JP4575086B2 - コハク酸の製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いたコハク酸の製造に関するものである。
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産などが報告されていたが（例えば、特許文献５参照）、フマル酸リダクターゼの活性を増強させた細菌を用いて非アミノ有機酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
米国特許第５，１４２，８３４号公報
米国特許第５，５０４，００４号公報
特開平１１−１１３５８８号公報
特開平１１−１９６８８８号公報
特開平１１−１９６８８７号公報
International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸の製造方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、フマル酸リダクターゼが増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸の生成速度、あるいは、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２） 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）の方法。
（３）細菌が、コリネ型細菌由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることによってフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（１）または（２）の方法。
（４）細菌が、大腸菌由来のフマル酸リダクターゼ遺伝子を用いることによってフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（１）または（２）の方法。
（５） 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６） 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７） 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８） 有機原料が、グルコースである（１）〜（７）のいずれかの方法。
（９） （１）〜（８）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
（１） フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２） 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）の方法。
（３）細菌が、コリネ型細菌由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることによってフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（１）または（２）の方法。
（４）細菌が、大腸菌由来のフマル酸リダクターゼ遺伝子を用いることによってフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（１）または（２）の方法。
（５） 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６） 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７） 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８） 有機原料が、グルコースである（１）〜（７）のいずれかの方法。
（９） （１）〜（８）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸を製造することができる。得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である。ここで、「フマル酸リダクターゼ活性」とは、フマル酸を還元してコハク酸に変換する反応を触媒する活性をいい、「フマル酸リダクターゼ活性が増強する」とは、野生株、あるいは、フマル酸リダクターゼ非改変株と比較してフマル酸リダクターゼ活性が増強していることをいう。フマル酸リダクターゼ活性は、後述するようなK3Fe(CN)6の減少を測定する方法によって測定することができる。大腸菌フマル酸リダクターゼは、TCA回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼの逆反応を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており、好気的条件下においては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されていることが知られている（Jones, H. M., Gunsalus, R. P., J. Bacteriol., 1985, Vol. 164, p1100-1109）。従って、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなることが考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性は菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましい。
フマル酸リダクターゼ活性の増強は、例えば、フマル酸リダクターゼ遺伝子を用いた遺伝子組換え法などにより、親株である細菌株を改変することによって行うことができる。また、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性と同時にフマル酸リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードしている場合もある。従って、フマル酸リダクターゼ活性及びコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の両方を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めてもよい。例えばコリネ型細菌のコハク酸デヒドロゲナーゼは、その逆反応であるフマル酸からコハク酸を生成する反応を触媒できる。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、Arkrell,B.A.Cらの方法（Meth Enzymol.53,466-483）により測定出来る。
本発明に使用できる細菌の親株は、コハク酸の生産能を有すれば特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌が好ま
しく、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
しく、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）遺伝子を用いてフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変する場合、用いることのできる遺伝子はフマル酸リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号１９に示す塩基配列を有する大腸菌由来の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はフマル酸リダクターゼを構成する４つのサブユニット（frdA、frdB、frdC及びfrdD；配列番号２０〜２３）をコードする遺伝子（配列番号１９の塩基番号440〜2245,2241〜2975,2986〜3381,及び3392〜3751）をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、このようなFRD遺伝子ホモログの中でも、FRDのBサブユニット（frdB）（配列番号２１）の１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンであるようなタンパク質をコードするものが好ましい。配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子又はそのホモログは、PCR法やハイブリダイゼーション法によって得ることができる。
また、必要に応じて、frdBの１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンになるような突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
また、必要に応じて、frdBの１７番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンになるような突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
また、コハク酸デヒドロゲナーゼとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用してもよい。例えば、配列番号２８に示す塩基配列を有するコリネ型細菌由来のsdh遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はコハク酸デヒドロゲナーゼを構成する３つのサブユニット（sdhA, sdhBおよびsdhC）をコードする遺伝子（配列番号２８の塩基番号 1153〜3171, 3174〜3920および363〜1133）をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。コリネバクテリウム・グルタミカムのsdhオペロンは、Genebank accession No.NCgl0359（sdhC） NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)に記載されている。
この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝子は、ＦＲＤ活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、フマル酸レダクターゼ活性を有する限り、配列番号２０−２３、配列番号２９−３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。
また、大腸菌やコリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のＦＲＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のＦＲＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いてＦＲＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
コリネ型細菌を使用する場合、FRD遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でFRDの発現増強が可能な組換えプラスミドを得ることができる。コリネ型細菌にFRD遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；特開平１０−２１５８８３号公報に記載のｐＶＫ７等を挙げることができる。なお、上述の通り、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなることが考えられるため、適当なコピー数のプラスミドを選択することにより、菌体の生育を阻害しない程度にＦＲＤ遺伝子の発現量を調節することが好ましい。なお、FRD活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でFRD遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現
化させることによっても行うことができる。
また、FRD遺伝子がオペロン構造であるときは、上記の方法のほかにWO0018935記載のように、その発現を制御するプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる。
化させることによっても行うことができる。
また、FRD遺伝子がオペロン構造であるときは、上記の方法のほかにWO0018935記載のように、その発現を制御するプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる。
上記組み換えプラスミドまたは染色体上への組み込みにおいて、FRD遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いるFRD遺伝子自身のプロモーターであってもよい。プロモーターを適宜選択することによっても、ＦＲＤ遺伝子の発現量の調節が可能である。以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、FRD活性の増強を達成することができる。
本反応においては、フマル酸リダクターゼ活性の増強に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここで、「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されＦＲＤ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例えば後述の実施例２のようにして、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をFRD遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作とFRD活性増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。
また、本反応においては、フマル酸リダクターゼ活性の増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌を用いてもよい。「ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強される」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ピルビン酸カルボキシラーゼの活性は例えば、後述するようなNADHの減少を測定する方法により測定することができる。フマル酸リダクターゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの発現が増強されたコリネ型細菌は、特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、フマル酸リダクターゼ（ＦＲＤ）遺伝子及びピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより作製することができる。
本発明の方法に使用されるＰＣ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、下記に示すような方法によりＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これらの供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するための基本操作を、配列が既知であるコリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。ＰＣ遺伝子は、上記コリネ型細菌コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上に存
在し（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）、それらの配列が既知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、単離・取得することができる。
在し（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）、それらの配列が既知であるため（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）（配列番号１５）、ＰＣＲ法により、単離・取得することができる。
例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとして、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、約３．７ｋｂからなるＰＣ遺伝子を増幅させることができる。このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことにより、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌に導入することができる。
また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、部分分解配列よりプローブを合成し、通常用いられるハイブリダイゼーションの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法によりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
本明細書において、切断DNA断片の大きさ及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。尚、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
本発明においてＰＣ活性を増強させるために用いる上記ＰＣ遺伝子を包含するＤＮＡ断片は、コリネバクテリウム・グルタミカム染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。また、前記の如くコリネ型細菌染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号１５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。配列番号１５の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号１５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物由
来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の確認は、該形質転換体から粗酵素液&; Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、後述の実施例３に記載するようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させることができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号１６）の確認は、該形質転換体から粗酵素液&; Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較することにより、確認することができる。ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。例えば、後述の実施例３に記載するようなＴＺ４プロモーターが挙げられる。
ＰＣ遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
ＰＣ遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、ＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でPC遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。得られた細菌を、FRD遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより、ＰＣ遺伝子及びＦＲＤ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、FRD遺伝子とPC遺伝子の導入はどちらを先に行ってもよい。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
テリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、ＰＣ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でPC遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。得られた細菌を、FRD遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより、ＰＣ遺伝子及びＦＲＤ遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、FRD遺伝子とPC遺伝子の導入はどちらを先に行ってもよい。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
さらに、本発明においては、フマル酸リダクターゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強し、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌を用いると、コハク酸の製造に特に有効である。このような細菌は、例えば、LDH遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を、ＰＣ遺伝子及びＦＲＤ遺伝子を含む組換えベクターでそれぞれ形質転換することにより得ることができる。なお、これらの遺伝子を用いた改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによっても製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化し
てコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
てコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜10、好ましくはｐＨ６〜9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。
反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーによりコハク酸を分離・精製することができる。
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリ
マーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
マーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
＜遺伝子破壊用ベクターの構築＞
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌
（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢI１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕIの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢI１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕIの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。
一方、上記（B）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌIおよびＰｓｔIで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕIリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕI切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕI切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕI切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した。
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
＜ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：
鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：
鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。
次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIにて切断した実施例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIおよびＳｐｈIで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）は、常法（Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983, 156(3) 1165-1170、Kurusu Y et al., Agric Biol Chem. 1990, 54(2) 443-7）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Res.Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に
塗抹した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Res.Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に
塗抹した。
この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｅ）ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
上記（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をＡ培地に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組成：50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄した。
次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍＬに懸濁し、氷冷下で超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。
ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ+に酸化されるのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株から調製された粗酵素液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。
＜コリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用すること
とした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用すること
とした。本プロモーター断片の取得は、実施例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａI部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。
次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨIとＰｓｔIに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａI）が含まれている。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。
この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２―９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２―９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
＜ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、＜実施例２＞の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１５に記載する。本アミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した＜実施例３＞にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。
この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△ＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液にをＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△ＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
＜大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング＞
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数
増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数
増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
（Ｂ）大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１７および配列番号１８）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎIで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎIで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。
ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列を配列番号１９，２０〜２３に記載する。
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製＞
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、 ５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅIによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した。
（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
実施例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、 ５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号２４および配列番号２５）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅIによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した。
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミドの構築
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素Hind IIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
実施例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素Hind IIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎIで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Hind III消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
（Ｂ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、実施例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
（Ｃ）ＦＲＤ酵素活性測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は33mM Tris塩酸緩衝液(pH7.5)、 0.1mM EDTA、20mM コハク酸Na、2mM K3Fe(CN)6及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に２μmolのK3Fe(CN)6の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドpFRPC1.1を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△ＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は0.01U/mg-蛋白質であった。
上記（Ｂ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン25mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）50mlで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は33mM Tris塩酸緩衝液(pH7.5)、 0.1mM EDTA、20mM コハク酸Na、2mM K3Fe(CN)6及び酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に２μmolのK3Fe(CN)6の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドpFRPC1.1を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△ＬＤＨ株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は0.01U/mg-蛋白質であった。
＜コリネ型細菌のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング＞
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をsdhC、sdhA、sdhBとする）の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC_003450）該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとしてPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２６と２７の配列を有する合成DNAをプライマーとして用いて、オペロンを形成するsdhC-sdhA-sdhBの各遺伝子を含むDNA断片（配列番号２８）を、PCRにより取得した。PCR反応は、KOD-PLUS- (東洋紡製)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 15秒、会合56℃ 30秒、伸長72
℃ 4分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後SmaIで消化した。このDNA断片と、pVK7（特開平１０−２１５８８３）をSalIで消化後にDNAブランティングKit（宝バイオ社製）で平滑化したDNA断片を混合し、ライゲーションKit ver.2（宝バイオ社製）で連結した。このプラスミドで、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、カナマイシン（以下、Kmと略す）25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVKSDHと命名した。pVKSDHの構築過程を図６に示す。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をsdhC、sdhA、sdhBとする）の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC_003450）該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとしてPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２６と２７の配列を有する合成DNAをプライマーとして用いて、オペロンを形成するsdhC-sdhA-sdhBの各遺伝子を含むDNA断片（配列番号２８）を、PCRにより取得した。PCR反応は、KOD-PLUS- (東洋紡製)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 15秒、会合56℃ 30秒、伸長72
℃ 4分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後SmaIで消化した。このDNA断片と、pVK7（特開平１０−２１５８８３）をSalIで消化後にDNAブランティングKit（宝バイオ社製）で平滑化したDNA断片を混合し、ライゲーションKit ver.2（宝バイオ社製）で連結した。このプラスミドで、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、カナマイシン（以下、Kmと略す）25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVKSDHと命名した。pVKSDHの構築過程を図６に示す。
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ活性増強用プラスミドの構築＞
実施例７で構築したpVKSDHをXbaIとSse8387Iで消化することによって得られたsdhC、sdhA、sdhBの3遺伝子を含むDNA断片と、pHSG399(宝バイオ社製)をXbaIとSse8387Iで消化した断片を混合し、DNAライゲーションKit ver.2（宝バイオ社製）で連結した。このDNAでエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（以下、Cmと略す）25μg/ml、X-Gal 50μg/ml、IPTG 1mMを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白コロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、sdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片が挿入されていたものをpHSGSDHと命名した（図７）。
一方、実施例６記載のエシェリヒア・コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバム由来pyc遺伝子が搭載されているプラスミドであるpFRPC1.1をKpnIとNdeIで消化することにより、エシェリヒア・コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子を除く残りの領域を1断片として回収することが可能である。そこでpFRPC1.1をKpnIとNdeIで消化した後に、平滑末端化し、フマレートレダクターゼ遺伝子を除いた残りの部分DNA断片を回収した。回収したDNA断片に、pHSGSDHをXbaIとSse8387Iで消化することによって得られたsdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片を平滑末端化した後に連結した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、Km25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、frdA、frdB 、frdC、frdD遺伝子が除去され、かつsdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片が挿入されていたものをpSDHPCと命名した（図８）。
実施例７で構築したpVKSDHをXbaIとSse8387Iで消化することによって得られたsdhC、sdhA、sdhBの3遺伝子を含むDNA断片と、pHSG399(宝バイオ社製)をXbaIとSse8387Iで消化した断片を混合し、DNAライゲーションKit ver.2（宝バイオ社製）で連結した。このDNAでエシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、クロラムフェニコール（以下、Cmと略す）25μg/ml、X-Gal 50μg/ml、IPTG 1mMを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白コロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、sdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片が挿入されていたものをpHSGSDHと命名した（図７）。
一方、実施例６記載のエシェリヒア・コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバム由来pyc遺伝子が搭載されているプラスミドであるpFRPC1.1をKpnIとNdeIで消化することにより、エシェリヒア・コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子を除く残りの領域を1断片として回収することが可能である。そこでpFRPC1.1をKpnIとNdeIで消化した後に、平滑末端化し、フマレートレダクターゼ遺伝子を除いた残りの部分DNA断片を回収した。回収したDNA断片に、pHSGSDHをXbaIとSse8387Iで消化することによって得られたsdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片を平滑末端化した後に連結した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を形質転換し、Km25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、frdA、frdB 、frdC、frdD遺伝子が除去され、かつsdhC、sdhA、sdhBを含むDNA断片が挿入されていたものをpSDHPCと命名した（図８）。
＜ピルベートカルボキシラーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ増強株の構築＞
実施例７および実施例８で得られたpVKSDH、ならびにpSDHPCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能である。そこで本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換し、形質転換体を取得した。実施例２で構築したMJ233/ΔLDH株を電気パルス法を用いてpVKSDH、ならびにpSDHPCで形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)、および寒天15g/L）に塗布し、31.5℃で約24時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドが導入されている株である。こうして得られた形質転換体をそれぞれMJ233/SDH/ΔLDH、MJ233/SDH/PC/ΔLDHとした。また、コントロール株作製のため、プラスミドpVK7、ならびに実施例４で構築したプラスミドpMJPC1も上記方法を用いてMJ233/ΔLDH株に導入した。こうして得られた形質転換体をそれぞれMJ233/ΔLDH/pVK7、MJ233/PC/ΔLDHとした。
実施例７および実施例８で得られたpVKSDH、ならびにpSDHPCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能である。そこで本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換し、形質転換体を取得した。実施例２で構築したMJ233/ΔLDH株を電気パルス法を用いてpVKSDH、ならびにpSDHPCで形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)、および寒天15g/L）に塗布し、31.5℃で約24時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドが導入されている株である。こうして得られた形質転換体をそれぞれMJ233/SDH/ΔLDH、MJ233/SDH/PC/ΔLDHとした。また、コントロール株作製のため、プラスミドpVK7、ならびに実施例４で構築したプラスミドpMJPC1も上記方法を用いてMJ233/ΔLDH株に導入した。こうして得られた形質転換体をそれぞれMJ233/ΔLDH/pVK7、MJ233/PC/ΔLDHとした。
＜菌体反応（炭酸アンモニウム中和、微好気反応）＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で本培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例６（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で本培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍｌ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、毎分１００ｍＬで通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。
反応開始後約２０時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は５．００ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は２．６６ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７０．１％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は４．７４ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は２．１３ｇ／Ｌ／ｈ、収率は５８．７％であった。
＜菌体反応（炭酸アンモニウム中和、嫌気反応）＞
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約４０時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は２．５０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．３５ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７８．４％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．３８ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．２１ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７４．４％であった。
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約４０時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は２．５０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．３５ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７８．４％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．３８ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．２１ｇ／Ｌ／ｈ、収率は７４．４％であった。
＜菌体反応（炭酸ナトリウム中和、微好気反応）＞
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸ナトリウムを用いて７．６に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約２８時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は３．６０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は２．２７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８２．８％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．９７ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．９７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８８．０％であった。
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸ナトリウムを用いて７．６に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約２８時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は３．６０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は２．２７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８２．８％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．９７ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．９７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８８．０％であった。
＜菌体反応（炭酸ナトリウム中和、嫌気反応）＞
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約３２時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は３．１３ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．８０ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９７．１％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．７０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．５７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８８．６％であった。
上記実施例１０と同様に反応用懸濁液を調製し、ｐＨを２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、通気は行わず、毎分２００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約３２時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は３．１３ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．８０ｇ／Ｌ／ｈ、収率は９７．１％であった。一方、実施例４（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は２．７０ｇ／Ｌ／ｈであり、コハク酸生産速度は１．５７ｇ／Ｌ／ｈ、収率は８８．６％であった。
＜菌体反応（炭酸マグネシウム中和、嫌気培養）＞
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔLDH/pVK7株及びMJ233/SDH/ΔLDH株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地（カナマイシン25μg/ml含有）にて培養して得たMJ233/ΔLDH /pVK7株及びMJ233/SDH/ΔLDH株の菌体をシード培地 3ml（グルコース 10g/L、(NH4) 2SO4 2.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.25g/L、尿素 2g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 50μg/L、VB1・HCl 100μg/L、プロトカテク酸 15mg/L、CuSO4 0.02mg/L、CaCl2 10mg/L、pH7.0(KOH)）に接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。その後、その試験管にメイン培地 3ml（グルコース 100g/L、(NH4) 2SO4 5g/L、KH2PO42g/L、尿素 3g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、MgCO3 71.4g/L、以上添加後最終濃度、pH6.8(NaOH)）を添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。培養終了後、培養液中のコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM ｐ-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸を測定した。このときの結果を表２に示した。MJ233/SDH/ΔLDH株では、同宿主にベクタープラスミドを導入したMJ233/ΔLDH/pVK7株に比べて、収率は約4%の向上が認められた。また、リンゴ酸蓄積は3.6g/L、フマル酸蓄積は0.5g/L減少した。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔLDH/pVK7株及びMJ233/SDH/ΔLDH株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地（カナマイシン25μg/ml含有）にて培養して得たMJ233/ΔLDH /pVK7株及びMJ233/SDH/ΔLDH株の菌体をシード培地 3ml（グルコース 10g/L、(NH4) 2SO4 2.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.25g/L、尿素 2g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 50μg/L、VB1・HCl 100μg/L、プロトカテク酸 15mg/L、CuSO4 0.02mg/L、CaCl2 10mg/L、pH7.0(KOH)）に接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。その後、その試験管にメイン培地 3ml（グルコース 100g/L、(NH4) 2SO4 5g/L、KH2PO42g/L、尿素 3g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、MgCO3 71.4g/L、以上添加後最終濃度、pH6.8(NaOH)）を添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。培養終了後、培養液中のコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM ｐ-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸を測定した。このときの結果を表２に示した。MJ233/SDH/ΔLDH株では、同宿主にベクタープラスミドを導入したMJ233/ΔLDH/pVK7株に比べて、収率は約4%の向上が認められた。また、リンゴ酸蓄積は3.6g/L、フマル酸蓄積は0.5g/L減少した。
（B）SDH、PC同時増幅株の培養評価
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/PC/ΔLDH株及びMJ233/SDH/PC/ΔLDH株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地にて培養して得たMJ233/PC/ΔLDH株及びMJ233/SDH/PC/ΔLDH株の菌体をA培地（ グルコース 20g/L、(NH4) 2SO4 14g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、尿素 4g/L、FeSO4・7H2O 0.02g/L、MnSO4・7H2O 0.02g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、カザミノ酸 1g/L、酵母エキス1g/L）3mlに接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。
その後、その試験管にメイン液（グルコース200g/L、亜硫酸ナトリウム 30g/L
、MgCO3 142.8g/L)3mlを添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/PC/ΔLDH株及びMJ233/SDH/PC/ΔLDH株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地にて培養して得たMJ233/PC/ΔLDH株及びMJ233/SDH/PC/ΔLDH株の菌体をA培地（ グルコース 20g/L、(NH4) 2SO4 14g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、尿素 4g/L、FeSO4・7H2O 0.02g/L、MnSO4・7H2O 0.02g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、カザミノ酸 1g/L、酵母エキス1g/L）3mlに接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。
その後、その試験管にメイン液（グルコース200g/L、亜硫酸ナトリウム 30g/L
、MgCO3 142.8g/L)3mlを添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。
培養終了後、培養液中のコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM
Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸を測定した。そのときの結果を表３に示した。
Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生リンゴ酸およびフマル酸を測定した。そのときの結果を表３に示した。
MJ233/SDH/PC/ΔLDH株ではPCのみの増強株であるMJ233/PC/ΔLDH に対して コハク酸収率は約3%向上し、リンゴ酸蓄積は3.2g/L、フマル酸蓄積は0.2g/L減少した。
この結果と上記（A）の結果から、SDHの増幅がコハク酸収率の向上、およびコハク酸生産時のリンゴ酸およびフマル酸の副生量低減に有効であることが示された。
この結果と上記（A）の結果から、SDHの増幅がコハク酸収率の向上、およびコハク酸生産時のリンゴ酸およびフマル酸の副生量低減に有効であることが示された。
Claims (6)
- コリネ型細菌由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または大腸菌由来のフマル酸リダクターゼ遺伝子を含むベクターで形質転換すること、相同組換え法によって染色体上で該遺伝子を高発現させること、または該遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することによってフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌または該コリネ型細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
- 前記コリネ型細菌が、さらに、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を、欠失領域を有する変異型遺伝子に置換することによってラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変されたコリネ型細菌である、請求項１に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換することまたは相同組換え法によって染色体上で該遺伝子を高発現させることによってピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 有機原料がグルコースである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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