JP3856438B2

JP3856438B2 - Biosensor

Info

Publication number: JP3856438B2
Application number: JP2002058992A
Authority: JP
Inventors: 美和長谷川; 智浩山本; 基一渡邊; 貴裕中南; 信池田; 俊彦吉岡; 史朗南海
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2022-03-05
Also published as: JP2003065997A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分について、迅速、高感度、かつ簡便に定量することができるバイオセンサ、特にコレステロールセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のバイオセンサの例を、グルコースセンサについて説明する。
代表的なものとして、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法により、少なくとも測定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系上に、親水性高分子、酸化還元酵素および電子メディエータを含む酵素反応層を形成して得られるグルコースセンサがある。酸化還元酵素にはグルコースオキシダーゼが、また電子メディエータにはフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体などの金属錯体や有機化合物などがそれぞれ用いられる。酵素反応層には、必要に応じて緩衝剤が加えられる。
【０００３】
このバイオセンサの酵素反応層上に、基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して、酵素と基質が反応し、この反応に伴い電子メディエータが還元される。酵素反応終了後、この還元された電子メディエータを電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることができる。
このタイプのグルコースセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエータの還元体を電極で酸化し、その酸化電流値からグルコース濃度を求める。
このようなバイオセンサは、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用いれば、各種医療機関で診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定することができる。
【０００４】
コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
しかし、反応系に界面活性剤が含まれることから、界面活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、グルコースセンサのように全血そのものを測定することは不可能である。
【０００５】
そこで、血球をろ過した血漿のみを迅速にセンサ内に供給するために、試料液供給路の開口部付近にフィルタ（血球ろ過部）を設ける提案がなされている。図９に、血液を分離するメカニズムを説明するためのフィルタ装置の概略断面図を示す。
血球を分離する方法としては、図９の（ａ）に示すように、▲１▼血液をフィルタの一次側部分の側端部に滴下して、水平方向においてろ過し、フィルタの二次側部分の端部から血漿をにじみ出させる水平分離（Lateral Separation）方式、図９の（ｂ）に示すように、▲２▼血液をフィルタの上表面に直接滴下して、垂直方向においてろ過し、前記フィルタの底面またはその付近の端部から血漿をにじみ出させる垂直分離（Vertical Separation）方式、および図９の（ｃ）に示すように、▲３▼血液をフィルタの一次側部分の上表面に直接滴下して、垂直方向においてろ過するとともに水平方向においてもろ過し、フィルタの二次側部分の端部から血漿がにじみ出る複合分離（Combination）方式の３種類がある。従来からは、水平分離（例えば特願２０００−３９９０５６号明細書）または複合分離（例えば特願２００１−１５２８６８号明細書）が用いられている。
【０００６】
しかし、センサ内へのフィルタの組み込み方が適していないと、フィルタ内に捕捉される血球が破壊され、ヘモグロビンが溶出してしまう。ヘモグロビン程度にまで小さくなると、血球成分をフィルタでろ過することが困難となり、試料液供給路内にヘモグロビンが流入し、測定誤差の原因となってしまう。
これは、試料液を吸収する前のフィルタの厚みと、試料液を吸収した後に膨張したフィルタの厚みとの差が、フィルタを上下から保持している押さえ部の間隔と適合していない点に原因があると考えられる。フィルタを上下から保持している押さえ部の間隔が、膨張したフィルタの厚みに対して狭すぎると、フィルタの膨張が妨げられる。そして、膨張が妨げられたフィルタの孔径は十分に広がることができず、浸透してきた血球を破壊してしまうのである。
【０００７】
これに対し、試料液によってそのヘマトクリット値（赤血球容積比）が異なり、これに起因してフィルタの膨張の程度も異なるため、あらかじめ膨張したフィルタの厚みを想定して前記押さえ部の上下の間隔を広めに設定すると、保存期間中にフィルタがずれてしまうおそれがある。
この問題を解決するために、複合分離方式において、前記フィルタ表面を保持する押さえ部を、前記フィルタのいずれかの部分において、前記フィルタの上下いずれか一方とだけ接触するようにすることが考えられている（例えば特願２００１−１５２８６８号明細書）。
【０００８】
この構成により、フィルタを保持する上下押さえ部の間の距離が、試料液を吸収して膨張したフィルタの厚みに適合しなくても、フィルタの膨張が妨げられることがなく、さらに膨張が妨げられることによって起こる血球破壊に起因する測定誤差を回避することができる。すなわち、前記フィルタを保持する押さえ部が、前記フィルタの上下から押さえていないことにより、フィルタが膨張した際、押さえ部以外の試料液供給部、および空隙部の部分において膨張することが可能となり、フィルタの孔径が自由に変化することができ、血球破壊が起こることがない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法は、試料液の量を低減する方法としては有効であるが、得られるバイオセンサの構造が複雑になるという問題があった。例えば、垂直方向への陰影図において三角形状を有する平らなフィルタを用いる場合、先端部（頂点部分）を試料液供給路の開口部（幅０．８ｍｍ）の内側に約１ｍｍでも挿入することが、製造上非常に困難であった。
また、▲１▼および▲３▼の分離方式は▲２▼の分離方式よりもろ液の流速が遅いという問題があった。これに対し、得られるバイオセンサの構造を簡素化することができるが、コレステロールセンサとして適用する場合、電極と対向する部分に試薬を担持させる必要があることから、構造上、通常の垂直分離方式を採用することは不可能であった。この理由は２つあり、ひとつは構造上の問題であり、もうひとつは試薬担持位置の問題である。
【００１０】
ひとつ目の問題点は、例えば特願昭６２−１８０４３４号および特願昭６２−２９２３２３号各明細書において指摘されている。例えば、上記▲２▼の分離方式を用いる場合は、図１０〜１２に示すような構造を採用する必要があった。
図１０に示すように、このタイプのバイオセンサは、絶縁性基板２０１の上に作用極２０２および対極２０３が設けられ、その上に酸化還元酵素層２０５、空隙部２０６、フィルタ２０７および多孔体２０８が設けられている。この際のろ過は、重力を利用した自然ろ過法に分類されるが、試料液中に気泡が生じたり、多孔体２０８に試料液が入りにくかったりして流速が遅いことから、ろ液が電極に充分に到達せず、測定精度に劣るという問題があるため、上部にポンプのタイプの加圧装置２１１が設け、圧力２１４をかけることによって試料液２１２をろ過している。
【００１１】
この点、特願昭６２−２９２３２３号明細書に記載されているセンサにおいては、図１１および１２に示すように、加圧装置に替えて、フィルタ３０８を通過したろ液を電極３０２’、３０３’および３０４’に導くように誘導層３０７がセンサ内に設置されている。これにより、ろ液は誘導層３０７に導かれて最初に電極を濡らし、電極表面の親水性高分子層３１２の助けも借りて電極上に広がるため、作用極上に気泡が生じることはなく、精度の高い測定が可能となっている。
なお、図１１および１２において、誘導層３０７の上部には、フィルタ３０８、保持枠３０９、多孔体３１０およびカバー３１１が設けられている。基板３０１の上部には電極３０２、３０３および３０４が配され、絶縁層３０５が設けられている。しかし、いずれの場合にあっても、センサの構造が複雑であるという問題がある。
【００１２】
一方、ふたつ目の試薬担持位置に関する問題点は、特願２０００−０１８８３４号明細書に記載されている。当該明細書に開示されているコレステロールセンサは、血糖センサと異なり非常に濃い濃度の試薬を担持させるため、血糖センサのように必要な試薬を全て一ヵ所に担持させると試薬の拡散の妨げとなり、応答電流値の精度が下がるという問題がある。また、試薬中には血糖センサにはない界面活性剤が含まれており、これが他の試薬の保存安定性に悪影響を与えるため、分離して担持しなければならない。そのため、試薬を上下（電極上とカバー側）に分離して担持し、電極の上部にフィルタを具備するという従来の構造を採用することは不可能であった。
【００１３】
そこで、本発明は、垂直分離方式を採用する際の上述のような不都合を回避し、血液のろ過によって血球を分離して得られる血漿が、迅速に電極系に達するように改良したバイオセンサを提供することを目的とする。さらに具体的には、本発明は、高精度で応答性に優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料液を導入するための試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部との間に設けられた、試料液をろ過するフィルタを具備し、前記フィルタでろ過されたろ液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、前記フィルタが前記試料液供給路内に侵入しておらず、前記試料液が前記フィルタを通過する方向が前記基板に対して垂直方向であり、さらに前記血漿が前記試料液供給路の開口部から前記空気孔に向かって通過する方向が前記基板に対して水平方向であることを特徴とするバイオセンサに関する。
【００１５】
前記フィルタは円柱状であるのが有効である。
また、前記フィルタの円状端面の直径が５ｍｍ以下であるのが有効である。また、前記フィルタの上部に前記試料液を滴下するための開口部があることが有効である。さらに、前記フィルタの一次側部分から二次側部分までの領域において、前記フィルタの表面を一回り囲む空隙部を少なくとも１つ有するのが有効である。
また、前記試料液供給部の底部に前記フィルタに通じる孔があるのが有効である。さらにまた、前記試料液供給部の開口部のサイズが前記フィルタのサイズよりも小さいのが有効である。前記フィルタの表面とフィルタ保持部が接触しない部分を有するのが有効である。
【００１６】
また、前記バイオセンサにおいては、前記フィルタがガラス繊維ろ紙で構成されているのが有効である。
この場合、前記フィルタが前記電極系と非接触であるのが有効である。また、前記フィルタの底面の少なくとも一部が前記絶縁性基板に接触しているのが有効である。
前記フィルタがガラス繊維ろ紙で構成されている場合は、前記フィルタを構成する繊維がポリビニルアルコールでコーティングされているのが有効である。
また、前記フィルタの試料液滴下部から試料液供給路の開口部までの領域において、前記フィルタ表面を一回り囲む空隙部を少なくとも１つ有するのが有効である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
上述のように、本発明は、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料液を導入するための試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部との間に設けられた、試料液をろ過するフィルタを具備し、前記フィルタでろ過されたろ液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサにおいて、前記フィルタが前記試料液供給路内に侵入しておらず、前記試料液が前記フィルタを通過する方向が垂直方向であり、さらに前記血漿が前記試料液供給路の開口部から前記空気孔に向かって通過する方向が水平方向であることを特徴とするバイオセンサに関する。このような技術的事項を具備することにより、得られるバイオセンサの構造を簡素化することが可能である。
【００１８】
本発明に係るバイオセンサにおいては、血球分離の方法としては垂直分離方式を用いるが、試料液として血液を用い、フィルタの二次側部分からにじみ出た血漿は、試料液供給路において、開口部からその終端部にある空気孔に向かって徐々に試薬を溶解しながら水平に流れることから、試料液供給路内に上下に分離して担持されている試薬の位置を変えることなく、センサ構造の簡素化を図ることが可能となる。
また、前記フィルタが前記試料液供給路内に侵入していないことから、フィルタが試料液供給路内の反応層に含まれる試薬と接触せず、この試薬がフィルタ内に拡散しにくい。これにより、試薬の濃度にバラツキが生じることがなく、安定したセンサ精度を実現することができる。
【００１９】
本発明に用いる電子メディエータは、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールオキシダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択することができる。
酸化還元酵素は測定対象物を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象物とするセンサでは、グルコースオキシダーゼを用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼと、コレステロールエステルをコレステロールに変化させる過程を触媒する酵素コレステロールエステラーゼとを用いる。コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
【００２０】
電子メディエータおよび酸化還元酵素などの試薬を含む反応層は、センサ内の電極系上またはその近傍の位置に配置する。電極系を設けた基板に組み合わされるカバー部材であって、基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を有するセンサにおいては、前記試料液供給路に露出する部分または試料液供給路の開口部などに前記反応層を配置することができる。いずれの位置であっても、導入された試料液によって前記反応層が容易に溶解して電極系に到達できることが好ましい。また、電極を保護し、形成される反応層の剥離を抑制するために、電極上に接して親水性高分子層を形成するのが好ましい。電極系以外でも、反応層を形成する際の下地として親水性高分子層を形成するのが好ましく、また、反応層を複数の層で構成する場合には最下層に親水性高分子を含ませるのが好ましい。
【００２１】
電子メディエータを含む反応層は、溶解性を高めるために、界面活性剤と分離して設けることが好ましい。また、保存安定性のために、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼと分離することが好ましい。
血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が反応層へ導入されるのを容易にするため、電極系上に形成された層などを被覆するように、脂質を含む層を形成する例がある（例えば、特開平２−０６２９５２号公報）。本発明のコレステロールを測定するバイオセンサは、反応層の一部を凍結乾燥法により形成するか（特願２０００−０１８８３４号明細書）、カバー部材の表面を界面活性剤またはプラズマ照射などにより親水処理するという構成をとるのが好ましく、そのような構成にすると、脂質層はなくてもよい。
【００２２】
親水性高分子としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体の他、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アガロース、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸の重合体およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどがあげられる。
【００２３】
界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、ジュークロースモノラウレート、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルなどがあげられ、本発明の効果を損なわない範囲で、これら以外の界面活性剤を用いることもできる。
【００２４】
脂質を使用する場合、例えばレシチン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質で両親媒性脂質が好適に用いられる。
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。
以下、具体的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。
【００２５】
実施の形態１
図１は、好ましい実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。図１に示すように、本発明に係るバイオセンサは、例えばポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性樹脂からなる絶縁性基板１を有する。図１において、基板１の左側上面にパラジウム部分がスパッタ法または蒸着法などによって形成されており、レーザートリミングにより作用極２と対極３を含む電極系が形成されている。
電極の面積は、後述するスペーサ５上に形成されるスリット８の幅により決定される。
【００２６】
前記基板１に組み合わせるスペーサ５には、得られるバイオセンサにおいて試料液供給路を形成するスリット８、スリット８の開口部７、フィルタ４を収納する連通部６が形成されている。また、カバー９には、フィルタ４を収納する連通部１０の他に、空気孔１１が形成されている。
フィルタ保持板１２には、空隙部１３と、フィルタ４を直接支える突起状のフィルタ保持部（突起部）１４が形成されている。さらに、試料液滴下部を構成する上カバー１５には、フィルタ４の上表面に通じる開口部１６が形成されている。なお、フィルタ保持板１２は、後述する実施例２に示すように、複数の部材で構成されていてもよい。
【００２７】
上述の基板１、スペーサ５、カバー９、フィルタ保持板１２および上カバー１５を一体化した際には、スリット８に連なる連通部６、カバー９に形成されている連通部１０、フィルタ保持板１２に形成されている空隙部１３、および上カバー１５に形成されている開口部１６が連通する。
血球ろ過部であるフィルタ４は、ガラス繊維製のろ紙からなり、直径２〜５ｍｍ、高さ（厚み）２００〜１０００μｍの円柱状の形状を有する。
【００２８】
このセンサを組み立てるには、後述のように基板１の所定の部分に反応層を形成する。また、図１に示す位置関係に基づいて、カバー９とスペーサ５を組み合わせた合体基板Ａのスリット８により形成される凹部（試料液供給路）において、後述のように所定の部材に反応層を形成する。さらに、図１に示す位置関係に基づいて、フィルタ保持板１２と上カバー１５を組み合わせた合体基板Ｂを作製する。そして、基板１、合体基板Ａ、フィルタ４および合体基板Ｂを、図１の点線および一点鎖線で示すように設置する。
【００２９】
ここで、図１の構成にしたがって得られる本発明に係るバイオセンサの概略斜視図を図２に示す。さらに、図２におけるＸ−Ｘ線断面図を図３に示す。図３の断面図に示すように、本発明に係るバイオセンサにおいては、フィルタ４と他の部材が非接触となる空隙部１３が形成される。妨害物質である血球を完全に除去するためには、試料液がフィルタを必ず通過するように、開口部１６から開口部７までの領域においてフィルタ保持部と非接触の箇所、すなわちフィルタ表面を一回りする空隙部１３を少なくとも一ヵ所設けることが必要である。
図２では反応層および電極系を省略したが、図４に、反応層および電極系を表した図３に対応する部分拡大断面図を示す。基板１の電極２および３上に、親水性高分子の層１７および反応層１８ａが形成されている。また、試料液供給路の天井に相当するカバー９の下面には反応層１８ｂが形成されている。なお、図４に示すその他の部材は、図３に示すものと同じである。
【００３０】
図１〜４に示すバイオセンサは、その構造をわかりやすくするために、フィルタ４と５種類の部材（基板）を用いて作製されるものである。しかし、上カバー１５とフィルタ保持板１２を一つの部材で形成したり、さらにこれらとカバー９を一つの部材で形成してもよい。また、フィルタ４の厚みによっては、フィルタ保持板１２またはフィルタ保持部１４を省略してもよい。
【００３１】
実施の形態２
図５は、別の好ましい実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。図５に示すように、本発明に係るバイオセンサは、例えばポリエチレンテレフタレートなどの絶縁性樹脂からなる絶縁性基板１０１を有す。図５において、基板１０１の左側上面にパラジウム部分がスパッタ法または蒸着法などによって形成されており、レーザートリミングにより、作用極１０２と対極１０３を含む電極系が形成されている。電極の面積は、後述するスペーサ１０５の上に形成されるスリット１０８の幅に対応して決定される。
【００３２】
前記基板１０１に組み合わせるスペーサ１０５には、得られるバイオセンサにおいて試料液供給路を構成するスリット１０８、スリット１０８の開口部１０７、フィルタ１０４よりも小さい直径を有しフィルタ１０４を収納する連通部１０６が形成されている。また、カバー１０９には、フィルタ１０４よりも小さい直径を有しフィルタ１０４を収納する連通部１１０、および空気孔１１１が形成されている。
ここで、上記実施の形態１におけるフィルタ保持板１２は一枚の板状体で構成されているが、実施の形態２におけるフィルタ保持板１１２は、フィルタ保持板１１２ａ、１１２ｂおよび１１２ｃで構成されている。
【００３３】
フィルタ保持板１１２ａには、フィルタ１０４よりも大きい直径の空隙部１１３ａが形成されており、フィルタ保持板１１２ｂには、空隙部１１３ａと同じ直径を有する空隙部１１３ｂと、フィルタ１０４を直接支える突起状のフィルタ保持部（突起部）１１４が形成されている。また、フィルタ保持板１１２ｃは、フィルタ保持板１１２ａと同形であり、空隙部１１３ｃが形成されている。
さらに、試料液滴下部を構成する上カバー１１５には、フィルタ１０４の上表面に通じる開口部１１６が形成されている。
【００３４】
上述の基板１０１、スペーサ１０５、カバー１０９、フィルタ保持板１１２ａ、１１２ｂおよび１１２ｃ、ならびに上カバー１１５を一体化した際には、スリット１０８に連なる連通部１０６、カバー１０９に形成されている連通部１１０、フィルタ保持板１１２ａに形成されている空隙部１１３ａ、フィルタ保持板１１２ｂに形成されている空隙部１１３ｂ、フィルタ保持板１１２ｃに形成されている空隙部１１３ｃ、ならびに上カバー１１５に形成されている開口部１１６が連通する。
血球ろ過部であるフィルタ１０４は、ガラス繊維製のろ紙からなり、直径３ｍｍ、高さ（厚み）５００〜１０００μｍの円柱状の形状を有する。そして、ガラス繊維製のろ紙を構成する繊維はＰＶＡがコーティングされている。
【００３５】
このセンサを組み立てるには、まず、図５に示す位置関係に基づいて、スペーサ１０５上にカバー１０９をのせ、合体基板Ｃを得る。このとき、カバー１０９およびスペーサ１０５を合体するときにスリット１０８により形成される凹部（試料液供給路）において、後述するように反応層を形成する。さらに、図５に示す位置関係に基づいて、フィルタ保持板１１２ａ上にフィルタ保持板１１２ｂおよびフィルタ保持板１１２ｃをのせ、さらにその上に上カバー１１５をのせて合体基板Ｄを得る。
基板１および合体基板Ａを、図５に示す位置関係に基づいて組み合わせ、連通した連通部１０６および１１０の真上に、フィルタ１０４を設置する。そして、基板１、合体基板Ｃおよび合体基板Ｄを、右端が一致するような位置関係で組み合わせる。
【００３６】
ここで、図５の構成にしたがって得られる本発明に係るバイオセンサの概略斜視図を図６に示す。さらに、図６におけるＹ−Ｙ線断面図を図７に示す。
図７では反応層および電極系を省略したが、図８に、反応層および電極系を表した図７に対応する部分拡大断面図を示す。基板１０１の電極系（１０２および１０３）上に、親水性高分子の層１１７および反応層１１８ａが形成されている。また、試料液供給路の天井に相当するカバー１０９の下面には反応層１１８ｂが形成されている。なお、図８に示すその他の部材は、図７に示すもとの同じである。
【００３７】
図５〜８に示す本発明のバイオセンサは、その構造をわかりやすく説明するために、フィルタ１０４と７種類の基材を用いて作製されるものである。しかし、カバー１０９とスペーサ１０５を一つの部材で構成したり、フィルタ１０４の厚みによっては、フィルタ保持板１１２ａおよび１１２ｂ、またはフィルタ保持板１１２ｂおよび１１２ｃを省略してもよい。また、フィルタ保持部１１４を省略してもよい。
【００３８】
図１〜４または図５〜８に示すバイオセンサを用いて血液中のコレステロールを測定するためには、例えば穿刺により指先から採取した試料液である血液を上カバー１５または１１５の開口部１６または１１６へ供給する。ここに供給された血液は、フィルタ４または１０４の一次側部分の上表面からその内へ浸透し、ろ過される。そして、血球以外のろ液である血漿が二次側部分からしみ出す。そして、しみ出した血漿は、電極系を覆う位置および／またはカバー９または１０９の裏面に担持された反応層を溶解しながら、電極系近傍、さらに空気孔１１または１１１まで延びるスリット８または１０８で構成される試料液供給路８’または１０８’全体を満たす。試料液供給路８’または１０８’全体が満たされると、フィルタ４または１０４に滴下された液体の流動も停止する。
【００３９】
フィルタ４または１０４としては、不連続かつ不均等質な内部構造を有し、不均一な孔径分布を有するものを用いるのが好ましい。したがって、フィルタ４または１０４の内部の流路の形態も不規則であるのが好ましい。なお、ろ過はフィルタ４または１０４の内部で行われる。また、上記実施の形態２においては、フィルタ１０４を構成する繊維をＰＶＡでコーティングしておく。
このような血球ろ過の過程を経て、血漿により溶解された反応層と血漿中の測定成分（例えばグルコース、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールなど）との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、血漿中の成分を定量することができる。
【００４０】
上述のように、図４および８は、試料液供給路８’または１０８’中の電極系近傍における反応層の配置例を示している。基板１または１０１の電極系２および３または１０２および１０３上には、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下、単に「ＣＭＣ」と表す）などを含む親水性高分子の層１７または１１７、および、例えば電子メディエータなどの反応試薬を含む反応層１８ａまたは１１８ａが形成されている。また、カバー９または１０９とスペーサ５または１０５を組み合わせた合体基板ＡまたはＣにおいては、カバー９または１０９の試料液供給路８’または１０８’に露出する面に、酸化還元反応酵素を含む反応層１８ｂまたは１１８ｂが形成されている。
【００４１】
特に、上記実施の形態１においては、フィルタ保持板１２の連通部１０は、フィルタ保持部１４を除いて、フィルタ４と接触しておらず、フィルタ４の膨張を妨げることがないよう設計されている。そのため、試料液中の血球が破壊される恐れもない。
図１〜４に示す構造を有するバイオセンサでは、前記試料液供給路の幅が１.５ｍｍ以下、高さが１５０μｍ以下、長さが４.５ｍｍ以下であることが好ましい。
【００４２】
本発明に係るバイオセンサの体積が０．０５μｌ以上、１．０１２５μｌ以下であることが好ましい。また、前記電極系が、貴金属からなる電極であるのが好ましい。前記試料液供給路の幅が、好ましくは１.５ｍｍ以下であるため、スクリーンを用いた印刷電極では電極面積を決定する精度が劣る。しかし、貴金属電極は、０．１ｍｍ幅でレーザートリミングすることが可能であり、電極面積を決定する精度が高いからである。
【００４３】
なお、特に、実施の形態１に係るバイオセンサにおいては、図１３に示すように、フィルタ４の二次側部分の少なくとも一部が、基板１、スペーサ５およびカバー９に接触していればよく、例えば図１４示すように、フィルタ４の二次側部分を斜めに切断して傾斜部を設けてもよい。このように、基板１との接触面において、開口部７に向かって開くような形状の傾斜部を設けることによって、ろ液を試料液供給路８’に導きやすくすることができる。
また、図１３に示すように、前記フィルタの一次側部分の断面積（Ｆ１）が前記試料液供給路の開口部７の断面積（Ｓ１）よりも大きいのが好ましい。これにより、センサの試料液供給路８’内がろ過された血漿で飽和される速度が速くなるという効果が得られる。
さらに、図１５に示すように、前記フィルタの一次側部分の断面積（Ｆ１）が、前記試料液供給路の開口部７側において基板１に接する二次側部分の断面積（Ｆ２）よりも大きいのが好ましい。これにより、センサの試料液供給路８’内がろ過された血漿で飽和される速度がさらに速くなるという効果が得られる。なお、図１３〜１５において、基板１、フィルタ４、スペーサ５およびカバー９以外の構成要素は省略した。
【００４４】
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらのみに限定されれるものではない。
《実施例１》
図１〜４に示す構造を有し、測定対象を総コレステロールとするバイオセンサであって、反応層１８ａに電子メディエータが含まれ、反応層１８ｂにコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよび界面活性剤が含まれたバイオセンサを作製した。
まず、基板１の電極系上に、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより親水性高分子の層１７を形成した。つぎに、フェリシアン化カリウム水溶液４μｌ（フェリシアン化カリウム７０ｍＭ相当）を親水性高分子の層１７上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層１８ａを形成した。
【００４５】
ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６：ＣｈＯＤ）とシュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．１．１３：ＣｈＥ）を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合液を、スペーサ５とカバー９を一体化して形成される凹部（カバー９の試料液供給路８’の上側に相当する部分）に０.４μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて予備凍結後、凍結乾燥機で２時間乾燥させることにより、４５０Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、１１２５Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼおよび２ｗｔ％界面活性剤を含む反応層１８ｂ（図４）を形成した。
【００４６】
なお、測定対象をＬＤＬコレステロールとするバイオセンサを得る場合は、ＬＤＬのみを選択的に可溶化させる界面活性剤を使用すればよい。これにより、ＬＤＬコレステロールを反応系に導き、ＬＤＬコレステロールを測定することが可能となる。ＬＤＬ以外のリポ蛋白（カイロミクロン、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ）に対する酵素反応は、この界面活性剤により阻害されるため、これらのリポ蛋白はコレステロールの反応系に導かれることなく、反応液中にリポ蛋白の形で残存する。
【００４７】
センサの各寸法については、スリット幅は０.８ｍｍ、スリット長（試料液供給路の開口部から空気孔までの長さ）は４.５ｍｍ、スペーサ５の厚み（基板１からカバー９までの距離）は１００μｍが好ましい。
フィルタ４は、厚さ約７００μｍのガラス繊維ろ紙を、直径２．５ｍｍの円形に打ち抜いて、円柱状のものとして作製した。基板１、スペーサ５、カバー９およびフィルタ保持板１２の合体して得られる連通部６、連通部１０および空隙部１３からなる空間にフィルタ４を設置した。
この後、フィルタ保持板１２の上部に上カバー１４を設置することにより、図１〜４に示す構造を有するバイオセンサを作製した。
【００４８】
得られたバイオセンサの開口部１６から、試料液として全血１０μｌまたは標準血清を滴下し、１８０秒後に対極を基準にして作用極にアノード方向へ＋０.２Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果である応答特性を図１６に示した。
図１６から明らかなように、本発明に係るバイオセンサによれば、総コレステロール濃度と応答値との間に良好な直線性が得られる。
【００４９】
《実施例２》
図５〜８に示す構造を有し、測定対象を総コレステロールとするバイオセンサであって、反応層１１８ａには電子メディエータが含まれ、反応層１１８ｂにはコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよび界面活性剤が含まれたバイオセンサを作製した。
まず、基板１０１の電極系上に、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより親水性高分子の層１１７を形成した。つぎに、フェリシアン化カリウム水溶液４μｌ（フェリシアン化カリウム７０ｍＭ相当）を親水性高分子の層１１７上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層１１８ａを形成した。
【００５０】
ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６：ＣｈＯＤ）とシュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．１．１３：ＣｈＥ）を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合液を、スペーサ１０５とカバー１０９を一体化して形成される凹部（カバー１０９の試料液供給路１０８’の上側に相当する部分）に０.４μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて予備凍結後、凍結乾燥機で２時間乾燥させることにより、４５０Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、１１２５Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼおよび２ｗｔ％界面活性剤を含む反応層１１８ｂ（図８）を形成した。
【００５１】
なお、測定対象をＬＤＬコレステロールとするバイオセンサを得る場合は、ＬＤＬのみを選択的に可溶化させる界面活性剤を使用すればよい。これにより、ＬＤＬコレステロールを反応系に導き、ＬＤＬコレステロールを測定することが可能となる。ＬＤＬ以外のリポ蛋白（カイロミクロン、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ）に対する酵素反応は、この界面活性剤により阻害されるため、これらのリポ蛋白はコレステロールの反応系に導かれることなく、反応液中にリポ蛋白の形で残存する。
【００５２】
フィルタ１０４は、ＰＶＡでコーティングされたガラス繊維ろ紙を、直径２.５ｍｍの円形に打ち抜いて作製した。
この後、前記基板１０１と合体基板Ｃとの上にフィルタ１０４を設置し、ついで、フィルタ保持板１１２ａ、１１２ｂおよび１１２ｃならびに上カバー１１５とを一体化した合体基板Ｂをフィルタ１０４上に接着し、図５〜８に示す構造を有するバイオセンサを作製した。
【００５３】
得られたバイオセンサの開口部１１６に、試料液として全血１０μｌを滴下し、１８０秒後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ＋０.２Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果である応答特性を図１７に示した。
図１７から明らかなように、本発明に係るバイオセンサによれば、コレステロール濃度と応答値との間に良好な直線性が得られる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、例えば指先の穿刺によって採取した血液を測定する場合、指先にある血液を効率的に導入することのできるバイオセンサを提供することができる。また、本発明によれば、妨害物質である血球をフィルタにより溶血することなく除去し、フィルタ厚が薄くても血球除去後の血漿を迅速に電極系へ供給することができ、したがって、応答特性に優れた電気化学的バイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサの合体斜視図である。
【図３】反応層などを省略した図２のＸ−Ｘ線断面図である。
【図４】図２の電極系付近の拡大断面図である。
【図５】本発明の別の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。
【図６】図５のバイオセンサの合体斜視図である。
【図７】反応層などを省略した図６のＹ−Ｙ線断面図である。
【図８】図６の電極系付近の拡大断面図である。
【図９】血液を分離するメカニズムを説明するためのフィルタ装置の概略断面図である。
【図１０】従来のバイオセンサの縦断面図である。
【図１１】また別の従来のバイオセンサの分解斜視図である。
【図１２】図１１に示すバイオセンサの縦断面図である。
【図１３】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二次側部分の形態を示す部分断面図である。
【図１４】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二次側部分の別の形態を示す部分断面図である。
【図１５】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二次側部分のまた別の形態を示す部分断面図である。
【図１６】実施例１におけるバイオセンサの応答特性を示すグラフである。
【図１７】実施例２におけるバイオセンサの応答特性を示すグラフである。
【符号の説明】
１、１０１基板
２、１０２作用極
３、１０３対極
４、１０４フィルタ
５、１０５スペーサ
６、１０６連通部
７、１０７開口部
８、１０８スリット
８’、１０８’ 試料液供給路
９、１０９カバー
１０、１１０連通部
１１、１１１空気孔
１２、１１２フィルタ保持板
１３、１１３空隙部
１４、１１４フィルタ保持部
１５、１１５上カバー
１６、１１６開口部
１７、１１７親水性高分子の層
１８ａ、１１８ａ反応層
１８ｂ、１１８ｂ反応層[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a biosensor, particularly a cholesterol sensor, that can quickly, highly sensitively and easily quantify a specific component in a sample.
[0002]
[Prior art]
A glucose sensor will be described as an example of a conventional biosensor.
As a typical example, an electrode system including at least a measurement electrode and a counter electrode is formed on an insulating substrate by a method such as screen printing, and a hydrophilic polymer, an oxidoreductase, and an electron mediator are placed on the electrode system. There is a glucose sensor that is obtained by forming an enzyme reaction layer containing the same. Glucose oxidase is used as the oxidoreductase, and metal complexes and organic compounds such as potassium ferricyanide, ferrocene derivatives, and quinone derivatives are used as the electron mediator. A buffering agent is added to the enzyme reaction layer as necessary.
[0003]
When a sample solution containing a substrate is dropped onto the enzyme reaction layer of this biosensor, the enzyme reaction layer is dissolved, the enzyme reacts with the substrate, and the electron mediator is reduced along with this reaction. After completion of the enzyme reaction, the substrate concentration in the sample solution can be determined from the oxidation current value that electrochemically oxidizes the reduced electron mediator.
In this type of glucose sensor, the reduced form of the electron mediator generated as a result of the enzyme reaction is oxidized by an electrode, and the glucose concentration is obtained from the oxidation current value.
Such a biosensor can in principle measure various substances by using an enzyme whose substrate is a substance to be measured. For example, if cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase is used as the oxidoreductase, the cholesterol level in serum used for diagnostic guidelines in various medical institutions can be measured.
[0004]
Since the progress of the enzymatic reaction of cholesterol esterase is very slow, by adding an appropriate surfactant, the activity of cholesterol esterase can be improved and the time required for the whole reaction can be shortened.
However, since a surfactant is included in the reaction system, the surfactant has an adverse effect on blood cells, so it is impossible to measure whole blood itself like a glucose sensor.
[0005]
Therefore, in order to quickly supply only plasma obtained by filtering blood cells into the sensor, a proposal has been made to provide a filter (blood cell filtration unit) in the vicinity of the opening of the sample liquid supply path. FIG. 9 shows a schematic cross-sectional view of a filter device for explaining a mechanism for separating blood.
As a method for separating blood cells, as shown in FIG. 9 (a), (1) blood is dropped on the side end of the primary part of the filter and filtered in the horizontal direction, and the secondary part of the filter As shown in FIG. 9 (b), (2) blood is dropped directly on the upper surface of the filter and filtered in the vertical direction. As shown in FIG. 9 (c), the blood is directly dripped onto the upper surface of the primary part of the filter, as shown in FIG. 9 (c). In addition, there are three types, that is, a composite separation method in which plasma is filtered in the vertical direction and also in the horizontal direction, and plasma is oozed out from the end of the secondary side portion of the filter. Conventionally, horizontal separation (for example, Japanese Patent Application No. 2000-399056) or composite separation (for example, Japanese Patent Application No. 2001-152868) has been used.
[0006]
However, if the method of incorporating the filter into the sensor is not appropriate, blood cells trapped in the filter are destroyed and hemoglobin is eluted. When it becomes small to about hemoglobin, it becomes difficult to filter the blood cell component with a filter, and hemoglobin flows into the sample liquid supply path, causing measurement errors.
This is because the difference between the thickness of the filter before absorbing the sample liquid and the thickness of the filter expanded after absorbing the sample liquid is not compatible with the distance between the holding parts holding the filter from above and below. There seems to be a cause. If the interval between the holding parts that hold the filter from above and below is too narrow with respect to the thickness of the expanded filter, the expansion of the filter is hindered. Then, the pore diameter of the filter that is prevented from expanding cannot be sufficiently widened, and the blood cells that have permeated are destroyed.
[0007]
On the other hand, the hematocrit value (red blood cell volume ratio) differs depending on the sample liquid, and the degree of expansion of the filter also varies due to this. If it is set wider, the filter may be shifted during the storage period.
In order to solve this problem, in the composite separation method, it is conceivable that the holding portion that holds the filter surface is in contact with only one of the upper and lower sides of the filter at any part of the filter. (For example, Japanese Patent Application No. 2001-152868).
[0008]
With this configuration, even if the distance between the upper and lower pressing portions that hold the filter does not match the thickness of the filter that has expanded by absorbing the sample liquid, the expansion of the filter is not hindered, and further the expansion is hindered. It is possible to avoid measurement errors caused by blood cell destruction. That is, since the holding part that holds the filter is not pressed from above and below the filter, when the filter expands, it is possible to expand in the sample liquid supply part other than the pressing part, and the part of the gap part, The pore size of the filter can be changed freely, and blood cell destruction does not occur.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, these methods are effective as a method for reducing the amount of the sample solution, but have a problem that the structure of the obtained biosensor becomes complicated. For example, when a flat filter having a triangular shape is used in a vertical shading, the tip (vertex portion) can be inserted even about 1 mm inside the opening (width 0.8 mm) of the sample liquid supply path. It was very difficult to manufacture.
Further, the separation methods (1) and (3) have a problem that the flow rate of the filtrate is slower than the separation method (2). In contrast, the structure of the obtained biosensor can be simplified, but when applied as a cholesterol sensor, it is necessary to carry a reagent on the part facing the electrode. It was impossible to adopt. There are two reasons for this, one is a structural problem, and the other is a problem of the reagent carrying position.
[0010]
The first problem is pointed out in, for example, each specification of Japanese Patent Application Nos. 62-180434 and 62-292323. For example, when the separation method (2) is used, it is necessary to adopt a structure as shown in FIGS.
As shown in FIG. 10, in this type of biosensor, a working electrode 202 and a counter electrode 203 are provided on an insulating substrate 201, and an oxidoreductase layer 205, a void portion 206, a filter 207, and a porous body 208 are formed thereon. Is provided. The filtration at this time is classified as a natural filtration method using gravity. However, since the flow rate is slow due to the formation of bubbles in the sample solution or the difficulty in entering the sample solution into the porous body 208, the filtrate is used as an electrode. Therefore, there is a problem that the measurement accuracy is inferior, and a pressurizing device 211 of a pump type is provided on the upper portion, and the sample liquid 212 is filtered by applying a pressure 214.
[0011]
In this respect, in the sensor described in the specification of Japanese Patent Application No. 62-292323, as shown in FIGS. 11 and 12, the filtrate that has passed through the filter 308 is replaced with electrodes 302 ′, 303 instead of the pressurizing device. An inductive layer 307 is placed in the sensor to lead to 'and 304'. As a result, the filtrate is guided to the induction layer 307, wets the electrode first, and spreads on the electrode with the help of the hydrophilic polymer layer 312 on the electrode surface. High measurement is possible.
In FIGS. 11 and 12, a filter 308, a holding frame 309, a porous body 310, and a cover 311 are provided on the induction layer 307. Electrodes 302, 303, and 304 are disposed on the substrate 301, and an insulating layer 305 is provided. However, in any case, there is a problem that the structure of the sensor is complicated.
[0012]
On the other hand, the problem concerning the second reagent carrying position is described in Japanese Patent Application No. 2000-018834. Unlike the blood glucose sensor, the cholesterol sensor disclosed in the specification carries a reagent with a very high concentration. Therefore, if all the necessary reagents are carried in one place like the blood glucose sensor, the diffusion of the reagent is hindered. There is a problem that the accuracy of the response current value is lowered. Further, the reagent contains a surfactant that is not found in the blood glucose sensor, and this adversely affects the storage stability of other reagents, so it must be separated and supported. For this reason, it has been impossible to adopt a conventional structure in which the reagent is carried separately on the top and bottom (on the electrode and on the cover side) and a filter is provided on the top of the electrode.
[0013]
Therefore, the present invention avoids the above-mentioned disadvantages when adopting the vertical separation method, and provides an improved biosensor so that plasma obtained by separating blood cells by blood filtration can quickly reach the electrode system. The purpose is to provide. More specifically, an object of the present invention is to provide a cholesterol sensor that is highly accurate and excellent in responsiveness and that uses whole blood as a measurement target.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention includes an insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode provided on the substrate, a reaction layer including at least an oxidoreductase and an electron mediator, the electrode system and the reaction layer, and a termination portion. A sample liquid supply path having an air hole on the side, a sample liquid supply part for introducing the sample liquid, and a filter provided between the sample liquid supply path and the sample liquid supply part for filtering the sample liquid The filtrate filtered by the filter is sucked into the sample liquid supply path by capillary action, and the filter does not enter the sample liquid supply path, and the sample The direction in which the liquid passes through the filter Against the substrate And a direction in which the plasma passes from the opening of the sample solution supply path toward the air hole. Against the substrate The present invention relates to a biosensor characterized by being in a horizontal direction.
[0015]
It is effective that the filter has a cylindrical shape.
In addition, it is effective that the diameter of the circular end face of the filter is 5 mm or less. In addition, it is effective that there is an opening for dropping the sample liquid on the upper part of the filter. Further, it is effective to have at least one void portion that surrounds the surface of the filter in the region from the primary side portion to the secondary side portion of the filter.
In addition, it is effective that a hole communicating with the filter is provided at the bottom of the sample solution supply unit. Furthermore, it is effective that the size of the opening of the sample solution supply unit is smaller than the size of the filter. It is effective to have a portion where the surface of the filter and the filter holding portion do not contact.
[0016]
In the biosensor, it is effective that the filter is made of glass fiber filter paper.
In this case, it is effective that the filter is not in contact with the electrode system. In addition, it is effective that at least a part of the bottom surface of the filter is in contact with the insulating substrate.
When the filter is made of glass fiber filter paper, it is effective that the fiber constituting the filter is coated with polyvinyl alcohol.
In addition, it is effective to have at least one void that surrounds the filter surface in the region from the lower part of the sample droplet of the filter to the opening of the sample liquid supply path.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As described above, the present invention includes an insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode provided on the substrate, a reaction layer including at least an oxidoreductase and an electron mediator, the electrode system and the reaction layer. A sample liquid supply path having an air hole on the terminal end side, a sample liquid supply section for introducing the sample liquid, and a sample liquid provided between the sample liquid supply path and the sample liquid supply section A biosensor comprising a filter for filtering, wherein the filtrate filtered by the filter is sucked into the sample liquid supply path by capillary action, and the filter does not enter the sample liquid supply path A direction in which the sample liquid passes through the filter is a vertical direction, and a direction in which the plasma passes from the opening of the sample liquid supply path toward the air hole is a horizontal direction. It relates to a sensor. By having such technical matters, the structure of the obtained biosensor can be simplified.
[0018]
In the biosensor according to the present invention, a vertical separation method is used as a method for separating blood cells, but blood is used as a sample liquid, and plasma that oozes out from the secondary side portion of the filter passes through an opening in the sample liquid supply path. Since the reagent flows horizontally while gradually dissolving the reagent toward the air hole at the end, the sensor structure can be simplified without changing the position of the reagent that is carried separately in the sample solution supply path. Can be achieved.
In addition, since the filter does not enter the sample solution supply path, the filter does not come into contact with the reagent contained in the reaction layer in the sample solution supply path, and this reagent is difficult to diffuse into the filter. As a result, there is no variation in reagent concentration, and stable sensor accuracy can be realized.
[0019]
The electron mediator used in the present invention can be selected from redox compounds having the ability to transfer electrons to oxidoreductases such as cholesterol oxidase in addition to potassium ferricyanide.
An oxidoreductase is an enzyme that uses a measurement object as a substrate, and glucose oxidase is used in a sensor that uses glucose as a measurement object. In order to measure the cholesterol level in serum used as a diagnostic guide, an enzyme cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase that catalyzes the oxidation reaction of cholesterol and an enzyme cholesterol esterase that catalyzes the process of changing cholesterol ester to cholesterol are used. Since the progress of the enzymatic reaction of cholesterol esterase is very slow, by adding an appropriate surfactant, the activity of cholesterol esterase can be improved and the time required for the whole reaction can be shortened.
[0020]
A reaction layer containing a reagent such as an electron mediator and an oxidoreductase is disposed on or near the electrode system in the sensor. In a sensor having a cover member that is combined with a substrate provided with an electrode system and forms a sample solution supply path for supplying the sample solution to the electrode system with the substrate, the sensor is exposed to the sample solution supply path. The reaction layer can be disposed at a portion to be performed or an opening of a sample solution supply path. At any position, it is preferable that the reaction layer is easily dissolved by the introduced sample solution and can reach the electrode system. Further, in order to protect the electrode and suppress peeling of the formed reaction layer, it is preferable to form a hydrophilic polymer layer in contact with the electrode. In addition to the electrode system, it is preferable to form a hydrophilic polymer layer as a base for forming the reaction layer. When the reaction layer is composed of a plurality of layers, a hydrophilic polymer is included in the lowermost layer. Is preferred.
[0021]
The reaction layer containing the electron mediator is preferably provided separately from the surfactant in order to increase the solubility. Further, for storage stability, it is preferable to separate it from the enzymes cholesterol oxidase and cholesterol esterase that catalyze the oxidation reaction of cholesterol.
In biosensors that measure blood glucose levels, there is an example in which a lipid-containing layer is formed so as to cover a layer formed on an electrode system in order to facilitate introduction of a sample solution into a reaction layer. (For example, JP-A-2-062952). In the biosensor for measuring cholesterol according to the present invention, a part of the reaction layer is formed by freeze-drying (Japanese Patent Application No. 2000-018834), or the surface of the cover member is subjected to a hydrophilic treatment by a surfactant or plasma irradiation. It is preferable to adopt a configuration in which a lipid layer is not required.
[0022]
Examples of the hydrophilic polymer include water-soluble cellulose derivatives such as ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, gelatin, agarose, polyacrylic acid and salts thereof, starch and derivatives thereof, and maleic anhydride. And their salts, polyacrylamide, methacrylate resin, poly-2-hydroxyethyl methacrylate and the like.
[0023]
Examples of the surfactant include n-octyl-β-D-thioglucoside, polyethylene glycol monododecyl ether, sodium cholate, dodecyl-β-maltoside, sucrose monolaurate, sodium deoxycholate, taurodeoxycholic acid. Sodium, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide, polyoxyethylene (10) octylphenyl ether and the like, and other surfactants as long as the effects of the present invention are not impaired. Can also be used.
[0024]
When lipids are used, amphipathic lipids are preferably used with phospholipids such as lecithin, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine.
As a method for measuring the oxidation current, there are a two-electrode method using only a measuring electrode and a counter electrode, and a three-electrode method including a reference electrode, and the three-electrode method enables more accurate measurement.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of specific embodiments.
[0025]
Embodiment 1
FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to a preferred embodiment. As shown in FIG. 1, the biosensor according to the present invention has an insulating substrate 1 made of an insulating resin such as polyethylene terephthalate. In FIG. 1, a palladium portion is formed on the upper left side of a substrate 1 by sputtering or vapor deposition, and an electrode system including a working electrode 2 and a counter electrode 3 is formed by laser trimming.
The area of the electrode is determined by the width of the slit 8 formed on the spacer 5 described later.
[0026]
The spacer 5 to be combined with the substrate 1 is formed with a slit 8 that forms a sample solution supply path in the obtained biosensor, an opening 7 of the slit 8, and a communication portion 6 that houses the filter 4. The cover 9 has an air hole 11 in addition to the communication portion 10 that houses the filter 4.
The filter holding plate 12 is formed with a gap portion 13 and a protruding filter holding portion (protrusion portion) 14 that directly supports the filter 4. Further, an opening 16 that communicates with the upper surface of the filter 4 is formed in the upper cover 15 that forms the lower part of the sample droplet. The filter holding plate 12 may be composed of a plurality of members as shown in Example 2 described later.
[0027]
When the substrate 1, the spacer 5, the cover 9, the filter holding plate 12 and the upper cover 15 are integrated, the communication portion 6 connected to the slit 8, the communication portion 10 formed in the cover 9, and the filter holding plate 12. And the opening 16 formed in the upper cover 15 communicate with each other.
The filter 4 which is a blood cell filtration part consists of filter paper made from glass fiber, and has a cylindrical shape with a diameter of 2 to 5 mm and a height (thickness) of 200 to 1000 μm.
[0028]
To assemble this sensor, a reaction layer is formed on a predetermined portion of the substrate 1 as will be described later. In addition, based on the positional relationship shown in FIG. 1, a reaction layer is formed on a predetermined member as will be described later in a recess (sample liquid supply path) formed by the slit 8 of the combined substrate A in which the cover 9 and the spacer 5 are combined. Form. Furthermore, based on the positional relationship shown in FIG. 1, a combined substrate B in which the filter holding plate 12 and the upper cover 15 are combined is manufactured. And the board | substrate 1, the unification board | substrate A, the filter 4, and the unification board | substrate B are installed so that it may show with the dotted line and dashed-dotted line of FIG.
[0029]
Here, FIG. 2 shows a schematic perspective view of the biosensor according to the present invention obtained according to the configuration of FIG. Further, a cross-sectional view taken along line XX in FIG. 2 is shown in FIG. As shown in the cross-sectional view of FIG. 3, in the biosensor according to the present invention, a gap 13 is formed in which the filter 4 and other members are not in contact with each other. In order to completely remove blood cells that are interfering substances, in order to ensure that the sample liquid passes through the filter, a portion that is not in contact with the filter holding portion, that is, the filter surface, in the region from the opening portion 16 to the opening portion 7 is made uniform. It is necessary to provide at least one gap 13 that turns around.
Although the reaction layer and the electrode system are omitted in FIG. 2, FIG. 4 shows a partially enlarged sectional view corresponding to FIG. 3 showing the reaction layer and the electrode system. A hydrophilic polymer layer 17 and a reaction layer 18 a are formed on the electrodes 2 and 3 of the substrate 1. A reaction layer 18b is formed on the lower surface of the cover 9 corresponding to the ceiling of the sample solution supply path. The other members shown in FIG. 4 are the same as those shown in FIG.
[0030]
The biosensor shown in FIGS. 1 to 4 is manufactured using the filter 4 and five types of members (substrates) in order to make the structure easy to understand. However, the upper cover 15 and the filter holding plate 12 may be formed from one member, and these and the cover 9 may be formed from one member. Further, depending on the thickness of the filter 4, the filter holding plate 12 or the filter holding portion 14 may be omitted.
[0031]
Embodiment 2
FIG. 5 is an exploded perspective view of a biosensor according to another preferred embodiment. As shown in FIG. 5, the biosensor according to the present invention has an insulating substrate 101 made of an insulating resin such as polyethylene terephthalate. In FIG. 5, a palladium portion is formed on the upper left surface of the substrate 101 by sputtering or vapor deposition, and an electrode system including a working electrode 102 and a counter electrode 103 is formed by laser trimming. The area of the electrode is determined corresponding to the width of the slit 108 formed on the spacer 105 described later.
[0032]
The spacer 105 combined with the substrate 101 includes a slit 108 constituting a sample solution supply path in the biosensor to be obtained, an opening 107 of the slit 108, and a communication portion 106 having a diameter smaller than that of the filter 104 and accommodating the filter 104. Is formed. The cover 109 is formed with a communication portion 110 having a smaller diameter than the filter 104 and accommodating the filter 104 and an air hole 111.
Here, the filter holding plate 12 in the first embodiment is configured by a single plate, but the filter holding plate 112 in the second embodiment is configured by filter holding plates 112a, 112b and 112c. Yes.
[0033]
The filter holding plate 112a is formed with a gap portion 113a having a diameter larger than that of the filter 104. The filter holding plate 112b has a gap portion 113b having the same diameter as the gap portion 113a and a protruding shape that directly supports the filter 104. The filter holding part (projection part) 114 is formed. The filter holding plate 112c has the same shape as the filter holding plate 112a, and a gap 113c is formed.
Further, an opening 116 that communicates with the upper surface of the filter 104 is formed in the upper cover 115 that forms the lower part of the sample droplet.
[0034]
When the substrate 101, the spacer 105, the cover 109, the filter holding plates 112a, 112b and 112c, and the upper cover 115 are integrated, the communication portion 106 connected to the slit 108 and the communication portion 110 formed in the cover 109 are integrated. , A gap 113a formed in the filter holding plate 112a, a gap 113b formed in the filter holding plate 112b, a gap 113c formed in the filter holding plate 112c, and an opening formed in the upper cover 115. The unit 116 communicates.
The filter 104 which is a blood cell filtration unit is made of glass fiber filter paper and has a cylindrical shape with a diameter of 3 mm and a height (thickness) of 500 to 1000 μm. And the fiber which comprises the filter paper made from glass fiber is coated with PVA.
[0035]
In order to assemble this sensor, first, the cover 109 is placed on the spacer 105 based on the positional relationship shown in FIG. At this time, a reaction layer is formed in a recess (sample liquid supply path) formed by the slit 108 when the cover 109 and the spacer 105 are combined. Further, on the basis of the positional relationship shown in FIG. 5, the filter holding plate 112b and the filter holding plate 112c are placed on the filter holding plate 112a, and the upper cover 115 is further placed thereon to obtain the combined substrate D.
The substrate 1 and the combined substrate A are combined based on the positional relationship shown in FIG. 5, and the filter 104 is installed immediately above the communicating portions 106 and 110 that communicate with each other. And the board | substrate 1, the unification board | substrate C, and the unification board | substrate D are combined in the positional relationship that a right end corresponds.
[0036]
Here, FIG. 6 shows a schematic perspective view of the biosensor according to the present invention obtained according to the configuration of FIG. Furthermore, FIG. 7 shows a cross-sectional view taken along line YY in FIG.
Although the reaction layer and the electrode system are omitted in FIG. 7, FIG. 8 shows a partially enlarged sectional view corresponding to FIG. 7 showing the reaction layer and the electrode system. On the electrode system (102 and 103) of the substrate 101, a hydrophilic polymer layer 117 and a reaction layer 118a are formed. In addition, a reaction layer 118b is formed on the lower surface of the cover 109 corresponding to the ceiling of the sample solution supply path. The other members shown in FIG. 8 are the same as those shown in FIG.
[0037]
The biosensor of the present invention shown in FIGS. 5 to 8 is manufactured using the filter 104 and seven types of base materials in order to easily explain the structure. However, the cover 109 and the spacer 105 may be formed of a single member, or the filter holding plates 112a and 112b or the filter holding plates 112b and 112c may be omitted depending on the thickness of the filter 104. Further, the filter holding unit 114 may be omitted.
[0038]
In order to measure cholesterol in blood using the biosensor shown in FIG. 1 to FIG. 4 or FIG. 5 to FIG. 8, for example, blood that is a sample solution collected from a fingertip by puncture is used. 116. The blood supplied here permeates into the upper surface of the primary part of the filter 4 or 104 and is filtered. And the plasma which is a filtrate other than a blood cell oozes out from a secondary side part. The exuding plasma is dissolved in the slit 8 or 108 extending to the vicinity of the electrode system and further to the air hole 11 or 111 while dissolving the reaction layer carried on the back surface of the cover 9 or 109 and / or the position covering the electrode system. The entire sample solution supply path 8 ′ or 108 ′ is filled. When the entire sample liquid supply path 8 ′ or 108 ′ is filled, the flow of the liquid dropped on the filter 4 or 104 is also stopped.
[0039]
As the filter 4 or 104, it is preferable to use a filter having a discontinuous and non-uniform internal structure and a non-uniform pore size distribution. Therefore, it is preferable that the shape of the flow path inside the filter 4 or 104 is also irregular. The filtration is performed inside the filter 4 or 104. Moreover, in the said Embodiment 2, the fiber which comprises the filter 104 is coated with PVA.
Through such a blood cell filtration process, a chemical reaction occurs between the reaction layer dissolved by plasma and a measurement component (for example, glucose, total cholesterol, or LDL cholesterol) in the plasma, and after a certain period of time, an electric current is generated by the electrode reaction. The value can be measured and the components in plasma can be quantified.
[0040]
As described above, FIGS. 4 and 8 show examples of the arrangement of the reaction layers in the vicinity of the electrode system in the sample solution supply path 8 ′ or 108 ′. On the electrode system 2 and 3 or 102 and 103 of the substrate 1 or 101, a hydrophilic polymer layer 17 or 117 containing sodium salt of carboxymethyl cellulose (hereinafter simply referred to as “CMC”) and the like, for example, electrons A reaction layer 18a or 118a containing a reaction reagent such as a mediator is formed. Further, in the combined substrate A or C in which the cover 9 or 109 and the spacer 5 or 105 are combined, a reaction layer containing an oxidation-reduction reaction enzyme is exposed on the surface exposed to the sample solution supply path 8 ′ or 108 ′ of the cover 9 or 109. 18b or 118b is formed.
[0041]
In particular, in the first embodiment, the communication part 10 of the filter holding plate 12 is designed not to contact the filter 4 except for the filter holding part 14 and to prevent the filter 4 from expanding. Yes. Therefore, there is no possibility that blood cells in the sample solution are destroyed.
In the biosensor having the structure shown in FIGS. 1 to 4, the sample liquid supply path preferably has a width of 1.5 mm or less, a height of 150 μm or less, and a length of 4.5 mm or less.
[0042]
The volume of the biosensor according to the present invention is preferably 0.05 μl or more and 1.0125 μl or less. The electrode system is preferably an electrode made of a noble metal. Since the width of the sample solution supply path is preferably 1.5 mm or less, the accuracy of determining the electrode area is inferior in a printed electrode using a screen. However, the noble metal electrode can be laser-trimmed with a width of 0.1 mm, and the accuracy of determining the electrode area is high.
[0043]
In particular, in the biosensor according to the first embodiment, as shown in FIG. 13, at least a part of the secondary side portion of the filter 4 only needs to be in contact with the substrate 1, the spacer 5, and the cover 9. For example, as shown in FIG. 14, the secondary side portion of the filter 4 may be cut obliquely to provide an inclined portion. As described above, by providing the inclined portion having a shape that opens toward the opening 7 on the contact surface with the substrate 1, the filtrate can be easily guided to the sample solution supply path 8 ′.
Moreover, as shown in FIG. 13, it is preferable that the cross-sectional area (F1) of the primary part of the said filter is larger than the cross-sectional area (S1) of the opening part 7 of the said sample liquid supply path. Thereby, the effect that the rate at which the inside of the sample liquid supply path 8 ′ of the sensor is saturated with the filtered plasma is increased is obtained.
Furthermore, as shown in FIG. 15, the cross-sectional area (F1) of the primary side portion of the filter is larger than the cross-sectional area (F2) of the secondary side portion in contact with the substrate 1 on the opening 7 side of the sample solution supply path. Larger is preferred. Thereby, the effect that the rate at which the sample liquid supply path 8 ′ of the sensor is saturated with the filtered plasma is further increased is obtained. 13 to 15, the components other than the substrate 1, the filter 4, the spacer 5, and the cover 9 are omitted.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described using examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
A biosensor having the structure shown in FIGS. 1 to 4 and having total cholesterol as a measurement target, the reaction layer 18a includes an electron mediator, and the reaction layer 18b includes cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and a surfactant. A biosensor was fabricated.
First, 5 μl of a 0.5 wt% CMC aqueous solution was dropped on the electrode system of the substrate 1 and dried in a hot air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to form a hydrophilic polymer layer 17. Next, 4 μl of potassium ferricyanide aqueous solution (corresponding to 70 mM potassium ferricyanide) is dropped on the hydrophilic polymer layer 17 and dried in a hot air dryer at 50 ° C. for 10 minutes, whereby the reaction layer 18 a containing potassium ferricyanide is obtained. Formed.
[0045]
Polyoxyethylene (Surfactant) is dissolved in an aqueous solution in which cholesterol oxidase derived from Nocardia (EC 1.1.3.6: ChOD) and Pseudomonas-derived cholesterol esterase (EC 3.1.1.13: ChE) are dissolved. 10) Octylphenyl ether (Triton X-100) was added. 0.4 μl of this mixed solution is dropped into a recess formed by integrating the spacer 5 and the cover 9 (the portion corresponding to the upper side of the sample solution supply path 8 ′ of the cover 9), and liquid nitrogen at −196 ° C. After preliminary freezing, the reaction layer 18b (FIG. 4) containing 450 U / ml cholesterol oxidase, 1125 U / ml cholesterol esterase and 2 wt% surfactant was formed by drying with a freeze dryer for 2 hours.
[0046]
In the case of obtaining a biosensor having LDL cholesterol as a measurement target, a surfactant that selectively solubilizes only LDL may be used. Thereby, LDL cholesterol can be guided to the reaction system and LDL cholesterol can be measured. Since the enzymatic reaction against lipoproteins other than LDL (chylomicron, HDL, VLDL) is inhibited by this surfactant, these lipoproteins are not introduced into the cholesterol reaction system, Remains in the form.
[0047]
For each sensor dimension, the slit width is 0.8 mm, the slit length (length from the opening of the sample liquid supply path to the air hole) is 4.5 mm, and the thickness of the spacer 5 (distance from the substrate 1 to the cover 9). ) Is preferably 100 μm.
The filter 4 was manufactured as a cylindrical one by punching a glass fiber filter paper having a thickness of about 700 μm into a circle having a diameter of 2.5 mm. The filter 4 was installed in a space composed of the communication portion 6, the communication portion 10, and the gap portion 13 obtained by combining the substrate 1, the spacer 5, the cover 9, and the filter holding plate 12.
Thereafter, an upper cover 14 was installed on the upper part of the filter holding plate 12 to produce a biosensor having the structure shown in FIGS.
[0048]
From the opening 16 of the obtained biosensor, 10 μl of whole blood or standard serum was dropped as a sample solution, and after 180 seconds, a pulse voltage of +0.2 V was applied to the working electrode in the anode direction with reference to the counter electrode, for 5 seconds. Later, the value of the current flowing between the working electrode and the counter electrode was measured. The resulting response characteristics are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 16, the biosensor according to the present invention provides good linearity between the total cholesterol concentration and the response value.
[0049]
Example 2
The biosensor has a structure shown in FIGS. 5 to 8 and uses a total cholesterol as a measurement target. The reaction layer 118a contains an electron mediator, and the reaction layer 118b contains cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and a surfactant. The included biosensor was made.
First, 5 μl of a 0.5 wt% CMC aqueous solution was dropped on the electrode system of the substrate 101 and dried in a hot air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to form a hydrophilic polymer layer 117. Next, 4 μl of an aqueous potassium ferricyanide solution (corresponding to 70 mM potassium ferricyanide) is dropped on the hydrophilic polymer layer 117 and dried in a hot air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to thereby form a reaction layer 118a containing potassium ferricyanide. Formed.
[0050]
Polyoxyethylene (Surfactant) is dissolved in an aqueous solution in which cholesterol oxidase derived from Nocardia (EC 1.1.3.6: ChOD) and Pseudomonas-derived cholesterol esterase (EC 3.1.1.13: ChE) are dissolved. 10) Octylphenyl ether (Triton X-100) was added. 0.4 μl of this mixed solution is dropped into a recess formed by integrating the spacer 105 and the cover 109 (the portion corresponding to the upper side of the sample solution supply path 108 ′ of the cover 109), and liquid nitrogen at −196 ° C. After preliminary freezing, the reaction layer 118b (FIG. 8) containing 450 U / ml cholesterol oxidase, 1125 U / ml cholesterol esterase and 2 wt% surfactant was formed by drying with a freeze dryer for 2 hours.
[0051]
In addition, when obtaining the biosensor which makes a measuring object LDL cholesterol, what is necessary is just to use the surfactant which selectively solubilizes only LDL. Thereby, LDL cholesterol can be led to the reaction system and LDL cholesterol can be measured. Since the enzyme reaction against lipoproteins other than LDL (chylomicron, HDL, VLDL) is inhibited by this surfactant, these lipoproteins are not introduced into the cholesterol reaction system, Remains in the form.
[0052]
The filter 104 was produced by punching a glass fiber filter paper coated with PVA into a circle having a diameter of 2.5 mm.
Thereafter, the filter 104 is installed on the substrate 101 and the combined substrate C, and then the combined substrate B in which the filter holding plates 112a, 112b and 112c and the upper cover 115 are integrated is bonded onto the filter 104. A biosensor having the structure shown in FIGS.
[0053]
To the opening 116 of the obtained biosensor, 10 μl of whole blood is dropped as a sample solution, and after 180 seconds, a +0.2 V pulse voltage is applied to the measurement electrode in the anode direction with reference to the counter electrode, and after 5 seconds, the working electrode is applied. The value of the current flowing between the electrode and the counter electrode was measured. The resulting response characteristics are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 17, the biosensor according to the present invention provides good linearity between the cholesterol concentration and the response value.
[0054]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, when measuring the blood extract | collected by the puncture of a fingertip, for example, the biosensor which can introduce | transduce the blood in a fingertip efficiently can be provided. Further, according to the present invention, blood cells that are interfering substances can be removed without hemolysis by a filter, and plasma after removal of blood cells can be rapidly supplied to the electrode system even if the filter thickness is thin, and thus response characteristics It is possible to provide an electrochemical biosensor excellent in the above.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an exploded perspective view of a biosensor according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a combined perspective view of the biosensor of FIG.
3 is a cross-sectional view taken along line XX of FIG. 2 in which a reaction layer and the like are omitted.
4 is an enlarged cross-sectional view of the vicinity of the electrode system of FIG.
FIG. 5 is an exploded perspective view of a biosensor according to another embodiment of the present invention.
6 is a combined perspective view of the biosensor of FIG. 5. FIG.
7 is a cross-sectional view taken along line YY of FIG. 6 in which a reaction layer and the like are omitted.
8 is an enlarged cross-sectional view of the vicinity of the electrode system of FIG.
FIG. 9 is a schematic cross-sectional view of a filter device for explaining a mechanism for separating blood.
FIG. 10 is a longitudinal sectional view of a conventional biosensor.
FIG. 11 is an exploded perspective view of another conventional biosensor.
12 is a longitudinal sectional view of the biosensor shown in FIG.
FIG. 13 is a partial cross-sectional view showing the form of the secondary side portion of the filter in the biosensor of the present invention.
FIG. 14 is a partial cross-sectional view showing another form of the secondary portion of the filter in the biosensor of the present invention.
FIG. 15 is a partial cross-sectional view showing still another form of the secondary side portion of the filter in the biosensor of the present invention.
16 is a graph showing the response characteristics of the biosensor in Example 1. FIG.
17 is a graph showing the response characteristics of the biosensor in Example 2. FIG.
[Explanation of symbols]
1, 101 substrate
2,102 Working electrode
3, 103 Counter electrode
4, 104 filters
5, 105 Spacer
6, 106 communication part
7, 107 opening
8,108 slit
8 ', 108' Sample solution supply path
9, 109 cover
10, 110 communication part
11, 111 Air hole
12, 112 Filter holding plate
13, 113 Cavity
14, 114 Filter holder
15, 115 Upper cover
16, 116 opening
17, 117 hydrophilic polymer layer
18a, 118a reaction layer
18b, 118b reaction layer

Claims

絶縁性基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料液を導入するための試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部との間に設けられた、試料液をろ過するフィルタを具備し、前記フィルタでろ過されたろ液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、
前記フィルタが前記試料液供給路内に侵入しておらず、前記試料液が前記フィルタを通過する方向が前記基板に対して垂直方向であり、さらに前記ろ液が前記試料液供給路の開口部から前記空気孔に向かって通過する方向が前記基板に対して水平方向であることを特徴とするバイオセンサ。An insulating substrate, an electrode system having a working electrode and a counter electrode provided on the substrate, a reaction layer including at least an oxidoreductase and an electron mediator, the electrode system and the reaction layer, and having an air hole on a terminal end side A sample liquid supply path, a sample liquid supply section for introducing the sample liquid, and a filter for filtering the sample liquid provided between the sample liquid supply path and the sample liquid supply section. A biosensor in which the filtered filtrate is sucked into the sample liquid supply path by capillary action,
The filter does not enter the sample solution supply path, the direction in which the sample solution passes through the filter is a direction perpendicular to the substrate , and the filtrate is an opening of the sample solution supply path. The biosensor is characterized in that the direction passing through the air hole toward the air hole is horizontal with respect to the substrate .

前記フィルタの一次側部分に前記試料液を供給するための開口部を有することを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。The biosensor according to claim 1, further comprising an opening for supplying the sample solution to a primary side portion of the filter.

前記フィルタの一次側部分から二次側部分までの領域において、前記フィルタの表面を一回り囲む空隙部を少なくとも１つ有することを特徴とする請求項１または２記載のバイオセンサ。 3. The biosensor according to claim 1, wherein in the region from the primary side portion to the secondary side portion of the filter, at least one void portion that surrounds the surface of the filter is provided.

前記フィルタの一次側部分の断面積が、前記試料液供給路の開口部の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 1 to 3, wherein a cross-sectional area of a primary side portion of the filter is larger than a cross-sectional area of an opening of the sample liquid supply path.

前記フィルタの一次側部分の断面積が、前記フィルタの二次側部分の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 1 to 4, wherein a cross-sectional area of a primary side portion of the filter is larger than a cross-sectional area of a secondary side portion of the filter.

前記フィルタがガラス繊維ろ紙で構成されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 1, wherein the filter is made of glass fiber filter paper.

前記フィルタが前記電極系と非接触であることを特徴とする請求項１または６記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 1 or 6, wherein the filter is not in contact with the electrode system.

前記フィルタの底面の少なくとも一部が前記絶縁性基板に接触していることを特徴とする請求項１、６または７記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 1, 6 or 7, wherein at least a part of a bottom surface of the filter is in contact with the insulating substrate.

前記フィルタを構成する繊維がポリビニルアルコールでコーティングされていることを特徴とする請求項７記載のバイオセンサ。 The biosensor according to claim 7, wherein the fiber constituting the filter is coated with polyvinyl alcohol.

前記フィルタの試料液滴下部から試料液供給路の開口部までの領域において、前記フィルタ表面を一回り囲む空隙部を少なくとも１つ有することを特徴とする請求項１および６〜９のいずれかに記載のバイオセンサ。 The region from the lower part of the sample droplet of the filter to the opening of the sample liquid supply path has at least one void part that surrounds the filter surface. The biosensor described.

前記フィルタの一次側断面積が、前記試料液供給路の開口部の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項６〜１０のいずれかに記載のバイオセンサ。 The biosensor according to any one of claims 6 to 10, wherein a primary side cross-sectional area of the filter is larger than a cross-sectional area of an opening of the sample liquid supply path.