JP4574758B2 - 顕微鏡画像観察装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学顕微鏡や走査型レーザ顕微鏡に適用され、観察対象を画像表示する顕微鏡画像観察装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡は、ステージ上に搭載したプレパラート上の試料を対物レンズで拡大して観察する構成となっており、一般に試料への照明としてランプなどの光源からの光をコンデンサレンズを用いて試料の観察領域全体に均等になるように照射する構造を採用している。通常、接眼レンズを介して像の観察を行なうが、画像の簡単な観察、記録を行なえるようにテレビカメラで撮影し、モニタディスプレイで観察する方法が一般的となっており、近年はテレビカメラの解像度も向上して鮮明に観察を行なうことも可能となった。
【０００３】
このように観察画像をデータとして扱うことで、顕微鏡の接眼レンズを覗き込む動作が不要となり、特に試料として生物の培養細胞などの画像をモニタディスプレイにて長時間観察することができる。また、観察している画像をビデオテープレコーダにより容易に記録することもできる。
【０００４】
そして、さらに画像の観察を高い分解能でコントラストよく行ないたい場合に、光学顕微鏡による観察では照明系としてフレア等の問題があり、また特に低コントラストの試料を観察する際に得られる画像が大変見づらいものになるという不具合が発生する。これを改善するものとして、点状光投射型（スポット光投射型）の走査型光学顕微鏡が提案されている。
【０００５】
この走査型光学顕微鏡は、高輝度の光を光源から対物レンズを介して試料へ点状に照射し、試料からの反射光、もしくは点状の光を照射したことで試料から発生する蛍光を、再び対物レンズ及び光学系を介して点状に結像し、その光をピンホール開口を有する検出器で検出して像の濃度情報を得るようにしたものである。
【０００６】
ただし、これだけでは点状光源が照射されたことによる１点の濃度情報しか得られないため、試料をＸ軸、Ｙ軸の方向にそれぞれ移動して二次元平面内で機械的に移動させるＸ−Ｙ走査方式を用いたり、光路の走査をＣＲＴディスプレイなどの画像表示装置の画面走査と同期させることで、Ｘ−Ｙ走査に対応した上記濃度情報の信号の強度を表示し、画像として観察できるようにしている。
【０００７】
以上が走査型光学顕微鏡の原理構成であり、光源としてレーザ光を使うと画像の解像が向上することが広く知られており、実際に光源としてレーザ光を用いたものは走査型レーザ顕微鏡と呼称されている。
【０００８】
この走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査することにより生じる試料の反射光または蛍光を、検出器である光電子増倍管やフォトダイオードなどで光電変換により電気信号に変換し、画像データとして保存、加工、表示する構成をなしている。
【０００９】
図１０は、一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図である。
図１０において、１１は光学顕微鏡本体であり、レーザ光源１２を用いてこの光学顕微鏡本体１１の顕微鏡ステージ１１１上の試料１１２表面にレーザ光によるスポット光を照射させる。実際には、試料１１２表面上をＸＹ走査するために、レーザ光源１２からのレーザ光に対し、２次元走査機構部１３が対物レンズ１１３に対するスポット光の光路をＸＹ光路にそれぞれ振らせることになる。
【００１０】
図１１は、２次元走査の原理を説明するための図である。図１１では、Ｘ，Ｙ方向の各ガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２の２枚を使った場合のＸＹ走査部の概略例を示しており、テレビジョン方式で用いられる所謂ラスタスキャンを実現している。スポット光を照射した結果、試料から得られる反射光または蛍光は、光学顕微鏡本体１１の対物レンズ１１３を通り、２次元走査機構部１３を介してピンホール板１４を通過した後、光検出部１５で受光され、その輝度に応じた電気信号に光電変換される。
【００１１】
上記ピンホール板１４は、所定径のピンホールが開孔され、光検出部１５の前面の結像位置に配置されるもので、ピンホールを通過した光を検出することで試料面上の観察点で合焦している情報のみを検出でき、共焦点効果が得られるようになる。なお、２次元走査機構部１３を駆動する場合には、後述する信号処理部１６内のＣＰＵ１６ｆから走査制御信号が発生され、同時にＣＰＵ１６ｆで前記走査制御信号を基準にデータ処理が行なわれる。
【００１２】
そして、光検出部１５で検出された電気信号は、信号処理部１６にて画像処理され、画像信号化されてモニタディスプレイである表示部１７に送られ、この表示部１７にて表示出力される。
【００１３】
次に、上記信号処理部１６にて行なう信号処理の内容を詳述する。光検出部１５で得た電気信号について、まず利得可変部１６ａで所望の電圧値となるように信号増幅を行ない、次にオフセット調整部１６ｂにて所望のオフセット量の増減を行なう。そのオフセット量は、ＣＰＵ１６ｆによりＤ／Ａ変換器１６ｈ，１６ｇを用いて所望の値に設定される。
【００１４】
オフセット調整部１６ｂで得られた信号は、次にＡ／Ｄ変換器１６ｃにてデジタル化された後、記憶部１６ｄに画像データとして一時記憶される。記憶部１６ｄに記憶された画像データは、その後ＣＰＵ１６ｆにより適宜加工、表示、保存される。すなわち、加工とはＣＰＵ１６ｆにより所望の画像処理を行なうことであり、表示とは記憶部１６ｄから読出した画像データをＤ／Ａ変換器１６ｅにてアナログ化した後に上記表示部１７に表示し、画像を観察することである。
【００１５】
また特に、併せて試料の深さ方向の情報つまり３次元情報が必要な場合には、Ｚ走査駆動部１６ｊによりステージ１１１を所望のＺ位置へ移動させ、必要な画像を順次記憶部１６ｄに構築させることにより、３次元画像の表示、観察も可能となる。
【００１６】
上記のような走査型レーザ顕微鏡では、異なる画像観察システムであっても、同じ顕微鏡鏡体を使用しているため、鏡体の性能が及ぼす影響は共通である。一般に、顕微鏡の鏡体は金属の材質で作られており、熱による鏡体自身の伸縮の影響がある。金属は、材質により固有の熱収縮率を持ち、温度の変化により収縮伸長をする。環境温度にもよるが、顕微鏡鏡体の熱安定まで数時間程度かかることがよくある。また、外部温度が変化するとさらに多くの安定時間を要する。この影響は通常の観察では目立たないが、高倍率及び長時間の画像観察においては、観察画像の位置が視野からずれる要因となる。
【００１７】
図１２は、観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示するもので、図１２（ａ）は観察視野ＯＦのほぼ中心に観察細胞ＯＣが位置している状態、図１２（ｂ）は顕微鏡鏡体の熱収縮により観察細胞ＯＣが観察視野ＯＦの中心ＣＯＦから大きく外れている状態を示す。具体的には、例えば１００倍観察において視野が２０ｍｍである場合、試料が数十μｍずれることで視野中心から外れることとなる。これは、顕微鏡鏡体に約１０℃の温度変化が生じたことで実際に起こり得るものである。
【００１８】
上記温度変化による熱収縮が生じる主な原因として、ランプ照明からの熱伝導、顕微鏡内部に配置されているユニット、例えばＩＣ、モータ等の電気部品からの熱、及び周囲の環境温度変化等が挙げられる。また、この収縮現象は、顕微鏡の鏡体の形、ユニット構成、材質等に影響を受けるものであって、一概にどのように変化するかを容易に知ることはできない。
【００１９】
このような不具合を解消し、画像の取込み状態を改善して見易い画像を取得するシステムが従来よりいくつか提案されている。例えば特開平９−１３８３５３号公報には、一般的にレーザ顕微鏡の画像を取得するシステムが開示されている。このシステムでは、画像の明るさの調整を行ない見易くした画像を取得しており、より詳しくは、見やすい画像を得るために画像の明るさ成分に関して最適な調整を行なっている。
【００２０】
また、特開平９−１９７２８７号公報では、レーザ顕微鏡のシステムにおいて、標本の位置を所定の視野内に位置させることを目的としている。そして、接眼レンズから見ることのできる観察画像範囲位置とモニタ画面に表示される範囲とがずれることがあるため、ステージの位置を再調整して観察視野内に合わせるようにしている。この手法として、入力手段により表示画面上で指定された位置に対応するようステージを制御し、ＸＹ移動させることで観察視野の中心に位置させている。また、位置の入力手段としては、表示画面上にタッチパネルを設けたり、あるいは表示画面にファンクションスイッチを設けたりしている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
上記特開平９−１３８３５３号公報のシステムは、一般的なレーザ顕微鏡の画像を取得するものであり、画像の明るさの調整を行なって見やすい画像を取得している。しかしながら、画像の明るさ成分に関しての調整のみしか行なっておらず、位置のずれについては何ら補正が行なわれていない。
【００２２】
また、上記特開平９−１９７２８７号公報においては、モニタ画面を見ながら画像のずれを手動操作により指定し、ずれ補正を行なっている。そのため、画像を観察する毎に同様の操作を行なう必要があり、その操作が煩雑となる。また、長時間にわたる観察においては、顕微鏡鏡体の変形に伴なって観察像位置がずれ、次の画像取込み及び観察操作の際には観察対象が観察視野から大きく外れてしまい、再度観察対象を画像から探さなければならない。このため、観察者は常に監視を続行しなければならない。
【００２３】
これは、基本的に接眼レンズからの観察画像と走査して得たモニタ画像との位置ずれの補正が、初期状態にしか対応していないことに起因するもので、顕微鏡鏡体の熱変形が生じたときの観察画像の位置ずれは、その度毎に手動で補正せざるを得ない。
【００２４】
本発明の目的は、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能な顕微鏡画像観察装置を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、顕微鏡で得た画像を観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記画像中の観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備したことを特徴とする。
【００２６】
このような構成とした結果、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００２７】
請求項２記載の発明は、観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から画像を構築して観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記光信号を検出する検出機構とは別に設けられ、前記画像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段で得た前記画像中の前記観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備し、前記制御手段により前記平面方向及び前記観察光軸方向の位置ずれを補正した状態で前記スポット光の走査による画像構築を行うことを特徴とする。
【００２８】
このような構成とした結果、特に走査型レーザ顕微鏡等で、観察画像を得るためのレーザ光源や２次元走査機構を用いることなしに、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合でも、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、無駄な電力消費を抑え、レーザ光源の長寿命化を図りながら、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００２９】
請求項３記載の発明は上記請求項１または２記載の発明において、前記算出手段が、算出したずれ量及びずれ方向の少なくとも一方を、顕微鏡鏡体の熱変形に係る情報を基に補正することを特徴とする。
【００３０】
このような構成とした結果、上記請求項１または２記載の発明の作用に加えて、顕微鏡鏡体に熱変形による平面方向または観察光軸方向の位置ずれが発生した場合であっても対物レンズの合焦範囲を考慮してこれを補正することができる。
【００３１】
請求項４記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第１の位置情報は前記観察対象の重心位置であり、前記基準位置は前記画像の中心位置であることを特徴とする。
【００３２】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の中心に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００３３】
請求項５記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記画像のコントラスト値であることを特徴とする。
【００３４】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、画像のコントラスト値を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
【００３５】
請求項６記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記対物レンズと前記ステージとの相対位置であることを特徴とする。
【００３６】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、演算処理を行なうことなく、前記対物レンズと前記ステージとの相対位置を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
請求項７記載の発明は請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、観察当初における前記第一の位置情報は操作者によって設定されることを特徴とする。
請求項８記載の発明は請求項１記載の発明において、前記顕微鏡画像観察装置は、前記観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から前記画像を構築して観察する走査型レーザ顕微鏡であることを特徴とする。
【００３７】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００３８】
図１は、光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。光学顕微鏡本体２１には、観察画像のＸＹ平面方向に移動可能なスキャニングステージ２１１が設けられ、画像観察用のテレビカメラ２２が取付けられている。テレビカメラ２２で得たステージ２１１上の試料２１３の画像信号は、信号処理部２３１とモニタディスプレイからなる表示部２４へ送られる。
【００３９】
信号処理部２３１では、テレビカメラ２２で得た画像信号をＡ／Ｄ変換器２３ａによりデジタル化した後、記憶部２３ｂに記憶させる。この記憶部２３ｂに記憶された画像信号は、Ｄ／Ａ変換器２３ｃで読出されて再びアナログ化された後、表示部２４とビデオテープレコーダからなる画像記録部２５へ送られる一方、重心検出部２３ｄでも読出され、特定の画像処理、すなわち観察視野中の観察対象である試料２１３における重心位置の算出がなされる。
【００４０】
なお、ＣＰＵ２３ｅ１の有する図示しないメモリには、後述する光学顕微鏡本体２１の鏡体の熱変形によって生じる位置ずれを補正するための補正処理情報が記憶されている。
【００４１】
さらに、重心検出部２３ｄでは、求めた重心位置と観察視野の中心位置とのなす距離及び方向をずれ情報として算出し、その算出結果により距離換算部２３ｆが、その時点での光学顕微鏡本体２１における対物レンズの倍率等を考慮し、実際のＸ，Ｙ各方向の移動量に換算し、ＸＹ駆動部２３ｇへ送る。ＸＹ駆動部２３ｇでは、距離換算部２３ｆから送られてくる情報に基いて、光学顕微鏡本体２１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ各方向へ駆動して移動させ、試料２１３の重心位置と観察視野の中心位置とを一致させる。
【００４２】
なお、記憶部２３ｂでの画像信号の記憶、重心検出部２３ｄでの重心位置の算出、距離換算部２３ｆでのずれ状態の算出、及びＸＹ駆動部２３ｇでのスキャニングステージ２１１の駆動は、すべてＣＰＵ２３ｅ１の駆動制御によりなされる。表示部２４では、テレビカメラ２２から直接送られる画像信号、あるいは信号処理部２３１のＤ／Ａ変換器２３ｃから出力される画像信号の一方を、モニタ画面で表示する。また、画像記録部２５は、表示部２４を介して送られてきた画像信号あるいはＤ／Ａ変換器２３ｃからの画像信号を順次記録する。
【００４３】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。テレビカメラ２２により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部２３１にて画像処理される。すなわち、まずＡ／Ｄ変換器２３ａにおいてデジタル化され、画像データとして記憶部２３ｂに記憶される。この記憶部２３ｂに記憶された画像データを用いて、重心検出部２３ｄで観察対象となる試料の重心が求められる。
【００４４】
図２は、試料である観察細胞ＯＣの観察視野ＯＦにおける位置関係を例示する図である。図２に示すように、観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣと観察視野ＯＦの中心ＣＯＦとが大きく離れており、観察細胞ＯＣが観察視野ＯＦ中の外れた位置にあることがわかる。なお、観察当初の観察位置の設定に関しては、必ずしも自動で重心位置を求めずとも、重心もしくは画像中心と思われる位置を観察者が表示部２４を見て視野中心となるよう設定してもよい。
【００４５】
次に、観察を開始してからの時間経過に伴ない、光学顕微鏡本体２１に生じる顕微鏡鏡体の熱変形に起因した位置ずれの補正処理について説明する。信号処理部２３１では、ＣＰＵ２３ｅ１が一定の時間間隔で順次更新記憶されている記憶部２３ｂの画像データを重心検出部２３ｄに読出し、観察対象となる試料の重心位置を自動算出させる。そして重心検出部２３ｄは、算出した重心位置と視野の中心位置との画素差を求め、求めた画素差を続く距離換算部２３ｆで移動距離に換算する。
【００４６】
図３は、上記画像データにおける観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣの位置と観察視野ＯＦの中心ＣＯＦの位置との関係を示す図である。距離換算部２３ｆは、図３に示すように重心検出部２３ｄで求められた画素差Ｌｘ，Ｌｙを実際の移動距離に換算する。ここで実際の移動距離とは、観察している対物レンズの倍率により決まる実寸法であり、それがスキャニングステージ２１１の移動量Ｓｘ，Ｓｙとなる。
【００４７】
例えば、使用するテレビカメラ２２がアスペクト比４：３、縦横の画素数６４０×４８０ドット（正方格子画素）の画像信号を出力するものとし、観察視野の対角線距離が２０ｍｍであったとすると、対物レンズの倍率が１倍のときの観察視野ＯＦの横、縦の距離は、それぞれ
（横） ２０×４÷５＝１６ｍｍ
（縦） ２０×３÷５＝１２ｍｍ
となり、これを１画素間あたりの距離に換算すると、
（横縦共） １６ｍｍ÷６４０＝２５μｍ
となる。
【００４８】
もし、対物レンズの倍率が１０倍の観察で、そのずれ量が画素数Ｌｘ＝２０画素、Ｌｙ＝１０画素であったとすると、
Ｓｘ＝２５×２０÷１０＝５０［μｍ］
Ｓｙ＝２５×１０÷１０＝２５［μｍ］
となり、これが距離換算部２３ｆで換算されてＸＹ駆動部２３ｇに送られる。ＸＹ駆動部２３ｇでは、この送られてきた情報に基いて光学顕微鏡本体２１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ方向に移動させ、観察対象の試料である観察細胞ＯＣの中心ＣＯＣを観察視野ＯＦの中心ＣＯＦに一致させる。
【００４９】
なお、上記位置補正処理において、実際には光学顕微鏡本体２１から送られる対物レンズの倍率の情報をＣＰＵ２３ｅ１が読取り、その情報を重心検出部２３ｄに与えることで移動量を得ることができる。
【００５０】
以上の処理により移動制御された後の画像は、観察対象が正確に視野の中心に位置することとなり、Ｄ／Ａ変換器２３ｃにてアナログ化された後、表示部２４に表示、あるいは画像記録部２５に記録される。なお、Ｄ／Ａ変換器２３ｃから得た画像信号に代えて、テレビカメラ２２で得た画像信号を直接表示部２４に表示、あるいは画像記録部２５に記録するものとしてもよい。
【００５１】
また、上記位置ずれの補正処理を実行する補正処理情報、ここでは時間間隔は、実際の光学顕微鏡本体２１の鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能であるものとする。
【００５２】
図４は、ＣＰＵ２３ｅ１のメモリに記憶されている画像取得時間間隔をＴ１、位置ずれの補正時間間隔をＴ２（Ｔ１＞Ｔ２）とした場合の、両者の関係を例示した図である。上記補正処理は、画像取得から次の画像取得までの間に行なわなければならないため、図４に示すように、時間Ｔ１内で１回あるいは時間間隔Ｔ２毎に複数回位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。
【００５３】
また、リアルタイムで常に補正処理を行ない観察対象を視野の中心に置きたい場合、テレビカメラ２２の１画面の露光時間に同期して、例えばテレビジョン方式がＮＴＳＣ方式であれば１／３０秒間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【００５４】
一般に、顕微鏡鏡体の熱変形の速度は十分に遅いものであるため、上記のような補正処理に要する処理時間も十分確保することができ、見やすい位置にある所望の観察が可能である。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取込み速度により制限される。
【００５５】
以上の動作により、初期の設定を行なうのみで、その後は顕微鏡鏡体に熱変形を生じた場合であっても、自動的に長時間にわたって常に観察対象が視野の中心に位置するようにでき、画像を観察、記録することが可能となる。
【００５６】
また、画像記録部２５はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ２２のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【００５７】
さらに、上述した補正処理のための情報として、所望の時間間隔で得る熱変形の速度等の情報を用いる他に、顕微鏡鏡体の温度を逐一検出することができる温度センサを鏡体に設け、その温度センサの検出結果を基に、実際の鏡体の熱変形に応じて位置ずれを補正処理するようにしてもよい。
【００５８】
（第２の実施の形態）
以下、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００５９】
図５は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図５の基本構成は上記第１の実施の形態に示した図１と同様であるため、図１と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【００６０】
図５において、３１はレーザ顕微鏡本体であり、レーザ光源３２から発振されたレーザ光は、必要に応じて光ファイバを介してレーザ顕微鏡本体３１に導かれ、対物レンズを通り、そのスポット光が観察光軸と直交する観察画像のＸＹ平面方向に移動可能なスキャニングステージ２１１上に載置された試料２１３表面に照射される。
【００６１】
２次元走査機構部３３は、後述する信号処理部２３２内の２次元走査駆動制御部２３ｌが発生する走査制御信号により試料２１３に対してＸＹ走査するものであり、具体的には上記図１２で例示したように、２枚のガルバノミラーを用いてＸ方向とＹ方向へ走査し、レーザ光をラスタスキャンする。
【００６２】
そして、試料２１３にスポット光を照射した結果得られる試料２１３からの反射光または蛍光を、レーザ顕微鏡本体３１の対物レンズを介して図示しない光路分割部により光路分割する。その分割された一方の光を、２次元走査機構部３３を介してピンホール板３４を通過させた後、一般に光電子増倍管（ＰＭＴ）で構成される光検出部３５にて輝度に応じた電気信号に光電変換する。
【００６３】
ピンホール板３４は、所定径のピンホールを開孔したものであり、光検出部３５の前面の結像位置に配置される。ピンホール板３４を通過した光を光検出部３５で検出することにより、試料面上の観察点での合焦により得た情報のみを検出でき、共焦点効果が得られる。光検出部３５で変換された電気信号は、信号処理部２３２において画像処理され、得られた画像信号が表示部２４で表示されるとともに、画像記録部２５で記録される。
【００６４】
信号処理部２３２では、まず光検出部３５で得た電気信号を利得可変部２３ｈにて所望の増幅率により増幅し、次に増幅した電気信号についてオフセット調整部２３ｉで所望分だけオフセット量の増減を行なう。これらの設定量は、ＣＰＵ２３ｅ２がそれぞれＤ／Ａ変換器２３ｊ，２３ｋに所望の値を可変設定することで決められる。そして、オフセット調整部２３ｉから出力された信号がＡ／Ｄ変換器２３ａに送られてデジタル化され、順次記憶部２３ｂに書込まれる。
【００６５】
この記憶部２３ｂでのアドレス指定はＣＰＵ２３ｅ２により行なわれる。ＣＰＵ２３ｅ２は、２次元走査駆動制御部２３ｌの制御による２次元走査機構部３３での走査に同期して、記憶部２３ｂに１画面分の信号を画像データとして記憶させる。
【００６６】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。まず、２次元走査機構部３３によりレーザ光源３２からのレーザ光を試料２１３表面に走査し、得られた反射光または蛍光を順次ピンホール板３４を介して光検出部３５で検出する。光検出部３５では検出した光に対して光電変換を行ない、信号処理部２３２の利得可変部２３ｈ及びオフセット調整部２３ｉでその電気信号の振幅及びオフセット値の調整をした後、Ａ／Ｄ変換器２３ａでデジタル化して記憶部２３ｂに記憶する。
【００６７】
この記憶部２３ｂに記憶された１画面分の画像に対して画像処理が実行されるが、その画像処理の内容自体は上記第１の実施の形態と同様であるので説明を省略する。そして、常に観察対象となる試料の重心位置が観察視野の中心位置と一致するよう、ＸＹ駆動部２３ｇによりレーザ顕微鏡本体３１のスキャニングステージ２１１を自動的に移動させる。
【００６８】
一般的にレーザ顕微鏡の場合、画像取得の方法としてはＸＹＴスキャン、ＸＹＺＴスキャンといった時間経過を観察する方法があり、上記第１の実施の形態の場合と同様に長時間観察が必要である。したがって、このようなレーザ顕微鏡の画像取込みモードにおいても適切な位置補正を行なうことで、良好な画像の確実な取得が可能となる。
【００６９】
（第３の実施の形態）
レーザ顕微鏡で画像を取得するためには、レーザ光源、２次元走査機構部といった主要部分を動かす要素が必須となり、多大な電力を消費する。これに対してテレビカメラで画像を得る場合は、かかる消費電力がはるかに少ないという利点がある。また、特にレーザ顕微鏡で用いられる気体レーザは、一般的に固体レーザに比べて寿命が短い。したがって、顕微鏡画像観察装置において画像の条件を抽出する間は、レーザ光による走査を一時的に停止し、電源を切断しておくことが望ましい。
【００７０】
これは、画像の位置ずれに対する補正処理を実行する場合も同様であり、やはりレーザ光による走査にかかる停止作業が必要とされる。そのため、画像の位置ずれの検出に関してはテレビカメラの画像を使い、実際に記憶したい顕微鏡画像としてレーザ光の走査で得た画像を記憶するという使い方を行なえば、必要な電力消費を充分低く抑えることができる。
【００７１】
以下、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。本第３の実施の形態では、レーザ光の走査により顕微鏡画像を取得する時間間隔が長い場合に、必要時以外はレーザ光の走査に係る回路の電源を一時的に切断し、その間に複数回テレビカメラで画像を得て、位置ずれの補正処理を行なう。
【００７２】
図６は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図６の基本構成は上記第２の実施の形態に示した図５と同様であるため、図５と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【００７３】
図６において、２次元走査機構部３３の対物レンズ側には光路分割部４１が設けられ、レーザ光の走査を行なっていない状態では、この光路分割部４１により観察対象となる試料２１３の光像をテレビカメラ４２に導く。テレビカメラ４２により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部２３３内のＡ／Ｄ変換器２３ｍでデジタル化された後に記憶部２３ｎに記憶される。この記憶部２３ｎは、記憶制御部２３ｏの制御に基いて送られくる画像信号を記憶し、記憶部２３ｎに記憶される画像に基いて、重心検出部２３ｄが観察視野中における観察対象となる試料の重心位置を検出する。
【００７４】
そして、レーザ光の走査により得られた顕微鏡画像の記憶部２３ｂへの記憶は記憶制御部２３ｐにより、またテレビカメラ４２で得られた画像の記憶部２３ｎへの記憶は記憶制御部２３ｏにより、それぞれ制御される。ＣＰＵ２３ｅ３では、光路分割部４１を切換えるとともに、これら記憶制御部２３ｐ，２３ｏを統括制御して、記憶部２３ｂと記憶部２３ｎのいずれか一方で顕微鏡画像を記憶するよう切換制御する。
【００７５】
このような構成とすることにより、試料の観察を行なう場合には、レーザ光源３２で発振したレーザ光を２次元走査機構部３３で当該試料の表面に走査しながら照射する。そして、光路分割部４１を光検出部３５側に切換えることで、試料２１３から得られた反射光あるいは蛍光はピンホール板３４を通過し、光検出部３５で検出される。
【００７６】
光検出部３５は、検出した光を順次電気信号に光電変換し、その電気信号は利得可変部２３ｈ，オフセット調整部２３ｉを介してＡ／Ｄ変換器２３ａでデジタル化され、記憶制御部２３ｐの制御により記憶部２３ｂに記憶され、適宜Ｄ／Ａ変換器２３ｃを介して表示部２４で表示出力される。
【００７７】
一方、上述した観察の合間に観察視野の位置ずれの補正処理を行なう場合には、光路分割部４１をテレビカメラ４２側に切換え、試料の画像を光路分割部４１を介してテレビカメラ４２で撮像する。テレビカメラ４２で得られた画像信号は、Ａ／Ｄ変換器２３ｍでデジタル化され、記憶制御部２３ｏの制御により記憶部２３ｎに記憶される。
【００７８】
この記憶部２３ｎに記憶された画像に基いて、重心検出部２３ｄは試料の重心位置を算出し、さらにその重心位置と観察視野の中心とのずれ量を座標値で算出し、その結果を距離換算部２３ｆに送出する。距離換算部２３ｆでは、送られてきたずれ量の情報と対物レンズの倍率とから上記第１の実施の形態で説明したようにＸＹ各方向のずれ量の示す各距離を算出し、その算出結果をＸＹ駆動部２３ｇに出力する。ＸＹ駆動部２３ｇは、この距離換算部２３ｆからの距離値に応じてレーザ顕微鏡本体３１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ各方向に移動させる。これにより、レーザ顕微鏡本体３１の鏡体に熱変形等が生じた場合であっても、観察視野の中心に確実に試料の重心が位置し、試料を観察視野の中央で観察することができるようになる。
【００７９】
（第４の実施の形態）
上記第１乃至第３の実施の形態では、いずれも位置ずれの補正処理として観察光軸に直交するＸＹ平面に沿ってステージの移動を行なうものとしたが、観察光軸と平行したＺ方向へも位置ずれが生じることがある。この問題は、自動合焦機能を有する顕微鏡であれば、後述するようにＺ方向の補正処理をＸＹ方向の補正処理と並列して実行することで解決できる。これにより、特に焦点深度の浅い対物レンズを使用するような場合であっても、確実に試料の高さ方向の変化に対応させ、常に合焦を得ることができる。
【００８０】
顕微鏡において観察者が観察する際に、ＸＹ方向の位置を決める調整操作を行なうとともに、Ｚ方向の合焦位置を決める。具体的には、ステージのＸＹ操作、Ｚ操作を行ない所望の位置を確定することで、ＸＹ観察位置合わせと合焦を行なう。これは、一般的に行なわれている位置合わせである。したがって、ＸＹ方向の位置決めにより観察重心位置を決め、Ｚ方向の位置決めにより合焦位置を決めることになる。本第４の実施の形態では、このときのＺ方向の合焦位置をＺ０とし、この状態で撮像された初期画像のコントラスト値を合焦位置ずれ補正の基準とする。
【００８１】
以下、本発明の第４の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００８２】
図７は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図７の基本構成は上記第３の実施の形態に示した図６と同様であるため、図６と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。本第４の実施の形態では、観察光軸方向（Ｚ方向）の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれに関して、そのずれ量を以下の処理にて補正し、合焦位置で撮像した初期の観察画像に対して合焦位置のずれていない観察画像を得ることを可能とする。
【００８３】
図７において、コントラスト算出部２３ｑは、記憶部２３ｎに記憶された観察対象の初期の画像のコントラスト値を、該初期画像の各周辺画素間の差分値を用いて算出する。
【００８４】
図８は、試料である観察細胞ＯＣの画像を示す図である。図８において、８１，８２は、それぞれコントラスト値算出用のＸ，Ｙラインを示している。コントラスト算出部２３ｑは、図８に示す画像におけるＸＹ平面内でのＸライン８１とＹライン８２の輝度の差分値の絶対値の和をコントラスト値とする。この場合、Ｘライン８１，Ｙライン８２でのコントラスト値とＺ位置でのコントラスト値は、以下のようになる。
【００８５】
ＣＸ＝Σ｜Ｄ（Ｘｎ，Ｙｋ）−Ｄ（Ｘｎ＋１，Ｙｋ）｜2 …（１）
ＣＹ＝Σ｜Ｄ（Ｘｋ，Ｙｎ）−Ｄ（Ｘｋ，Ｙｎ＋１）｜2 …（２）
ＣＺ＝ＣＸ＋ＣＹ …（３）
ここで、Ｘｎ，Ｙｎは画像中の各画素の位置を示し、Ｄ（Ｘｎ，Ｙｎ）はＸｎ，Ｙｎ位置での画像の輝度を示す。また、ｋは任意の画像位置である。（１），（２）式に示すＣＸ，ＣＹは、Ｘ，Ｙラインでのコントラスト値、（３）式に示すＣＺは最終的なＺ位置でのコントラスト値であり、ＣＸとＣＹを加算することによりＺ位置でのコントラスト値ＣＺを求める。
【００８６】
図９は、光軸方向の位置（Ｚ位置）に対するコントラスト値の変化を示す図である。前述したようにコントラスト算出部２３ｑによりＺ位置でのコントラスト値を求めた後、光軸方向の位置ずれの補正を行なう。この場合、今回取得した画像に対して、同様にコントラスト算出部２３ｑでコントラスト値（Ｚｎの位置でのコントラスト値）を算出し、前回取得した初期画像のコントラスト値（合焦位置Ｚ０でのコントラスト値）と比較する。
【００８７】
これら二つのコントラスト値が異なれば合焦位置がずれているため、ＣＰＵ２３ｅ３は以下のようにＺ駆動部２３ｒでステージ２１１を光軸方向で移動させ、前記二つのコントラスト値が一致する光軸位置すなわち合焦位置Ｚ０を探す。すなわち、光軸方向の位置ずれ補正処理の際に上記二つのコントラスト値が異なる場合、今回取得したコントラスト値が合焦位置Ｚ０のときの値と一致するようにステージ２１１をＺ方向で動かす。
【００８８】
まずＣＰＵ２３ｅ３は、標本２１３と対物レンズの衝突を防ぐため、初めにそれらが離れる方向へＺ駆動部２３ｒによりステージ２１１を移動する。この移動量は、使用している対物レンズの焦点深度量のステップに合わせる。これは、焦点深度内でステージ２１１を動かしても、合焦範囲内であるため変化を認識できないからである。
【００８９】
このとき、ステージ２１１を２または３ステップ移動してコントラスト値が大きくなるなら、合焦位置のコントラスト値に至るまで、同じ方向で移動を続け合焦点に合わせる。もし、コントラスト値が小さくなるなら、合焦点からずれてゆくので、ステージ２１１を逆方向へ移動し、合焦位置に到達するようＺ方向の位置合わせを行なう。このＺ方向の位置ずれ補正処理を行なう時間間隔は、実際の顕微鏡鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能である。
【００９０】
なお、画像取得時間と位置補正時間の関係については、第１の実施の形態の説明で用いた図４と同様であり、例えば、画像取得時間（Ｔ１）に対し、位置ずれ補正時間（Ｔ２）とした場合（Ｔ１＞Ｔ２）、位置補正は次の画像取得までの間に行なわれなければならないため、Ｔ１内にＴ２の時間間隔で複数回（あるいは１回）位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。また、リアルタイムで常に補正処理を行ない、観察位置を中心に置きたい場合、テレビカメラの１画面の露光時間に同期して例えば１／３０ｓ間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【００９１】
一般に、通常の熱変形の速度は十分に遅いため、処理時間も十分確保でき、所望の観察が可能になる。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取り込み速度に制限される。以上により、初期の設定を行なうのみで、その後は自動でＺ方向の位置ずれ補正を行ない長時間の画像記録が可能となるため、観察に係る作業効率が向上する。
【００９２】
また、Ｚ方向の位置ずれ補正を画像のコントラスト値を基に行なうのでなく、対物レンズとステージの相対距離を基に行なうようにしてもよい。この場合、顕微鏡本体に対物レンズとステージの相対距離を測定するセンサを設け、このセンサで測定される相対距離をＣＰＵ２３ｅ３で検出する。そしてＣＰＵ２３ｅ３は、補正処理時に、検出した相対距離と初期の合焦時における相対距離とが一致するよう、Ｚ駆動部２３ｒによりステージ２１１を光軸方向で移動させる。
【００９３】
また、画像記録部２５はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ２２のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【００９４】
一般的にレーザー顕微鏡の場合、ＸＹＴスキャン、ＸＹＺＴスキャンといった方法により時間経過に応じて画像を取得し観察をするため、長時間の観察が必要となる。しかし、以上このようなレーザ顕微鏡の画像取り込みモードによれば、適切な位置補正を行なうことで、長時間による良好な画像の取得が可能となる。これにより、ＸＹ方向すなわち平面方向だけでなく、光軸方向の合焦ずれも補正され、長時間において観察位置がずれない画像を取得できる。
【００９５】
なお、本発明はその要旨を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することが可能であるものとする。
【００９６】
（変形例）
上記各実施の形態では示さなかったが、当然ながらレーザ顕微鏡システムでは、透過検出画像に関しても同様の処理を実行することができる。また、複数の画像に対しても同様の位置ずれの補正処理を行なうことが可能である。その場合の構成は上記各実施の形態と同様で、異なる波長の蛍光画像を同時または時分割により記憶部２３ｎに記憶する。そして、複数の蛍光画像に対してそれぞれ位置ずれの補正処理を行ない、全ての画像に対して補正処理を終了した後、表示部２４にてマルチ画像を表示させる。
【００９７】
さらに、上記第２〜４の実施の形態では、光検出部３５を光電子増倍管（ＰＭＴ）で構成するものとして説明したが、これに限らず、フォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤ、ＣＭＤ等の光電変換の効率が良いものであれば他の素子を用いてもよい。また２次元走査機構部３３は、ガルバノミラーや、共振ガルバノミラー、ポリゴンミラー、あるいはＡＯＤでもよく、要はＸＹの走査が制御できればよい。また、上述した位置合わせの処理は、ハードウェアとソフトウェアのどちらでも実現可能である。
【００９８】
【発明の効果】
本発明のようにすれば、任意に設定された時間間隔後の、画像に係る平面方向の基準位置に対する第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び画像に係る観察光軸方向の基準値に対する第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出し、これらずれ量とずれ方向に基いて顕微鏡の対物レンズと観察対象を載置したステージとの相対位置を駆動制御し、対物レンズと観察対象との位置ずれを補正するので、光学顕微鏡あるいは走査型レーザ顕微鏡等において、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る試料である観察細胞ＯＣの観察視野ＯＦにおける位置関係を例示する図。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係る画像データにおける観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣと観察視野ＯＦの中心ＣＯＦを示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係る画像所得時間間隔と位置ずれの補正時間間隔の関係を例示した図。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図６】本発明の第３の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図７】本発明の第４の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図８】本発明の第４の実施の形態に係る試料である観察細胞ＯＣの画像を示す図。
【図９】本発明の第４の実施の形態に係る光軸方向の位置に対するコントラスト値の変化を示す図。
【図１０】従来例に係る一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図。
【図１１】従来例に係る２次元走査の原理を説明するための図。
【図１２】従来例に係る観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示する図。
【符号の説明】
２１…光学顕微鏡本体
２１１…スキャニングステージ
２１３…試料
２２…テレビカメラ
２３１，２３２，２３３…信号処理部
２３ａ…Ａ／Ｄ変換器
２３ｂ…記憶部
２３ｃ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｄ…重心検出部
２３ｅ１，２３ｅ２，２３ｅ３…ＣＰＵ
２３ｆ…距離換算部
２３ｇ…ＸＹ駆動部
２３ｈ…利得可変部
２３ｉ…オフセット調整部
２３ｊ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｋ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｌ…２次元走査駆動制御部
２３ｍ…Ａ／Ｄ変換器
２３ｎ…記憶部
２３ｏ…記憶制御部
２３ｐ…記憶制御部
２３ｑ…コントラスト算出部
２３ｒ…Ｚ駆動部
２４…表示部
２５…画像記録部
３１…レーザ顕微鏡本体
３２…レーザ光源
３３…２次元走査機構部
３４…ピンホール板
３５…光検出部
４１…光路分割部
４２…テレビカメラ
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学顕微鏡や走査型レーザ顕微鏡に適用され、観察対象を画像表示する顕微鏡画像観察装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡は、ステージ上に搭載したプレパラート上の試料を対物レンズで拡大して観察する構成となっており、一般に試料への照明としてランプなどの光源からの光をコンデンサレンズを用いて試料の観察領域全体に均等になるように照射する構造を採用している。通常、接眼レンズを介して像の観察を行なうが、画像の簡単な観察、記録を行なえるようにテレビカメラで撮影し、モニタディスプレイで観察する方法が一般的となっており、近年はテレビカメラの解像度も向上して鮮明に観察を行なうことも可能となった。
【０００３】
このように観察画像をデータとして扱うことで、顕微鏡の接眼レンズを覗き込む動作が不要となり、特に試料として生物の培養細胞などの画像をモニタディスプレイにて長時間観察することができる。また、観察している画像をビデオテープレコーダにより容易に記録することもできる。
【０００４】
そして、さらに画像の観察を高い分解能でコントラストよく行ないたい場合に、光学顕微鏡による観察では照明系としてフレア等の問題があり、また特に低コントラストの試料を観察する際に得られる画像が大変見づらいものになるという不具合が発生する。これを改善するものとして、点状光投射型（スポット光投射型）の走査型光学顕微鏡が提案されている。
【０００５】
この走査型光学顕微鏡は、高輝度の光を光源から対物レンズを介して試料へ点状に照射し、試料からの反射光、もしくは点状の光を照射したことで試料から発生する蛍光を、再び対物レンズ及び光学系を介して点状に結像し、その光をピンホール開口を有する検出器で検出して像の濃度情報を得るようにしたものである。
【０００６】
ただし、これだけでは点状光源が照射されたことによる１点の濃度情報しか得られないため、試料をＸ軸、Ｙ軸の方向にそれぞれ移動して二次元平面内で機械的に移動させるＸ−Ｙ走査方式を用いたり、光路の走査をＣＲＴディスプレイなどの画像表示装置の画面走査と同期させることで、Ｘ−Ｙ走査に対応した上記濃度情報の信号の強度を表示し、画像として観察できるようにしている。
【０００７】
以上が走査型光学顕微鏡の原理構成であり、光源としてレーザ光を使うと画像の解像が向上することが広く知られており、実際に光源としてレーザ光を用いたものは走査型レーザ顕微鏡と呼称されている。
【０００８】
この走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査することにより生じる試料の反射光または蛍光を、検出器である光電子増倍管やフォトダイオードなどで光電変換により電気信号に変換し、画像データとして保存、加工、表示する構成をなしている。
【０００９】
図１０は、一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図である。
図１０において、１１は光学顕微鏡本体であり、レーザ光源１２を用いてこの光学顕微鏡本体１１の顕微鏡ステージ１１１上の試料１１２表面にレーザ光によるスポット光を照射させる。実際には、試料１１２表面上をＸＹ走査するために、レーザ光源１２からのレーザ光に対し、２次元走査機構部１３が対物レンズ１１３に対するスポット光の光路をＸＹ光路にそれぞれ振らせることになる。
【００１０】
図１１は、２次元走査の原理を説明するための図である。図１１では、Ｘ，Ｙ方向の各ガルバノミラーＧＭ１，ＧＭ２の２枚を使った場合のＸＹ走査部の概略例を示しており、テレビジョン方式で用いられる所謂ラスタスキャンを実現している。スポット光を照射した結果、試料から得られる反射光または蛍光は、光学顕微鏡本体１１の対物レンズ１１３を通り、２次元走査機構部１３を介してピンホール板１４を通過した後、光検出部１５で受光され、その輝度に応じた電気信号に光電変換される。
【００１１】
上記ピンホール板１４は、所定径のピンホールが開孔され、光検出部１５の前面の結像位置に配置されるもので、ピンホールを通過した光を検出することで試料面上の観察点で合焦している情報のみを検出でき、共焦点効果が得られるようになる。なお、２次元走査機構部１３を駆動する場合には、後述する信号処理部１６内のＣＰＵ１６ｆから走査制御信号が発生され、同時にＣＰＵ１６ｆで前記走査制御信号を基準にデータ処理が行なわれる。
【００１２】
そして、光検出部１５で検出された電気信号は、信号処理部１６にて画像処理され、画像信号化されてモニタディスプレイである表示部１７に送られ、この表示部１７にて表示出力される。
【００１３】
次に、上記信号処理部１６にて行なう信号処理の内容を詳述する。光検出部１５で得た電気信号について、まず利得可変部１６ａで所望の電圧値となるように信号増幅を行ない、次にオフセット調整部１６ｂにて所望のオフセット量の増減を行なう。そのオフセット量は、ＣＰＵ１６ｆによりＤ／Ａ変換器１６ｈ，１６ｇを用いて所望の値に設定される。
【００１４】
オフセット調整部１６ｂで得られた信号は、次にＡ／Ｄ変換器１６ｃにてデジタル化された後、記憶部１６ｄに画像データとして一時記憶される。記憶部１６ｄに記憶された画像データは、その後ＣＰＵ１６ｆにより適宜加工、表示、保存される。すなわち、加工とはＣＰＵ１６ｆにより所望の画像処理を行なうことであり、表示とは記憶部１６ｄから読出した画像データをＤ／Ａ変換器１６ｅにてアナログ化した後に上記表示部１７に表示し、画像を観察することである。
【００１５】
また特に、併せて試料の深さ方向の情報つまり３次元情報が必要な場合には、Ｚ走査駆動部１６ｊによりステージ１１１を所望のＺ位置へ移動させ、必要な画像を順次記憶部１６ｄに構築させることにより、３次元画像の表示、観察も可能となる。
【００１６】
上記のような走査型レーザ顕微鏡では、異なる画像観察システムであっても、同じ顕微鏡鏡体を使用しているため、鏡体の性能が及ぼす影響は共通である。一般に、顕微鏡の鏡体は金属の材質で作られており、熱による鏡体自身の伸縮の影響がある。金属は、材質により固有の熱収縮率を持ち、温度の変化により収縮伸長をする。環境温度にもよるが、顕微鏡鏡体の熱安定まで数時間程度かかることがよくある。また、外部温度が変化するとさらに多くの安定時間を要する。この影響は通常の観察では目立たないが、高倍率及び長時間の画像観察においては、観察画像の位置が視野からずれる要因となる。
【００１７】
図１２は、観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示するもので、図１２（ａ）は観察視野ＯＦのほぼ中心に観察細胞ＯＣが位置している状態、図１２（ｂ）は顕微鏡鏡体の熱収縮により観察細胞ＯＣが観察視野ＯＦの中心ＣＯＦから大きく外れている状態を示す。具体的には、例えば１００倍観察において視野が２０ｍｍである場合、試料が数十μｍずれることで視野中心から外れることとなる。これは、顕微鏡鏡体に約１０℃の温度変化が生じたことで実際に起こり得るものである。
【００１８】
上記温度変化による熱収縮が生じる主な原因として、ランプ照明からの熱伝導、顕微鏡内部に配置されているユニット、例えばＩＣ、モータ等の電気部品からの熱、及び周囲の環境温度変化等が挙げられる。また、この収縮現象は、顕微鏡の鏡体の形、ユニット構成、材質等に影響を受けるものであって、一概にどのように変化するかを容易に知ることはできない。
【００１９】
このような不具合を解消し、画像の取込み状態を改善して見易い画像を取得するシステムが従来よりいくつか提案されている。例えば特開平９−１３８３５３号公報には、一般的にレーザ顕微鏡の画像を取得するシステムが開示されている。このシステムでは、画像の明るさの調整を行ない見易くした画像を取得しており、より詳しくは、見やすい画像を得るために画像の明るさ成分に関して最適な調整を行なっている。
【００２０】
また、特開平９−１９７２８７号公報では、レーザ顕微鏡のシステムにおいて、標本の位置を所定の視野内に位置させることを目的としている。そして、接眼レンズから見ることのできる観察画像範囲位置とモニタ画面に表示される範囲とがずれることがあるため、ステージの位置を再調整して観察視野内に合わせるようにしている。この手法として、入力手段により表示画面上で指定された位置に対応するようステージを制御し、ＸＹ移動させることで観察視野の中心に位置させている。また、位置の入力手段としては、表示画面上にタッチパネルを設けたり、あるいは表示画面にファンクションスイッチを設けたりしている。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
上記特開平９−１３８３５３号公報のシステムは、一般的なレーザ顕微鏡の画像を取得するものであり、画像の明るさの調整を行なって見やすい画像を取得している。しかしながら、画像の明るさ成分に関しての調整のみしか行なっておらず、位置のずれについては何ら補正が行なわれていない。
【００２２】
また、上記特開平９−１９７２８７号公報においては、モニタ画面を見ながら画像のずれを手動操作により指定し、ずれ補正を行なっている。そのため、画像を観察する毎に同様の操作を行なう必要があり、その操作が煩雑となる。また、長時間にわたる観察においては、顕微鏡鏡体の変形に伴なって観察像位置がずれ、次の画像取込み及び観察操作の際には観察対象が観察視野から大きく外れてしまい、再度観察対象を画像から探さなければならない。このため、観察者は常に監視を続行しなければならない。
【００２３】
これは、基本的に接眼レンズからの観察画像と走査して得たモニタ画像との位置ずれの補正が、初期状態にしか対応していないことに起因するもので、顕微鏡鏡体の熱変形が生じたときの観察画像の位置ずれは、その度毎に手動で補正せざるを得ない。
【００２４】
本発明の目的は、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能な顕微鏡画像観察装置を提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、顕微鏡で得た画像を観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記画像中の観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備したことを特徴とする。
【００２６】
このような構成とした結果、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００２７】
請求項２記載の発明は、観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から画像を構築して観察するための顕微鏡画像観察装置であり、前記光信号を検出する検出機構とは別に設けられ、前記画像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段で得た前記画像中の前記観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、を具備し、前記制御手段により前記平面方向及び前記観察光軸方向の位置ずれを補正した状態で前記スポット光の走査による画像構築を行うことを特徴とする。
【００２８】
このような構成とした結果、特に走査型レーザ顕微鏡等で、観察画像を得るためのレーザ光源や２次元走査機構を用いることなしに、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合でも、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、無駄な電力消費を抑え、レーザ光源の長寿命化を図りながら、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００２９】
請求項３記載の発明は上記請求項１または２記載の発明において、前記算出手段が、算出したずれ量及びずれ方向の少なくとも一方を、顕微鏡鏡体の熱変形に係る情報を基に補正することを特徴とする。
【００３０】
このような構成とした結果、上記請求項１または２記載の発明の作用に加えて、顕微鏡鏡体に熱変形による平面方向または観察光軸方向の位置ずれが発生した場合であっても対物レンズの合焦範囲を考慮してこれを補正することができる。
【００３１】
請求項４記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第１の位置情報は前記観察対象の重心位置であり、前記基準位置は前記画像の中心位置であることを特徴とする。
【００３２】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、顕微鏡の顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の中心に位置するようにして表示させることが可能となる。
【００３３】
請求項５記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記画像のコントラスト値であることを特徴とする。
【００３４】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、画像のコントラスト値を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
【００３５】
請求項６記載の発明は上記請求項１乃至３記載の発明において、前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記対物レンズと前記ステージとの相対位置であることを特徴とする。
【００３６】
このような構成とした結果、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の発明の作用に加えて、演算処理を行なうことなく、前記対物レンズと前記ステージとの相対位置を基に観察光軸方向の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれを補正し、合焦位置のずれていない観察画像を得ることが可能となる。
請求項７記載の発明は請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、観察当初における前記第一の位置情報は操作者によって設定されることを特徴とする。
請求項８記載の発明は請求項１記載の発明において、前記顕微鏡画像観察装置は、前記観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から前記画像を構築して観察する走査型レーザ顕微鏡であることを特徴とする。
【００３７】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００３８】
図１は、光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。光学顕微鏡本体２１には、観察画像のＸＹ平面方向に移動可能なスキャニングステージ２１１が設けられ、画像観察用のテレビカメラ２２が取付けられている。テレビカメラ２２で得たステージ２１１上の試料２１３の画像信号は、信号処理部２３１とモニタディスプレイからなる表示部２４へ送られる。
【００３９】
信号処理部２３１では、テレビカメラ２２で得た画像信号をＡ／Ｄ変換器２３ａによりデジタル化した後、記憶部２３ｂに記憶させる。この記憶部２３ｂに記憶された画像信号は、Ｄ／Ａ変換器２３ｃで読出されて再びアナログ化された後、表示部２４とビデオテープレコーダからなる画像記録部２５へ送られる一方、重心検出部２３ｄでも読出され、特定の画像処理、すなわち観察視野中の観察対象である試料２１３における重心位置の算出がなされる。
【００４０】
なお、ＣＰＵ２３ｅ１の有する図示しないメモリには、後述する光学顕微鏡本体２１の鏡体の熱変形によって生じる位置ずれを補正するための補正処理情報が記憶されている。
【００４１】
さらに、重心検出部２３ｄでは、求めた重心位置と観察視野の中心位置とのなす距離及び方向をずれ情報として算出し、その算出結果により距離換算部２３ｆが、その時点での光学顕微鏡本体２１における対物レンズの倍率等を考慮し、実際のＸ，Ｙ各方向の移動量に換算し、ＸＹ駆動部２３ｇへ送る。ＸＹ駆動部２３ｇでは、距離換算部２３ｆから送られてくる情報に基いて、光学顕微鏡本体２１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ各方向へ駆動して移動させ、試料２１３の重心位置と観察視野の中心位置とを一致させる。
【００４２】
なお、記憶部２３ｂでの画像信号の記憶、重心検出部２３ｄでの重心位置の算出、距離換算部２３ｆでのずれ状態の算出、及びＸＹ駆動部２３ｇでのスキャニングステージ２１１の駆動は、すべてＣＰＵ２３ｅ１の駆動制御によりなされる。表示部２４では、テレビカメラ２２から直接送られる画像信号、あるいは信号処理部２３１のＤ／Ａ変換器２３ｃから出力される画像信号の一方を、モニタ画面で表示する。また、画像記録部２５は、表示部２４を介して送られてきた画像信号あるいはＤ／Ａ変換器２３ｃからの画像信号を順次記録する。
【００４３】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。テレビカメラ２２により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部２３１にて画像処理される。すなわち、まずＡ／Ｄ変換器２３ａにおいてデジタル化され、画像データとして記憶部２３ｂに記憶される。この記憶部２３ｂに記憶された画像データを用いて、重心検出部２３ｄで観察対象となる試料の重心が求められる。
【００４４】
図２は、試料である観察細胞ＯＣの観察視野ＯＦにおける位置関係を例示する図である。図２に示すように、観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣと観察視野ＯＦの中心ＣＯＦとが大きく離れており、観察細胞ＯＣが観察視野ＯＦ中の外れた位置にあることがわかる。なお、観察当初の観察位置の設定に関しては、必ずしも自動で重心位置を求めずとも、重心もしくは画像中心と思われる位置を観察者が表示部２４を見て視野中心となるよう設定してもよい。
【００４５】
次に、観察を開始してからの時間経過に伴ない、光学顕微鏡本体２１に生じる顕微鏡鏡体の熱変形に起因した位置ずれの補正処理について説明する。信号処理部２３１では、ＣＰＵ２３ｅ１が一定の時間間隔で順次更新記憶されている記憶部２３ｂの画像データを重心検出部２３ｄに読出し、観察対象となる試料の重心位置を自動算出させる。そして重心検出部２３ｄは、算出した重心位置と視野の中心位置との画素差を求め、求めた画素差を続く距離換算部２３ｆで移動距離に換算する。
【００４６】
図３は、上記画像データにおける観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣの位置と観察視野ＯＦの中心ＣＯＦの位置との関係を示す図である。距離換算部２３ｆは、図３に示すように重心検出部２３ｄで求められた画素差Ｌｘ，Ｌｙを実際の移動距離に換算する。ここで実際の移動距離とは、観察している対物レンズの倍率により決まる実寸法であり、それがスキャニングステージ２１１の移動量Ｓｘ，Ｓｙとなる。
【００４７】
例えば、使用するテレビカメラ２２がアスペクト比４：３、縦横の画素数６４０×４８０ドット（正方格子画素）の画像信号を出力するものとし、観察視野の対角線距離が２０ｍｍであったとすると、対物レンズの倍率が１倍のときの観察視野ＯＦの横、縦の距離は、それぞれ
（横） ２０×４÷５＝１６ｍｍ
（縦） ２０×３÷５＝１２ｍｍ
となり、これを１画素間あたりの距離に換算すると、
（横縦共） １６ｍｍ÷６４０＝２５μｍ
となる。
【００４８】
もし、対物レンズの倍率が１０倍の観察で、そのずれ量が画素数Ｌｘ＝２０画素、Ｌｙ＝１０画素であったとすると、
Ｓｘ＝２５×２０÷１０＝５０［μｍ］
Ｓｙ＝２５×１０÷１０＝２５［μｍ］
となり、これが距離換算部２３ｆで換算されてＸＹ駆動部２３ｇに送られる。ＸＹ駆動部２３ｇでは、この送られてきた情報に基いて光学顕微鏡本体２１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ方向に移動させ、観察対象の試料である観察細胞ＯＣの中心ＣＯＣを観察視野ＯＦの中心ＣＯＦに一致させる。
【００４９】
なお、上記位置補正処理において、実際には光学顕微鏡本体２１から送られる対物レンズの倍率の情報をＣＰＵ２３ｅ１が読取り、その情報を重心検出部２３ｄに与えることで移動量を得ることができる。
【００５０】
以上の処理により移動制御された後の画像は、観察対象が正確に視野の中心に位置することとなり、Ｄ／Ａ変換器２３ｃにてアナログ化された後、表示部２４に表示、あるいは画像記録部２５に記録される。なお、Ｄ／Ａ変換器２３ｃから得た画像信号に代えて、テレビカメラ２２で得た画像信号を直接表示部２４に表示、あるいは画像記録部２５に記録するものとしてもよい。
【００５１】
また、上記位置ずれの補正処理を実行する補正処理情報、ここでは時間間隔は、実際の光学顕微鏡本体２１の鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能であるものとする。
【００５２】
図４は、ＣＰＵ２３ｅ１のメモリに記憶されている画像取得時間間隔をＴ１、位置ずれの補正時間間隔をＴ２（Ｔ１＞Ｔ２）とした場合の、両者の関係を例示した図である。上記補正処理は、画像取得から次の画像取得までの間に行なわなければならないため、図４に示すように、時間Ｔ１内で１回あるいは時間間隔Ｔ２毎に複数回位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。
【００５３】
また、リアルタイムで常に補正処理を行ない観察対象を視野の中心に置きたい場合、テレビカメラ２２の１画面の露光時間に同期して、例えばテレビジョン方式がＮＴＳＣ方式であれば１／３０秒間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【００５４】
一般に、顕微鏡鏡体の熱変形の速度は十分に遅いものであるため、上記のような補正処理に要する処理時間も十分確保することができ、見やすい位置にある所望の観察が可能である。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取込み速度により制限される。
【００５５】
以上の動作により、初期の設定を行なうのみで、その後は顕微鏡鏡体に熱変形を生じた場合であっても、自動的に長時間にわたって常に観察対象が視野の中心に位置するようにでき、画像を観察、記録することが可能となる。
【００５６】
また、画像記録部２５はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ２２のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【００５７】
さらに、上述した補正処理のための情報として、所望の時間間隔で得る熱変形の速度等の情報を用いる他に、顕微鏡鏡体の温度を逐一検出することができる温度センサを鏡体に設け、その温度センサの検出結果を基に、実際の鏡体の熱変形に応じて位置ずれを補正処理するようにしてもよい。
【００５８】
（第２の実施の形態）
以下、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００５９】
図５は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図５の基本構成は上記第１の実施の形態に示した図１と同様であるため、図１と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【００６０】
図５において、３１はレーザ顕微鏡本体であり、レーザ光源３２から発振されたレーザ光は、必要に応じて光ファイバを介してレーザ顕微鏡本体３１に導かれ、対物レンズを通り、そのスポット光が観察光軸と直交する観察画像のＸＹ平面方向に移動可能なスキャニングステージ２１１上に載置された試料２１３表面に照射される。
【００６１】
２次元走査機構部３３は、後述する信号処理部２３２内の２次元走査駆動制御部２３ｌが発生する走査制御信号により試料２１３に対してＸＹ走査するものであり、具体的には上記図１２で例示したように、２枚のガルバノミラーを用いてＸ方向とＹ方向へ走査し、レーザ光をラスタスキャンする。
【００６２】
そして、試料２１３にスポット光を照射した結果得られる試料２１３からの反射光または蛍光を、レーザ顕微鏡本体３１の対物レンズを介して図示しない光路分割部により光路分割する。その分割された一方の光を、２次元走査機構部３３を介してピンホール板３４を通過させた後、一般に光電子増倍管（ＰＭＴ）で構成される光検出部３５にて輝度に応じた電気信号に光電変換する。
【００６３】
ピンホール板３４は、所定径のピンホールを開孔したものであり、光検出部３５の前面の結像位置に配置される。ピンホール板３４を通過した光を光検出部３５で検出することにより、試料面上の観察点での合焦により得た情報のみを検出でき、共焦点効果が得られる。光検出部３５で変換された電気信号は、信号処理部２３２において画像処理され、得られた画像信号が表示部２４で表示されるとともに、画像記録部２５で記録される。
【００６４】
信号処理部２３２では、まず光検出部３５で得た電気信号を利得可変部２３ｈにて所望の増幅率により増幅し、次に増幅した電気信号についてオフセット調整部２３ｉで所望分だけオフセット量の増減を行なう。これらの設定量は、ＣＰＵ２３ｅ２がそれぞれＤ／Ａ変換器２３ｊ，２３ｋに所望の値を可変設定することで決められる。そして、オフセット調整部２３ｉから出力された信号がＡ／Ｄ変換器２３ａに送られてデジタル化され、順次記憶部２３ｂに書込まれる。
【００６５】
この記憶部２３ｂでのアドレス指定はＣＰＵ２３ｅ２により行なわれる。ＣＰＵ２３ｅ２は、２次元走査駆動制御部２３ｌの制御による２次元走査機構部３３での走査に同期して、記憶部２３ｂに１画面分の信号を画像データとして記憶させる。
【００６６】
次に、本顕微鏡画像観察装置の動作について説明する。まず、２次元走査機構部３３によりレーザ光源３２からのレーザ光を試料２１３表面に走査し、得られた反射光または蛍光を順次ピンホール板３４を介して光検出部３５で検出する。光検出部３５では検出した光に対して光電変換を行ない、信号処理部２３２の利得可変部２３ｈ及びオフセット調整部２３ｉでその電気信号の振幅及びオフセット値の調整をした後、Ａ／Ｄ変換器２３ａでデジタル化して記憶部２３ｂに記憶する。
【００６７】
この記憶部２３ｂに記憶された１画面分の画像に対して画像処理が実行されるが、その画像処理の内容自体は上記第１の実施の形態と同様であるので説明を省略する。そして、常に観察対象となる試料の重心位置が観察視野の中心位置と一致するよう、ＸＹ駆動部２３ｇによりレーザ顕微鏡本体３１のスキャニングステージ２１１を自動的に移動させる。
【００６８】
一般的にレーザ顕微鏡の場合、画像取得の方法としてはＸＹＴスキャン、ＸＹＺＴスキャンといった時間経過を観察する方法があり、上記第１の実施の形態の場合と同様に長時間観察が必要である。したがって、このようなレーザ顕微鏡の画像取込みモードにおいても適切な位置補正を行なうことで、良好な画像の確実な取得が可能となる。
【００６９】
（第３の実施の形態）
レーザ顕微鏡で画像を取得するためには、レーザ光源、２次元走査機構部といった主要部分を動かす要素が必須となり、多大な電力を消費する。これに対してテレビカメラで画像を得る場合は、かかる消費電力がはるかに少ないという利点がある。また、特にレーザ顕微鏡で用いられる気体レーザは、一般的に固体レーザに比べて寿命が短い。したがって、顕微鏡画像観察装置において画像の条件を抽出する間は、レーザ光による走査を一時的に停止し、電源を切断しておくことが望ましい。
【００７０】
これは、画像の位置ずれに対する補正処理を実行する場合も同様であり、やはりレーザ光による走査にかかる停止作業が必要とされる。そのため、画像の位置ずれの検出に関してはテレビカメラの画像を使い、実際に記憶したい顕微鏡画像としてレーザ光の走査で得た画像を記憶するという使い方を行なえば、必要な電力消費を充分低く抑えることができる。
【００７１】
以下、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。本第３の実施の形態では、レーザ光の走査により顕微鏡画像を取得する時間間隔が長い場合に、必要時以外はレーザ光の走査に係る回路の電源を一時的に切断し、その間に複数回テレビカメラで画像を得て、位置ずれの補正処理を行なう。
【００７２】
図６は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図６の基本構成は上記第２の実施の形態に示した図５と同様であるため、図５と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。
【００７３】
図６において、２次元走査機構部３３の対物レンズ側には光路分割部４１が設けられ、レーザ光の走査を行なっていない状態では、この光路分割部４１により観察対象となる試料２１３の光像をテレビカメラ４２に導く。テレビカメラ４２により撮像された観察対象の画像信号は、信号処理部２３３内のＡ／Ｄ変換器２３ｍでデジタル化された後に記憶部２３ｎに記憶される。この記憶部２３ｎは、記憶制御部２３ｏの制御に基いて送られくる画像信号を記憶し、記憶部２３ｎに記憶される画像に基いて、重心検出部２３ｄが観察視野中における観察対象となる試料の重心位置を検出する。
【００７４】
そして、レーザ光の走査により得られた顕微鏡画像の記憶部２３ｂへの記憶は記憶制御部２３ｐにより、またテレビカメラ４２で得られた画像の記憶部２３ｎへの記憶は記憶制御部２３ｏにより、それぞれ制御される。ＣＰＵ２３ｅ３では、光路分割部４１を切換えるとともに、これら記憶制御部２３ｐ，２３ｏを統括制御して、記憶部２３ｂと記憶部２３ｎのいずれか一方で顕微鏡画像を記憶するよう切換制御する。
【００７５】
このような構成とすることにより、試料の観察を行なう場合には、レーザ光源３２で発振したレーザ光を２次元走査機構部３３で当該試料の表面に走査しながら照射する。そして、光路分割部４１を光検出部３５側に切換えることで、試料２１３から得られた反射光あるいは蛍光はピンホール板３４を通過し、光検出部３５で検出される。
【００７６】
光検出部３５は、検出した光を順次電気信号に光電変換し、その電気信号は利得可変部２３ｈ，オフセット調整部２３ｉを介してＡ／Ｄ変換器２３ａでデジタル化され、記憶制御部２３ｐの制御により記憶部２３ｂに記憶され、適宜Ｄ／Ａ変換器２３ｃを介して表示部２４で表示出力される。
【００７７】
一方、上述した観察の合間に観察視野の位置ずれの補正処理を行なう場合には、光路分割部４１をテレビカメラ４２側に切換え、試料の画像を光路分割部４１を介してテレビカメラ４２で撮像する。テレビカメラ４２で得られた画像信号は、Ａ／Ｄ変換器２３ｍでデジタル化され、記憶制御部２３ｏの制御により記憶部２３ｎに記憶される。
【００７８】
この記憶部２３ｎに記憶された画像に基いて、重心検出部２３ｄは試料の重心位置を算出し、さらにその重心位置と観察視野の中心とのずれ量を座標値で算出し、その結果を距離換算部２３ｆに送出する。距離換算部２３ｆでは、送られてきたずれ量の情報と対物レンズの倍率とから上記第１の実施の形態で説明したようにＸＹ各方向のずれ量の示す各距離を算出し、その算出結果をＸＹ駆動部２３ｇに出力する。ＸＹ駆動部２３ｇは、この距離換算部２３ｆからの距離値に応じてレーザ顕微鏡本体３１のスキャニングステージ２１１をＸ，Ｙ各方向に移動させる。これにより、レーザ顕微鏡本体３１の鏡体に熱変形等が生じた場合であっても、観察視野の中心に確実に試料の重心が位置し、試料を観察視野の中央で観察することができるようになる。
【００７９】
（第４の実施の形態）
上記第１乃至第３の実施の形態では、いずれも位置ずれの補正処理として観察光軸に直交するＸＹ平面に沿ってステージの移動を行なうものとしたが、観察光軸と平行したＺ方向へも位置ずれが生じることがある。この問題は、自動合焦機能を有する顕微鏡であれば、後述するようにＺ方向の補正処理をＸＹ方向の補正処理と並列して実行することで解決できる。これにより、特に焦点深度の浅い対物レンズを使用するような場合であっても、確実に試料の高さ方向の変化に対応させ、常に合焦を得ることができる。
【００８０】
顕微鏡において観察者が観察する際に、ＸＹ方向の位置を決める調整操作を行なうとともに、Ｚ方向の合焦位置を決める。具体的には、ステージのＸＹ操作、Ｚ操作を行ない所望の位置を確定することで、ＸＹ観察位置合わせと合焦を行なう。これは、一般的に行なわれている位置合わせである。したがって、ＸＹ方向の位置決めにより観察重心位置を決め、Ｚ方向の位置決めにより合焦位置を決めることになる。本第４の実施の形態では、このときのＺ方向の合焦位置をＺ０とし、この状態で撮像された初期画像のコントラスト値を合焦位置ずれ補正の基準とする。
【００８１】
以下、本発明の第４の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００８２】
図７は、レーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図である。図７の基本構成は上記第３の実施の形態に示した図６と同様であるため、図６と同一な部分に同一符号を付してその説明を省略する。本第４の実施の形態では、観察光軸方向（Ｚ方向）の位置ずれ、すなわち合焦位置ずれに関して、そのずれ量を以下の処理にて補正し、合焦位置で撮像した初期の観察画像に対して合焦位置のずれていない観察画像を得ることを可能とする。
【００８３】
図７において、コントラスト算出部２３ｑは、記憶部２３ｎに記憶された観察対象の初期の画像のコントラスト値を、該初期画像の各周辺画素間の差分値を用いて算出する。
【００８４】
図８は、試料である観察細胞ＯＣの画像を示す図である。図８において、８１，８２は、それぞれコントラスト値算出用のＸ，Ｙラインを示している。コントラスト算出部２３ｑは、図８に示す画像におけるＸＹ平面内でのＸライン８１とＹライン８２の輝度の差分値の絶対値の和をコントラスト値とする。この場合、Ｘライン８１，Ｙライン８２でのコントラスト値とＺ位置でのコントラスト値は、以下のようになる。
【００８５】
ＣＸ＝Σ｜Ｄ（Ｘｎ，Ｙｋ）−Ｄ（Ｘｎ＋１，Ｙｋ）｜2 …（１）
ＣＹ＝Σ｜Ｄ（Ｘｋ，Ｙｎ）−Ｄ（Ｘｋ，Ｙｎ＋１）｜2 …（２）
ＣＺ＝ＣＸ＋ＣＹ …（３）
ここで、Ｘｎ，Ｙｎは画像中の各画素の位置を示し、Ｄ（Ｘｎ，Ｙｎ）はＸｎ，Ｙｎ位置での画像の輝度を示す。また、ｋは任意の画像位置である。（１），（２）式に示すＣＸ，ＣＹは、Ｘ，Ｙラインでのコントラスト値、（３）式に示すＣＺは最終的なＺ位置でのコントラスト値であり、ＣＸとＣＹを加算することによりＺ位置でのコントラスト値ＣＺを求める。
【００８６】
図９は、光軸方向の位置（Ｚ位置）に対するコントラスト値の変化を示す図である。前述したようにコントラスト算出部２３ｑによりＺ位置でのコントラスト値を求めた後、光軸方向の位置ずれの補正を行なう。この場合、今回取得した画像に対して、同様にコントラスト算出部２３ｑでコントラスト値（Ｚｎの位置でのコントラスト値）を算出し、前回取得した初期画像のコントラスト値（合焦位置Ｚ０でのコントラスト値）と比較する。
【００８７】
これら二つのコントラスト値が異なれば合焦位置がずれているため、ＣＰＵ２３ｅ３は以下のようにＺ駆動部２３ｒでステージ２１１を光軸方向で移動させ、前記二つのコントラスト値が一致する光軸位置すなわち合焦位置Ｚ０を探す。すなわち、光軸方向の位置ずれ補正処理の際に上記二つのコントラスト値が異なる場合、今回取得したコントラスト値が合焦位置Ｚ０のときの値と一致するようにステージ２１１をＺ方向で動かす。
【００８８】
まずＣＰＵ２３ｅ３は、標本２１３と対物レンズの衝突を防ぐため、初めにそれらが離れる方向へＺ駆動部２３ｒによりステージ２１１を移動する。この移動量は、使用している対物レンズの焦点深度量のステップに合わせる。これは、焦点深度内でステージ２１１を動かしても、合焦範囲内であるため変化を認識できないからである。
【００８９】
このとき、ステージ２１１を２または３ステップ移動してコントラスト値が大きくなるなら、合焦位置のコントラスト値に至るまで、同じ方向で移動を続け合焦点に合わせる。もし、コントラスト値が小さくなるなら、合焦点からずれてゆくので、ステージ２１１を逆方向へ移動し、合焦位置に到達するようＺ方向の位置合わせを行なう。このＺ方向の位置ずれ補正処理を行なう時間間隔は、実際の顕微鏡鏡体の熱変形の速度により異なるが、所望の時間間隔を設定可能である。
【００９０】
なお、画像取得時間と位置補正時間の関係については、第１の実施の形態の説明で用いた図４と同様であり、例えば、画像取得時間（Ｔ１）に対し、位置ずれ補正時間（Ｔ２）とした場合（Ｔ１＞Ｔ２）、位置補正は次の画像取得までの間に行なわれなければならないため、Ｔ１内にＴ２の時間間隔で複数回（あるいは１回）位置ずれ補正を行なうよう設定すればよい。また、リアルタイムで常に補正処理を行ない、観察位置を中心に置きたい場合、テレビカメラの１画面の露光時間に同期して例えば１／３０ｓ間隔で補正処理を行なうことも可能である。
【００９１】
一般に、通常の熱変形の速度は十分に遅いため、処理時間も十分確保でき、所望の観察が可能になる。ただし、全体の処理時間は、入力画像の取り込み速度に制限される。以上により、初期の設定を行なうのみで、その後は自動でＺ方向の位置ずれ補正を行ない長時間の画像記録が可能となるため、観察に係る作業効率が向上する。
【００９２】
また、Ｚ方向の位置ずれ補正を画像のコントラスト値を基に行なうのでなく、対物レンズとステージの相対距離を基に行なうようにしてもよい。この場合、顕微鏡本体に対物レンズとステージの相対距離を測定するセンサを設け、このセンサで測定される相対距離をＣＰＵ２３ｅ３で検出する。そしてＣＰＵ２３ｅ３は、補正処理時に、検出した相対距離と初期の合焦時における相対距離とが一致するよう、Ｚ駆動部２３ｒによりステージ２１１を光軸方向で移動させる。
【００９３】
また、画像記録部２５はビデオテープレコーダからなるものとしたが、その他にもパーソナルコンピュータを介した記録媒体、例えば光磁気ディスク、ハードディスク等を用いて記録するものとしてもよい。また、テレビカメラ２２のサイズ、信号方式には制限はなく、解像度の高いものであれば、位置合わせを行なう精度がより高くなることは言うまでもない。また、テレビカメラを複数用いて、一度に複数の画像を得るようにしてもよい。
【００９４】
一般的にレーザー顕微鏡の場合、ＸＹＴスキャン、ＸＹＺＴスキャンといった方法により時間経過に応じて画像を取得し観察をするため、長時間の観察が必要となる。しかし、以上このようなレーザ顕微鏡の画像取り込みモードによれば、適切な位置補正を行なうことで、長時間による良好な画像の取得が可能となる。これにより、ＸＹ方向すなわち平面方向だけでなく、光軸方向の合焦ずれも補正され、長時間において観察位置がずれない画像を取得できる。
【００９５】
なお、本発明はその要旨を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することが可能であるものとする。
【００９６】
（変形例）
上記各実施の形態では示さなかったが、当然ながらレーザ顕微鏡システムでは、透過検出画像に関しても同様の処理を実行することができる。また、複数の画像に対しても同様の位置ずれの補正処理を行なうことが可能である。その場合の構成は上記各実施の形態と同様で、異なる波長の蛍光画像を同時または時分割により記憶部２３ｎに記憶する。そして、複数の蛍光画像に対してそれぞれ位置ずれの補正処理を行ない、全ての画像に対して補正処理を終了した後、表示部２４にてマルチ画像を表示させる。
【００９７】
さらに、上記第２〜４の実施の形態では、光検出部３５を光電子増倍管（ＰＭＴ）で構成するものとして説明したが、これに限らず、フォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤ、ＣＭＤ等の光電変換の効率が良いものであれば他の素子を用いてもよい。また２次元走査機構部３３は、ガルバノミラーや、共振ガルバノミラー、ポリゴンミラー、あるいはＡＯＤでもよく、要はＸＹの走査が制御できればよい。また、上述した位置合わせの処理は、ハードウェアとソフトウェアのどちらでも実現可能である。
【００９８】
【発明の効果】
本発明のようにすれば、任意に設定された時間間隔後の、画像に係る平面方向の基準位置に対する第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び画像に係る観察光軸方向の基準値に対する第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出し、これらずれ量とずれ方向に基いて顕微鏡の対物レンズと観察対象を載置したステージとの相対位置を駆動制御し、対物レンズと観察対象との位置ずれを補正するので、光学顕微鏡あるいは走査型レーザ顕微鏡等において、顕微鏡鏡体に熱変形が生じた場合であっても、観察者が煩雑な操作を行なうことなしに、常に対象画像を観察視野の基準位置に位置するようにして表示させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る光学顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る試料である観察細胞ＯＣの観察視野ＯＦにおける位置関係を例示する図。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係る画像データにおける観察細胞ＯＣの重心ＣＯＣと観察視野ＯＦの中心ＣＯＦを示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係る画像所得時間間隔と位置ずれの補正時間間隔の関係を例示した図。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図６】本発明の第３の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図７】本発明の第４の実施の形態に係るレーザ顕微鏡を用いた顕微鏡画像観察装置の構成を示すブロック図。
【図８】本発明の第４の実施の形態に係る試料である観察細胞ＯＣの画像を示す図。
【図９】本発明の第４の実施の形態に係る光軸方向の位置に対するコントラスト値の変化を示す図。
【図１０】従来例に係る一般的な走査型レーザ顕微鏡の基本構成を示すブロック図。
【図１１】従来例に係る２次元走査の原理を説明するための図。
【図１２】従来例に係る観察対象となる試料が視野から外れた場合を例示する図。
【符号の説明】
２１…光学顕微鏡本体
２１１…スキャニングステージ
２１３…試料
２２…テレビカメラ
２３１，２３２，２３３…信号処理部
２３ａ…Ａ／Ｄ変換器
２３ｂ…記憶部
２３ｃ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｄ…重心検出部
２３ｅ１，２３ｅ２，２３ｅ３…ＣＰＵ
２３ｆ…距離換算部
２３ｇ…ＸＹ駆動部
２３ｈ…利得可変部
２３ｉ…オフセット調整部
２３ｊ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｋ…Ｄ／Ａ変換器
２３ｌ…２次元走査駆動制御部
２３ｍ…Ａ／Ｄ変換器
２３ｎ…記憶部
２３ｏ…記憶制御部
２３ｐ…記憶制御部
２３ｑ…コントラスト算出部
２３ｒ…Ｚ駆動部
２４…表示部
２５…画像記録部
３１…レーザ顕微鏡本体
３２…レーザ光源
３３…２次元走査機構部
３４…ピンホール板
３５…光検出部
４１…光路分割部
４２…テレビカメラ
Claims (8)
- 顕微鏡で得た画像を観察するための顕微鏡画像観察装置であり、
前記画像中の観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、
前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、
前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、
を具備したことを特徴とする顕微鏡画像観察装置。 - 観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から画像を構築して観察するための顕微鏡画像観察装置であり、
前記光信号を検出する検出機構とは別に設けられ、前記画像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で得た前記画像中の前記観察対象に係る平面方向の第１の位置情報及び観察光軸方向の第２の位置情報の両方を求め、かつ任意に設定された時間間隔後の、前記画像に係る前記平面方向の基準位置に対する前記第１の位置情報のずれ量とずれ方向、及び前記画像に係る前記観察光軸方向の基準値に対する前記第２の位置情報のずれ量とずれ方向の両方を自動算出する算出手段と、
前記顕微鏡の対物レンズと前記観察対象を載置したステージとの相対位置を変化させる駆動手段と、
前記算出手段で得た前記第１の位置情報及び前記第２の位置情報の両方に関する前記ずれ量と前記ずれ方向に基いて前記駆動手段の駆動を制御し、前記対物レンズと前記観察対象との位置ずれを補正する制御手段と、
を具備し、
前記制御手段により前記平面方向及び前記観察光軸方向の位置ずれを補正した状態で前記スポット光の走査による画像構築を行うことを特徴とする顕微鏡画像観察装置。 - 前記算出手段は、算出した前記ずれ量及び前記ずれ方向の少なくとも一方を、顕微鏡鏡体の熱変形に係る情報を基に補正することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第１の位置情報は前記観察対象の重心位置であり、前記基準位置は前記画像の中心位置であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記画像のコントラスト値であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記第２の位置情報と前記基準値は、各々前記対物レンズと前記ステージとの相対位置であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 観察当初における前記第１の位置情報は操作者によって設定されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の顕微鏡画像観察装置。
- 前記顕微鏡画像観察装置は、前記観察対象に対してスポット光を走査して得られる光信号から前記画像を構築して観察する走査型レーザ顕微鏡であることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡画像観察装置。
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