JP4620339B2 - 抗原ペプチドの同定法 - Google Patents
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Description
(a)哺乳類生物体から単離された抗原ペプチドとペプチド受容体との複合体を0.1μg〜5μgの量で提供する段階;および
(b)会合した抗原ペプチドをペプチド受容体から溶離する段階。
界面活性剤により細胞を可溶化する段階、および免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーによりペプチド受容体と抗原ペプチドとの複合体を隔離する段階。
(a)哺乳類生物体の細胞、組織または体液から単離された抗原ペプチドとペプチド受容体との複合体を0.1μg〜5μgの量で提供する段階;
(b)抗原ペプチドとペプチド受容体との隔離された複合体を、限外濾過チューブ中で水により洗浄する段階;
(c)希釈したトリフルオロ酢酸を用いて、会合した抗原ペプチドをペプチド受容体から37℃で溶離する段階;および
(d)単離されたペプチドを、液体クロマトグラフィーおよび質量分析により、配列決定および同定する段階。
(a)0.1μg〜5μgのMHC分子を提供する数のMHC発現細胞を提供する段階;
(b)段階(a)の細胞を、抗原の潜在的供給源と接触させる段階;
(c)MHC分子-抗原ペプチド複合体を、細胞から単離する段階;および
(d)会合したペプチドをMHC分子から溶離する段階。
界面活性剤により細胞を可溶化する段階、および免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーにより抗原ペプチドとペプチド受容体との複合体を隔離する段階。
(a)0.1μg〜5μgのMHC II分子を提供する数の未成熟樹状細胞を提供する段階;
(b)段階(a)の細胞を抗原の潜在的供給源と接触させる段階および、TNFαの添加により樹状細胞の成熟を誘導する段階;
(c)界面活性剤TX-100による細胞の可溶化、および、免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーによるMHC II分子と抗原ペプチドとの複合体の隔離を含む方法により、MHC II分子-抗原ペプチド複合体を、細胞から単離する段階;
(d)MHC II分子と抗原ペプチドとの隔離された複合体を、限外濾過チューブ中で水により洗浄する段階;
(e)会合した抗原ペプチドを、希釈したトリフルオロ酢酸により37℃でMHC II分子から溶離する段階;ならびに
(f)単離されたペプチドを、液体クロマトグラフィーおよび質量分析により、配列決定および同定する段階。
上記(7)〜(13)のいずれか一つまたは上記(23)〜(27)のいずれか一つ記載の段階;
同定されたペプチドを作製する段階および任意にそれらを修飾する段階;ならびに
得られた生成物を薬学的に許容される担体または希釈剤と共に製剤化する段階。
本発明は、哺乳類生物体由来の抗原ペプチドとペプチド受容体との複合体を0.1μg〜5μg、好ましくは0.2μg〜3μg提供する段階を含む、同定が可能なフェムトモル量の疾患関連抗原ペプチドを単離する方法を提供する。この量は、患者または健常ドナーの生検標本または体液から通常入手できる材料の量に等しい。先行技術において必要な材料の最低量は、非限定供給源(近交系マウス)に由来するII型MHC分子約200μgである(Dongre ARら、EJI、31:1485-94(2001))。これは、ヒト患者材料から入手可能な材料よりもほぼ二桁多い。
本発明の抗原ペプチドは、哺乳類生物体の組織もしくは体液もしくは細胞由来の、または哺乳類生物体由来抗原提示細胞由来の、ペプチド受容体に会合したペプチドである。これらは、免疫系のT細胞に対する抗原ペプチドを細胞表面において提示するMHC I分子およびMHC II分子を含む膜貫通ペプチド受容体に結合することができる。抗原ペプチドはまた、細胞内または細胞外のMHC分子に結合することができる。ペプチドはまた、熱ショックタンパク質(Hsp)ファミリーに関連する細胞内ペプチド受容体に結合することもできる。
更なる態様において、本発明の方法は、II型MHC分子、I型MHC分子およびHspタンパク質を含む、抗原ペプチドに結合する全てのタンパク質を含むペプチド受容体に関連する。
本発明の方法は、ペプチド受容体を発現する全細胞、例えば、抗原に会合したHsp分子を含む全細胞、抗原に会合したMHC分子を含む全細胞を包含しており、MHC IまたはHsp分子を発現する細胞は、ほぼ全ての有核細胞を含み、MHC II分子を発現する細胞は、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、胸腺上皮細胞、小膠細胞、活性化T細胞、並びに、IFNγなど炎症誘発性サイトカインによる誘導後の内皮細胞および上皮細胞を含む。MHC II分子を発現する細胞は、抗原提示細胞(APC)とも呼ばれる(Unanue, ER.、Macrophages, antigen presenting cells and the phenomena of antigen handling and presentation.、Fundamental Immunology、第2版(Paul, W.E編)、New York, Raven Press社、1989年)。
細胞または組織由来のペプチド受容体-ペプチド複合体の精製のために、細胞膜または組織は可溶化されなければならない。細胞溶解は、例えば凍結融解サイクルおよび界面活性剤の使用、並びにそれらの組合せなど、当技術分野において公知の方法により行われうる。好ましい溶解法は、界面活性剤、好ましくはTX-100、NP4O、n-オクチルグルコシド、Zwittergent、Lubrol、CHAPS、最も好ましくはTX-100またはZwittergent3-12を用いた可溶化である。細胞デブリおよび核は、可溶化された受容体-ペプチド複合体を含有する細胞溶解液から、遠心分離により除去されなければならない。従って本発明の更なる態様において、ペプチド受容体と抗原ペプチドとの複合体は、界面活性剤による可溶化を含む方法により、細胞から単離される。
更に本発明は、免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーを含む方法による、細胞溶解液由来のMHC-ペプチド複合体の精製を提供する。免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーに関して、I型MHC分子またはII型MHC分子に特異的な抗体およびこれらの方法に適した抗体が使用される。特異的抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、例えばプロテインAを介して共有的または非共有的に、例えばセファロースまたはアガロースビーズなどのビーズに結合されている。先行技術において使用された、広範なパネルの抗HLA抗体の選択には以下が含まれる:
抗HLA-DR抗体:L243、TU36、DA6.147、好ましくはL243;抗HLA-DQ抗体:SPVL3、TU22、TU169、好ましくはTU22およびTU169;抗HLA-DP抗体B7/21ならびに抗HLA-A,B,C抗体W6/32およびB9.12。
Hsp-ペプチド複合体は、当技術分野において公知の方法により精製されうる(Binder, R.ら、J. Immunol.、165:2582-2587(2000))。簡単に述べると、細胞を低張緩衝液中でホモジナイズして、その後硫安塩析により分画することができる。Hsp7O-ペプチド複合体を精製するために、50%沈殿物をADP親和性ビーズにに適用し、その後続いてDEAEアニオン交換ビーズに適用できる。前述の硫安塩析の80%沈殿物を用いて、コンカナバリンA親和性クロマトグラフィーおよびDEAEアニオン交換クロマトグラフィーの併用により、Hsp9Oファミリータンパク質-ペプチド複合体を精製することができる。
受容体分子からペプチドを溶離することにより、抗原の潜在的供給源由来のおよび細胞内または細胞外のポリペプチド由来の天然プロセシングされたペプチドの複合体混合物が得られる。溶離が終了して初めて、ペプチドを分画して配列解析に供することができる。
本発明の更なる態様において、単離された抗原ペプチドは、分画され、配列決定されて、同定される。配列決定により、単離された抗原ペプチド混合物中の個々のペプチドのアミノ酸配列が、フェムトモル量のペプチドの配列決定に適した方法により解明されたことが理解される。同定により、抗原ペプチドがどのタンパク質またはポリペプチドに由来し、かつ、これらのタンパク質またはポリペプチド内においてどの配列が構成されているかが確立されるということが理解される。
溶離時に得られた全ペプチドレパートリーの定性分析のために、マトリクス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間(MALDI-TOF)型質量分析を行うことができる。ペプチドを断片化しない設定を用いると、MALDI-TOF分析により、ペプチド混合物の複雑性および優性ペプチドの存在に関するおおよその概略が提供される。
ペプチド受容体から溶離した単独ペプチドの量を推定するために、マイクロキャピラリーカラムを通る流れを、検出波長214nmで操作されるフロースルーUV検出器により分析することができる。定量のために、分析対象のペプチドのピーク面積を、段階量の合成標準ペプチドのピーク面積と比較する。
本発明の戦略1は、生物体内のペプチド受容体に負荷された抗原ペプチドを単離するために使用される(エクスビボ法、図1A)。
本発明の戦略2は、例えば細胞培養物中など、生物体外のペプチド受容体上に負荷された抗原ペプチドの単離を見越したものである(インビトロ法、図1B)。
腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞株、遺伝子修飾した腫瘍細胞株、これらの細胞または細胞株の粗細胞溶解液、腫瘍細胞由来熱ショックタンパク質、病原体、公知のウイルス性、細菌性および寄生体性の抗原、免疫攻撃対象の組織、公知の自己抗原、自家抗原、ならびに、腫瘍、自己免疫または感染性疾患を持つ患者由来の体液または組織生検標本、ならびに、参照対照としての健常個体由来の体液または組織生検標本。対照APCは、抗原の潜在的供給源に曝露されないこと以外は、同等に処理される。抗原の潜在的供給源は、様々な哺乳類種、好ましくはヒトに由来しうる。
本発明の方法で同定されたペプチド配列は、MHC結合モチーフ、MHC結合能およびT細胞認識を含む、数種類の判定基準の一つにより証明されうる。
本発明の方法を適用して、広範な疾患の病因に関連するペプチドを、特に易罹患性が1種もしくは数種の特定のMHC対立遺伝子の発現に関連しているペプチドまたはMHCで拘束されたT細胞反応が欠けているペプチドを同定できる。
本発明の方法の段階である、同定されたペプチドを作製して任意にそれらを修飾する段階、および、得られた生成物を、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に製剤化する段階。
下記実施例は添付の図面に関連しており、図1Aおよび図1Bで概説されかつ以下で詳細に説明される方法論に基づくものである。実施例において言及された市販の試薬は、特記しない限りは、製造業者の指示に従い使用された。
細胞株および培養
本試験は、以下に説明するように、単球から分化したヒト樹状細胞を用いて行った。単球は、ヒト末梢血から精製した。加えて、メラノーマ細胞株UKRV-Mel-15aおよびUKRV-Mel-20c(Eichmueller Sら、Exp Dermatol、11:292-31(2002))を用いた。
末梢血を、健常ドナー由来の標準バッフィーコート(buffy coat)調製物として、地域の血液バンクから入手した。ヘパリン(200I.U./ml血液、Liquemine、Roche社)を用い、凝血を防いだ。LSM(登録商標)(1.077g/ml〜1.080g/ml;ICN社、Aurora、OH)において800g(室温)で30分間遠心分離することにより、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを中間相から収集し、20mM Hepesを含有するRPMI中で2回洗浄した(500gで15分間、300gで5分間)。赤血球を除去するために、PBMCを、ALT緩衝液(140mM塩化アンモニウム、20mM Tris、pH7.2)で3分間、37℃で処理した。PBMCを、20mM Hepesを含有するRPMIで2回洗浄した(200gで5分間)。
製造業者のプロトコールに従って抗CD14磁気ビーズ(Miltenyi Biotech社、Auburn、CA)を用いた陽性選別により、単球をPBMCから単離した。1%非必須アミノ酸(Gibco, BRL社、Rockville、MD)、50ng/ml組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF;S.A. 1.1×107U/mg)(Leucomax;Novartis社、Basel、スイス)および3ng/ml組換えヒトIL-4(S.A. 2.9×104U/mg)(R&D Systems社、Minneapolis、MN)を添加したRPMI中で、単球を培養した。単球を、6ウェルプレート(Costar社)上に0.3×106/mlで5日間播種し、未成熟樹状細胞を得た。
メラノーマ細胞株を、液体窒素中での凍結およびその後の室温解凍を4サイクル行うことにより壊死させた。壊死性細胞の割合は、光学顕微鏡でモニタリングされた。樹状細胞にメラノーマ細胞由来抗原を供給するために、6×106個の未成熟樹状細胞を、1.8×107個壊死性細胞(比3:1)に曝露した。同時に、樹状細胞の成熟を、10ng/ml組換えヒト腫瘍壊死因子(TNFα;S.A. 1.1×105U/mg)の添加により誘導した。対照として、6×106個の樹状細胞を、TNFα単独と共にインキュベーションした。
抗HLA-DRモノクローナル抗体(mAb)L243(ATCC、Manassas、VA)を、各マウスハイブリドーマ細胞株の培養により作製した。mAb L243を、プロテインAセファロース(Pharmacia社、Uppsala、スウェーデン)を用いて精製し、最終濃度2.5mg/mlのCNBr活性化セファロースビーズ(Pharmacia社)に、製造業者のプロトコールに従って固定した。L243ビーズは、0.1%Zwittegent3-12(Calbiochem社、La Jolla、CA)を含有するPBS中に保存された。
凍結した樹状細胞ペレットを、10倍容量の氷***解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤キモスタチン、ペプスタチン、PMSFおよびロイペプチンが添加された、1%Triton-X-100、20mM Tris、pH7.8、5mM MgCl2(Roche社、Manheim、ドイツ))中に再懸濁し、かつ1000rpmの水平振盪機において4℃で1時間溶解した。細胞溶解液を、2000g、4℃で10分間の遠心分離により細胞デブリおよび核から清澄化した。溶解液を、L243ビーズ(5μl〜10μl L243ビーズ/100μl細胞溶解液)と共に、水平振盪機中で、1000rpm、4℃で2時間、共インキュベーションした。L243ビーズに結合した免疫沈降HLA-DR-ペプチド複合体を、2000g、4℃で5分間の遠心分離により遠沈し、0.1%Zwittegent3-12(Calbiochem社)のPBS溶液300μlで3回洗浄した。
L243ビーズに結合したHLA-DR-ペプチド複合体を、400μlのH2O(HPLC等級;Merck社、Darmstadt、ドイツ)中に再懸濁し、カットオフ値30kDの限外濾過チューブUltrafree MC(Millipore社、Bedford、MA)に移して、400μl H2O(HPLC等級)と共に14000rpm、4℃で2分間〜4分間遠心分離することにより10回洗浄した。結合したペプチドを溶離するために、0.1%トリフルオロ酢酸(Fluka社、Buchs、スイス)50μlのH2O(HPLC等級)溶液を添加し、かつインキュベーションを37℃で30分間行った。溶離したペプチドを、新たなエッペンドルフチューブに収集し、Ultrafree unitで、14000rpm、3分間室温で遠心分離し、かつ即座にSpeed-Vac(商標)真空遠心分離装置において凍結乾燥した。
HLA-DR分子から溶離した凍結乾燥ペプチドを、0.05%トリフルオロ酢酸、5%アセトニトリル(Merck社、Darmstadt、ドイツ)のH2O(HPLC等級)溶液に溶解し、FAMOS(商標)自動試料採取装置およびULTIMATE(商標)ナノフローHPLC(Dionex社、Olten、スイス)に連結した75μm×15cm C18 PepMapキャピラリー(C18;3μm;100Å)(LC-Packings社、Amsterdam、オランダ)上で分離した。その後の定常流速200nl/分における非線形勾配では、以下を使用した:0分から40分、5%から50%システムB;40分から50分、50%〜90%システムB。システムAは、0.05%トリフルオロ酢酸、5%アセトニトリル/H2Oであり、システムBは、0.04%トリフルオロ酢酸、80%アセトニトリル/H2Oであった。分離を、214nmおよび280nmでのデュアルUV吸収によりモニタリングした。画分(400nl)を、自動分取装置PROBOT(商標)(BAI社、Weiterstadt、ドイツ)を用いて収集し、AnchorChip 600/384 MALDI-MS標的(Bruker社、Bremen、ドイツ)上にスポットした。
MALDI-TOF質量分析
AnchorChipプレート上にスポットしたペプチドを、マトリクス(10mg/ml;a-シアノ-4-ヒドロキシ-ケイヒ酸(Merck社、Darmstadt、ドイツ)、50%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸)と共に、同時結晶化した。全ペプチドレパートリーの定性分析のために、製造業者のプロトコールに従い、Ultraflex(商標)MALDI-TOF質量分析装置(Bruker社、Bremen、ドイツ)において試料を分析した。
複合体ペプチド混合物の高処理配列決定を行うために、MudPIT(多次元タンパク質同定技術)を用いた(Washburn MPら、Nat Biotechnol、19:242-247(2001))が、これは液体クロマトグラフィー分画、およびその後の質量分析配列決定を基本としている。
上述したようなイオントラップMS/MSによる配列分析を行う代わりとして、Bruker Ultraflex TOF/TOF質量分析装置(Bruker社、Bremen、ドイツ)において、データ捕捉用ソフトウェアFLEXControl 1.1 Alphaを用いてMALDI-PSD分析を行った。ヒト血清アルブミン(Merck社、Darmstadt、ドイツ)のトリプシン消化を用いて、キャリブレーションを行った。まずペプチド混合物を、リフレクトロン(reflectron)モードで走査した。次に関心対象のペプチドを、リフトモードで選択した(MALDI-PSD分析)。得られたペプチド断片化スペクトルを、Xmas 5.1.2およびBiotools 2.1 Software(Bruker社)を用いて自動的に評価し、MASCOTアルゴリズム(http://www.matrixscience.com)を用って、少数(non-redundant)タンパク質データベースにおける配列同定のために使用した。
は、DR対立遺伝子DRB1*1101/DRB1*1104に関連して、HLA-DR会合エピトープとして説明されている(Verreck FAら、Immunogenetics、43:392-397(1996))。これは、培養EBV形質転換B細胞に由来する自己ペプチドのEdman配列決定により同定されている。これらの両対立遺伝子のペプチド結合モチーフは、P1位置に芳香族残基または脂肪族残基を、P4に脂肪族残基を、およびP6に塩基性残基を必要とする(Verreck FAら、Immunogenetics、43:392-397(1996))。これらの必要条件はPBMCに由来し、かつ本明細書において同定されたヒト血清アルブミンエピトープにおいてもまた満たされている(P1=L、P4=V、P6=R)(ペプチド11〜18)が、ペプチド1〜4、6〜10、20〜23および27においても同様である(表1)。更に、ここで見出されたα1アンチトリプシンペプチドと重複しているエピトープは、DRB1*04O2に関連してEBV B細胞において説明されている(Friede Tら、Biochim Biophys Acta、1316:85-101(1996))。
(配列番号:88)は、I-260を、Q-264を、およびL-269をそれぞれP1、P4、P9のアンカー残基として使用する、DRB1*0101およびDRB5*01O1に対するMHCペプチド結合モチーフを含む(アンカー残基に下線を付した)。
(図3B)を有するビメンチン(202-217)である腫瘍抗原ビメンチン由来の新規エピトープがもたらされた。イオントラップMS-MSによる配列分析は、この配列を確認した(図3C)。
aペプチド配列を、HLA-DR4のペプチド結合モチーフ(DRB1*0401)に従って整列化した:P1アンカー:W、Y、F;P4アンカー:D、E、L。アンカー6位における特殊な「D」(T、S、またはNの代わり)は、太字で示した。
bR.F. Wang、Trends in Immunology、22:269-276(2001)
Claims (8)
- フェムトモル量の抗原ペプチドを得る方法であり、以下の段階からなる方法:
(a) 哺乳類生物体の細胞、組織または体液から得られた抗原ペプチドとMHC II分子との複合体を0.1μg〜5μgの量で提供する段階;
(b) 免疫沈降または免疫親和性クロマトグラフィーにより該複合体を分離する段階であって、該複合体が、ビーズと結合したMHC II特異的抗体に結合されている、段階;
(c) 該結合されたMHCII分子と抗原ペプチドの複合体を水で洗浄する段階;および
(d) 会合した抗原ペプチドをMHC II分子から溶離する段階。 - 哺乳類生物体から得られた細胞が樹状細胞である、請求項1記載の方法。
- MHC II分子と抗原ペプチドとの分離された複合体が、ペプチドの溶離前に、限外濾過チューブ中で水により洗浄される、請求項1または2記載の方法。
- 抗原ペプチドが、希酸によりMHC II分子から溶離される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 得られた抗原ペプチドが、分画され、配列決定されて、同定される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 得られた抗原ペプチドが、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を含む方法により、分画され、配列決定されて、同定される、請求項5記載の方法。
- 抗原ペプチドが、天然プロセシングされた抗原ペプチドであるか、または生物体に投与された非天然プロセシングされた抗原ペプチドである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳類生物体がヒト生物体である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
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