283〜294ページ。

繊維芽細胞マトリックス（FPM）（生組織モデルを含む）を調製して測定する方法の概略図である。この図には、調製して測定する方法全体の一例が示してある。 引っ張りに対する組織モデルの応答と、1つのFPMに対して4回の引っ張りサイクルを適用して得られたプロファイルの時間変化が示してある。この図のプロファイルでは、1回目の引っ張りサイクルにおいて、その後のサイクルよりもピークが実質的に大きくなっていることがわかる。この図のプロファイルbは、2つのFPMについて力の応答を測定した結果であり、測定結果の再現性がよいことがわかる。 組織弾性を細胞が発生する力の関数として示したグラフである。図3aは、ウシ胎仔血清による活性化に応答して力と動的弾性がどのように変化するかを示している。図3bは、2μMのサイトカラシンD（CD）によってアクチン細胞骨格が破壊されるときに力と動的弾性がどのように変化するかを示している。図3cは、図3aと図3bの両方からのデータをまとめた図であり、全体として動的弾性が力にどのように依存しているか（比例していること）を示している。 収縮力と動的弾性がCDとラトルンクリンB（LA-B、カルバイオケム-ノヴァバイオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の濃度にどのように依存するかを示している。図4Aと図4Bは、さまざまな濃度のCDで処理した後に組織モデルが発生する収縮力と弾性をそれぞれ示している。図4Cと図4Dは、さまざまな濃度のLA-Bで処理した後に組織モデルが発生する収縮力と弾性をそれぞれ示している。 さまざまな組織培養条件のときに心臓ミオサイトがどの程度広がるかを示している。図5Aは、心臓繊維芽細胞を用いて調製したならし培地の中に作った心臓組織モデルの中に心臓ミオサイトがよく広がっている様子を示している。10％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した心臓ミオサイトは、図5Bに示したようによく広がらない。ならし培地ありの場合となしの場合に組織培養皿の上で培養した心臓ミオサイトをそれぞれ図5Cと図5Dに示してある。図5に示した付属の表には、さまざまな培養条件で作った心臓組織モデルの自発的収縮能力が示してある。 図1cと図1eに示した鋳型から組織モデルを外した後にその組織モデルを培養するのに用いるステンレス鋼製スペーサである。 マウス胚の心臓に由来する細胞を用いた心臓組織モデルの自発的収縮を撮影し、得られた画像を時間軸に沿って並べた図である（1〜32の間隔はそれぞれ200ミリ秒）。 レギュラー・サイズと小サイズの組織用鋳型と組織モデルの写真である。図8Aは、小サイズとレギュラー・サイズの鋳型を分解した状態であり、図1eにその概略が示してある。図8Bは、小サイズとレギュラー・サイズの鋳型を組み立てた状態であり、図1cにその概略が示してある。図8Cは、小サイズの鋳型を用いて作った小サイズの組織モデルがスペーサによって保持されている状態の写真である。図8Dは、図6に概略を示したスペーサによって保持されているレギュラー・サイズの組織モデルについての写真である。 上記の鋳型を用いて作った小サイズとレギュラー・サイズの心臓組織モデルで観察された力の変化を比較した結果である。図9aに示した力の時間変化は、レギュラー・サイズの型を用いて作った心臓組織モデルで観察される。引っ張りとY27632（ρキナーゼによるミオシン活性化の阻害剤）を用いた処理に応答した力の時間変化を図9bに示してある。図9bに挿入されている図は、サンプルを引っ張ることによってサンプルが自発的に収縮しているときの力の時間変化をプロットした拡大図である。 再構成した組織をリングにする方法（左側）と単一の細胞を押す方法（右側）を用いて組織の弾性を測定した結果の違いを比較した図である。 図11aは、直径約1mmのステンレス鋼製ワイヤーからなる三角形のフレームと図11bに示した長方形（代わりの形）のフレームを用いた高スループットのシステムを示している。これらのフレームが足場用支持体となってその表面に再構成した組織が形成され、押し込み法で組織の収縮力と弾性を測定する際のサンプルとなる。 収縮力のピークが安定レベルに達した後に組織モデルを20％ウシ胎仔血清（FBS）で活性化する（図12aの矢印）と力が増大することを示している。この量のFBSで繊維芽細胞の非筋ミオシンが活性化する。図12bは、図12aと同様のデータであり、力と押し込みの深さの関係をプロットしたグラフである。40nMのCDと2μMのCDを添加した効果も示してある。 図13（a）、図13（b）、図13（c）は、図12と関係しており、組織の最大応力とヒステリシスの面積（単位は任意）の変化を示している。 再構成した組織からなる膜を押したときの力の応答を示している。96ウエルのプレートのウエル内の小さな膜を繰り返して押した（それぞれのピークは1回の押しを表わす）。押したときの力の応答を70分間にわたって記録した。10％FBSを添加してミオシンを活性化させると押したときのピークが上昇した。それに対してサイトカラシンD（CD）は、アクチンの細胞骨格を破壊することにより、投与量に依存した形でピークを低下させた。（力のスケールはゼロから始めなかった。） 平滑筋を用いたリング系の組織モデルにアゴニストを何種類か添加した一連のテストで得られた力（ダイン）を示している。パネルa、b、c、d、e、f、gは、それぞれトロンビン、バソプレッシン、LPA、ブラジキニン、エンドセリン、ノルエピネフリン、フェニルエフリンで処理した場合の力の応答のプロファイルを示している。 ニワトリの心臓繊維芽細胞（パネルa〜d）とラットの心臓繊維芽細胞（パネルe〜h）で作ったリング系の組織モデルに対して一連のアゴニストを添加した場合の収縮力の応答プロファイルを示している。 最初に20％FBSで刺激したミオシンの収縮を抑制することにより、収縮力が低下することを示している。この図は、すでに20％FBSで刺激した収縮応答が、さまざまな濃度のブタン-ジオン-モノオキシム（“BDM”）によって抑制されることを示している。パネルa、b、c、dは、それぞれ2、4、20、40mMのBDMで処理した場合を示す。 化学薬品による処理なし（a）、ハービマイシンAで処理（b）、ナコダゾールで処理（c）、サイトカラシンで処理（d）の場合にリング系で組織が増殖している間に収縮力のプロファイルを示している。リングは、コラーゲンがゲル化した約1時間後、かつ細胞によるマトリックスのリモデリングと圧縮が顕著に起こる前に力測定システムに取り付けた。 図19aは、FBSで刺激した後にリング系の組織モデルで測定した力が歪みにどのように依存するかを示している（“合計”と表記）。次にこのリング系を2μMのCDで処理してから測定を行なうと、“受動”と表記した曲線が得られる。合計と受動の差を“能動”と表記する。図19bは、同じ測定から得られた動的弾性を示している。 適切なコラーゲン結合インテグリンが欠けている細胞は、組織のリモデリング期間中（図20a）に力を発生することがなく、コウシ血清に応答（図20b）して力を発生することもないことを示している。このような欠陥は、コラーゲン結合インテグリンの失われたサブユニット（α2）を回復させることによって正常になる。 さまざまな濃度のY27632で処理した後に組織モデルと大動脈ストリップを用いて観察した収縮力の変化を比較した図である。 さまざまな条件で培養した細胞が組織培地に分泌するMMPのザイモグラムである。 MMP阻害剤であるGM6001とともに、あるいはGM6001なしで培養した組織モデルを引っ張ったときの力の応答を比較した図である。 さまざまな処理を行なったときに記録された力の時間変化を表現できるパラメータである。

Claims (55)

1. ａ）ｉ）組織の接着を促進する非孔性支持体物質から形成された足場支持体であって、空間を確保するように選択された形状を有する足場支持体；
   ｉｉ）細胞外マトリクス並びに筋肉細胞、非筋肉細胞、内皮細胞、及び心臓細胞からなる群から選ばれる１又は複数の細胞を含むバイオ人工組織であって、上記足場支持体に接着し、そして上記空間にまたがり、かつ上記足場支持体の選択された形状に対応する形状を有する膜又は小片を形成するバイオ人工組織；
   を含む組織モデルシステムを提供し；
   ｂ）バイオ人工組織を試験薬剤に接触させ、
   ｃ）バイオ人工組織の機械的特性を測定し、ここでこの機械的特性は組織弾性および収縮力の少なくとも１つとする、そして
   ｄ）上記試験薬剤が、バイオ人工組織の機械的特性に影響を与えるかを決定する
   ステップを含む、バイオ人工組織に対する試験薬剤の効果を評価する方法。
2. ａ）複数の異なる試験薬剤で、請求項１に記載の方法を複数回実施し；及び
   ｂ）前記複数の試験薬剤からバイオ人工組織の機械的特性に対して効果を有する各試験薬剤を同定する
   を含む、試験薬剤のスクリーニング方法。
3. 前記足場支持体がワイヤフレームを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ワイヤフレームがステンレス鋼製ワイヤから構成される、請求項３に記載の方法。
5. 前記足場支持体が三角形、方形または円形である部分を少なくとも含む、請求項１に記載の方法。
6. 組織弾性の測定に、ヒステリシス、位相の遅れ、動的弾性のうちの少なくとも１つの測定が含まれる、請求項１に記載の方法。
7. 前記組織モデルシステムがさらにウェルを含み、そして前記足場支持体及びバイオ人工組織が当該ウェル内に配置される、請求項１に記載の方法。
8. 前記ウェルが、２〜１０，０００のウェルを含むマルチウェル・プレートの複数のウェルのうちの１つである、請求項７に記載の方法。
9. 組織押し込みシステムを用いて、前記バイオ人工組織の機械的特性を測定する、請求項１に記載の方法。
10. 前記組織押し込みシステムが、力変換器とコンピュータとに接続された押し込みプローブを備える、請求項９に記載の方法。
11. 前記力変換器がコンピュータ制御にされるモーターと接続され、プローブによりバイオ人工組織への力の印加を制御する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記組織モデルシステムをステージ上に配置し、そして前記コンピュータに制御されるモーターが、前記プローブに対してステージを移動させる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記組織押し込みシステムが、バイオ人工組織に適用される力を測定するように適用されており、当該力が一定力、線形力、ランプ状力およびサイン曲線状力からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
14. ｅ）複数の異なる濃度で複数回工程ａ−ｄを行い；そして
    ｆ）前記試験薬剤が、前記バイオ人工組織の機械的特性について濃度依存的効果を有するかを決定する
    ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記試験薬剤が、第一の試験薬剤であり、そしてさらに：
    ｅ）第二試験薬剤で工程ａ−ｄを繰り返し；そして
    ｆ）前記バイオ人工組織の機械的特性について第一の試験薬剤が有する効果を、前記バイオ人工組織の機械的特性について第二の試験薬剤が有する効果と比較する
    ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記試験薬剤が、複数の試験薬剤のうちの一つであり、そしてさらに：
    ｅ）上記複数の試験薬剤の各々について、工程ａ−ｄを繰り返し；そして
    ｆ）前記バイオ人工組織の機械的特性に対して各試験薬剤が与える相対効果に基づいて、複数の試験薬剤をランキングする
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記バイオ人工組織が疾病に関与することが知られている細胞を含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記バイオ人工組織の機械的特性に対して試験薬剤が与える効果を、前記バイオ人工組織に存在する細胞に対応させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 試験薬剤と接触させる前にバイオ人工組織の機械的特性を測定することをさらに含み、ここで、前記決定ステップが、
    試験薬剤が前記バイオ人工組織の機械的特性について影響を与えるかを決定するステップが、当該バイオ人工組織を試験薬剤と接触させる前に得られた機械的特性の計測値を、前記バイオ人工組織を試験薬剤と接触させた後に得られた機械的特性の計測値と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記試験薬剤が、第一試験薬剤であり、そしてさらに
    ｅ）前記バイオ人工組織の機械的特性に影響を与えると知られている第二試験薬剤を選択し；
    ｆ）ステップａ−ｄを繰り返し、ここでステップｂの繰り返しが、バイオ人工組織を、第一試験薬剤及び第二試験薬剤の組合せと接触させることを含み；そして
    ｇ）第一薬剤がバイオ人工組織の機械的特性に与える影響を、第一試験薬剤と第二試験薬剤の組合せがバイオ人工組織の機械的特性に与える影響を比較する
    ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
21. ａ）ウェル；
    ｂ）当該ウェル内に配置される足場支持体であって、空間を確保するように選択された形状を有する足場支持体；
    ｃ）細胞外マトリクス並びに筋肉細胞、非筋肉細胞、内皮細胞、及び心臓細胞からなる群から選ばれる１又は複数の細胞を含むバイオ人工組織であって、当該バイオ人工組織が、足場支持体に接着し、そして上記空間にまたがり、かつ上記足場支持体の選択された形状に対応する形状を有する膜又は小片を形成するバイオ人工組織；そして
    ｄ）バイオ人工組織と接触させ得るプローブを含み、ここで当該組織押し込みシステムが、バイオ人工組織の機械的特性を計測するように適用され、ここで、当該機械的特性が、収縮力および組織弾性の少なくとも１つである、
    を含む、バイオ人工組織の機械的特性を計測するためのシステム。
22. 前記足場支持体が、当該支持体に対する組織の接着を促進する非孔性支持体物質から形成される、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記足場支持体の少なくとも一部が、ワイヤフレームである、請求項２１又は２２に記載のシステム。
24. 前記ワイヤフレームがステンレス鋼製ワイヤから構成される、請求項２３に記載のシステム。
25. 前記足場支持体の少なくとも一部が、三角形、方形または円形である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のシステム。
26. 組織弾性にヒステリシス、位相の遅れ、動的弾性のうちの少なくとも１つが含まれる、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. 前記バイオ人工組織が疾病に関与することが知られている細胞を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載のシステム。
28. 前記ウェルが、マルチウェル・プレートの複数のウェルのうちの一つである、請求項２１、２６及び２７のいずれか一項に記載のシステム。
29. 前記マルチウェル・プレートが２〜１０，０００ウェルを含む、請求項２８に記載のシステム。
30. 前記組織押し込みシステムが、力変換器をさらに含み、そして前記プローブが、当該力変換器に接続されている、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載のシステム。
31. 前記力変換器がコンピュータ制御のモーターに接続され、バイオ人工組織への力の印加を制御する、請求項３０に記載のシステム。
32. 前記ウェルが、ステージ上に置かれ、そして前記コンピューター制御されるモーターが、当該プローブに対してステージを移動する、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載のシステム。
33. 前記組織押し込みシステムが、前記バイオ人工組織に適用される力を計測するように適用され、前記力が、一定力、線形力、ランプ状力およびサイン曲線状力からなる群から選択される、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載のシステム。
34. 細胞外マトリクス、並びに筋肉細胞、非筋肉細胞、内皮細胞、及び心臓細胞からなる群から選ばれる１又は複数の細胞を含むバイオ人工組織であって、当該バイオ人工組織が、空間を確保するように選択された形状を有する足場支持体に接着し、ウェル内に配置され、そして組織接着を促進するために非孔性支持体物質から形成されて、そして当該バイオ人工組織が、上記足場支持体の選択された形状に対応する形状を有し、かつ空間にまたがる膜又は小片の形態である、バイオ人工組織。
35. 前記ウェルが、マルチウェル・プレートの複数のウェルのうちの一つである、請求項３４に記載のバイオ人工組織。
36. 少なくとも１のウェル；及び
    当該ウェル内に配置され、空間を確保するように選択された形状を有し、そしてコラーゲン及び細胞を含む非重合溶液から、上記空間にまたがり、かつ足場支持体の形状に対応する形状を有する膜及び小片を形成することできる足場支持体
    を含む、細胞外マトリクス並びに筋肉細胞、非筋肉細胞、内皮細胞、及び心臓細胞からなる群から選ばれる１又は複数の細胞を含むバイオ人工組織を培養するための装置。
37. 前記ウェルがマルチウェル・プレート内の複数のウェルのうちの１つである、請求項３６に記載の装置。
38. 前記足場支持体がウェルの底面上に支持された少なくとも１の表面を含む、請求項３６又は３７に記載の装置。
39. 前記表面がウェルの底面から１．０ｍｍ上にある、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の装置。
40. 前記足場支持体が管状の少なくとも一部を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の装置。
41. 前記足場支持体が方形、円形または三角形の少なくとも一部を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の装置。
42. 前記足場支持体が間をおいて配置された２つの平行面を含む、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の装置。
43. 前記足場支持体が、それに対する組織の接着を促進する非孔性支持体材料で形成される、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の装置。
44. 前記足場支持体が、前記ウェル内に配置され、そして当該ウェルの底に実質的に平行である少なくとも１の延長部材を含む、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の装置。
45. 前記延長部材が、１００μｍ〜２．０ｍｍの断面直径を有する、請求項４４に記載の装置。
46. 前記延長部材が、平行に離して配置された部材の対のうちの１つであり、前記ウェル内で、かつウェルの底に実質的に平行に配置される、請求項４４又は４５のいずれかに記載の装置。
47. 前記組織モデルシステムが、さらにウェルを含み、そして前記足場支持体が、当該ウェル内に配置され、かつ当該ウェルの底に実質的に平行である少なくとも１の延長部材を含む、請求項１に記載の方法。
48. 前記延長部材が、１００μｍ〜２．０ｍｍの断面直径を有する、請求項４７に記載の方法。
49. 前記延長部材が、平行に離して配置された部材の対のうちの１つであり、前記ウェル内で、かつウェルの底に実質的に平行に配置される、請求項４６又は４７のいずれかに記載の方法。
50. 前記組織モデルシステムが、さらにウェルを含み、そして前記足場支持体が、当該ウェル内に配置され、かつ当該ウェルの底に実質的に平行である少なくとも１の延長部材を含む、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
51. 前記延長部材が、１００μｍ〜２．０ｍｍの断面直径を有する、請求項５０に記載のシステム。
52. 前記延長部材が、平行に離して配置された部材の対のうちの１つであり、前記ウェル内で、かつウェルの底に実質的に平行に配置される、請求項５０又は５１のいずれかに記載のシステム。
53. 前記足場支持体が、当該ウェル内に配置され、かつ当該ウェルの底に実質的に平行である少なくとも１の延長部材を含み、そして膜又は小片が、当該ウェル内でかつ当該ウェルの底に実質的に平行となるように配置される様式で、前記バイオ人工組織が延長部材に接着する、請求項３４又は３５のいずれかに記載のバイオ人工組織。
54. 前記延長部材が、１００μｍ〜２．０ｍｍの断面直径を有する、請求項５３に記載のバイオ人工組織。
55. 前記延長部材が、平行に離して配置された部材の対のうちの１つであり、前記ウェル内で、かつウェルの底に実質的に平行に配置される、請求項５３又は５４に記載のバイオ人工組織。

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