JP4603655B2

JP4603655B2 - Neutral fat measurement sensor

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Publication number: JP4603655B2
Application number: JP2000162429A
Authority: JP
Inventors: 武司上村; 義介酒井; 浩樹山崎; 益男相澤
Original assignee: Techno Medica Co Ltd
Current assignee: Techno Medica Co Ltd
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: JP2001343349A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全血、血漿、血清、又は標準液等の試料液中の中性脂肪成分を測定するためのセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、基板上に測定極と対極とからなる電極系を形成し、この電極系の上に、酵素と電子受容体とを担持した多孔体から成る酵素反応層を設け、それらを適当なカバーで一体化したバイオセンサが提案されている。
このバイオセンサは、血液等の試料液を酵素反応層に滴下して酵素と電子受容体とを試料液中に溶解させ、酵素及び電子受容体と試料液中の特定の基質との間で酵素反応を進行させて電子受容体を還元した後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させて、このときに得られる酸化電流値から試料液中の特定の基質の濃度を求める。
しかし、上記した構成では、電極系を含む基板面の濡れが必ずしも一様とならないため、多孔体と基板との間に気泡が残り、応答電流に影響を与えたり反応速度が低下するという問題があった。
上記した従来の問題点を解決する方法として、測定極と対極とからなる電極系の上に、親水性高分子と酵素とから成る酵素反応層を設けることが登録第２５０２６６５号にて提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記したように親水性高分子を用いて酵素反応層と電極との間の気泡の残存を防ぐ方法は、親水性高分子を含む層と電極系とを隙間なく一体化する必要があるため、始めに、親水性高分子を溶液にして電極上に塗布した後に乾燥させて親水性高分子層を形成した後に、親水性高分子層の上に酵素を含む酵素層を形成しなければならないという製造上の制限があるという問題があった。このような製造方法は、親水性高分子層を形成した後でなければ、酵素層の形成を開始することができないので製造に時間がかかるという問題がある。また、塗布・乾燥工程を用いた製造方法は、塗布時に塗布すべき溶液の量にバラツキが出やすいため、複数のセンサを製造する場合、各センサで親水性高分子や酵素の濃度にバラツキが生じる可能性が高いという問題もある。
また、上記した従来のバイオセンサは、本来、対極上には酵素反応層を設ける必要がないにも拘わらず、測定極と対極との両方に跨って酵素反応層を設けているため、製造コストが高くなるという問題もある。
酵素には、高価なものも、安価なものもあるため、上記した問題の大きさは、測定すべき基質の種類、即ち、酵素の種類に依存する問題ではあるが、中性脂肪を測定する場合には、中性脂肪の測定に有効な酵素であるリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ，グリセロリン酸オキシダーゼが高価であるので大きな問題となる。
この製造コスト上の問題を解決するためには、測定極上のみに酵素を設ける必要があるが、従来のバイオセンサは、上記したように、始めに、親水性高分子を溶液にして塗布し乾燥させなければならないという製造上の制限があり、そのため、測定極上のみに酵素反応層を設けようとすると、始めに、親水性高分子を測定極と対極との両方に別々に塗布・乾燥させて各々に親水性高分子層を形成しなければならないので、塗布・乾燥工程が増えてしまい、結局、製造コストが高くなってしまうという問題がある。親水性高分子は測定極上及び対極上の両方に設けることが望ましいので、塗布・乾燥工程を増やさないために、親水性高分子層だけは電極全面に形成し、酵素を含む酵素層だけを測定極上のみに設けるという考え方もあるが、親水性高分子層を塗布・乾燥した後に、測定極上のみに酵素が溶解した試料液を塗布・乾燥させて酵素層を測定極上に局在するように形成するのは極めて困難であり、このような製造方法を採るとセンサ一個体ごとにバラツキが生じることは避けられないので現実的ではない。
さらに、上記した従来のバイオセンサのように、測定極と対極との両方に渡って酵素反応層を設けるという従来の構造は、上記したコスト面に関する問題の他にも、対極が試料液中の基質と酵素との反応生成物と相互作用を起こし易く、測定結果に影響を及ぼす可能性があるという根本的な問題点もある。
また、中性脂肪の測定には、血液中に含まれているグリセロールの値を用いるが、血液中には、センサー上での中性脂肪分解反応によって生じたグリセロールと、血液中に元々存在していたグリセロール、すなわち遊離グリセロールがあるため、遊離グリセロールの値を勘案して中性脂肪由来のグリセロールを測定しなければならないが、簡易のセンサでは、遊離グリセロールの値を正確に測定できるものが従来なかったため、中性脂肪濃度の真値に、遊離グリセロール分の濃度（１０％程度）が上乗せされた値を測定値としていた。しかし、実際には、遊離グリセロールの量は検体によって異なるため、この測定方法では必ずしも正確な中性脂肪の値が測定できているとはいえなかった。最近では、大型の生化学汎用測定器において測定された、遊離グリセロール分が差し引かれた値が、より正確な測定値として広く認知されており、簡易のセンサによる、遊離グリセロール濃度を含む測定値は、それよりも正確度の低い数値として取り扱われているのが実状である。
本発明は、上記した簡易型センサにおける従来の問題点を解決し、測定精度を落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツキが極めて少ない中性脂肪測定用センサを提供することを目的としている。
また、本発明は、上記した従来の問題点を解決し、正確な中性脂肪の値を測定することができる中性脂肪測定用センサを提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記した目的を達成するために本発明に係る中性脂肪測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成し、かつ、絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定極上に、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体から成る層を設けたことを特徴とするものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に示した幾つかの実施例を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサの実施の形態について説明する。
始めに、図１〜図５を参照して本発明に係る中性脂肪測定用センサの第１の実施例について説明していく。
図１は、本発明に係る中性脂肪測定用の一実施例の展開図、図２は、図１に示した中性脂肪測定用センサの組立完成品の部分断面図、図３は、図１に示した中性脂肪測定用センサの中央断面図を各々示している。
図中符号１は、絶縁性基板を示している。この絶縁性基板１の上には、カーボンペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより第１測定極２及び第２測定極３が形成されており、また、銀／塩化銀ペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより対極４が形成されている。前記測定極２と第２測定極３とは、対極４を中心として左右対称となる位置に形成されている。また、前記測定極２、第２測定極３、及び対極４は、測定部分２ａ、３ａ、４ａ及び端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂ以外は絶縁層５で覆われる。
図中符号６は、絶縁性材料で形成された保持枠を示している。この保持枠６は、図２に示すように前記端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂを残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に形成されており、また、前記測定部分２ａ、３ａ、４ａと対応する位置には、後述する酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９を保持する孔６ａ、６ｂ、６ｃが形成されている。
酵素反応層７は、第１測定極２の測定部分２ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポタンパク中の中性脂肪を分解し、中性脂肪由来のグリセロールを生成するためのリポプロテインリパーゼ、グリセロールをリン酸化するためのグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸を酸化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するためのグリセロリン酸オキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。このコンジュゲートリリースパッドは、イムノクロマトグラフィー用センサーデバイスの構成要素として開発されたろ紙であり、ガラス繊維などの表面に、必要に応じ特殊なコーティングを施したものを材料とする。このろ紙は、たんぱく質等の吸着量が低いという特徴を有し、これを酵素反応層の保持体として適用すると、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を奏する。また、繊維の微細なコンジュゲートリリースパッド用いることにより、より多くの酵素を保持させることができ、それにより、さらに反応速度が短縮するという効果を奏する。
酵素反応層８は、第２測定極３の測定部分３ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポプロテインリパーゼを含んでいないこと以外は、全て、酵素反応層７と同一の条件、即ち、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
界面活性剤保持層９は、対極４の測定部分４ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、界面活性剤を保持させたろ紙、例えば、ポリエステル繊維ろ紙で形成されている。前記界面活性剤としては、例えば、トリトンＸ−１００（製品名）等）を用いることができる。
図中、符号１０は、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００（製品名））、塩化マグネシウム及び電子受容体としてのフェリシアンイオンを保持させたろ紙（例えば、ポリエステル繊維ろ紙）から成る保持層を示している。この保持層１０は、前記酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９の上面に、これらを覆うように載置される処理層であり、その中心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持層９の同軸上に配置された時に、前記酵素反応層７及び８を覆うことができるよう寸法決めされている。
また、図中、符号１１は、血球分離膜を示している。この血球分離膜１１は、グリセロールキナーゼの補酵素としてのアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと称します。）を保持させたろ紙（例えば、ガラス繊維ろ紙）から成り、前記保持層１０と同様、その中心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持層９の同軸上に配置され時に、前記保持層１０を覆うことができるよう寸法決めされている。
図中、符号１２は、カバーを示している。図４は、カバー１２を底面から見た斜視図である。図４に示すように、このカバー１２は、絶縁性材料、例えば、適当な樹脂で形成された底面が開口した箱体から成る。カバー１２は、その上壁１２ａの内面１２ｂに、前記保持層１０及び血球分離膜１１を嵌め込むことができる凹部１２ｃが形成されている。前記凹部１２ｃの深さの寸法は、前記保持層１０と血球分離膜１１とを重ねた時の厚みに合わせられ、組み立てた時に、上壁１２ａの内面１２ｂと、前記保持枠６の上面とが当たるようにされており、また、その形状は、前記保持層１０及び血球分離膜１１を位置決めできるように、保持層１０の形状に合わせられている（図２及び図３参照）。
また、カバー１２の上壁１２ａには、試料液を導入するための開口１２ｄが設けられている。この開口１２ｄの位置及び大きさは、試料液の導入位置を制限して、試料液を保持層１０の中心に導入できるように決められ、これにより、前記第１測定極２と第２測定極３との中間位置に試料液が導入できるようになる（図３参照）。
さらに、カバー１２の前壁１２ｅには、切り欠き１２ｆが形成されており（図４参照）、組み立てた時に、基板１の上の端子部分２ｂ、３ｂ、４ｂが、この切り欠き１２ｆから突出するようにされている（図２参照）。
【０００６】
上記した中性脂肪測定用センサは、基板１上に、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９を保持した保持枠６を載置し、保持枠６の上に、前記保持層１０及び血球分離膜１１を積層し、さらに、カバー１２を被せて、カバー１２と基板１とを適当な方法で固定することにより、基板１とカバー１２との間に、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９を保持した保持枠６と、前記保持層１０と、血球分離膜１１とを挟み込んで固定することで組み立てられる。尚、組み立て順序及び方法は前記の方法に限定されるものではなく、任意の方法でよく、例えば、カバー１２側から組み立ててもよいことは勿論である。
基板１とカバー１２とを固定する方法は、任意の方法でよく、例えば、保持枠６の上面及び下面に接着剤を塗布して保持枠６を介して基板１とカバー１２とを固定してもよく、また、基板１及び／又はカバー１２に適当な係止部材を設けて固定してもよく、さらにまた、カバー１２に基板１をスライド嵌合可能な溝を設けて固定してもよい。
【０００７】
以上説明したように構成された中性脂肪測定用センサの開口１２ｄから試料液を滴下すると試料液が血球分離膜１１、前記保持層１０を通過する際に試料液中にＡＴＰ、塩化マグネシウム、界面活性剤及び電子受容体としてのフェリシアンイオンが溶解する。
次いで、酵素反応層７を通過する試料液には、リポプロテインリパーゼが溶解し、この酵素により試料液のリポたんぱく中の中性脂肪が分解され、グリセロール及び脂肪酸が生成される。さらに、酵素反応層７において、試料液中にグリセロールキナーゼが溶解し、この酵素とＡＴＰとによりグリセロール−３−リン酸及びＡＤＰが生成される。さらに、グリセロリン酸オキシダーゼが、グリセロール−３−リン酸を酸化すると共に、試料液中に溶解したフェリシアンイオンを還元してジヒドロキシアセトン−３−リン酸及びフェロシアンイオンを生成する。
この酵素反応層２２では、前記したようにリポプロテインリパーゼによりリポ蛋白中の中性脂肪から生成されたグリセロールが含まれているので、ここで生成されるフェロシアンイオンの値は、遊離グリセロールと中性脂肪由来のグリセロールとの両方から得られた値になる。
一方、酵素反応層８を通過する試料液には、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシダーゼが溶解し、これらの酵素によりフェロシアンイオンが生成されるが、この酵素反応層８には、リポプロテインリパーゼが含まれていないので、中性脂肪由来のグリセロールは生成されず、従って、この酵素反応層８で得られるフェロシアンイオンの値は、遊離グリセロールから得られる値となる。
次いで、第１測定極２及び第２測定極３と、対極４との間に、適当な電圧を印加し、その時に、第１測定極２と対極４との間に流れる電極応答電流の値から中性脂肪由来のグリセロール及び遊離グリセロールの合計の濃度が算出され、第２測定極３と対極４との間に流れる電極応答電流の値から遊離グリセロールの濃度が算出され、これらの差をとることにより、中性脂肪濃度を算出することができる。
尚、上記したように、酵素反応層７，８及び界面活性剤保持層９は、それぞれ、第１測定極２、第２測定極３、及び対極４上に載置された後、基板１とカバー１２とで挟まれて固定されているだけなので、各層７，８，９と各極２，３，４とは、完全に一体化しているわけではない。従って、層７，８，９と各極２，３，４との間には、必ず、微小な隙間が生じてしまい、その隙間に空気が残存してしまうが、第１測定極２、第２測定極３及び対極４に達する試料液中には、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤が、疎水性の第１測定極２、第２測定極３、及び対極４と、試料液との界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極２，３，４と、試料液との間に気泡の残存はなくなり、各極２，３，４の濡れが一様になり、測定値が安定する。
【０００８】
各層を下記の条件で構成し、鶏卵黄を、ウシ血清アルブミン７％、リン酸緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）、塩化ナトリウム１５０ｍＭの組成の水溶液にて希釈し、中性脂肪濃度を適当に調整した４つの試料液ａ〜ｄを開口１２ｄより滴下したときの測定結果を図５に示す。

図５の測定結果に示すように試料液ａ〜ｄの測定結果は、１直線上に乗っており、安定した中性脂肪濃度が測定できることが分かる。
【０００９】
次にに、図６を参照して本発明に係る中性脂肪測定用センサの第２の実施例を説明する。
図６は、上記した第１実施例の中性脂肪測定用センサに、さらに、コレステロール測定機能を加え、かつ全血測定をも可能としたコレステロール及び中性脂肪測定用センサの展開図を示している。
図中、符号１は絶縁性基板を、符号２は中性脂肪用第１測定極、符号３は中性脂肪用第２測定極、符号４は対極、符号５は絶縁層、符号６は保持枠、符号７及び８は酵素反応層、符号９は界面活性剤保持層、符号１０は界面活性剤、塩化マグネシウム及び電子受容体を保持する保持層、符号１１は血球分離膜及び符号１２はカバーを各々示している。前記第１測定極２及び第２測定極３は、対極４を中心として左右対称に配置され、酵素反応層７、８及び界面活性剤保持層９は、組立時に保持枠６により第１測定極、第２測定極３及び対極４上の保持される。これらの構成部材は、基本的に上記した第１の実施例と同じ構成なので、重複する説明はここでは省略する。
【００１０】
前記絶縁性基板１には、コレステロール測定用の第３測定極２０及び第４測定極２１が、前記対極４を中心として左右対称となる位置に形成されている。これらのコレステロール測定用の測定極２０及び２１は、中性脂肪測定用の測定極と同様、カーボンペーストをスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより形成されており、また、その測定部分２０ａ及び２１ａ並びに端子部分２０ｂ及び２１ｂ以外の部分は絶縁層５で覆われている。
前記保持枠６は、端子部分２ｂ，３ｂ，４ｂ，２０ｂ，２１ｂを残して絶縁性基板１の上面を覆える寸法に形成されており、また、孔６ａ〜６ｃに加えて、前記中性脂肪測定用の測定極２０及び２１と対応する位置に、後述する酵素反応層２２及び２３を保持する孔６ｄ，６ｅが形成されている。
酵素反応層２２は、第３測定極２０の測定部分２０ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、リポプロテインを分解するためのリポプロテインリパーゼ、コレステロールエステルを加水分解するためのコレステロールエステラーゼ、コレステロールを酸化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するためのコレステロールオキシダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
酵素反応層２３は、第４測定極２１の測定部分２１ａの上に載置されるよう前記保持枠６により保持される処理層であり、コレステロールオキシダーゼを含んでいないこと以外は、全て、酵素反応層７と同一の条件、即ち、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。
【００１１】
上記したコレステロール及び中性脂肪測定用センサは、前記第１実施例に挙げた中性脂肪測定用センサと同様に組み立てられる。
【００１２】
以上説明したように構成されたコレステロール及び中性脂肪測定用センサの作用について説明する。
開口１２ｄから試料液を滴下すると、試料液が血球分離膜２４、前記保持層１０を通過する際に試料液中にＡＴＰ、塩化マグネシウム、界面活性剤及び電子受容体としてのフェリシアンイオンが溶解する。
前記した処理層２４及び１０を通過した試料液は、酵素反応層７及び８を通り通過し、第１測定極２、第２測定極３、及び対極４に至り、これらの電極間に適当な電圧をかけることにより、その時の電極応答電流の値から中性脂肪成分の濃度が算出され得る。酵素反応層７及び８における反応は、先に説明した第１実施例と同じなのでここでは、その説明は省略する。
一方、酵素反応層２２を通過する試料液には、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼが溶解し、これらの酵素が試料液中のコレステロールエステルを加水分解してコレステロールを生成し、さらに、コレステロールオキシダーゼがコレステロールを酸化し、血液中に溶解したフェリシアンイオンを還元してコレステ−４-エン−３−オン及びフェロシアンイオンを生成する。
他方、酵素反応層２３を通過する試料液には、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステラーゼが溶解してコレステロールエステルからコレステロールが生成される。しかし、酵素反応層８には、コレステロールオキシダーゼは保持されていないので、フェロシアンイオンは生成されない。
次いで、第３測定極２０及び第４測定極２１と、対極４との間に、適当な電圧をかけ、その時に、第３測定極２０と対極４との間に流れる電極応答電流の値Ａと、第４測定極２１と対極４との間に流れる電極応答電流の値Ｂとを測定し、電流値Ａからを電流値Ｂを引いた値からコレステロール成分の濃度を算出する。
第３測定極２０に達する試料液中にはコレステロールの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれているため、対極４との間には、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流が流れるが、第４測定極２１に達する試料液中にはコレステロールの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれていないので、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流は流れない。しかし、第３測定極２０と第４測定極２１とは、酵素反応層２３にコレステロールオキシダーゼが保持されていないこと以外の条件は同一である。従って、上記したように、電極応答電流値Ａから電極応答電流値Ｂとを引くと、フェロシアンイオンの酸化時に生じる酸化電流値のみが残るので、その値からコレステロール成分の濃度を算出することが可能になる。
尚、各酵素反応層７，８，２２，２３、界面活性剤保持層９は、それぞれ、各測定極２，３，２０，２１及び対極４上に載置された後、基板１とカバー１２とで挟まれて固定されているだけなので、各層７，８，２２，２３，９と各極２，３，２０，２１，４とは、完全に一体化しているわけではないが、各極２，３，２０，２１，４に達する試料液中には、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤が、疎水性の各極２，３，２０，２１，４と試料液との界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極２，３，２０，２１，４と、試料液との間に気泡の残存はなくなり、各極２，３，２０，２１，４の濡れが一様になり、測定値が安定する。
【００１３】
各層を下記の条件で構成し、下記の人血清１〜６を開口１２ｄより滴下したときのコレステロール並びに中性脂肪の測定結果を図７（ａ）及び（ｂ）に各々示す。

図７の測定結果に示すように試料液１〜６の測定結果は、好適な値を示しており、安定したコレステロール濃度並びに中性脂肪濃度の測定を同時に行うことができることが分かる。
一般的に、健康診断では患者の血液からコレステロール濃度と中性脂肪濃度との両方を測定することが多く、このように、コレステロールと中性脂肪とを同時に測定できるように構成することにより、２度測定する必要がなくなるので診療の効率化を図ることができ、また、検体の量を減らすことができるので患者に与える負担を軽減させることができるようになる。
【００１４】
以上説明した中性脂肪測定用センサは、第１実施例及び第２実施例共に、第１測定極２及び第２測定極３を対極４を中心として対称に配置し、さらに、試料液を、第１測定極２と第２測定極３との中間位置に導入できるようにカバー１２の開口１２ｄを形成しているので、第１測定極２と第２測定極３とに到達する試料液を均等にすることができ、これにより、第１測定極２及び第２測定極３の条件を、リポプロテインリパーゼ以外の部分で同一にすることができるようになり、第１測定極２の値を第２測定極３の値で補正することによる測定の精度をより上げることが可能になる。
また、以上説明した中性脂肪測定用センサは、界面活性剤を用いることにより、各処理層を基板と別体に構成することを可能にしており、その結果、各処理層をろ紙で形成できるようにしている。ろ紙で各処理層を形成する場合、一つのろ紙に必要な試薬を保持させた後、そこから、複数個の処理層を切り出して、複数のセンサの製造に用いることができる。このように製造することで、各処理層の条件を合わせやすくなるので、処理層を塗布・乾燥して製造する場合に比べて、センサの性能のバラツキを小さくすることができる。また、このように製造することで、処理層の製造工程と、センサの組み立て工程とを分離することができるので、センサを効率的に製造することができるようになる。さらに、このように各処理層をろ紙で製造することにより、対極上の処理層と測定極上の処理層を分けることができるようになり、その結果、高価なコレステロールオキシダーゼを、必要もないのに対極上に設ける必要がなくなるので、製造コストを安価にすることができる。
さらにまた、親水性高分子を用いて各処理層を、塗布・乾燥して形成する場合、製造コストの高騰を防ぐために、測定極と対極とに跨って親水性高分子層を形成する必要があるので、上記した実施例のように、測定極を二つ設け、一方の測定極（即ち、第１測定極）にリポプロテインリパーゼを含む酵素反応層を形成し、他方の測定極（即ち、第２測定極）にリポプロテインリパーゼを含まない酵素反応層を形成することにより、中性脂肪由来のグリセロール及び遊離グリセロールの合計値と、遊離グリセロールのみの値とを測定し、これらの差から中性脂肪濃度を測定するように構成するセンサを塗布・乾燥が必要な親水性高分子層を用いて製造する場合には、親水性高分子層を介して一方の測定極上の酵素反応層から、他方の測定極に酵素が混入しないように、二つの測定極上の親水性高分子層を完全に分離する必要がある。そのため、対極と測定極とからなる電極を二つ形成し、その各々に別個に親水性高分子層を形成する必要があるので、上記した中性脂肪測定用センサに比べて対極が一つ多くなり、材料費や製造工程が増え、製造コストが高くなるという問題が生じると共に、二つの測定極間の条件を合わせることが難しくなるという問題がある。このような観点からみると、本発明に係る中性脂肪測定用センサは、測定極を二つ設けて、各測定極間に生じる電流値の差に基づいて基質濃度を測定するセンサを、従来のバイオセンサに比べて、より、安価に、かつ、精度よく製造することができるよういう効果も奏する。
また、以上説明したセンサは、酵素反応層を測定極上のみに設けることができるように構成し、かつ、酵素反応層の保持体としてコンジュゲートリリースパッドを用いているので、無駄に酵素を使用することなく酵素濃度を高めることができるという効果を奏し、酵素濃度を高めることにより、反応速度をより高めることができるようになるという効果を奏する。
【００１５】
本発明に係る中性脂肪測定用センサの構成は上記した実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の概念内で任意に変更することができる。具体的には、上記した第１の実施例では、電子受容体、界面活性剤及び酵素を各処理層に分離しているが、これらは、一つのろ紙に保持させて構成してもよく、また、図８〜図１０に示すようにろ紙に保持される試薬の組合せも任意に決めることができ、さらに、積層順序も任意に変更することができる。これは、血球分離膜１１についても同様である。
さらに、第１実施例及び第２実施例における第２測定極３上の保持層に、第１測定極２のリポプロテインリパーゼに相当する量のたんぱくを保持させることにより、また、第２実施例における第４測定極２１上に、第３測定極２０のコレステロールオキシダーゼに相当する量のたんぱくを保持させることにより、第２測定極３上の保持層にリポプロテインリパーゼがないことによる第１測定極２との試料反応時の粘性の違いや、第４測定極２０上にコレステロールオキシダーゼがないことによる第３測定極２０との試料反応時の粘性の違いを補完してもよく、このように構成することにより測定精度はさらに高まる。
【００１６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る中性脂肪測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成し、かつ、絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定極上に、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体から成る層を設けているので、測定精度を落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツキが極めて少ない中性脂肪測定用センサを提供することが可能になるという効果を奏する。
また、絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定上に、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体から成る層を設けているので、中性脂肪由来のグリセロールと遊離グリセロールの合計値と、遊離グリセロールのみの値との両方を算出することができるようになり、簡易なセンサでより正確な中性脂肪の測定を行うことができるようになるという効果を奏する。
また、前記第１層をリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ，グリセロリン酸オキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤及び電子受容体保持層とで形成することにより、測定極と対極とに共通に必要な界面活性剤を保持する処理層を一体化することが可能になり、製造及び組み立て工程をより簡略化することができるようになるという効果を奏する。
さらに、前記酵素反応層に、コンジュゲートリリースパッドを用いることにより、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を奏する。
さらに、試料液を前記測定極と前記第２測定極との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けることで、使用者が試料液の滴下位置を意識する必要がなくなるので、測定が簡単に行えるようになるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る中性脂肪測定用センサの第一実施例の展開図
【図２】図１に示した中性脂肪測定用センサの組立完成品の部分断面図
【図３】図１に示した中性脂肪測定用センサの中央横断面図
【図４】カバー１２を底面から見た斜視図
【図５】図１〜図４に示した中性脂肪測定用センサを用いた中性脂肪濃度の測定結果を示すグラフである。
【図６】本発明に係る中性脂肪測定用センサの構造を適用したコレステロール及び中性脂肪測定用センサの展開図である。
【図７】（ａ）は図６に示したコレステロール測定用センサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグラフであり、（ｂ）は同センサを用いた中性脂肪濃度の測定結果を示すグラフである。
【図８】本発明に係る中性脂肪測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【図９】本発明に係る中性脂肪測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【図１０】本発明に係る中性脂肪測定用センサの各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
【符号の説明】
１絶縁性基板
２第１測定極（中性脂肪測定用）
２ａ測定部分
２ｂ端子部分
３第２測定極（中性脂肪測定用）
３ａ測定部分
３ｂ端子部分
４対極
４ａ測定部分
４ｂ端子部分
５絶縁層
６保持枠
６ａ保持孔（酵素反応層７の保持用）
６ｂ保持孔（酵素反応層８の保持用）
６ｃ保持孔（界面活性剤保持層９の保持用）
（６ｄ保持孔（酵素反応層２２の保持用））
（６ｅ保持孔（酵素反応層２３の保持用））
７酵素反応層（中性脂肪測定用の第１測定極用）
８酵素反応層（中性脂肪測定用の第２測定極用）
９界面活性剤保持層
１０界面活性剤及び電子受容体保持層
１１血球分離膜
１２カバー
１２ａ上壁
１２ｂ上壁の内面
１２ｃ凹部
１２ｄ開口（試料液滴下用）
１２ｅ前壁
１２ｆ切り欠き
２０第３測定極（コレステロール測定用）
２０ａ測定部分
２０ｂ端子部分
２１第４測定極（コレステロール測定用）
２１ａ測定部分
２１ｂ端子部分
２２酵素反応層（コレステロール測定用）
２３酵素反応層（コレステロール測定用）[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor for measuring a neutral fat component in a sample solution such as whole blood, plasma, serum, or standard solution.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, an electrode system comprising a measuring electrode and a counter electrode is formed on a substrate, and an enzyme reaction layer comprising a porous body carrying an enzyme and an electron acceptor is provided on this electrode system, and these are covered appropriately. An integrated biosensor has been proposed.
In this biosensor, a sample liquid such as blood is dropped on an enzyme reaction layer to dissolve the enzyme and the electron acceptor in the sample liquid, and the enzyme is intervened between the enzyme and the electron acceptor and a specific substrate in the sample liquid. After the reaction proceeds to reduce the electron acceptor, the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized, and the concentration of a specific substrate in the sample solution is obtained from the oxidation current value obtained at this time.
However, in the above-described configuration, wetting of the substrate surface including the electrode system is not necessarily uniform, so that bubbles remain between the porous body and the substrate, affecting the response current and reducing the reaction rate. there were.
Registration No. 2502665 proposes to provide an enzyme reaction layer composed of a hydrophilic polymer and an enzyme on an electrode system composed of a measurement electrode and a counter electrode as a method for solving the above-mentioned conventional problems. Yes.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, as described above, the method for preventing bubbles from remaining between the enzyme reaction layer and the electrode using the hydrophilic polymer needs to integrate the layer containing the hydrophilic polymer and the electrode system without any gap. Therefore, first, after forming a hydrophilic polymer layer after forming a hydrophilic polymer in solution and applying it on the electrode, an enzyme layer containing an enzyme must be formed on the hydrophilic polymer layer. There was a problem that there was a manufacturing restriction that it was not possible. Such a production method has a problem that it takes time for production because the formation of the enzyme layer can be started only after the hydrophilic polymer layer is formed. In addition, since the manufacturing method using the coating / drying process tends to vary in the amount of solution to be applied at the time of coating, when manufacturing multiple sensors, the concentration of the hydrophilic polymer or enzyme varies among the sensors. There is also a problem that it is likely to occur.
In addition, since the conventional biosensor described above has an enzyme reaction layer straddling both the measurement electrode and the counter electrode, it is not necessary to provide an enzyme reaction layer on the counter electrode. There is also a problem that becomes high.
Enzymes are expensive and inexpensive, so the magnitude of the problem described above depends on the type of substrate to be measured, that is, the type of enzyme, but it measures neutral fat. In some cases, lipoprotein lipase, glycerol kinase, and glycerophosphate oxidase, which are effective enzymes for measuring neutral fat, are expensive, which is a big problem.
In order to solve this manufacturing cost problem, it is necessary to provide an enzyme only on the measurement electrode. However, as described above, in the conventional biosensor, first, a hydrophilic polymer is applied as a solution and dried. Therefore, if an enzyme reaction layer is to be provided only on the measurement electrode, the hydrophilic polymer is first applied and dried separately on both the measurement electrode and the counter electrode. Since a hydrophilic polymer layer has to be formed on each of them, there is a problem that the coating / drying steps increase, resulting in an increase in manufacturing cost. Since it is desirable to provide the hydrophilic polymer on both the measurement electrode and the counter electrode, in order not to increase the coating and drying process, only the hydrophilic polymer layer is formed on the entire surface of the electrode and only the enzyme layer containing the enzyme is measured. Although there is a concept that it is provided only on the top, after applying and drying the hydrophilic polymer layer, the sample solution in which the enzyme is dissolved is applied and dried only on the measurement pole so that the enzyme layer is localized on the measurement pole. It is extremely difficult to do this, and if such a manufacturing method is adopted, it will be unavoidable that variations will occur for each individual sensor.
Further, as in the conventional biosensor described above, the conventional structure in which the enzyme reaction layer is provided over both the measurement electrode and the counter electrode has a counter electrode in the sample solution in addition to the above-described problems related to cost. There is also a fundamental problem that the reaction product of the substrate and the enzyme is likely to interact and may affect the measurement result.
For the measurement of triglycerides, the value of glycerol contained in blood is used, but in blood, glycerol produced by triglyceride reaction on the sensor and originally present in blood. Since there is glycerol, that is, free glycerol, it is necessary to measure glycerol derived from neutral fat in consideration of the value of free glycerol, but with a simple sensor, the one that can accurately measure the value of free glycerol has been conventionally Therefore, the value obtained by adding the concentration of free glycerol (about 10%) to the true value of the neutral fat concentration was used as the measurement value. However, in practice, since the amount of free glycerol varies depending on the specimen, it cannot be said that this measurement method can always measure an accurate neutral fat value. Recently, the value obtained by subtracting the free glycerol content measured by a large-scale biochemical general-purpose measuring instrument is widely recognized as a more accurate measurement value. In reality, it is treated as a numerical value with lower accuracy than that.
The present invention provides a neutral fat measurement sensor that solves the conventional problems in the simple sensor described above, can be easily manufactured at low cost without degrading measurement accuracy, and has very little variation in quality. It is intended to provide.
Another object of the present invention is to provide a sensor for measuring triglycerides capable of solving the above-described conventional problems and measuring an accurate triglyceride value.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, a neutral fat measurement sensor according to the present invention forms an electrode system having at least a measurement electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and reacts an enzyme, an electron acceptor and a sample solution. In a sensor for electrochemically detecting a change in substance concentration of the sample with the electrode system and measuring the substrate concentration of the sample solution, on the measurement electrode, lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, Surfactants and electron acceptorsAnd a holder through which the sample solution can pass is placed to form a first layer, and a holder that holds the surfactant and through which the sample solution can pass is placed on the counter electrode. To form a second layerIn addition, a second measurement electrode is provided at a position corresponding to the measurement electrode across the counter electrode on the insulating substrate, and glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, a surfactant and an electron acceptor are provided on the second measurement electrode. A layer made of a holder that holds and allows the sample liquid to pass through is provided.It is characterized by this.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the cholesterol measuring sensor according to the present invention will be described with reference to several examples shown in the accompanying drawings.
First, a first embodiment of a neutral fat measurement sensor according to the present invention will be described with reference to FIGS.
FIG. 1 is a development view of an embodiment for measuring neutral fat according to the present invention, FIG. 2 is a partial cross-sectional view of an assembled product of the sensor for measuring neutral fat shown in FIG. 1, and FIG. The center sectional drawing of the sensor for neutral fat measurement shown in 1 is shown, respectively.
Reference numeral 1 in the drawing denotes an insulating substrate. On the insulating substrate 1, a carbon paste is screen-printed and then heated and dried to form a first measurement electrode 2 and a second measurement electrode 3, and a silver / silver chloride paste is screen-printed. After that, the counter electrode 4 is formed by heating and drying. The measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 are formed at positions that are symmetrical with respect to the counter electrode 4. The measurement electrode 2, the second measurement electrode 3, and the counter electrode 4 are covered with an insulating layer 5 except for the

measurement portions

2a, 3a, and 4a and the

terminal portions

2b, 3b, and 4b.
Reference numeral 6 in the figure denotes a holding frame made of an insulating material. As shown in FIG. 2, the holding frame 6 is formed to have a dimension that covers the upper surface of the insulating substrate 1 while leaving the

terminal portions

2b, 3b, and 4b, and the

measurement portions

2a, 3a, and 4a. At the corresponding positions,

holes

6a, 6b, and 6c for holding

enzyme reaction layers

7 and 8 and a surfactant holding layer 9 described later are formed.
The enzyme reaction layer 7 is a treatment layer held by the holding frame 6 so as to be placed on the measurement portion 2 a of the first measurement electrode 2, and decomposes neutral fat in lipoproteins to neutral fat. Lipoprotein lipase for producing glycerol derived from, glycerol kinase for phosphorylating glycerol, glycerol-3-phosphate is oxidized and ferricyan ion as an electron acceptor described later is reduced to ferrocyan ion It is formed of filter paper holding glycerophosphate oxidase for producing. As the filter paper, for example, filter paper made of polyester fiber can be used, and preferably a conjugate release pad can be used. This conjugate release pad is a filter paper developed as a component of a sensor device for immunochromatography, and is made of a material such as a glass fiber with a special coating as necessary. This filter paper has the feature that the adsorption amount of protein etc. is low, and when this is applied as a support for the enzyme reaction layer, when the sample solution is introduced into the enzyme reaction layer, the reagent is quickly released and the reaction is completed. There is an effect that the time until is greatly shortened. Further, by using a fine conjugate release pad of fibers, more enzyme can be retained, thereby producing an effect of further reducing the reaction rate.
The enzyme reaction layer 8 is a treatment layer held by the holding frame 6 so as to be placed on the measurement part 3a of the second measurement electrode 3, and all of the enzyme reaction layer 8 except that it does not contain lipoprotein lipase. The reaction layer 7 is formed under the same condition, that is, a filter paper holding glycerol kinase and glycerophosphate oxidase. As the filter paper, for example, filter paper made of polyester fiber can be used, and preferably a conjugate release pad can be used.
The surfactant holding layer 9 is a treatment layer held by the holding frame 6 so as to be placed on the measurement portion 4a of the counter electrode 4, and is a filter paper holding a surfactant, for example, a polyester fiber filter paper. Is formed. As the surfactant, for example, Triton X-100 (product name) can be used.
In the figure, reference numeral 10 denotes a retaining layer comprising a surfactant (for example, Triton X-100 (product name)), magnesium chloride and filter paper (for example, polyester fiber filter paper) retaining ferricyan ion as an electron acceptor. Is shown. The retention layer 10 is a treatment layer placed on the upper surfaces of the enzyme reaction layers 7 and 8 and the surfactant retention layer 9 so as to cover them, and has a symmetrical shape with respect to the central axis. The dimension is determined so that the enzyme reaction layers 7 and 8 can be covered when placed on the same axis of the surfactant holding layer 9.
In the drawing, reference numeral 11 denotes a blood cell separation membrane. The blood cell separation membrane 11 is made of filter paper (for example, glass fiber filter paper) holding adenosine triphosphate (hereinafter referred to as ATP) as a coenzyme for glycerol kinase. It has a shape symmetrical to the central axis and is dimensioned so that it can cover the retaining layer 10 when placed on the same axis as the surfactant retaining layer 9.
In the figure, reference numeral 12 denotes a cover. FIG. 4 is a perspective view of the cover 12 as viewed from the bottom. As shown in FIG. 4, the cover 12 is made of a box body having an open bottom made of an insulating material, for example, a suitable resin. The cover 12 has a recess 12c in which the holding layer 10 and the blood cell separation membrane 11 can be fitted in the inner surface 12b of the upper wall 12a. The depth dimension of the recess 12c is adjusted to the thickness when the holding layer 10 and the blood cell separation membrane 11 are overlapped, and when assembled, the inner surface 12b of the upper wall 12a and the upper surface of the holding frame 6 are The shape of the holding layer 10 is matched with the shape of the holding layer 10 so that the holding layer 10 and the blood cell separation membrane 11 can be positioned (see FIGS. 2 and 3).
Further, an opening 12d for introducing a sample solution is provided in the upper wall 12a of the cover 12. The position and size of the opening 12d are determined so that the sample liquid can be introduced into the center of the holding layer 10 by restricting the introduction position of the sample liquid, whereby the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode can be introduced. The sample solution can be introduced at a position intermediate to 3 (see FIG. 3).
Further, a notch 12f is formed in the front wall 12e of the cover 12 (see FIG. 4), and when assembled, the

terminal portions

2b, 3b, 4b on the substrate 1 protrude from the notch 12f. (See FIG. 2).
[0006]
In the above-described sensor for measuring neutral fat, the holding frame 6 holding the enzyme reaction layers 7 and 8 and the surfactant holding layer 9 is placed on the substrate 1, and the holding layer 10 is put on the holding frame 6. And the blood cell separation membrane 11 are further laminated, and the cover 12 is covered, and the cover 12 and the substrate 1 are fixed by an appropriate method, whereby the enzyme reaction layers 7, 8 and It is assembled by sandwiching and fixing the holding frame 6 holding the surfactant holding layer 9, the holding layer 10 and the blood cell separation membrane 11. Note that the assembly order and method are not limited to the above-described method, and any method may be used. For example, the assembly may be performed from the cover 12 side.
The substrate 1 and the cover 12 may be fixed by any method. For example, an adhesive is applied to the upper and lower surfaces of the holding frame 6 and the substrate 1 and the cover 12 are fixed via the holding frame 6. Alternatively, the substrate 1 and / or the cover 12 may be provided with an appropriate locking member and fixed, and the cover 12 may be fixed with a groove in which the substrate 1 can be slidably fitted. .
[0007]
When the sample solution is dropped from the opening 12d of the neutral fat measurement sensor configured as described above, the sample solution passes through the blood cell separation membrane 11 and the holding layer 10 and the sample solution contains ATP, magnesium chloride, and an interface. The activator and ferricyan ions as electron acceptors dissolve.
Next, lipoprotein lipase is dissolved in the sample solution passing through the enzyme reaction layer 7, and the neutral fat in the lipoprotein of the sample solution is decomposed by this enzyme to produce glycerol and fatty acid. Furthermore, in the enzyme reaction layer 7, glycerol kinase is dissolved in the sample solution, and glycerol-3-phosphate and ADP are generated by this enzyme and ATP. Further, glycerophosphate oxidase oxidizes glycerol-3-phosphate and reduces ferricyan ion dissolved in the sample solution to produce dihydroxyacetone-3-phosphate and ferrocyan ion.
Since the enzyme reaction layer 22 contains glycerol generated from the neutral fat in the lipoprotein by the lipoprotein lipase as described above, the value of the ferrocyanide ion generated here is free glycerol and medium. The value obtained from both glycerol derived from sex fat.
On the other hand, glycerol kinase and glycerophosphate oxidase are dissolved in the sample solution passing through the enzyme reaction layer 8, and ferrocyanide ions are generated by these enzymes. The enzyme reaction layer 8 contains lipoprotein lipase. Therefore, glycerol derived from neutral fat is not generated, and therefore the value of ferrocyan ion obtained in the enzyme reaction layer 8 is a value obtained from free glycerol.
Next, an appropriate voltage is applied between the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 and the counter electrode 4, and the value of the electrode response current flowing between the first measurement electrode 2 and the counter electrode 4 at that time is applied. The total concentration of glycerol derived from neutral fat and free glycerol is calculated from the calculated value, and the concentration of free glycerol is calculated from the value of the electrode response current flowing between the second measurement electrode 3 and the counter electrode 4, and the difference between them is calculated. Thus, the neutral fat concentration can be calculated.
As described above, the enzyme reaction layers 7 and 8 and the surfactant holding layer 9 are placed on the first measurement electrode 2, the second measurement electrode 3, and the counter electrode 4, respectively. Since it is only sandwiched and fixed between the cover 12, the

layers

7, 8, 9 and the

poles

2, 3, 4 are not completely integrated. Therefore, a minute gap is always generated between the

layers

7, 8, and 9 and the

poles

2, 3, and 4, and air remains in the gap. 2 Since the surfactant is dissolved in the sample solution reaching the measurement electrode 3 and the counter electrode 4, the surfactant is dissolved in the hydrophobic first measurement electrode 2, the second measurement electrode 3, and the counter electrode 4. , Because significant adsorption occurs at the interface with the sample liquid, no bubbles remain between the

electrodes

2, 3 and 4 and the sample liquid, and wetting of the

electrodes

2, 3 and 4 is uniform. The measured value is stable.
[0008]
Each layer is constructed under the following conditions, and chicken egg yolk is diluted with an aqueous solution of 7% bovine serum albumin, phosphate buffer 50 mM (pH 7.5), and sodium chloride 150 mM to adjust the neutral fat concentration appropriately. FIG. 5 shows the measurement results when the four sample liquids a to d were dropped from the opening 12d.

As shown in the measurement results of FIG. 5, the measurement results of the sample liquids a to d are on a straight line, and it can be seen that a stable neutral fat concentration can be measured.
[0009]
Next, a second embodiment of the neutral fat measurement sensor according to the present invention will be described with reference to FIG.
FIG. 6 shows a development view of the sensor for measuring cholesterol and triglyceride, in which a cholesterol measuring function is further added to the sensor for measuring triglyceride in the first embodiment and the whole blood can be measured. Yes.
In the figure, reference numeral 1 is an insulating substrate, reference numeral 2 is a first measuring electrode for neutral fat, reference numeral 3 is a second measuring electrode for neutral fat, reference numeral 4 is a counter electrode, reference numeral 5 is an insulating layer, and reference numeral 6 is retained. Frame,

reference numerals

7 and 8 are enzyme reaction layers, reference numeral 9 is a surfactant holding layer, reference numeral 10 is a holding layer for holding a surfactant, magnesium chloride and an electron acceptor, reference numeral 11 is a blood cell separation membrane, and reference numeral 12 is a cover Respectively. The first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 are arranged symmetrically with respect to the counter electrode 4, and the enzyme reaction layers 7 and 8 and the surfactant holding layer 9 are held by the holding frame 6 at the time of assembly. , Held on the second measurement electrode 3 and the counter electrode 4. Since these structural members are basically the same as those in the first embodiment described above, a duplicate description is omitted here.
[0010]
A third measurement electrode 20 and a fourth measurement electrode 21 for measuring cholesterol are formed on the insulating substrate 1 at positions that are symmetrical with respect to the counter electrode 4. These

measurement electrodes

20 and 21 for measuring cholesterol are formed by screen-printing a carbon paste and then drying by heating, similarly to the measurement electrodes for measuring neutral fat, and the

measurement parts

20a and 21a. The portions other than the

terminal portions

20b and 21b are covered with the insulating layer 5.
The holding frame 6 is formed to have a size that covers the upper surface of the insulating substrate 1 while leaving the

terminal portions

2b, 3b, 4b, 20b, and 21b. In addition to the holes 6a to 6c, the neutral fat is formed.

Holes

6d and 6e for holding enzyme reaction layers 22 and 23 described later are formed at positions corresponding to the

measurement electrodes

20 and 21 for measurement.
The enzyme reaction layer 22 is a treatment layer that is held by the holding frame 6 so as to be placed on the measurement portion 20a of the third measurement electrode 20, and contains lipoprotein lipase and cholesterol ester for decomposing lipoprotein. It is formed of a cholesterol esterase for hydrolysis, a filter paper that oxidizes cholesterol and holds cholesterol oxidase for reducing ferricyan ion as an electron acceptor described later to generate ferrocyanide ion. As the filter paper, for example, filter paper made of polyester fiber can be used, and preferably a conjugate release pad can be used.
The enzyme reaction layer 23 is a treatment layer held by the holding frame 6 so as to be placed on the measurement portion 21a of the fourth measurement electrode 21, and all the enzyme reactions except that it does not contain cholesterol oxidase. It is formed of the same condition as that of the layer 7, that is, a filter paper holding lipoprotein lipase and cholesterol esterase. As the filter paper, for example, filter paper made of polyester fiber can be used, and preferably a conjugate release pad can be used.
[0011]
The above cholesterol and neutral fat measurement sensor is assembled in the same manner as the neutral fat measurement sensor described in the first embodiment.
[0012]
The operation of the cholesterol and neutral fat measuring sensor configured as described above will be described.
When the sample solution is dropped from the opening 12d, ATP, magnesium chloride, a surfactant, and ferricyan ion as an electron acceptor are dissolved in the sample solution when the sample solution passes through the blood cell separation membrane 24 and the holding layer 10. .
The sample solution that has passed through the treatment layers 24 and 10 passes through the enzyme reaction layers 7 and 8, and reaches the first measurement electrode 2, the second measurement electrode 3, and the counter electrode 4, and an appropriate gap between these electrodes. By applying a voltage, the concentration of the neutral fat component can be calculated from the value of the electrode response current at that time. Since the reaction in the enzyme reaction layers 7 and 8 is the same as that in the first embodiment described above, the description thereof is omitted here.
On the other hand, in the sample solution passing through the enzyme reaction layer 22, lipoprotein lipase, cholesterol esterase, and cholesterol oxidase are dissolved, and these enzymes hydrolyze cholesterol esters in the sample solution to generate cholesterol, Cholesterol oxidase oxidizes cholesterol and reduces ferricyanide ions dissolved in blood to produce cholest-4-en-3-one and ferrocyanide ions.
On the other hand, in the sample solution passing through the enzyme reaction layer 23, lipoprotein lipase and cholesterol esterase are dissolved to produce cholesterol from cholesterol ester. However, since cholesterol oxidase is not retained in the enzyme reaction layer 8, ferrocyanide ions are not generated.
Next, an appropriate voltage is applied between the third measurement electrode 20 and the fourth measurement electrode 21 and the counter electrode 4, and at that time, the value A of the electrode response current flowing between the third measurement electrode 20 and the counter electrode 4. Then, the value B of the electrode response current flowing between the fourth measurement electrode 21 and the counter electrode 4 is measured, and the concentration of the cholesterol component is calculated from the value obtained by subtracting the current value B from the current value A.
Since the sample solution reaching the third measuring electrode 20 contains ferrocyan ion generated by the oxidation reaction of cholesterol, the oxidation generated when the ferrocyan ion is electrochemically oxidized with the counter electrode 4. Although current flows, since the ferrocyan ion generated by the oxidation reaction of cholesterol is not contained in the sample solution reaching the fourth measurement electrode 21, the oxidation current generated when ferrocyan ion is oxidized electrochemically flows. Absent. However, the third measurement electrode 20 and the fourth measurement electrode 21 have the same conditions except that the enzyme reaction layer 23 does not hold cholesterol oxidase. Therefore, as described above, when the electrode response current value B is subtracted from the electrode response current value A, only the oxidation current value generated during oxidation of the ferrocyan ion remains, so that the concentration of the cholesterol component can be calculated from that value. It becomes possible.
The enzyme reaction layers 7, 8, 22, 23 and the surfactant holding layer 9 are placed on the

measurement electrodes

2, 3, 20, 21 and the counter electrode 4, respectively, and then the substrate 1 and the cover 12. Each

layer

7, 8, 22, 23, 9 and each

pole

2, 3, 20, 21, 4 are not completely integrated, but each pole Since the surfactant is dissolved in the sample solution reaching 2, 3, 20, 21, and 4, this surfactant is added to each of the

hydrophobic electrodes

2, 3, 20, 21, and 4 and the sample solution. Causes significant adsorption at the interface between the

electrodes

2, 3, 20, 21, 4 and the sample liquid, so that no bubbles remain and each

electrode

2, 3, 20, 21, 4 gets wet. Becomes uniform and the measured value becomes stable.
[0013]
Each layer is configured under the following conditions, and the measurement results of cholesterol and neutral fat when human serum 1 to 6 below is dropped from the opening 12d are shown in FIGS. 7 (a) and 7 (b), respectively.

As shown in the measurement results of FIG. 7, the measurement results of the sample solutions 1 to 6 show suitable values, and it can be seen that stable cholesterol concentration and neutral fat concentration can be measured simultaneously.
In general, in a medical examination, both cholesterol concentration and triglyceride concentration are often measured from a patient's blood. Thus, by configuring so that cholesterol and triglyceride can be measured simultaneously, 2 Therefore, it is possible to improve the efficiency of medical care and to reduce the amount of the specimen, so that the burden on the patient can be reduced.
[0014]
In the neutral fat measurement sensor described above, the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 are arranged symmetrically around the counter electrode 4 in both the first and second embodiments, and the sample liquid is Since the opening 12d of the cover 12 is formed so that it can be introduced at an intermediate position between the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3, the sample solution reaching the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 can be removed. Accordingly, the conditions of the first measurement electrode 2 and the second measurement electrode 3 can be made the same in the portion other than the lipoprotein lipase, and the value of the first measurement electrode 2 can be changed. It becomes possible to further improve the accuracy of measurement by correcting with the value of the second measurement pole 3.
In addition, the neutral fat measurement sensor described above enables each processing layer to be formed separately from the substrate by using a surfactant, and as a result, each processing layer can be formed of filter paper. I am doing so. When forming each processing layer with filter paper, after holding a necessary reagent on one filter paper, a plurality of processing layers can be cut out therefrom and used for manufacturing a plurality of sensors. Manufacturing in this way makes it easy to match the conditions of each processing layer, so that variations in the performance of the sensor can be reduced compared to the case of manufacturing by applying and drying the processing layer. Moreover, since the manufacturing process of a process layer and the assembly process of a sensor can be isolate | separated by manufacturing in this way, a sensor can be manufactured efficiently. Furthermore, by manufacturing each treatment layer with filter paper in this way, it becomes possible to separate the treatment layer on the counter electrode and the treatment layer on the measurement electrode, and as a result, there is no need for expensive cholesterol oxidase. Since there is no need to provide the counter electrode, the manufacturing cost can be reduced.
Furthermore, when each treatment layer is formed by applying and drying using a hydrophilic polymer, it is necessary to form a hydrophilic polymer layer across the measurement electrode and the counter electrode in order to prevent an increase in manufacturing cost. Therefore, as in the above-described embodiment, two measurement electrodes are provided, and an enzyme reaction layer containing lipoprotein lipase is formed on one measurement electrode (ie, the first measurement electrode), and the other measurement electrode (ie, the first measurement electrode). By forming an enzyme reaction layer that does not contain lipoprotein lipase at the second measurement electrode), the total value of glycerol derived from neutral fat and free glycerol and the value of only free glycerol are measured. When manufacturing a sensor configured to measure sex fat concentration using a hydrophilic polymer layer that needs to be coated and dried, from the enzyme reaction layer on one measurement electrode via the hydrophilic polymer layer, Fermentation on the other measuring electrode So it not mixed, it is necessary to completely separate the hydrophilic polymer layer of the two measuring electrode. For this reason, it is necessary to form two electrodes each consisting of a counter electrode and a measurement electrode, and separately form a hydrophilic polymer layer for each of them. Therefore, one counter electrode is required as compared with the above-described sensor for measuring neutral fat. Thus, there are problems that the material cost and the manufacturing process increase and the manufacturing cost increases, and that it is difficult to match the conditions between the two measuring electrodes. From this point of view, the neutral fat measuring sensor according to the present invention is provided with two measuring electrodes, and a conventional sensor for measuring the substrate concentration based on the difference in the current value generated between the measuring electrodes. Compared to the biosensor of this type, there is also an effect that it can be manufactured at low cost and with high accuracy.
In addition, the sensor described above is configured so that the enzyme reaction layer can be provided only on the measurement electrode, and the conjugate release pad is used as a support for the enzyme reaction layer. There is an effect that the enzyme concentration can be increased without any effect, and there is an effect that the reaction rate can be further increased by increasing the enzyme concentration.
[0015]
The configuration of the neutral fat measurement sensor according to the present invention is not limited to the above-described embodiments, and can be arbitrarily changed within the concept of the invention described in the claims. Specifically, in the first embodiment described above, the electron acceptor, the surfactant, and the enzyme are separated into each treatment layer, but these may be configured to be held on one filter paper, Moreover, as shown in FIGS. 8 to 10, the combination of reagents held on the filter paper can be arbitrarily determined, and the stacking order can be arbitrarily changed. The same applies to the blood cell separation membrane 11.
Furthermore, by retaining the amount of protein corresponding to the lipoprotein lipase of the first measurement electrode 2 in the retention layer on the second measurement electrode 3 in the first and second embodiments, the second embodiment By holding a protein corresponding to the cholesterol oxidase of the third measurement electrode 20 on the fourth measurement electrode 21 in FIG. 1, the first measurement electrode due to the absence of lipoprotein lipase in the holding layer on the second measurement electrode 3 2 may be supplemented with the difference in viscosity at the time of sample reaction with 2 or the difference in viscosity at the time of sample reaction with the third measurement electrode 20 due to the absence of cholesterol oxidase on the fourth measurement electrode 20. By doing so, the measurement accuracy is further increased.
[0016]
【The invention's effect】
  As described above, the neutral fat measurement sensor according to the present invention forms an electrode system having at least a measurement electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and reacts with an enzyme, an electron acceptor, and a sample solution. In a sensor for electrochemically detecting a change in concentration with the electrode system and measuring the substrate concentration of the sample solution, lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase is provided on the measurement electrode., Surfactants and electron acceptorsAnd a holder through which the sample solution can pass is placed to form a first layer, and a holder that holds the surfactant and through which the sample solution can pass is placed on the counter electrode. To form a second layerAnd a second measurement electrode is provided at a position corresponding to the measurement electrode across the counter electrode on the insulating substrate, and glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, surfactant and electron acceptor are provided on the second measurement electrode. Provide a layer that holds and allows the sample liquid to pass through.Therefore, there is an effect that it is possible to provide a sensor for measuring neutral fat that can be easily manufactured at low cost without reducing measurement accuracy and that has very little variation in quality.
  In addition, a second measurement electrode is provided at a position corresponding to the measurement electrode across the counter electrode on the insulating substrate, and glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, a surfactant and an electron acceptor are held on the second measurement. In addition, since a layer composed of a holder through which the sample solution can pass is provided, both the total value of glycerol derived from neutral fat and free glycerol and the value of only free glycerol can be calculated. Thus, there is an effect that it becomes possible to measure neutral fat more accurately with a simple sensor.
  The first layerTheEnzyme reaction layer formed of a carrier that holds lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase and allows sample solution to pass through, and surfactantAnd electron acceptorsAnd a holding body through which the sample liquid can passSurfactant and electron acceptor holding layerIt becomes possible to integrate the processing layer holding the necessary surfactant in common for the measurement electrode and the counter electrode, and the manufacturing and assembly process can be further simplified. There is an effect.
  Furthermore, by using a conjugate release pad for the enzyme reaction layer, when the sample solution is introduced into the enzyme reaction layer, the reagent is quickly released, and the time until the reaction is completed is greatly shortened.The
  Further, by providing a guide means capable of restricting the dropping position of the sample liquid so that the sample liquid can be introduced at an intermediate position between the measuring electrode and the second measuring electrode, the user is aware of the dropping position of the sample liquid. This eliminates the need to perform the measurement, thus providing an effect that the measurement can be easily performed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a development view of a first embodiment of a neutral fat measurement sensor according to the present invention.
FIG. 2 is a partial cross-sectional view of a finished product of the neutral fat measurement sensor shown in FIG.
3 is a central cross-sectional view of the neutral fat measurement sensor shown in FIG.
FIG. 4 is a perspective view of the cover 12 as viewed from the bottom.
FIG. 5 is a graph showing measurement results of neutral fat concentration using the neutral fat measurement sensor shown in FIGS.
FIG. 6 is a development view of a cholesterol and neutral fat measurement sensor to which the structure of the neutral fat measurement sensor according to the present invention is applied.
7A is a graph showing the measurement result of cholesterol concentration using the cholesterol measurement sensor shown in FIG. 6, and FIG. 7B is a graph showing the measurement result of neutral fat concentration using the sensor. It is.
FIG. 8 is a schematic view showing another embodiment of the combination of the treatment layers of the neutral fat measurement sensor according to the present invention.
FIG. 9 is a schematic view showing another embodiment of the combination of the treatment layers of the neutral fat measurement sensor according to the present invention.
FIG. 10 is a schematic view showing another embodiment of the combination of the treatment layers of the neutral fat measurement sensor according to the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Insulating substrate
2 First measurement electrode (for neutral fat measurement)
2a Measurement part
2b Terminal part
3 Second measurement electrode (for neutral fat measurement)
3a Measurement part
3b Terminal part
4 Counter electrode
4a Measurement part
4b Terminal part
5 Insulation layer
6 Holding frame
6a Holding hole (for holding the enzyme reaction layer 7)
6b Holding hole (for holding the enzyme reaction layer 8)
6c Holding hole (for holding the surfactant holding layer 9)
(6d holding hole (for holding the enzyme reaction layer 22))
(6e holding hole (for holding the enzyme reaction layer 23))
7 Enzyme reaction layer (for the first measuring electrode for measuring neutral fat)
8 Enzyme reaction layer (for second measurement electrode for measuring neutral fat)
9 Surfactant retention layer
10 Surfactant and electron acceptor holding layer
11 Blood cell separation membrane
12 Cover
12a Upper wall
12b Inner surface of upper wall
12c recess
12d Opening (for sample drop)
12e front wall
12f Notch
20 Third measurement electrode (for cholesterol measurement)
20a Measurement part
20b terminal part
21 4th measurement electrode (for cholesterol measurement)
21a Measurement part
21b Terminal part
22 Enzyme reaction layer (for cholesterol measurement)
23 Enzyme reaction layer (for cholesterol measurement)

Claims

絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、
酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、
前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第１層を形成し、
前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第２層を形成し、かつ、
絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測定極と対応する位置に第２測定極を設け、前記第２測定極上に、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体から成る層を設けた
ことを特徴とする中性脂肪測定用センサ。Forming an electrode system having at least a measuring electrode and a counter electrode on an insulating substrate;
In a sensor for electrochemically detecting a change in substance concentration during reaction of an enzyme, an electron acceptor and a sample solution with the electrode system and measuring a substrate concentration of the sample solution,
On the measurement electrode, lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase , a surfactant and an electron acceptor are held, and a holder through which a sample solution can pass is placed to form a first layer,
On the counter electrode, a surfactant is held, and a holding body through which the sample liquid can pass is placed to form a second layer , and
A second measurement electrode is provided at a position corresponding to the measurement electrode across the counter electrode on an insulating substrate, and glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, a surfactant and an electron acceptor are held on the second measurement electrode, A neutral fat measurement sensor comprising a layer made of a holder through which a sample solution can pass .

前記第１層が、
リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、
界面活性剤及び電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤及び電子受容体保持層と
から形成されていることを特徴とする請求項１に記載のセンサ。The first layer is
An enzyme reaction layer formed of a holder that holds lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, and through which a sample solution can pass;
Holding the surfactant and electron acceptor, and, according to claim 1, characterized in that the sample liquid is formed from the surface active agent and electron acceptor holding layer formed in the holding member can pass Sensor.

前記酵素反応層を構成する保持体をコンジュゲートリリースパッドで形成したことを特徴とする請求項２に記載のセンサ。 The sensor according to claim 2, wherein the holding body constituting the enzyme reaction layer is formed of a conjugate release pad.

測定極上に前記酵素反応層を、前記酵素反応層上に前記界面活性剤及び電子受容体保持層を順次積層してなることを特徴とする請求項２又は３に記載のセンサ。The sensor according to claim 2 or 3, wherein the enzyme reaction layer is stacked on the measurement electrode, and the surfactant and the electron acceptor holding layer are sequentially stacked on the enzyme reaction layer.

前記界面活性剤及び電子受容体保持層が、前記第１層と第２層とに跨って載置されることを特徴とする請求項４に記載のセンサ。The sensor according to claim 4 , wherein the surfactant and the electron acceptor holding layer are placed across the first layer and the second layer .

前記界面活性剤及び電子受容体保持層と前記第２層とが一つの保持体で形成されていることを特徴とする請求項５に記載のセンサ。6. The sensor according to claim 5, wherein the surfactant / electron acceptor holding layer and the second layer are formed of a single holding body.

前記第１層が、The first layer is
リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ及び界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素及び界面活性剤保持層と、  An enzyme and surfactant holding layer formed of a holding body that holds lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase and a surfactant, and through which a sample solution can pass;
電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された電子受容体保持層とから形成されている  And an electron acceptor holding layer formed of a holder that holds the electron acceptor and through which the sample liquid can pass.
ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。  The sensor according to claim 1.

前記第１層が、The first layer is
リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼを保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された酵素保持層と、  An enzyme holding layer formed of a holding body that holds lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerophosphate oxidase, and through which a sample solution can pass;
界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された界面活性剤保持層と、  A surfactant holding layer formed of a holding body that holds the surfactant and allows the sample liquid to pass through;
電子受容体を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成された電子受容体保持層とから形成されている  And an electron acceptor holding layer formed of a holder that holds the electron acceptor and through which the sample liquid can pass.
ことを特徴とする請求項１に記載のセンサ。  The sensor according to claim 1.

前記電子受容体が、フェリシアンイオンである
ことを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のセンサ。The sensor according to any one of claims 1 to 8, wherein the electron acceptor is ferricyan ion.

試料液を前記測定極と前記第２測定極との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けた
ことを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載のセンサ。As the sample liquid can be introduced into an intermediate position between said second measuring electrode and the measuring electrode, any one of claims 1 to 9, characterized in that the dropping position of the sample liquid is provided a guide means capable restriction The sensor according to item .