JP4624477B1 - 加工食品中の豚肉検出法およびその検出キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イムノクロマトグラフィー法により試料中の検出対象物を検出する際に、加熱処理した豚肉中に含まれる23kD(分子量23,000)付近の蛋白質を特異的に認識する抗体として、少なくとも一方または両方にポリクローナル抗体を検出抗体として用いることによって、加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の検出をする。
【選択図】なし
Description
一方で、食品中に含まれる食物アレルゲンに対して食物アレルギー患者は、喘息、皮膚炎、胃腸障害、アナフィラキシーショックといったさまざまなアレルギー症状を引き起こし、時には深刻な事態に至るケースもある。食物アレルギー患者は増加傾向にあることもあって、食品への安全性に関する消費者の関心は非常に高まっている。
(特許文献1、特許文献2参照)
本発明者等は、上記モノクローナル抗体を用いる代わりにポリクローナル抗体を用いて同様の実験をイムノクロマトグラフ法で行なったところ、加熱食品中の豚肉以外の牛肉などに交差反応性が見られ、精度の点で満足な結果が得られなかった。
このように、試料中の検出対象物である加熱食品中の豚肉をポリクローナル抗体を用いてイムノクロマトグラフ法により検出する際、非特異的反応が起こることを観察しており、非特異的反応を十分に抑制できないという課題が依然としてあった。
このため、本発明の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出で使用される検出抗体(生体物質)は、加熱食品検出系に特に適したものであり、非加熱食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出系と異なるのみならず、従来公知の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質の免疫学的検出で使用される検出抗体(生体物質)とも異なっている。その検出抗体を特定したうえで、イムノクロマト法による加熱加工食品中の豚肉の有無を検査(検知)する方法および検査(検知)キットの発明を、本発明者等が初めて完成した。
本発明の加熱食品検出系では、例えば100℃以上で加熱処理した豚肉中に含まれる23kD(分子量23,000)付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体として好適に用いるものである。
(a)本発明の第1の特徴は、豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)のクマシー染色による解析で40kD(分子量40,000)〜60kD(分子量60,000)の範囲に属するフラクションに含まれる50kD(分子量50,000)付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる20kD(分子量20,000)〜26kD(分子量26,000)の範囲に属する23kD(分子量23,000)付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法にある。
(d)本発明の第4の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている前記(c)に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置にある。
また、本発明では、ポリクローナル抗体であっても、豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる50kD(分子量50,000)付近の蛋白質を免疫抗原に用いて動物に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体(生体物質)として使用しているため、大豆といった植物由来蛋白質のみならず、牛、鶏、羊といった豚以外の動物由来蛋白質に対する交差反応が完無であり、感度の低下がなく、正確かつ容易に加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出の結果の判定が可能である。
本発明の加熱処理された豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出法は、加熱加工食品のみならず、蛋白質の変性を引き起こすような温度条件での加工処理(加熱、加熱加圧、乾燥等)を施した健康食品、医薬品、家畜飼料、ペットフードなどに含有される豚肉由来蛋白質の検出においても、簡便かつ安価に活用することが可能である。そのため、本発明は、豚肉に対してアレルギー反応を引き起こす患者さんや、嗜好上または食文化上、豚肉を食さない一般消費者の方々に対して、その問題の解決に貢献できる。
本発明のイムノクロマトグラフィー検出法は、PCR法やELISA法に比べて、簡便な装置で迅速かつ安価に、加熱加工された食品中の豚肉由来蛋白質の検出が可能であるため、一般消費者のニーズに貢献できるという利点を有する。
本発明の加熱食品検出系においては、例えば100℃以上で加熱処理した豚肉中に含まれる23kD(分子量23,000)付近の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を検出抗体として好適に用いるというものである。
本発明の加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマト検出法においては、豚生肉からの抽出物である豚生肉中に含まれる50kD(分子量50,000)付近の蛋白質を免疫用抗原として使用し、これを動物(ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット等々。)に免疫して得られるポリクローナル抗体を検出抗体(生体物質)として使用するというものである。
本発明において、緩衝剤としては、酢酸緩衝液(酢酸+酢酸ナトリウム)、リン酸緩衝液(リン酸+リン酸ナトリウム)、クエン酸緩衝液(クエン酸+クエン酸ナトリウム)、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液(トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタン+塩酸)、TE緩衝液(トリス+エチレンジアミン四酢酸)、TAE緩衝液(トリス+酢酸+エチレンジアミン四酢酸)、TBE緩衝液(トリス+ホウ酸+エチレンジアミン四酢酸)又はHEPES緩衝液(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルフォン酸)等が挙げられる。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液HEPES緩衝液である。
その他の非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤などを配合して使用することも可能である。
本発明において、キレート剤としては、エチレンジアミン、ジピリジン、エチレンジアミン四酢酸(以下、「EDTA」という)、EDTA・2Na、EDTA・3Na、EDTA・4Na、EDTA誘導体(例えば、EDTA・2NH4、EDTA・3K、EDTA・特殊アミン塩等)、EDTA金属塩(例えば、EDTA・Ca・2Na等)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)系、ジヒドロキシエチルエチレンジアミン二酢酸(DHEDDA)系、1,3−プロパンジアミン四酢酸(1,3PDTA)系、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)系、トリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)系、ニトリロ三酢酸(NTA)系、グルコン酸系、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIMDA)系、L−アスパラギン酸−N、N−二酢酸(ASDA)系、アミノトリメチレンホスホン酸(NTMP)系、ヒドロキシエタンホスホン酸(HEDP)系、3−ヒドロキシ−2,2’−イミノジコハク酸4ナトリウム、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等が挙げられる。
抽出展開液としては、通常、溶媒として水を用い、これに緩衝液、および非イオン界面活性剤、さらに蛋白質や高分子化合物、必要に応じて更にキレート剤など、を加える。加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。抽出展開液として用いる場合には、検出する試料が固体状であるか、ペースト状であるかといった状態に応じて、適宜抽出展開液の使用態様を最適にするようにできる。検出する試料と展開液を予め混合したものを、サンプルパッド(試料添加部)上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に試料をサンプルパッド(試料添加部)上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド(試料添加部)上に供給・滴下して展開させてもよい。試料希釈液として使用する場合には、試料を希釈した希釈液は、そのまま展開液としてサンプルパッド(試料添加部)上に供給・滴下することにより使用できる。
[試薬] (肉1kgあたりの使用量)
・塩化ナトリウム ・・・ 0.14M 水溶液 2L
・酢酸ナトリウム ・・・ 1M 水溶液 200mL
0.1M 水溶液 500mL
・硫酸アンモニウム ・・・ 2872g
・1N 塩酸 ・・・ 適量(目安:250mL)
・ポリエチレングリコール 20000 ・・・ 30% 水溶液 1L
・酢酸ナトリウム緩衝液(pH=3.7) ・・ 0.1M 溶液 3.2L
・ハサミ、ピンセット(肉処理用)
・ビーカー
・フードプロセッサ
・超音波ホモジナイザー
・遠心機&遠沈管(コクサン製遠心機)
・吸引ろ過器具(吸引びん、ブフナーロート)
・マグネチックスターラー
・pHメーター
・透析膜(使用前に煮沸して、グリセロール、硫黄を除去したもの)
・AKTA(タンパク質精製装置)
I.(抗原以外のタンパク除去)
(1)脂肪を取り除いた赤身肉(豚ヒレ肉)500gを、フードプロセッサを使用してミンチにし、0.14M塩化ナトリウム水溶液を1L加える。超音波ホモジナイザーで分散させ、スラリーを作製する。1時間室温でインキュベート後、遠心(10000g,4℃,20min)、上澄をキムワイプでろかする。Whatman No.42 ろ紙で吸引ろ過して、ろ液をIEWで1900mLに希釈して、1M酢酸ナトリウム水溶液を100mL加える。氷上で撹拌しながら、硫酸アンモニウム722gを加えて、氷上(4℃)で2時間撹拌する。4℃で一晩インキュベートする。
(2)沈殿物をよく撹拌し、遠心(10000g,4℃,20min)して上清を分取(ペレットを捨てる)後、1Nの塩酸を加えてpH4.9に調整する。4℃で一晩インキュベートする。
(3)沈殿物をよく撹拌し、遠心(10000g,4℃,20min)して上清を分取(ペレットを捨てる)後、1Nの塩酸を加えてpH3.7に調整する。4℃で一晩インキュベートする。
(5)遠心(19000g,4℃,20min)して上清を捨て、120mLの滅菌精製水でペレットを懸濁させる。4℃で一晩インキュベートする。
(6)遠心(19000g,4℃,20min)して上清を透析膜中に分取し、2〜3Lの滅菌精製水で透析する。さらに2〜3Lの滅菌精製水で透析する。
(7)PEG20000の30%水溶液1〜2Lで透析し、40mLに濃縮する。0.01Mの酢酸バッファー(pH3.7)2000mLで透析。さらに0.01Mの酢酸バッファー(pH3.7)2000mLで透析する。
上記(1)〜(7)の手順により得られた抗原の精製を以下の手順により行なう。
(8)上記(7)で得られたものを遠心(10000g,4℃,20min)し、上澄を陽イオン交換カラムに通して精製する。最初に行なうカラム平衡化、カラム洗浄には、0.01M 酢酸バッッファー(pH3.7)を使用し、サンプル溶出とその直後のカラム洗浄には、0.8M 酢酸ナトリウム水溶液(pH3.7)を使用した。陽イオン交換精製分画としてf1〜F10が得られた。
(9)主要なピーク部分のフラクション(UVスペクトルからタンパク濃度が最も高いフラクション)を集める。これを適当な量のPBS(0.01Mリン酸塩バッファー化食塩水)で透析後、PEG20000の30%水溶液1000mLで透析して2mgプロテイン/mLに濃縮する。
(10)f1〜f5までのフラクションを集めてタンパク定量(プロテインアッセイ)を行なった。このような操作により生豚肉から免疫用抗原を調製した。
生豚肉から上記のようにして調製した免疫用抗原を用いて、常法に従ってウサギに免疫して、抗血清を得る。抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、50%飽和硫酸アンモニウムで塩析後、DEAEカラム(陰イオン交換カラム)を用いて精製回収する手法により得る。
試料添加部は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成されている。多孔質シートとしては、セルロース濾紙、ガラス濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。本発明の多孔質シートとしては、ガラス濾紙が好ましく用いられる。本発明においては、非特異的反応を抑制するために、サンプルパッド(試料添加部)中に、緩衝液、非イオン界面活性剤、および蛋白質などの添加剤、必要に応じてキレート剤、を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を予め含浸させて後、乾燥させる等の手段により保持させる態様とすることができる。
モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原(豚生肉から抽出された抽出物である豚生肉中に含まれる50kD(分子量50,000)付近の蛋白質)で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する。例えば、ケーラーとミルスタインの技法(Nature 256(1975)495−497)を参照。
1.試料(例えば、肉類を含む加熱加工食品の抽出展開液)を、サンプルパッド上に、所定量(通常、0.1〜2ml)滴下する。試料が滴下されると、サンプルパッド中を、試料が移動を始める。サンプルパッド中に特定のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物が含浸されたりしている場合には、イムノクロマトグラフィー用試薬組成物は試料の水分に溶解し、試料と共に移動を始める。
2.試料(例えば、肉類を含む加熱加工食品の抽出展開液)又はイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を溶解した試料は、まず標識物質保持部へと移動する。ここを試料が通過する際、標識物質保持部に保持されていた標識試薬(第二試薬)が試料の水分に溶解し、試料と共に移動する。
3.ついで、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体上の検出部を通過する。ここでは、抗原・抗体の特異的結合反応により、試料中に豚肉が含まれている場合には、検出部に保持、即ち、担持固定されている抗体と標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する。試料中に豚肉が含まれていない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
4.最後に、試料の水分は、吸収部へと移動する。
このように、試料中の豚肉の有無を正確に判定することができる。
1.クロマトグラフ媒体上への反応部位の作製
25×2.5cmのニトロセルロース膜(ミリポア社製:HF120)に、抗体塗布機(BioDot社製)を用いて2%のStabiliGuard(SurModics社)および5%のイソプロピルアルコール、炭酸緩衝液(pH9.0)で0.65mg/mLの濃度になるように希釈した抗Porkポリクローナル抗体を塗布し、40〜50℃で60分間乾燥させた後、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体上の反応部位を作製した。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業(株)製:平均粒子径60nm)0.5mLにHEPES緩衝液(pH8.5)で0.02mg/mLの濃度になるように希釈した抗Porkポリクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、CE510(JSR Corporation)を0.1mL加え、リン酸カリウム溶液(pH7.5)に溶解した1%ポリエチレングリコールを0.05mL加えて十分撹拌した後、室温で10分間静置した。8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含む緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液とした。
上記作製した標識物質溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、検出試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製した反応部位が作製されたクロマトグラフ媒体、検出試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料や不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後にラミネートシールを貼り付けて裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体とした。
HEPES緩衝液(pH8.0)にskim milkを0.2%、Tween20を0.15%、塩化ナトリウムを0.05Mとなるように加えさらに防腐剤としてアジ化ナトリウムを0.1%となるように加えて混和した。
上記した抽出展開液0.5mLに対して、加工豚肉あるいは豚以外の動物種由来の加工肉0.1〜0.2gを加えて手で30秒間振とうする。
上記作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中の豚肉の存在の有無を測定した。上記作製した豚肉が含まれる試料を陽性検体、また上記作製した豚以外の動物種由来の肉が含まれる試料を陰性検体とし、クロマトグラフ媒体の先端を各試料溶液に浸した。金コロイドがグラスファイバー製パッドから流出するのを確認した後、浸していたクロマト媒体を溶液から取り出して水平な台の上に置き、10〜15分後に目視判定する。
1.試験食品0.1〜0.2g程度を上記した抽出展開液0.5mL入りチューブに添加する。
2.チューブの蓋をしっかり閉め、手でチューブを約30秒程度振とうする。
3.蓋を開け、検査キットの試料添加部先端を溶液中に浸し、赤色溶液が検査キット上に
展開されることを確認する。
4.赤色溶液の上昇を確認後、検査キットを取り出し、水平な場所に置く。
5.10〜15分後にラインの有無を確認する。
試料滴下後10分で目視判定を行い、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「+」、強く(濃い色で)よりはっきりと確認できるものを「++」、極めて強く確認されるものを「+++」、赤い線を確認できないものを「−」、弱く(薄い色で)確認されるものを(±)とした。
試験加工食品として牛肉中に含まれている豚肉の割合(豚肉/牛肉)が、0重量%、0.1重量%、0.5重量%、1重量%、5重量%の各場合について、評価した結果を表1に示す。
その結果は、非特異反応(偽陽性)を伴わず、牛肉中に含まれる0.1重量%以上の豚肉を検出できた。この試験例において、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
その結果は、非特異反応(偽陽性)が生じた。牛肉も検出してしまい、豚肉特異性が低いものであった。
試験加工食品として鶏肉中に含まれている豚肉の割合(豚肉/鶏肉)が、0重量%、0.25重量%、0.5重量%、1重量%、5重量%の各場合について、評価した結果を表2に示す。
その結果は、非特異反応(偽陽性)を伴わず、鶏肉中に含まれる0.25重量%以上の豚肉を検出できた。この試験例において、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
本発明の検出キットを用いて、豚肉、牛肉、鶏肉、ラム肉、大豆の各加熱単一食品(100%)からの抽出液を検出試料としたものについて、その評価を測定した。結果を表3に示す。
その結果は、牛肉、鶏肉、ラム肉、大豆から抽出されるタンパク質は検出されず、豚肉由来タンパク質のみが検出された。この結果から、豚肉の特異性が明らかとなった。この試験例においても、製造ロット間差及び繰り返し試験にばらつきは生じなかった。
<本発明の検出キット(イムノクロマト法)とPCR法の比較>
本発明の検出キットを用いて、市販されている加熱食品類からの抽出液を検出試料としたものについて、該加熱食品類中に含まれている材料表示(豚肉、牛肉または鶏肉)に対する判定評価を行なった。また、本発明の検出キットに代えて遺伝子学的手法として知られているPCR法でも同様に該加熱食品類からの抽出液を検出試料として用いて判定評価を行なった。その結果を表4に示す。
その結果は、イムノクロマト法による本発明の検出キットの結果とPCR法による検出結果は略同じ結果が得られた。どちらの方法においても、ラベルに豚と表示された食品を検出した。牛肉、鶏肉から抽出されるタンパク質は検出されず、豚肉由来タンパク質のみが検出された。この結果から、豚肉の特異性が明らかとなった。この結果からみて、イムノクロマト法による本発明の検出キットの結果は、特異性が高く高性能とされるPCR法に劣らない精度で、加熱食品類中に含まれている豚肉を特異的に検出できるものである。
本発明のイムノクロマトグラフィー検出法は、PCR法やELISA法に比べて、簡便、迅速かつ安価に実施できるため、産業上の利用可能性が大である。
2 抽出展開液
3 チューブ
4 蓋
5 検出チップ
Claims (5)
- 豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)のクマシー染色による解析で40kD(分子量40,000)〜60kD(分子量60,000)の範囲に属するフラクションに含まれる50kD(分子量50,000)付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる20kD(分子量20,000)〜26kD(分子量26,000)の範囲に属する23kD(分子量23,000)付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体を、検出抗体とする加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出法。
- 豚生肉から抽出される抽出物のイオン交換精製フラクションであって、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)のクマシー染色による解析で40kD(分子量40,000)〜60kD(分子量60,000)の範囲に属するフラクションに含まれる50kD(分子量50,000)付近に強い発色を示す分子量の蛋白質を免疫用抗原として動物に免疫して得られるポリクローナル抗体であって、加熱処理した豚肉中に含まれる20kD(分子量20,000)〜26kD(分子量26,000)の範囲に属する23kD(分子量23,000)付近の分子量の蛋白質を特異的に認識するポリクローナル抗体。
- 請求項2に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項2に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部を備えた加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
- 試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されている請求項3に記載のイムノクロマトグラフィー検出用装置。
- 試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体、検出部および吸収部から実質的に構成されており、且つ請求項2に記載のポリクローナル抗体を、標識物質により標識した標識抗体を保持させた標識物質保持部と、請求項2に記載のポリクローナル抗体を固定した検出部が設けられている加熱加工食品中の豚肉由来蛋白質のイムノクロマトグラフィー検出用キット。
Priority Applications (6)
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---|---|---|---|
JP2010034120A JP4624477B1 (ja) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | 加工食品中の豚肉検出法およびその検出キット |
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