JP4575162B2 - 二次元ミクロ流体生体分子分離システム - Google Patents
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Description
1975年以来、複雑なタンパク質混合物は、一般に二次元ゲル電気泳動を用いて分離されてきたが、該電気泳動においては、第1次元ゲル中のタンパク質の物理的分離は分析対象タンパク質のそれぞれの等電点による分離に基づいている。これは、タンパク質の等電点電気泳動法(IEF)と呼ばれている(たとえば、O’Farrell PH.の非特許文献1を参照のこと)
しかしながら、細胞中には典型的には20,000を越える異なるタンパク質が存在することから、IEFゲルでは1つの細胞型中に存在するすべてのタンパク質を解析することはできない。したがって、ある細胞中で発現されるタンパク質のいくつかまたはすべてを研究し、同定すること(プロテオミクス)を望む多くの研究者達は、第2の次元、すなわち第2のゲルを用いてきた。この第2のゲルにおいて、タンパク質は、第1のIDFゲルに対して直角に分離され、タンパク質はそれらの個々の分子量の違いに基づいて分離される。これは二次元ゲル電気泳動(2DGE)と呼ばれている。
他の目的は、大量の異なる生体分子、例えば5,000を越える、または10,000を越えるまたは15,000を越える異なる生体分子からなる組成物から、生体分子を分離する装置を提供することである。
本発明のさらなる目的は、望まれる解像度を得ることができ、公知のプロセスに比べて使用の手間を省くことのできる、生体分子の分離装置を提供することである。
理に供される。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次分離経路と、1つ以上の二次処理経路とを含む。
ィングは1つ以上の分離層を含む。少なくとも1つの分離層は、水性環境においてプロトン化又は脱プロトン化され得る化学基として定義されるpH活性基を含む1つ以上のpH活性成分で構成されるか、該活性成分を含む。このような経路はデンマーク国特許出願第DK PA2002−00875号に開示されている。一次分離経路は、原理的には、デンマーク国特許出願第DK PA2002−00875号に開示されるような任意の形状および構造を有していてもよく、たとえば、デンマーク国特許出願第DK PA2002−00875号に記載されるように製造することができる。一実施形態において、pH活性基を有する塗布された捕捉コーティングを、pHバッファ、例えば、酢酸バッファまたはリン酸バッファを用いてさらに平衡化する。基材は、原理的には、デンマーク国特許出願第DK PA2002−00875号に好適に開示されるような任意のタイプであってよい。経路の構造、基材および経路の製造方法に関する技術的情報は参照により本願に援用される。
PA2002−00875号に記載されるキノンなどの光化学的反応基を介して提供してもよい。
本発明の一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングを有する分離基材は、自立性のものである。これは、乾燥時に構造が潰れないことを意味する。本実施形態においては、分離コーティングを有する基材の厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、20%未満、例えば10%未満、例えば5%未満しか変化しないことが好ましい。分離コーティングの厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、20%未満、例えば10%未満、例えば5%未満しか変化しないことが好ましい。
PA2002−00875号に記載されている。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿ったpH勾配を含むpHを有する。このような徐々に変化するpH値を有する分離経路の製造方法は、参照により本願に援用されるDK PA2002−00593号に開示されている。
別の実施形態において、2つ以上の経路区域が異なる長さを有していてもよい。一例において、一次分離経路全体に電圧が印加される際に、電極に近い1つ以上の経路区域が、電極からより遠い経路区域よりも短くなるように、経路区域は異なる長さを有している。本実施形態の一例において、一次分離経路は、例えば、経路に沿って、それぞれ2x、1.6x、1.2x、1x、1x、1.2x、1.6xおよび2xの長さを有する8つの連続する経路区域を含んでいてもよい。ここで「x」は、例えば、1〜100mmの間、例えば2〜10mmの間、例えば5mm前後である。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次経路全体に電圧を印加するための手段をさらに含んでいる。このような電圧印加手段は当該技術において一般に知られており、その好ましい例としては、一次分離経路に装着するか、一次分離経路に装着可能に構成してもよい一対の電極を含み、該電極は一次分離経路に沿って距離をおいて分離コーティングに好適に接触する。
回収ステーションは好ましくは、二次処理経路のための1つまたは複数の入口と液体連通しており、その結果、回収ステーション内に回収された生体分子は、二次処理経路全体に例えば求心力または電気泳動力などの駆動力が与えられた場合に二次処理経路に流入する。
公報第WO9958245号にさらに記載されるような、二次処理経路内の流れが、異なる表面特性を有した装置の異なる表面によって制御されるように構成された二次処理経路を含むディスク状装置の形態である。
一実施形態において、二次処理経路は、例えば上述のゲルの群より選択されるゲルなどの分離媒体を含んだミクロチャネルを含む。
使用した材料:
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料(H1010,53g/m2)(Freudenberg社)
・N−[4−(3−アミノプロピル)モルフォリル]−9.10−アントラキノン−2−カルボキサミド(AQ−03)
・10×5mm IEFサンプルアプリケーションピース(80−1129−46)(Amersham Pharrnacia Biotech AB社)
・10×2.5mm IEF電極片(18−1004−40)(Amersham Pharmacia Biotech AB社)
・サンプル付与片(18−1002−76)(Amersham Pharrnacia
Biotech AB社)
・プラチナ電極φ0.5mm
・10×3mmポリアクリルアミドゲル;8%T:2.7%C;pH3.5
・10×3mmポリアクリルアミドゲル;2.7%C;pH10.5
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−10(kDa)(Millipore社)
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−30(kDa)(Millipore社)
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−50(kDa)(Millipore社)
・0.1Mリン酸ナトリウムバッファ−pH6.5
・7M尿素;2Mチオ尿素
・溶解バッファ(7M尿素;1Mチオ尿素;2%CHAPS;5mMトリス)
・90μgHeLa抽出物を20μLの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−N48
・プログラム可能電源(EPS3501XL)(Amersham Pharrnacia Biotech AB社)
・特注ディスクスピナー
55mmの幅を有する1mgのポリエステル材料H1010を、連続ループとして条片を供給する機械的装置上に載置した。条片に100μMのAQ−03の水溶液を供給し、UV照射して熱風で乾燥させた後、AQ−03溶液に戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で100μモルのAQ−03が結合する。材料をリン酸バッファ中で平衡化し、蒸留水中で2回洗浄し、乾燥させる。
特注のポリエステルディスクの直径は120mm、厚みは2mm、中央の孔は15mmである。分離溝1の形態の環状一次分離経路を、直径45mm、幅3mm、深さ1mmとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の180°をカバーする。環状分離溝1の両端において、幅10mm、厚み5mm、深さ1mmの矩形の回収ステーション溝2を前記両端に直交するように設ける。各矩形の回収ステーション溝2を通る半径上には、中心と各回収ステーション溝2の間にリザーバ3が配置される。リザーバ3は、流路8によって回収ステーション溝に連結される。回収ステーション溝2のその反対側において、流路8は径方向外側に続いており、ディスクの中心から60,75および90mmの所にある3つのフィルタホルダー4a,4b,4cと、ディスクの中心から105mmの所にあるリザーバ5と交差する。各矩形の回収ステーション溝2と直交して、長さ10mm、幅3mm、深さ1mmの別の矩形のゲル溝6を加工する。最後に矩形の電極溝7を、ゲル溝の端部6において、長さ10mm、幅2.5mm、深さ1mmとなるように加工する。
。H1010材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝2のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを1つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝6には、pH3.5を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝6には、pH10.5を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝7のそれぞれには、IEF電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。電極を各IEF電極片上に、左側が陽極、右側が陰極となるように配置する。
上記2つのIEF電極片を7M尿素:2Mチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。H1010は溶解バッファ中で飽和させる。生体分子試料を、官能化1010の一次分離経路の中央に、サンプル付与片を用いて付与する。
minitanフィルタを、フィルタホルダ4a,4b,4cに合うように裁断し、50kDaフィルタが最も内側のホルダ4a,30kDaフィルタが真ん中のフィルタホルダ4b、10kDaフィルタが最も外側のフィルタホルダ4c内に配置されるように配置する。220μLの溶解0バッファを各リザーバ3内に入れ、ディスクを100RPMで60秒間回転させ(回収ステーション溝2からの試料の再抽出)、その後、濾過のために1500RPMで10分間回転させる。
分離された材料をフィルタ(4a,4b,4c)およびリザーバ5から以下の画分内に回収する。
左側:
(4a):pI<6.5;質量>50kDa
(4b)pI<6.5;50kDa>質量>30kDa
(4c)pI<6.5;30kDa>質量>10kDa
(5)pI<6.5;質量<10kDa
(4a):pI>6.5;質量>50kDa
(4b)pI>6.5;50kDa>質量>30kDa
(4c)pI>6.5;30kDa>質量>10kDa
(5)pI>6.5;質量<10kDa
使用した材料:
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料(H1010,53g/m2)(Freudenberg社)
・4−(2−アントラキノイル)−4−オキソ−3−アザ−ブタン酸(AQ−01)
・N−[4−(3−アミノプロピル)モルフォリル]−9.10−アントラキノン−2−カルボキサミド(AQ−03)
・10×5mm IEFサンプルアプリケーションピース(80−1129−46)(Amersham Pharrnacia Biotech AB社)
・10×2.5mm IEF電極片(18−1004−40)(Amersham Pharmacia Biotech AB社)
・サンプル付与片(18−1002−76)(Amersham Pharrnacia
Biotech AB社)
・プラチナ電極φ0.5mm
・10×3mmポリアクリルアミドゲル;8%T:2.7%C;pH3.5
・10×3mmポリアクリルアミドゲル;2.7%C;pH10.5
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−10(kDa)(Millipore社)
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−30(kDa)(Millipore社)
・Minitan濾過プレート−PBGC 0MP 04−50(kDa)(Millipore社)
・0.1Mリン酸ナトリウムバッファ−pH6.5
・7M尿素;2Mチオ尿素
・溶解バッファ(7M尿素;1Mチオ尿素;2%CHAPS;5mMトリス)
・90μgHeLa抽出物を20μLの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−N48
・プログラム可能電源(EPS3501XL)(Amersham Pharrnacia Biotech AB社)
・特注ディスクスピナー
55mmの幅を有する1mgのポリエステル材料H1010を、連続ループとして条片を提供する機械的装置上に載置した。条片に100μMのAQ−01の水溶液を供給し、UV照射して熱風で乾燥させた後、AQ−01溶液に再び戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で100μモルのAQ−01が結合する。これによりpH4を有する材料が得られる。
特注のポリエステルディスクの直径は120mm、厚みは2mm、中央の孔は15mmである。分離溝1,2の形態の環状一次分離経路を、直径45mm、幅3mm、深さ1mmとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の270°をカバーする。環状分離溝1,2の両端および中間点に、幅10mm、厚み5mm、深さ1mmの矩形の回収ステーション溝3を環状溝に直交するように配置する。各矩形の回収ステーション溝3を通る半径には、中心と各回収ステーション溝3の間にリザーバ4を配置する。リザーバ4は、流路9によって回収ステーション溝3に連結される。回収ステーション溝3のその反対側において、流路9は径方向外側に続いており、ディスクの中心から60,75および90mmに位置する3つのフィルタホルダー5a,5b,5cと、ディスクの中心から105mmに位置するリザーバ6と交差する。陽極区画と陰極区画における各矩形の回収ステーション溝3と垂直に、長さ10mm、幅3mm、深さ1mmの別個の矩形のゲル溝7を加工する。最後にゲル溝の端部7において矩形の電極溝8を、長さ10mm、幅2.5mm、深さ1mmとなるように加工する。
離溝1に配置する。AQ−03で官能化した材料H1010を環状の分離溝2に適合するように裁断し、分離溝2に配置する。H1010材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝3のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを1つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝7には、pH3.5を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝7には、pH10.5を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝8のそれぞれには、IEF電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。陽極電極を陽極IEF電極片8上に載置し、陰極電極を陰極IEF電極片8上に配置する。
上記2つのIEF電極片を7M尿素:2Mチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。H1010は溶解バッファ中で飽和させる。タンパク質試料を、AQ−03官能化1010の一次分離経路2の中間に、サンプル付与片を用いて付与する。
minitanフィルタを、フィルタホルダ5a,5b,5cに適合するように裁断し、50kDaフィルタが最内側のホルダ5a,30kDaフィルタが真ん中のフィルタホルダ5b、10kDaフィルタが最外側のフィルタホルダ5c内に配置されるように配置する。220μLの溶解0バッファを各リザーバ4内に入れ、ディスクを100RPMで60秒間回転させ(回収ステーション溝3からの試料の再抽出)、その後、濾過のために1500RPMで10分間回転させる。
分離された材料をフィルタ(5a,5b,5c)およびリザーバ6から以下の画分内に回収する。
陽極:
(5a):pI<4;質量>50kDa
(5b)pI<4;50kDa>質量>30kDa
(5c)pI<4;30kDa>質量>10kDa
(6)pI<4;質量<10kDa
中間:
(5a):pI<4<6.5;質量>50kDa
(5b)pI<4<6.5;50kDa>質量>30kDa
(5c)pI<4<6.5;30kDa>質量>10kDa
(6)pI<4<6.5;質量<10kDa
陰極:
(5a):pI>6.5;質量>50kDa
(5b)pI>6.5;50kDa>質量>30kDa
(5c)pI>6.5;30kDa>質量>10kDa
(6)pI>6.5;質量<10kDa
Claims (17)
- 略環状であって中心部を有しミクロチャネル構造が前記中心部の周りに配置されているディスク状装置の形態であり、一次分離経路と、1つ以上の二次処理経路とを含むミクロ流体生体分子分離システムであって、前記一次分離経路は基材に保持された分離コーティングの形態であり、前記分離コーティングは、1つ以上の分離層を含み、少なくとも1つの分離層が、水性環境中でプロトン化または脱プロトン化されうる化学基として定義されるpH活性基を含む1つ以上のpH活性成分で構成されるか、または該pH活性成分を含み、前記流体生体分子分離システムは、一次分離経路全体に電圧を印加するための手段を含み、各二次処理経路は、一次分離経路と液体流通する1つ以上の入口を含み、前記1つ以上の入口は一次分離経路に沿って設けられるか、該一次経路に沿って延び、前記分離コーティングは、0.01〜15μmの厚みを有し、前記pH活性成分は光化学的反応性基を介して前記基材に結合されていることを特徴とするミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿って、1pH単位未満しか変化しないpH値を有し、前記分離コーティングは、一次分離経路に沿って、本質的に同一のpH値を有することを特徴とする請求項1に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 分離コーティングに接触してまたは接触できるように一次分離経路に沿って離間されて設けられた正電極と負電極の形態の、一対の電極をさらに含むことを特徴とする、請求項1または2に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路は、1つ以上の回収ステーションを含むことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 各分離経路区画は区画回収ステーションを含むことを特徴とする請求項4に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路は、1mm〜10cmの長さを有することを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 該システムは1つの二次経路を含み、前記二次経路はゲルの形状であることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記一次経路および前記二次経路は互いに直交しており、前記二次経路は上縁と下縁との間の長さおよび幅を有し、前記一次分離経路は前記二次経路の幅に沿って延びるとともに前記二次経路の下縁と接触することにより、前記一次経路および前記二次経路は互いに液体流通することを特徴とする請求項7に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 該システムは、二次処理経路全体に電圧を印加する手段をさらに含むことを特徴とする請求項8に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次経路は、基材内のチャネルの形態であるか、該チャネルに含まれることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は1つ以上の反応チャンバを含むことを特徴とする請求項1乃至10のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、表面特性が変化する壁を有するミクロチャネルを含むことを特徴とする請求項1乃至11のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、分離媒体を含むミクロチャネルを含むことを特徴とする請求項1乃至12のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記一次分離経路は、分離コーティングを有する一次ミクロチャネルによって提供され、前記一次ミクロチャネルは略環状であり、ディスク状装置の中心部の周りに配置されることを特徴とする請求項1乃至13のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、一次経路からディスク状装置の周囲に向けて延びることを特徴とする請求項14に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路を提供する前記チャネルは、一次ミクロチャネル内に設けられた二次経路への入口を構成する開口部の形態にある2つ以上の回収ステーションを含むことを特徴とする請求項1乃至15のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 二次処理経路のうちの1つ以上が、分離経路であることを特徴とする請求項1乃至16のいずれか1項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
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