JP4594733B2 - 腫瘍特異的融合蛋白質の検出のための方法およびプローブ - Google Patents
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Description
前述のように、本発明は、プローブセットを用いて細胞中の融合蛋白質の存在を決定する方法に関する。この方法は、融合遺伝子を生じさせる染色体転座、逆位または欠失に関与する種々のタイプの癌を診断するために用いられ得る。たとえば、急性リンパ性白血病(ALL)および慢性骨髄性白血病(CML)を有する成人患者の約35%は、特異的な染色体異常、すなわちフィラデルフィア(Ph)染色体を産生する染色体9と染色体22との間の転座に関連する。この転座は、ABLと呼ばれる蛋白質チロシンキナーゼのゲノム中の部位において生じ、異常なBCR−ABL融合蛋白質、すなわちABL遺伝子と、BCRと呼ばれる別の遺伝子とをin-frame融合した遺伝子産生物を産生する。一般的に、融合蛋白質は、腫瘍形成過程において重要な役割を果たす。たとえば、BCR−ABL融合蛋白質におけるABKのキナーゼ活性は、活性化かつ自由化され、ALL中およびCML中で観察される制御不能な細胞成長を促進する。急性リンパ性白血病が、患者において診断される場合、典型的には、Ph染色体の核型分析などの伝統的な細胞遺伝学的分析を含み、白血病性細胞の全数は、おおよそ1011〜1013である。患者の大部分は、化学療法の約5週間後に完全な回復に達する。完全な回復は、白血病性細胞が身体から全滅したことを意味するものではなく、これらのレベルが、古典的な細胞形態学的方法の感度レベル(たとえば1〜5%)を超えることを意味するものである。このときに、1010以下の悪性細胞が、患者にまだ残存し得る。これらは、微小残存病変(MRD)を示す。残存する悪性細胞の低い頻度の検出は、化学療法期間中における全身腫瘍組織量のより長い追跡検査を可能とし、したがって、治療に対する白血病性細胞の感度をより好ましく評価することを可能とする。MRDのレベルが最終の結果にとって力強い予後因子を示すことが確立される。その一方で、MRDレベルの増加の検出は、近い将来の再発予想を可能にする。本発明において提供される方法は、単細胞レベルでの正常な蛋白質の存在と異常な融合蛋白質の存在との区別を可能とする。
プローブセットの調製
好ましくは、本発明に従ったプローブセットは、2つの蛍光色素複合抗体のセットを含み、各抗体は、反応基を追加的に備える。抗体を産生する方法は、当業者に知られている。たとえば、ポリクローナル抗体を得るために、実験動物は、組み換え蛋白質または合成ペプチドのようなイムノゲンによって免疫にされる。動物の免疫応答は、検査採血および反応性の力価測定によって監視される。適切に高い力価が得られるとき、血液を、動物から得て、抗血清を調製する。蛋白質に対して反応する抗体の質を高めるために抗血清のさらなる分画が、必要に応じて行われてもよい。たとえば、Harlow et al. Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)を参照。モノクローナル抗体は、本技術分野において知られている種々の技術によって、たとえば、ポリエチレングリコール(PEG)の添加により、免疫にされたマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞系を融合させることによって、得ることができる。融合された細胞を、選択培地、たとえばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの混合物を含有する培地において培養する。この選択培地に生残する融合された細胞を、所望の抗体の産生のために(しばしばELISAのような固相免疫検定法によって)検査し、可能ならば、培養物を、各培養ウェルに1つの細胞のみが存在するようにクローン化する。これは、共に不死の単一の前駆細胞と、モノクローナル抗体の産生細胞とから、細胞のクローンを産生する。得た抗体を、従来の免疫学的診断を用いて、たとえば、組み換え融合蛋白質を発現する細胞の溶解物を用いるウエスタンブロッティング法、またはELISAによって、特徴付けることができる。
ビオチンは、典型的に、第一級アミン(すなわちリジン)を介して、蛋白質と複合される。通常、3〜6のビオチン分子が、各抗体に複合される。100mMの炭酸塩(pH8.4)中の抗体を、カラムに亘って透析または交換する。緩衝液を均衡にした後の抗体濃度を測定する(IgGに関して、1mg/mLは1.4のA280を有する。)。もし、抗体濃度が1mg/mL未満である場合、複合は、おそらく最適状態には及ばないであろう。必要に応じて、抗体を、4mg/mLの濃度に希釈する。10mgsのビオチン(N−ヒドロキシコハク酸イミドビオチン(N-hydroxysuccinimidobiotin)、ピアース(Pierce)社製)を、使用の直前に1mLの無水DMSO(無水ジメチルスルホキシド、オールドリッチ(Aldrich)社製)中で溶解させる。反応性ビオチン分子は、不安定である。ビオチンを可溶化したら、即座に用いなければならない。ビオチンを、抗体1mgあたり80μgの割合になるまで加え、即座に混合する。試験管をホイルに包み、室温で2時間回転させる。反応しないビオチンを除去し、抗体を、10mMのTrispH8.2、150mMのNaCl、pHixni中に、交換する(95%エタノール中の5mg/mLのペンタクロロフェノール(10,000x、または1リットルあたり3〜4滴用いる)、シグマ(Sigma)社製)。
FITCは、小さい有機分子であり、免疫グロブリンの第一級アミン(すなわちリジン)を介して蛋白質と典型的に複合される。通常、3〜6のFITC分子が、各抗体に複合され、複合が高くなるほど、溶解性の問題と、内部消光(および低減された輝度)とを生じさせ得る。したがって、抗体は、通常異なる量のFITCと、いくらかの並発反応において複合され、その結果生じる試薬は、最適な複合割合を選択するために、輝度(および背景の粘性)を比較される。全体の複合は、約半日で実行され得る。反応性のあるフルオレセイン分子、フルオレセインイソチオシアネートは不安定である。水薬瓶が割れ、FITCが安定化したら、即座に用いなければならない。FITCの単一の水薬瓶が、100mgs以下の抗体に充分な材料を含有するので、同日に複数のFITC複合を実行することは経済的である。
500mMの炭酸塩pH9.5中で抗体を、カラムに亘って透析または交換する。緩衝液を均等にした後に抗体濃度を測定する。(IgGに関して、1mg/mLは、1.4のA280を有する。)もし、抗体濃度が、1mg/mL未満であれば、複合は、おそらく最適状態には及ばないであろう。必要に応じて、抗体を、4mg/mLの濃度に希釈する。
使用の直前に無水DMSO中でFITC(分子プローブ)の10mgs(1つの水薬瓶における全体の内容物。重さ測定の必要なし。)を溶解する。FITCを、抗体1mgあたり40〜80μgの割合になるまで加え、即座に混合する。試験管をホイルで包み、室温で1時間、インキュベーションし、かつ回転させる。反応しないFITCを除去し、ゲル濾過または透析によって、500mMの炭酸塩9.5pHに、抗体を交換する。
280および495nmで吸光度を測定することによって、F/Pおよび蛋白質濃度を決定する。IgG:1mg/mLは1.4のA(280)を有する。mw=150,000。IgM:1mg/mLは、1.2のA(280)を有し、mw=900,000。フルオレセイン:1mMは、68のA(495)と11.8のA(280)とを有する。3〜10のF/P値は、おそらく個々のIgGのいかなるものにも最適である。蛋白質濃度:IgG(mg/mL)=[A(280)−0.31*A(495)]/1.4IgM(mg/mL)=[A(280)−0.31*A(495)]/1.2
F/P割合:
IgG:3.1*A(495)/[A(280)−0.31*A(495)]
IgM:15.9*A(495)/[A(280)−0.31*A(495)]
骨髄試料を、ALL患者から得て、白血球を、標準的な手順に従って単離する。白血球を、免疫表現型特性を介しては血球のサブセットを規定するために、2つの細胞表面マーカーで標識化する。FITC複合モノクローナル抗ヒトCD19(FITC−CD19)と、PE複合モノクローナル抗ヒトCD10(PE−CD10)とを用いた。細胞を、その後標準的な手順に従って、細胞およびその内容物の完全性を保存するために、たとえば1%パラホルムアルデヒド中で固定する。プローブセットに内部アクセス可能な細胞を産生するために、細胞膜を、サポニンのような界面活性剤を用いて浸透化する。細胞を、本発明に従ったプローブセット(各プローブ0.1〜0.3μg/mL)を含有する混合物によって、暗闇内において4℃で1時間標識化し、これは、TELのヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフに対するCy3標識ビオチン複合抗体と、AMLのRuntドメインに対するCy5標識ビオチン複合抗体とを含む。結合されないプローブを除去するために細胞を洗浄した後、2つの異なる抗体の充分に近接し、かつ安定的な並列を誘導するために、細胞を、標識化されていないアビジンとインキュベーションする。その後、細胞を、フローサイトメトリーにおいて分析する。結果は、図4に示す。パネルAは、診断時に患者から得た前駆B−ALL細胞におけるTEL−AML1融合蛋白質の評価を示す。ALL芽細胞を、これらの光散乱特性に基づいてゲーティングする(前方散乱対側方散乱)。その後、CD19陽性芽細胞をゲーティングする(FL1対側方散乱)。TEL−AML1融合蛋白質の存在は、CD19+/CD10+ALL細胞のサブセットにおいて簡単に検出可能である。パネルBにおいて、治療の効果を評価するための、5週間治療プロトコル後の同一患者からの類似する分析を示す。CD10+芽細胞のたった3%が、TEL−AML1融合蛋白質について陽性であり、すなわち、全白血球のたった0.2%である。TEL−AML1陽性細胞のかかる低い頻度の検出(微小残存病変)は、これまでに示されなかった。
Claims (26)
- 少なくとも第1および第2の分子プローブのセットであって、各プローブは、関心ある分子と特異的に結合することができ、各プローブは、色素を備え、各プローブは、関心ある分子との結合に続いて、色素間のエネルギ転移を可能にするように前記プローブの空間的構造を調節するための反応基を備え、前記反応基は、関心ある分子との結合に関与せず、
前記第1のプローブの反応基は、前記第2のプローブと直接反応せず、
前記プローブは互いに、前記第1のプローブの反応基を前記第2のプローブの反応基に結合可能な物質を介して接触し、
前記反応基は、ビオチンを含み、前記物質は、ビオチン結合分子を含むことを特徴とするセット。 - ビオチン結合分子がアビジンもしくはストレプトアビジン、またはその誘導体であることを特徴とする請求項1記載のセット。
- ビオチン結合分子が抗ビオチン抗体であることを特徴とする請求項1記載のセット。
- 前記反応基は、前記プローブの空間的構造を調節し、前記色素の間隔を、互いに100オングストローム以内にすることを特徴とする請求項1〜3のうちいずれか1項に記載のセット。
- 前記間隔を、互いに50オングストローム以内にすることを特徴とする請求項4記載のセット。
- 前記間隔を、互いに20オングストローム以内にすることを特徴とする請求項5記載のセット。
- 各プローブは、多数の反応基を備えることを特徴とする請求項1〜6のうちいずれか1項に記載のセット。
- 前記プローブは、抗体またはこれと機能的に均等な結合断片であることを特徴とする請求項1〜7のうちいずれか1項に記載のセット。
- 前記色素のうち少なくとも1つは、蛍光色素であることを特徴とする請求項1〜8のうちいずれか1項に記載のセット。
- 前記蛍光色素は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、テキサスレッド(TR)、R−フィコエリトリン(R−PE)、アロフィコシアニン(APC)、フィコビリプロテインのメンバー、Cy3、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、シアニン色素、アレクサフルオール(
Alexa Fluor)色素、これらの蛍光色素のタンデム複合体、および量子ドット色素からなる群から選択されることを特徴とする請求項9記載のセット。 - 少なくとも第1および第2の分子プローブのセットを用いて細胞中の融合蛋白質の存在を検出する方法であって、各プローブは、前記融合蛋白質の融合領域の反対側に位置する結合部位を認識することができ、各プローブは、色素をさらに備え、各プローブは、前記色素間のエネルギ転移の可能性を高めるように、関心ある分子との結合後、前記プローブの空間的構造を調節可能な反応基を備え、前記第1のプローブの反応基は、関心ある分子との結合に関与せず、かつ前記第2のプローブと直接反応せず、
前記反応基は、ビオチンを含み、前記物質は、ビオチン結合分子を含み、
プローブセットを提供することと、
細胞を含む試料を提供することと、
前記融合蛋白質に対する前記プローブの結合を可能にする条件下で、前記試料を前記プローブセットと接触させることと、
前記プローブを、前記第1のプローブの反応基を前記第2のプローブの反応基に結合可能な物質と接触させることと、
前記融合蛋白質の存在を決定するためにFRETを介して前記プローブの並列を検出することとを含むことを特徴とする方法。 - 前記物質は、前記色素の間隔を、互いに2〜100オングストローム以内にすることを特徴とすることを特徴とする請求項11記載の方法。
- ビオチン結合分子がアビジンもしくはストレプトアビジン、またはその誘導体であることを特徴とする請求項11または12記載の方法。
- ビオチン結合分子が抗ビオチン抗体であることを特徴とする請求項11または12記載の方法。
- 前記試料を、標的細胞集合を規定するための少なくとも1つの細胞マーカーのために染色することを含み、前記試料を、前記細胞マーカーに選択的に結合可能な化合物と接触させることを含むことを特徴とする請求項11〜14のうちいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞マーカーは、cluster of differentiation(CD)抗原であることを特徴とする請求項15記載の方法。
- 前記融合蛋白質は、腫瘍特異的融合蛋白質であることを特徴とする請求項11〜16のうちいずれか1項に記載の方法。
- 単細胞レベルで検出を可能にする請求項11〜17のうちいずれか1項に記載の方法。
- フローサイトメトリーを用いることを特徴とする請求項18記載の方法。
- 少なくとも第1および第2の色素複合プローブを提供する方法であって、各プローブは、前記色素間のエネルギ転移の可能性を高めるように、関心ある分子との結合後、前記プローブの空間的構造を調節可能にする反応基を備え、前記反応基は、関心ある分子との結合に関与せず、
前記第1のプローブの反応基は、前記第2のプローブと直接反応せず、
各プローブを、前記プローブと前記色素との複合体を形成するために適切な色素と接触させることを含み、
1つのプローブを、前記プローブと前記反応基との複合体を形成するために、反応基またはその誘導体と接触させることをさらに含み、
前記プローブは互いに、前記第1のプローブの反応基を前記第2のプローブの反応基に結合可能な物質を介して接触し、
前記反応基は、ビオチンを含み、前記物質は、ビオチン結合分子を含むことを特徴とする方法。 - ビオチン結合分子がアビジンもしくはストレプトアビジン、またはその誘導体であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- ビオチン結合分子が抗ビオチン抗体であることを特徴とする請求項20記載の方法。
- 請求項1〜10のうちいずれか1項に記載のプローブセットを含むことを特徴とする診断キット。
- 疾患の治療前、治療中および治療後に、前記治療の有効性を評価するための、または疾患を分類するための、請求項1〜10のうちいずれか1項に記載のプローブセットまたは請求項11〜19のうちいずれか1項に記載の方法の使用。
- 細胞内融合蛋白質の存在を検出するためのエネルギ転移技術の使用であって、少なくとも第1および第2の分子プローブの使用を含み、各プローブは、前記融合蛋白質の融合領域の反対側に位置する結合部位を認識することができ、各プローブは、色素を備え、前記色素は、エネルギ転移を共に可能にすることを特徴とする使用。
- 各プローブは、前記色素間のエネルギ転移の可能性を高めるように、前記融合蛋白質との結合後、前記プローブの空間的構造を調節可能にする反応基を備え、前記反応基は、関心ある分子との結合に関与しないことを特徴とする請求項25記載の使用。
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