JP4600769B2 - プローブ及び特定物質解析装置並びに特定物質解析方法 - Google Patents
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具体的に説明すると、ガラス基板等の透明基板上に形成した金薄膜の表面に、タンパク質等、ある特定のターゲット物質に対する抗体を、リンカーを介して固定した後、透明基板を通して金薄膜の裏面側にプリズムを介してレーザ光を入射・反射させる。この際、レーザ光の全反射によって、金薄膜側に微弱なエネルギー波(エバネッセント波)が生じると共に、抗体に接触した金薄膜表面に粗密波(表面プラズモン)が発生する。そして、レーザ光の入射角度を変化させると、特定の入射角度で、エバネッセント波と粗密波との波数が一致して反射光が減衰する。
即ち、SPRセンサを利用した測定では、同じSPRセンサ同士間で相互の測定結果を比較し合うことはできるが、他の検出方法で測定された測定結果と比較し合って、測定結果の妥当性を検討するといったことができなかった。つまり、測定結果が、SPRセンサ固有の値として示されるので、他の方法による測定結果と比較することができなかった。そのため、利便性に欠け、測定結果を有効に利用することが困難であった。
仮にこれを解明するため、走査型プローブ顕微鏡のカンチレバー等を利用して、ターゲット物質が抗体に結合した後の結合状態を観察しようとしても、いずれのセンサであっても抗体が吸着するセンサ面は数十nmのスケールで凹凸形状となっているので、該凹凸内に抗体やターゲット物質が入り込んでしまい、ターゲット物質の結合状態を正確に観察することができなかった。その結果、走査型プローブ顕微鏡等を用いたとしても、やはり上述した問題が依然残されたままであった。
本発明のプローブは、所定の厚みを有した平板状に形成され、基端側から先端側に向けて一方向に延びたレバー部と、該レバー部の主面上に取り付けられ、特定物質が反応して付着する薄膜と、前記レバー部の基端側を片持ち状態に支持するホルダ部と、前記レバー部の変位を測定する変位測定手段とを備え、前記薄膜が、多層に積層された層状物質を剥離して得られた薄膜であることを特徴とするものである。
そして、この薄膜上にタンパク質やDNA等の微小な特定物質が反応して付着すると、その重量変化によりレバー部は撓んで変形する。また、このレバー部の変位は、変位測定手段によって測定される。
ここで、薄膜表面は、上述したように原子レベルで平らな平滑面となっているので、走査型プローブ顕微鏡等を利用して薄膜表面に付着した特定物質の状態、例えば、特定物質がいくつ付着したのか、どのような状態で付着したのか等を観察することができる。つまり、数十nmの凹凸内に入り込んで特定物質を観察することが困難であった従来のものとは異なり、表面が原子レベルで平滑なため、このような不具合がなく、付着した全ての特定物質の、実際の状態を正確に観察して把握することができる。
この際、金薄膜又は二酸化珪素は、原子レベルで平滑された薄膜上に被膜されているので、薄膜と同様にやはり表面が原子レベルで平滑化した状態となっている。よって、予め抗体がどのような状態で、金薄膜又は二酸化珪素にどのくらいの個数固定していたか、また、この抗体に対していくつ抗原が結合したか等を、走査型プローブ顕微鏡等を利用して正確に把握することができる。
その結果、従来困難であった、変位測定手段による測定結果と、実際の結合状態とを相関付けた抗体−抗原反応を観察することができる。
このように動的な方法で、特定物質の微小な重量変化を測定することができ、静的な方法に比べて測定結果の精度をより向上することができる。
このように溶液を貯留する容器を備えているので、液中で特定物質の観察を行うことができる。よって、観察できる特定物質の幅を広げることができ、より使い易くなり、機能性が向上する。
次いで、付着工程が終了した後、プローブとカンチレバーとをXY方向に相対的に移動させて、探針で薄膜上の走査工程を行う。この走査工程の際、カンチレバーの撓みが一定となるように探針とレバー部との距離(高さ)をフィードバック制御する。その結果、薄膜上に付着した特定物質の形状観察を行うことができ、実際の付着状態を正確に把握することができる。なお、特定物質の形状観察だけでなく、特定物質の導電性の有無等、各種物性情報についても観察することができる。
このように動的な方法で、特定物質の微小な重量変化を測定することができ、静的な方法に比べて測定結果の精度をより向上することができる。
また、付着工程が終了した後、走査工程前にレバー部の振動状態を停止する。その後、カンチレバーによる走査を行って、付着した特定物質の形状観察を行う。
本実施形態の特定物質解析装置1は、図1に示すように、プローブ2と、該プローブ2の後述するレバー部10の主面10aに対向するように配され、先端に探針3を有するカンチレバー4と、該カンチレバー4とプローブ2とを、主面10aに平行なXY方向に相対的に走査させると共に、主面10aに垂直なZ方向に相対的に移動させる移動手段5と、カンチレバー4の変位を測定する第2の変位測定手段6と、該第2の変位測定手段6による測定結果に基づいて、走査時に探針3とレバー部10との距離を、カンチレバー4の撓みが一定となるように移動手段5を制御する制御手段9と、溶液W及び特定のDNA(特定物質)を貯留すると共に、少なくともプローブ2及びカンチレバー4を溶液W内に浸した状態で収納する容器7とを備えている。
即ち、本実施形態では、溶液W内に存在するDNAを液中観察する場合を例にして説明する。
また、このピエゾ抵抗素子15には、アルミニウム等の金属配線16が電気的に接続されており、金属配線16を含む全体的な形状がU字状になるように形成されている。また、金属配線16の端部は、2つの外部接続端子17にそれぞれ電気的に接続されている。つまり、一方の外部接続端子17から金属配線16に流れた電流は、一方のピエゾ抵抗素子15を通った後、開口14を回り込んで他方のピエゾ抵抗素子15に流れ、その後、他方の外部接続端子17から外部に流れるようになっている。
なお、ピエゾ抵抗素子15及び金属配線16上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
即ち、上述したピエゾ抵抗素子15、金属配線16及び外部接続端子17は、上記変位測定手段13を構成している。
なお、プローブ2と同様に、ピエゾ抵抗素子33及び金属配線34上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
また、このZ電圧フィードバック回路23には、上述した制御部20が接続されており、該制御部20が出力信号に基づいて、レバー部30の変位を算出し、薄膜11の表面の形状観察を行うようになっている。
上述したピエゾ抵抗素子33、金属配線34及び外部接続端子35は、上記第2の変位測定手段6を構成している。また、Z電圧フィードバック回路23及び制御部20は、制御手段9を構成している。
本実施形態の特定物質解析方法は、プローブ2の周囲にDNAを供給して、特定のDNAを薄膜11に反応させて付着させる付着工程と、該付着工程中におけるレバー部10の変位を測定する変位測定工程と、付着工程後、探針3とレバー部10との距離を、カンチレバー4の撓みが一定となるようにZ方向に移動制御しながら、カンチレバー4とプローブ2とをXY方向に向けて相対的に移動させて、探針3で薄膜11上を走査する走査工程とを備えている。これら各工程について、以下に詳細に説明する。
この付着工程により、レバー部10は重量が変化するので、撓んで変形する。レバー部10が撓んで変形すると、レバー部10の基端側に設けられたピエゾ抵抗素子15に歪みが生じ、該歪みに応じて抵抗値が変化する。そして、ピエゾ抵抗素子15は、レバー部10の撓みに応じた出力信号を制御部20に出力する。この変位測定工程により、制御部20は送られてきた出力信号からレバー部10の変位を測定でき、薄膜11にDNAが付着したことによる重量変化を正確に測定することができる。
また、プローブ2に対向する位置にカンチレバー4を備えているので、DNAが付着した後、そのまま溶液中で速やかにDNAの形状観察を行うことができる。よって、使い易く、測定時間の短縮化を図ることができる。
ここで、特定物質を抗原とし、本発明に係るプローブ2及び特定物質解析装置1を利用して抗原の結合状態を正確に測定して、抗体−抗原反応を観察する場合を以下に説明する。なお、抗体として最も多量に血液中に含まれているIgG(Immunoglobulin Gamma)抗体を例にして説明する。
次いで、IgG抗体が固定化されたプローブ2を、各種の抗原が存在する溶液W内に浸す。すると、IgG抗体に反応する特定の抗原が次々とIgG抗体に結合して修飾し始める。レバー部10は、この抗原の修飾によって重量が変化するので、撓んで変形する。そして、このレバー部10の変位を変位測定手段13で測定することで、抗原の修飾状態を検出することができる。
つまり、変位測定手段13による測定結果を、実際の状態に関係付けながら解析することができる。従って、従来取得することが困難であった正確で幅広いデータを取得することができ、抗原−抗体反応をより詳細に解明することができる。
このプローブ41においては、薄膜11上にさらに金薄膜40が被膜されているので、IgG抗体を金薄膜40上に、図示しないリンカーを介して確実に固定することができる。よって、抗原−抗体反応をより正確に観察することができる。
こうすることで、一度に複数種類の特定物質を検出して解析を行うことができる。例えば、一度に複数の抗体−抗原反応を観察することができ、各種のアレルギー反応(例えば、蕎麦、卵や花粉アレルギー等)を一度に効率良く調べることができる。よって、解析にかける時間を短縮することができ、使い易さを向上することができる。
なお、付着工程が終了した後、走査工程前にレバー部10の振動状態を停止させる。その後、カンチレバー4による走査を行って、付着した特定物質の形状観察を行う。
DNA 特定物質
1 特定物質解析装置
2、41 プローブ
4 カンチレバー
3 探針
5 移動手段
6 第2の変位測定手段
7 容器
9 制御手段
10 レバー部
10a 主面
11 薄膜
12 ホルダ部
13 変位測定手段
40 金薄膜
41 圧電素子(加振手段)
Claims (8)
- 所定の厚みを有した平板状に形成され、基端側から先端側に向けて一方向に延びたレバー部と、
該レバー部の主面上に取り付けられ、特定物質が反応して付着する薄膜と、
前記レバー部の基端側を片持ち状態に支持するホルダ部と、
前記レバー部の変位を測定する変位測定手段とを備え、
前記薄膜は、多層に積層された層状物質を剥離して得られた薄膜であることを特徴とするプローブ。 - 請求項1に記載のプローブにおいて、
前記薄膜上には、金薄膜又は二酸化珪素のいずれかが被膜されていることを特徴とするプローブ。 - 請求項1又は2に記載のプローブにおいて、
前記レバー部を前記主面に直交する方向に向けて、所定の周波数で振動させる加振手段を備え、
前記変位測定手段が、前記レバー部の振動状態の変化から、前記特定物質の付着に起因するレバー部の重量変化を測定することを特徴とするプローブ。 - 請求項1から3のいずれか1項に記載のプローブにおいて、
前記レバー部を複数備え、各レバー部の前記薄膜がそれぞれ異なる種類の前記特定物質を付着させることを特徴とするプローブ。 - 請求項1から4のいずれか1項に記載のプローブと、
前記レバー部の主面に対向するように配され、先端に探針を有するカンチレバーと、
該カンチレバーと前記プローブとを、前記主面に平行なXY方向に相対的に走査させると共に、主面に垂直なZ方向に相対的に移動させる移動手段と、
前記カンチレバーの変位を測定する第2の変位測定手段と、
該第2の変位測定手段による測定結果に基づいて、前記走査時に前記探針と前記レバー部との距離を、前記カンチレバーの撓みが一定となるように前記移動手段を制御する制御手段とを備えていることを特徴とする特定物質解析装置。 - 請求項5に記載の特定物質解析装置において、
溶液及び前記特定物質を貯留すると共に、少なくとも前記プローブ及び前記カンチレバーを溶液内に浸した状態で収納する容器を備えていることを特徴とする特定物質解析装置。 - 所定の厚みを有した平板状に形成され、基端側がホルダ部に片持ち状態に支持されたレバー部と、該レバー部の主面上に設けられて特定物質が反応して付着する薄膜とを備えたプローブと、主面に対向するように配され、先端に探針を有するカンチレバーとを利用して、特定物質の解析を行う特定物質分析方法であって、
前記プローブの周囲に前記特定物質を供給して、該特定物質を前記薄膜に反応させて付着させる付着工程と、
該付着工程中における前記レバー部の変位を測定する変位測定工程と、
前記付着工程後、前記探針と前記レバー部との距離を、前記カンチレバーの撓みが一定となるように前記主面に垂直なZ方向に移動制御しながら、前記カンチレバーと前記プローブとを前記主面に平行なXY方向に向けて相対的に移動させて、前記探針で前記薄膜上を走査する走査工程とを備え、
前記薄膜が、多層に積層された層状物質を剥離して得られた薄膜であることを特徴とする特定物質解析方法。 - 請求項7に記載の特定物質解析方法において、
前記付着工程前に、前記レバー部を前記主面に垂直な方向に向けて、所定の周波数で振動させる加振工程を備え、
前記レバー部を振動させた状態で前記付着工程を行った後、前記走査工程前にレバー部の振動を停止させることを特徴とする特定物質解析方法。
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