JP4550555B2 - Preparation of quantum dot (Qdot) -nanogel composite - Google Patents
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Description
本発明は、疎水化多糖ナノゲルと量子ドット（Qdot）の複合体の調製法、及びその用途に関する。 The present invention relates to a method for preparing a complex of hydrophobized polysaccharide nanogel and quantum dots (Qdot), and uses thereof.
量子ドット（Qdot）とは、粒径のサイズによって蛍光波長が異なるという特徴を有する直径数nmの半導体素材からなる公知のナノクリスタルである（非特許文献１）。量子ドットには、蛍光色素として、CdSe（セレン化カドミウム）、CdTe（テルル化カドミウム）といった半導体素材が使用されている。量子ドットは、従来の蛍光色素と比較して卓越した光安定性を有し、長時間の検出が可能であり、きわめて明るい蛍光を有し、検出波長の分布がシャープである。さらに、全ての色を一つの光源で励起可能であり、光学顕微鏡における細胞観察等に適している。近年、量子ドットを、細胞内機能を調べるための新しいプローブとして利用しようとする研究が進められている。例えば、抗体付き量子ドットは、GFPタンパク質に変わる細胞内挙動の可視化プローブとして期待されている。 A quantum dot (Qdot) is a known nanocrystal made of a semiconductor material having a diameter of several nanometers and having a feature that the fluorescence wavelength varies depending on the size of the particle diameter (Non-Patent Document 1). Quantum dots use semiconductor materials such as CdSe (cadmium selenide) and CdTe (cadmium telluride) as fluorescent dyes. Quantum dots have excellent light stability compared to conventional fluorescent dyes, can be detected for a long time, have extremely bright fluorescence, and have a sharp distribution of detection wavelengths. Furthermore, all colors can be excited with one light source, which is suitable for cell observation in an optical microscope. In recent years, research has been conducted to use quantum dots as new probes for examining intracellular functions. For example, quantum dots with antibodies are expected as a visualization probe of intracellular behavior that changes to GFP protein.
一方で、ナノ微粒子とゲルの特性を併せ持つナノメーターサイズ（特に100nm以下）の高分子ゲル微粒子（ナノゲル）は、特にドラッグデリバリーシステムやナノテクノロジー分野で注目されるようになってきた。一般に化学架橋ナノゲルはマイクロエマルション重合法や高分子分子内での架橋反応により合成されてきた。本発明者らは、疎水化高分子の自己組織化による物理架橋ナノゲルの新規な調製法を報告した（非特許文献２）。すなわち、比較的疎水性の高い疎水基（コレステロール基）を部分的に導入した水溶性多糖類が、希薄水溶液中で自己組織的に会合し、疎水基の会合領域を架橋点とする単分散なナノゲルを形成することを見出した。発明者らの知る限り、物理架橋点を有する50nm以下のサイズの揃ったナノゲルとしては、初めての報告であった。 On the other hand, polymer gel fine particles (nanogel) of nanometer size (particularly 100 nm or less) having both the properties of nanoparticle and gel have been attracting attention especially in the field of drug delivery systems and nanotechnology. In general, chemically crosslinked nanogels have been synthesized by a microemulsion polymerization method or a crosslinking reaction in a polymer molecule. The present inventors have reported a novel method for preparing a physically crosslinked nanogel by self-organization of a hydrophobic polymer (Non-patent Document 2). That is, a water-soluble polysaccharide partially introduced with a hydrophobic group (cholesterol group) having a relatively high hydrophobicity self-organizes in a dilute aqueous solution, and is monodispersed with the association region of the hydrophobic group as a crosslinking point. It has been found that a nanogel is formed. As far as the inventors know, this was the first report of a nanogel having a physical crosslinking point and having a size of 50 nm or less.
通常のナノ微粒子は、その表面の特性を利用した研究がほとんどであるが、ナノゲルはさらにその内部の空間に疎水性の薬物やタンパク質といった物質を取り込めるスペースを有することが最大の特色である。コレステロール置換プルラン（CHP）のナノゲルは、タンパク質と選択的に相互作用するホストとして機能し、ドラッグデリバリーシステムのキャリアーとして有効であることを報告している。さらに、ナノゲルはシクロデキストリンの添加により崩壊し、取り込んだ物質を放出することが可能である。 Most of the research on the characteristics of normal nanoparticles is based on the characteristics of the surface, but nanogels have the greatest feature that they have a space that can take in substances such as hydrophobic drugs and proteins in the interior space. Cholesterol-substituted pullulan (CHP) nanogels have been reported to function as hosts that interact selectively with proteins and to be effective as carriers for drug delivery systems. Furthermore, the nanogel can be disintegrated by the addition of cyclodextrin and release the incorporated material.
また、第２の利点は物理架橋点を有することから、架橋構造の動的構造制御が可能であることである。疎水基の構造を変えることでゲルネットワークの動的特性を制御しえることやシクロデキストリンとのホストーゲスト相互作用を利用することで、ナノゲルの生成と崩壊を動的に制御しえる。この性質を利用して、変性タンパク質の取り込みと放出を制御した人工分子シャペロンの開発に成功している。
量子ドットを細胞内機能の解析のためのプローブとして用いる際の問題点は、量子ドットの安定性と細胞の取り込み効率の低さにある。したがって、本発明の課題は、量子ドットのコロイド安定性の向上、細胞内移行性の向上を達成することである。 A problem in using quantum dots as probes for analyzing intracellular functions is the stability of quantum dots and the low efficiency of cell uptake. Therefore, the subject of this invention is achieving the improvement of the colloidal stability of a quantum dot, and the improvement in intracellular migration.
本発明は、疎水化多糖ナノゲルと量子ドットの複合化による量子ドット−ナノゲル複合体の形成を主要な特徴とする。
つまり本発明は、
「１．疎水化高分子からなるナノゲルと量子ドット（Qdot）を共存させ、量子ドットをナノゲル内に取り込むことを特徴とする量子ドット−ナノゲル複合体の調製方法。
２．ナノゲルが粒径（直径）5〜200ｎｍである、前項１に記載の調製方法。
３．ナノゲルがコレステロール置換プルラン（CHP）である、前項２に記載の調製方法。
４．ナノゲルが糖鎖に官能基を導入したナノゲルである、前項１〜３のいずれか１に記載の調製方法。
５．ナノゲルが糖鎖に正電荷を有する官能基を導入したナノゲルである、前項４に記載の調製方法。
６．官能基がアミノ基である、前項５に記載の調製方法。
７．量子ドット（Qdot）が表面にタンパク質が結合している量子ドットである、前項１〜６のいずれか一に記載の調製方法。
８．前項１〜７のいずれか一に記載の調製方法によって調製された量子ドット−ナノゲル複合体。
９．シクロデキストリンの添加により前項９に記載の量子ドット（Qdot）−ナノゲル複合体からの量子ドットの解離を制御する方法。
１０．ナノゲルの正電荷の大きさを制御することにより、前項８に記載の量子ドット（Q dot）−ナノゲル複合体の動物細胞への取り込み率を制御する方法。
１１．アミノ基の導入率によりナノゲルの正電荷の大きさを制御する、前項１０に記載の方法。」
からなる。
The main feature of the present invention is the formation of a quantum dot-nanogel complex by combining a hydrophobic polysaccharide nanogel and quantum dots.
In other words, the present invention
“1. A method for preparing a quantum dot-nanogel complex, wherein a nanogel composed of a hydrophobic polymer and a quantum dot (Qdot) are allowed to coexist and the quantum dot is taken into the nanogel.
2. 2. The preparation method according to item 1 above, wherein the nanogel has a particle size (diameter) of 5 to 200 nm.
3. 3. The preparation method according to item 2 above, wherein the nanogel is cholesterol-substituted pullulan (CHP).
4). 4. The preparation method according to any one of items 1 to 3, wherein the nanogel is a nanogel having a functional group introduced into a sugar chain.
5). 5. The preparation method according to item 4, wherein the nanogel is a nanogel having a functional group having a positive charge in a sugar chain.
6). 6. The preparation method according to item 5 above, wherein the functional group is an amino group.
7). 7. The preparation method as described in any one of 1 to 6 above, wherein the quantum dot (Qdot) is a quantum dot having a protein bonded to its surface.
8). 8. A quantum dot-nanogel composite prepared by the preparation method according to any one of 1 to 7 above.
9. 10. A method for controlling dissociation of quantum dots from the quantum dot (Qdot) -nanogel complex according to item 9 by adding cyclodextrin.
10. 9. A method of controlling the rate of incorporation of the quantum dot (Q dot) -nanogel complex according to item 8 above into animal cells by controlling the size of the positive charge of the nanogel.
11. 11. The method according to item 10 above, wherein the size of the positive charge of the nanogel is controlled by the amino group introduction rate. "
Consists of.
本発明の量子ドット−ナノゲル複合体は単分散なナノ粒子であることから、ナノゲルとの複合化による量子ドットのコロイド安定性の向上が可能となり、量子ドットの細胞内移行性を増加させ、量子ドットによる細胞内解析の感度を高めることが可能となる。また、ナノゲルの架橋構造の動的構造を制御することにより、量子ドット−ナノゲル複合体からの量子ドットの解離を制御することが可能となる。さらに、量子ドット−ナノゲル複合体のナノゲルの正電荷を変化させることにより、量子ドット−ナノゲル複合体の細胞への取り込み率を制御できるという利点を有する。 Since the quantum dot-nanogel composite of the present invention is a monodispersed nanoparticle, it is possible to improve the colloidal stability of the quantum dot by combining with the nanogel, increasing the intracellular migration of the quantum dot, It is possible to increase the sensitivity of intracellular analysis using dots. Moreover, it becomes possible to control dissociation of the quantum dots from the quantum dot-nanogel complex by controlling the dynamic structure of the crosslinked structure of the nanogel. Furthermore, it has the advantage that the uptake | capture rate to the cell of a quantum dot-nanogel complex can be controlled by changing the positive charge of the nanogel of a quantum dot-nanogel complex.
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。 Technical and scientific terms used herein have meanings commonly understood by one of ordinary skill in the art unless otherwise defined. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail. The following detailed description is exemplary and illustrative only and is not intended to limit the invention in any way.
本発明に使用する疎水化高分子からなるナノゲル（疎水化多糖ナノゲル）は公知である。例えばWO00/12564（高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法）に開示がある。それによると、第１段階反応は、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、OCN-R1 NCO（式中、R1は炭素数1〜50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物を反応させて、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはコレステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。 Nanogels (hydrophobized polysaccharide nanogels) made of hydrophobic polymers used in the present invention are known. For example, WO00 / 12564 (high purity hydrophobic group-containing polysaccharide and method for producing the same) is disclosed. According to this, the first stage reaction is represented by a hydroxyl group-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms and OCN-R1 NCO (wherein R1 is a hydrocarbon group having 1 to 50 carbon atoms). The diisocyanate compound is reacted to produce an isocyanate group-containing hydrophobic compound in which one molecule of a C 12-50 hydroxyl group-containing hydrocarbon or cholesterol is reacted.
第２段階反応は、前記第１段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。この第２段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。使用されうる多糖類としては、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群より選択される１種以上である。 In the second stage reaction, the isocyanate group-containing hydrophobic compound obtained in the first stage reaction is further reacted with a polysaccharide to contain a hydrocarbon group having 12 to 50 carbon atoms or a steryl group as the hydrophobic group. To produce a hydrophobic group-containing polysaccharide. The reaction product of the second stage reaction can be purified with a ketone solvent to produce a high purity hydrophobic group-containing polysaccharide. The polysaccharide that can be used is at least one selected from the group consisting of pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethyldextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, xyloglucan and water-soluble cellulose.
このうち好適なナノゲルとしてはコレステロール置換プルラン（CHP、分子量108,000のプルランに100単糖あたりコレステロールが1〜10個、好ましくは1〜数個置換）が例示される。疎水化高分子の性状は、タンパク質のサイズや疎水性の程度により、コレステロール置換量を変え変更可能である。疎水性をコントロールするためには、炭素数10〜30、好ましくは炭素数12〜20程度のアルキル基を導入することも好適である。本発明で使用するナノゲルは、粒径10〜40nm、好ましくは20〜30nmである。ナノゲルは既に広く市販されており、本発明では、これら市販品を広く利用可能である。 Among these, a suitable nanogel is exemplified by cholesterol-substituted pullulan (CHP, pullulan having a molecular weight of 108,000 is substituted with 1 to 10, preferably 1 to several cholesterols per 100 monosaccharides). The properties of the hydrophobized polymer can be changed by changing the amount of cholesterol substitution depending on the size of the protein and the degree of hydrophobicity. In order to control hydrophobicity, it is also suitable to introduce an alkyl group having 10 to 30 carbon atoms, preferably about 12 to 20 carbon atoms. The nanogel used in the present invention has a particle size of 10 to 40 nm, preferably 20 to 30 nm. Nanogels have already been widely marketed, and in the present invention, these commercially available products can be widely used.
本発明に使用する量子ドットは、タンパク質、核酸を公知の方法により表面に結合させた量子ドットを用いることができる（非特許文献３〜９）。量子ドットに異なる物質を結合することで、複数の蛋白質・遺伝子など生体試料を同時に解析することが可能となる。量子ドットに結合させるタンパク質の好適な例としては、抗体、プロテインＡ、アビジン、ビオチンが挙げられる。量子ドットに結合させる核酸の好適な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。量子ドットへのタンパク質、核酸の結合には、市販品を利用可能である。市販品の具体例として、量子ドットによる抗体の標識に用いるキットである、Qdot抗体標識シリーズ（カンタムドット社（住商バイオサイエンス社））が挙げられる。 The quantum dot used for this invention can use the quantum dot which couple | bonded the protein and the nucleic acid with the surface by the well-known method (nonpatent literature 3-9). By binding different substances to the quantum dots, it is possible to simultaneously analyze biological samples such as a plurality of proteins and genes. Preferable examples of proteins to be bound to the quantum dots include antibodies, protein A, avidin, and biotin. Preferable examples of the nucleic acid to be bound to the quantum dot include DNA and RNA. Commercially available products can be used for binding proteins and nucleic acids to the quantum dots. Specific examples of commercially available products include the Qdot antibody labeling series (Quantum Dot (Sumisho Bioscience)), which is a kit used for labeling antibodies with quantum dots.
また、量子ドットは既に広く市販されており、本発明ではこれら市販品を広く利用可能である。市販品の具体例として、Qdot標識シリーズ（カンタムドット社（住商バイオサイエンス社））が挙げられる。Qdot標識シリーズ（カンタムドット社）には、生細胞の標識に用いることができる量子ドット（QtrackerTM）がある。また、タンパク質や酵素を表面に結合した量子ドットとして、Qdot１次抗体標識シリーズ、Qdot２次抗体標識シリーズ、Qdotビオチン標識シリーズ、QdotプロテインＡ標識シリーズ、Qdotストレプトアビジン標識シリーズがある。 In addition, quantum dots are already widely available on the market, and these commercially available products can be widely used in the present invention. Specific examples of commercially available products include the Qdot label series (Quantum Dot (Sumisho Bioscience)). The Qdot label series (Quantum Dot) has a quantum dot (Qtracker ™ ) that can be used to label live cells. In addition, there are Qdot primary antibody label series, Qdot secondary antibody label series, Qdot biotin label series, Qdot protein A label series, and Qdot streptavidin label series as quantum dots in which proteins and enzymes are bound to the surface.
本発明に係る量子ドット−ナノゲル複合体は、ナノゲルと量子ドットを共存させ、相互作用させることにより、量子ドットをナノゲル内に取り込むことにより得られる。量子ドットとナノゲルの混合比は、用いる量子ドットおよびナノゲルの種類に応じて適宜実験的繰り返しにより決定される。好ましくは量子ドットに対しCHPを1：1〜100、より好ましくは1：10のモル比で混合する。 The quantum dot-nanogel composite according to the present invention is obtained by incorporating quantum dots into the nanogel by allowing the nanogel and the quantum dots to coexist and interact with each other. The mixing ratio between the quantum dots and the nanogel is appropriately determined by experimental repetition according to the type of quantum dots and nanogel used. Preferably, CHP is mixed with the quantum dots in a molar ratio of 1: 1 to 100, more preferably 1:10.
量子ドット−ナノゲル複合体の好適な形成条件としては、量子ドットとナノゲルをバッファー中において混合し、5分間〜60分間、好ましくは10〜30分間、20〜70度、好ましくは20〜30度にて静置する。量子ドット−ナノゲル複合体の形成に用いるバッファーは、量子ドットとナノゲルの種類により適宜調製することができ、具体例としてTris HCl緩衝液（50mM、pH7.6）が好適に挙げられる。予想される量子ドット−ナノゲル複合体の形成の模式図を図１に示す。量子ドット−ナノゲル複合体の粒径は用いる量子ドットおよびナノゲルの種類等により異なる。 As a suitable formation condition of the quantum dot-nanogel complex, the quantum dot and the nanogel are mixed in a buffer, and it is 5 to 60 minutes, preferably 10 to 30 minutes, 20 to 70 degrees, preferably 20 to 30 degrees. Leave it alone. The buffer used for the formation of the quantum dot-nanogel complex can be appropriately prepared according to the kind of quantum dot and nanogel, and a specific example is a Tris HCl buffer (50 mM, pH 7.6). A schematic diagram of the formation of the expected quantum dot-nanogel composite is shown in FIG. The particle size of the quantum dot-nanogel complex varies depending on the type of quantum dot and nanogel used.
調製された量子ドット−ナノゲル複合体は、広く公知の方法により解析することが可能である。例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography、GPC）、原子間力顕微鏡（atomic force microscope、AFM）、蛍光顕微鏡および共焦点レーザー蛍光顕微鏡により解析できる。 The prepared quantum dot-nanogel composite can be analyzed by a widely known method. For example, it can be analyzed by gel permeation chromatography (GPC), atomic force microscope (AFM), fluorescence microscope and confocal laser fluorescence microscope.
本発明に係る量子ドット−ナノゲル複合体はシクロデキストリンを添加することにより、量子ドットーナノゲル複合体から量子ドットを適宜解離させることができる。シクロデキストリンはCHPに対し、1：1000のモル比で添加する。シクロデキストリンとしてはシクロデキストリンのa、b、g、およびその誘導体等、好ましくはメチル−b−シクロデキストリンを用いることができる。ナノゲルと量子ドットを複合化することにより量子ドットのコロイド安定性を高めておき、必要時にシクロデキストリンを添加して、量子ドットの機能を発揮させる系の構築が可能である。 The quantum dot-nanogel complex according to the present invention can be appropriately dissociated from the quantum dot-nanogel complex by adding cyclodextrin. Cyclodextrin is added at a molar ratio of 1: 1000 to CHP. As the cyclodextrin, a, b, g of cyclodextrin, and derivatives thereof, preferably methyl-b-cyclodextrin can be used. It is possible to construct a system that enhances the colloidal stability of quantum dots by combining nanogels and quantum dots, and adds cyclodextrin when necessary to exert the functions of quantum dots.
また、本発明に係る量子ドット−ナノゲル複合体の細胞への取り込み効率を向上させるため、正電荷を有する置換基、例えばアミノ基を導入したナノゲルも好適に用いられる。ナノゲルへのアミノ基の導入率はCHPのグルコース100単糖あたり1〜50、より好ましくは5〜30である。ナノゲルへのアミノ基の導入方法としては、以下のような手法が好適に挙げられる。 Moreover, in order to improve the uptake efficiency of the quantum dot-nanogel complex according to the present invention into cells, a nanogel into which a substituent having a positive charge, for example, an amino group is introduced, is also preferably used. The introduction rate of amino groups into the nanogel is 1-50, more preferably 5-30, per 100 glucose monosaccharides of CHP. As a method for introducing an amino group into the nanogel, the following methods are preferably exemplified.
減圧乾燥したCHP 1 gおよびジメチルアミノピリジン（DMAP） 0.035 gをジメチルスルホキシド（DMSO）/ピリジン（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒20mlに溶解し、これに10mlの0.25 g/ml 4-ニトロフェニルクロロギ酸/(DMSO/ピリジン（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒)をゆっくり添加し、4時間攪拌する。これを、エタノール/ジエチルエーテル（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒を用いて再沈する。回収した沈殿物を300mlのDMSO/ピリジン（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒に溶解し、10 mlの28.5％ エチレンジアミン/(DMSO/ピリジン（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒)にゆっくりと滴下し、4日間攪拌する。これを、エタノール/ジエチルエーテル（ｖ：ｖ＝1：1）混合溶媒を用いて再沈する。沈殿物を減圧乾燥し、200mlのDMSOに溶解し、蒸留水により透析する。さらに1N NaOH水溶液により透析し、これをHClにより中和し、さらに蒸留水により透析する。これを凍結乾燥し、乳白色の固体を得る。アミノ基の具体例としてはＮＨ2が好適に挙げられる。導入する置換基の数は適宜変えることができ、導入する置換基の数を変えることにより正電荷の大きさを制御し、量子ドット−ナノゲル複合体の細胞への取り込み効率を制御することが可能である。 1 g of CHP dried under reduced pressure and 0.035 g of dimethylaminopyridine (DMAP) were dissolved in 20 ml of a mixed solvent of dimethyl sulfoxide (DMSO) / pyridine (v: v = 1: 1), and 10 ml of 0.25 g / ml 4-nitro was dissolved therein. Slowly add phenylchloroformic acid / (DMSO / pyridine (v: v = 1: 1) mixed solvent) and stir for 4 hours. This is reprecipitated using a mixed solvent of ethanol / diethyl ether (v: v = 1: 1). The collected precipitate is dissolved in 300 ml of DMSO / pyridine (v: v = 1: 1) mixed solvent, and slowly dissolved in 10 ml of 28.5% ethylenediamine / (DMSO / pyridine (v: v = 1: 1) mixed solvent). And stir for 4 days. This is reprecipitated using a mixed solvent of ethanol / diethyl ether (v: v = 1: 1). The precipitate is dried under vacuum, dissolved in 200 ml DMSO and dialyzed against distilled water. Further, dialyzed with 1N NaOH aqueous solution, neutralized with HCl, and further dialyzed with distilled water. This is lyophilized to give a milky white solid. A specific example of the amino group is preferably NH 2 . The number of substituents to be introduced can be changed as appropriate. By changing the number of substituents to be introduced, the size of positive charges can be controlled, and the efficiency of quantum dot-nanogel complex uptake into cells can be controlled. It is.
本発明に用いる細胞は、一般に使用されている細胞を使用可能である。具体例として、HeLa細胞、Hep2細胞が挙げられる。量子ドット−ナノゲル複合体の細胞への取り込みは、量子ドット−ナノゲル複合体と細胞を共存させ、接触させることにより可能である。 As the cells used in the present invention, commonly used cells can be used. Specific examples include HeLa cells and Hep2 cells. Incorporation of the quantum dot-nanogel complex into the cell is possible by allowing the quantum dot-nanogel complex and the cell to coexist and contact with each other.
細胞に添加する量子ドット−ナノゲル複合体の培地中の濃度は細胞、量子ドット、およびナノゲルの種類等に応じて適宜実験的繰り返しにより決定されるが、終濃度で0.25〜1nMを添加するのが好適である。 The concentration of the quantum dot-nanogel complex added to the cells in the medium is determined by appropriate experimental repetition depending on the type of cells, quantum dots, nanogels, etc., but adding 0.25 to 1 nM at the final concentration is recommended. Is preferred.
細胞へ量子ドット−ナノゲル複合体を取り込ませる好適な条件としては、量子ドット−ナノゲル複合体含有培地で細胞を少なくとも1〜3時間培養することにより、細胞に量子ドット−ナノゲル複合体が取り込まれる。本発明の量子ドット−ナノゲル複合体は、コロイド安定化しているため、量子ドットの細胞内への取り込み率が良い。したがって、本発明の量子ドット−ナノゲル複合体を用いることにより、量子ドットによる細胞内機能の解析の感度が上昇するという利点がある。 As a suitable condition for incorporating the quantum dot-nanogel complex into the cell, the quantum dot-nanogel complex is incorporated into the cell by culturing the cell in a medium containing the quantum dot-nanogel complex for at least 1 to 3 hours. Since the quantum dot-nanogel composite of the present invention is colloidally stabilized, the uptake rate of quantum dots into cells is good. Therefore, by using the quantum dot-nanogel composite of the present invention, there is an advantage that the sensitivity of the analysis of the intracellular function by the quantum dot is increased.
以下に説明する調製条件により、目的に合わせた量子ドット−ナノゲル複合体を調製することができる。 According to the preparation conditions described below, a quantum dot-nanogel composite tailored to the purpose can be prepared.
具体的な調製方法の１は、量子ドットとしてプロテインA標識量子ドットを、疎水化多糖としてCHPを用い、量子ドットとCHPを、室温にて1：1〜100のモル比でリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）中で混合し、30分間、静置する。この量子ドット−ナノゲル複合体を用いることにより、培地中における量子ドットのコロイド安定化が高まる。 One specific preparation method uses protein A-labeled quantum dots as quantum dots, CHP as a hydrophobized polysaccharide, and a quantum buffer and CHP phosphate buffer (at a molar ratio of 1: 1 to 100 at room temperature) Mix in pH 7.4) and let stand for 30 minutes. By using this quantum dot-nanogel composite, colloidal stabilization of the quantum dots in the medium is enhanced.
具体的な調製方法の２は、量子ドットとしてプロテインA標識量子ドットを、疎水化多糖としてアミノ基を導入したCHP（CHPNH2）を用い、量子ドットとCHPNH2を、室温にて1：１〜100のモル比でリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）中で混合し、30分間、静置する。この量子ドット−ナノゲル複合体を用いることにより、量子ドットの細胞への取り込み率が上昇する。 2 Specific methods of preparation, the Protein A labeled quantum dots as quantum dots, using the CHP introduced with amino group as a hydrophobic polysaccharide (CHPNH 2), a quantum dot and CHPNH 2, 1 at room temperature: 1 Mix in phosphate buffer (pH 7.4) at a molar ratio of 100 and let stand for 30 minutes. By using this quantum dot-nanogel composite, the uptake rate of quantum dots into cells is increased.
具体的な調製方法の３は、具体的な調製方法の３は、量子ドットとしてストレプトアビジン標識量子ドットを、疎水化多糖としてアミノ基を導入したCHP（CHPNH2）を用い、量子ドットとCHPNH2を、1：1〜100のモル比でリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）中で混合し、70度にて10分間、静置する。この量子ドット−ナノゲル複合体を用いることにより、量子ドットの細胞への取り込み率が上昇する。 Specific preparation method 3 uses streptavidin-labeled quantum dots as quantum dots and CHP (CHPNH2) into which an amino group is introduced as a hydrophobized polysaccharide. Mix in a phosphate buffer (pH 7.4) at a molar ratio of 1: 1 to 100 and let stand at 70 degrees for 10 minutes. By using this quantum dot-nanogel composite, the uptake rate of quantum dots into cells is increased.
以下、本発明を実施例で説明するが、実施例は本発明の一例を示すものであって、その技術的範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, an Example shows an example of this invention and does not limit the technical scope.
実施例１
（量子ドット−ナノゲル複合体の調製）
ナノゲルと量子ドットを混合し、ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography、GPC）により複合化を確認した。
＜材料および方法＞
ナノゲルは、コレステロール置換プルラン（CHP）（ コレステロール置換率1.4個/100単糖）を用いた。量子ドットは、プロテインA標識量子ドット（Qdot655プロテインA標識、住商バイオサイエンス）（2μM in 50mMホウ酸バッファー(pH8.3)、蛍光波長655nm、粒径10〜12nm、5〜7プロテインA分子/量子ドット）を用いた。
Example 1
(Preparation of quantum dot-nanogel composite)
Nanogels and quantum dots were mixed, and complexation was confirmed by gel permeation chromatography (GPC).
<Materials and methods>
As the nanogel, cholesterol-substituted pullulan (CHP) (cholesterol substitution rate: 1.4 / 100 monosaccharide) was used. Quantum dots are protein A labeled quantum dots (Qdot655 protein A labeled, Sumisho Bioscience) (2μM in 50mM borate buffer (pH8.3), fluorescence wavelength 655nm, particle size 10-12nm, 5-7 protein A molecule / quantum Dot).
200 mｌの1 mM CHP, 10 nMプロテインA標識量子ドット/50mMTris HCl緩衝液(pH7.6)を調製し、室温で5〜10分間静置した（sample3）。コントロールとして、10nMプロテインA標識量子ドット/50mMTrisHCl緩衝液(pH7.6)（sample1）、1mMCHP/50mMTrisHCl緩衝液(pH7.6)（sample2）を調製した。さらに、sample3を70℃で10分間処理した溶液をsample4とした。これらの試料を、50mMTris HCl緩衝液(pH7.6)を溶離液として用いて、GPCシステム（ポンプ：SD-8022 (TOSOH)、カラムオーブン：CO-8022(TOSOH)、示差屈折率検出器：RI-8020 (TOSOH)、蛍光検出器：FP-2025 (JASCO)）により解析した。溶離液の流量は0.5ml/分とした。表１に実施例１および２において用いた試料の組成を示す。 200 ml of 1 mM CHP, 10 nM protein A labeled quantum dots / 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.6) was prepared and allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes (sample 3). As controls, 10 nM protein A-labeled quantum dots / 50 mM TrisHCl buffer (pH 7.6) (sample 1) and 1 mM HPH / 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.6) (sample 2) were prepared. Furthermore, a solution obtained by treating sample 3 at 70 ° C. for 10 minutes was designated as sample 4. These samples were analyzed using a GPC system (pump: SD-8022 (TOSOH), column oven: CO-8022 (TOSOH), differential refractive index detector: RI) using 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.6) as an eluent. -8020 (TOSOH), fluorescence detector: FP-2025 (JASCO)). The flow rate of the eluent was 0.5 ml / min. Table 1 shows the compositions of the samples used in Examples 1 and 2.
＜結果＞
図２にsample 1〜4について、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定した蛍光測定結果を示す。図２より、量子ドットのみ（sample1）とCHPを相互作用させた量子ドット（sample3、sample4）とを比較すると、ピークが大きくシフトすることがわかった。このことより、CHPと量子ドットが複合体を形成していると考える。また、sample3とsample4を比較すると、多少のピークのシフトは見られたが、大きな差異は見られなかった。このことから、加熱処理を施さなくても、量子ドット−ナノゲル複合体が形成されることが確認された。さらに、この結果から単分散なナノパーティクルの形成が確認された。これは、ナノゲルとの複合化によりコロイド的に安定化され、ゲルカラムとの相互作用が軽減されカラムに吸着することなく回収されたために、蛍光強度の増加が見られたと推定される。
<Result>
FIG. 2 shows the fluorescence measurement results of samples 1 to 4 measured by gel permeation chromatography. From FIG. 2, it was found that when the quantum dots alone (sample 1) and the quantum dots (sample 3 and sample 4) with which CHP interacted were compared, the peak shifted greatly. This suggests that CHP and quantum dots form a complex. In addition, when sample 3 and sample 4 were compared, a slight peak shift was observed, but no significant difference was observed. From this, it was confirmed that a quantum dot-nanogel composite was formed without heat treatment. Furthermore, from this result, the formation of monodispersed nanoparticles was confirmed. It is presumed that an increase in fluorescence intensity was observed because this was colloidally stabilized by complexing with the nanogel, and the interaction with the gel column was reduced and recovered without being adsorbed on the column.
実施例２
（量子ドット−ナノゲル複合体とメチル−β−シクロデキストリンの相互作用）
量子ドットーナノゲル複合体にメチル−β−シクロデキストリンを添加し、複合体の崩壊の有無を調べた。
＜材料および方法＞
ナノゲルと量子ドットは実施例１と同様のものを用いた。 200 mLの1 mM CHP, 10 nMプロテインA標識量子ドット/50mMTrisHCl緩衝液(pH7.6)を調製し、室温で5〜10分間静置した（sample3）。コントロールとして、10nMプロテインA標識量子ドット/50mMTrisHCl緩衝液(pH7.6)（sample1）を調製した。sample3に1mM（終濃度）メチル−β−シクロデキストリン（東京化成工業）を加え、室温で30分間静置した試料をsample5とした。これらの試料を、50mMTrisHCl緩衝液(pH7.6)を溶離液として用いて、ゲル浸透クロマトグラフィー（gel permeation chromatography、GPC）（ポンプ：SD-8022(TOSOH)、カラムオーブン：CO-8022 (TOSOH)、示差屈折率検出器：RI-8020 (TOSOH)、蛍光検出器：FP-2025 (JASCO)）により解析した。溶離液の流量は0.5ml/分とした。
Example 2
(Interaction between quantum dot-nanogel complex and methyl-β-cyclodextrin)
Methyl-β-cyclodextrin was added to the quantum dot-nanogel complex, and the presence or absence of the collapse of the complex was examined.
<Materials and methods>
The same nanogel and quantum dot as in Example 1 were used. 200 mL of 1 mM CHP, 10 nM protein A-labeled quantum dots / 50 mM TrisHCl buffer (pH 7.6) was prepared and allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes (sample 3). As a control, a 10 nM protein A-labeled quantum dot / 50 mM TrisHCl buffer solution (pH 7.6) (sample 1) was prepared. A sample obtained by adding 1 mM (final concentration) methyl-β-cyclodextrin (Tokyo Kasei Kogyo) to sample 3 and allowing to stand at room temperature for 30 minutes was designated as sample 5. Using these samples, gel permeation chromatography (GPC) (pump: SD-8022 (TOSOH), column oven: CO-8022 (TOSOH) using 50 mM TrisHCl buffer (pH 7.6) as an eluent , Differential refractive index detector: RI-8020 (TOSOH), fluorescence detector: FP-2025 (JASCO)). The flow rate of the eluent was 0.5 ml / min.
＜結果＞
図３にsample 1、sample 3およびsample5のゲル浸透クロマトグラフィーの蛍光測定値を比較した結果を示す。量子ドット−CHP複合体からメチル−β−シクロデキストリン添加により量子ドットが放出されるかを検討した結果、メチル−β−シクロデキストリンの添加によって、蛍光強度が約５割減少した。これは、約50%の量子ドットがナノゲルとの複合体から開放されたことを意味している。メチル−β−シクロデキストリン添加により、ナノゲルと被覆とその除去による量子ドット本来の姿への再生を制御しえることが明らかになった。さらには、ナノゲル複合化により量子ドットのコロイド安定性を高めておき、必要な時にシクロデキストリンを添加してその機能を発揮させる系の構築が可能になった。
<Result>
FIG. 3 shows the result of comparison of fluorescence measurement values of gel permeation chromatography of sample 1, sample 3 and sample 5. As a result of examining whether quantum dots are released from the quantum dot-CHP complex by addition of methyl-β-cyclodextrin, the addition of methyl-β-cyclodextrin reduced the fluorescence intensity by about 50%. This means that about 50% of the quantum dots have been released from the complex with the nanogel. It has been clarified that the addition of methyl-β-cyclodextrin can control the regeneration of the quantum dot to its original form by nanogel and coating and its removal. Furthermore, it has become possible to construct a system in which the colloidal stability of quantum dots is enhanced by nanogel complexization and cyclodextrin is added when necessary to exert its function.
実施例３
（原子間力顕微鏡（AFM）による量子ドット−ナノゲル複合体の観察）
量子ドット−CHPNH2複合体をマイカ表面に吸着させ、原子間力顕微鏡で観察した。得られた画像より、粒子径を測定した。
＜材料および方法＞
量子ドットは、実施例１と同様のものを用いた。量子ドットのインキュベーションバッファーは量子ドット付属のものを用いた（50 mM ホウ酸バッファー(pH8.3)、2% BSA、0.05% アジ化ナトリウム）。
ナノゲルは、コレステロール置換プルラン（CHP）（ コレステロール置換率1.4個/100単糖）にアミノ基を導入したもの（CHPNH2(25)）を用いた。CHPNH2(25)はアミノ基導入率25個/100単糖で調製した。
量子ドット−ナノゲル複合体溶液は、1mg/ml CHPNH2(25)水溶液と2mM量子ドットを10：1（体積比）で混合し、室温で5〜10分間静置したものを用いた。また、コントロールとしてCHPNH2(25)水溶液と量子ドット水溶液を調製した。CHPNH2(25)水溶液として、1mg/mlCHPNH2(25)水溶液を用いた。さらに量子ドット水溶液として、市販の量子ドット2mMをmiliQ水により10倍に希釈したものを用いた。
Example 3
(Observation of quantum dot-nanogel complex by atomic force microscope (AFM))
The quantum dot-CHPNH 2 complex was adsorbed on the mica surface and observed with an atomic force microscope. The particle diameter was measured from the obtained image.
<Materials and methods>
The quantum dots similar to those in Example 1 were used. The quantum dot incubation buffer used was the one attached to the quantum dot (50 mM borate buffer (pH 8.3), 2% BSA, 0.05% sodium azide).
The nanogel used was a cholesterol-substituted pullulan (CHP) (cholesterol substitution rate of 1.4 / 100 monosaccharide) with an amino group introduced (CHPNH 2 (25)). CHPNH 2 (25) was prepared with an amino group introduction rate of 25/100 monosaccharide.
As the quantum dot-nanogel complex solution, a 1 mg / ml CHPNH 2 (25) aqueous solution and 2 mM quantum dots were mixed at 10: 1 (volume ratio) and allowed to stand at room temperature for 5 to 10 minutes. As controls, an aqueous CHPNH 2 (25) solution and an aqueous quantum dot solution were prepared. As CHPNH 2 (25) solution was used 1mg / mlCHPNH 2 (25) solution. Further, as the quantum dot aqueous solution, a commercially available quantum dot of 2 mM diluted 10 times with miliQ water was used.
量子ドット−ナノゲル複合体溶液、CHPNH2(25)水溶液、および量子ドット水溶液を劈開したマイカ表面に10μL滴下し、そのまま2分間吸着させた。N2ブローにより溶液を吹き飛ばし、原子間力顕微鏡（SPI300、Seiko）のダイナミックモードで大気中観察した。 10 μL of the quantum dot-nanogel complex solution, the CHPNH 2 (25) aqueous solution, and the quantum dot aqueous solution were dropped on the cleaved mica surface and adsorbed for 2 minutes. The solution was blown off by N 2 blow and observed in the atmosphere in the dynamic mode of an atomic force microscope (SPI300, Seiko).
＜結果＞
図４〜６に得られた原子間力顕微鏡像を示す。観察された原子間力顕微鏡像より、CHPNH2(25)と量子ドットの複合体は、サイズの揃った粒子であることが分かった。測定された粒子径を平均すると、量子ドット−CHPNH2(25)複合体の粒子径は44±2nm、CHPNH2(25)の粒子径は35±5nmであった。また、図４では、15〜25nm程度の粒子も多数観察された。これは、複合化していない量子ドットであると考える。
<Result>
The atomic force microscope images obtained in FIGS. From the observed atomic force microscope image, it was found that the complex of CHPNH 2 (25) and quantum dots is a particle of uniform size. When the measured particle size was averaged, the particle size of the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex was 44 ± 2 nm, and the particle size of CHPNH 2 (25) was 35 ± 5 nm. Moreover, in FIG. 4, many particles of about 15 to 25 nm were observed. This is considered to be an uncomplexed quantum dot.
実施例４
（量子ドット−ナノゲル複合体と細胞との相互作用の蛍光顕微鏡による観察）
CHPと量子ドットの複合体、および正電荷をもつCHPNH2と量子ドットの複合体を形成させ、細胞への取り込みを蛍光顕微鏡および共焦点レーザー蛍光顕微鏡観察により比較した。
Example 4
(Observation of interaction between quantum dot-nanogel complex and cell by fluorescence microscope)
A CHP / quantum dot complex and a positively charged CHPNH 2 / quantum dot complex were formed, and their cellular uptake was compared by fluorescence microscopy and confocal laser fluorescence microscopy.
＜材料および方法＞
量子ドット、ナノゲルは実施例１と同様のものを用いた。量子ドット−CHPNH2複合体の調製に用いるナノゲルは、コレステロール置換プルラン（CHP）（コレステロール置換率1.4個/100単糖）にアミノ基を導入したものを用いた。CHPへのアミノ基の導入率は、CHPNH2(25)はアミノ基導入率25個/100単糖で、CHPNH2(11)はアミノ基導入率11個/100単糖とした。
量子ドット−ナノゲル複合体溶液は次のように調製した。量子ドット−CHP複合体は100 mlの1 mg/ml CHPおよび1mlの2 mMプロテインA標識量子ドットを189 mLのリン酸緩衝液（PBS）（pH7.4）に溶解し、70℃で10分間処理することにより調製した。量子ドット−CHPNH2複合体も同様の方法で調製した。また、2mM量子ドットをPBSにより1nMに希釈した試料を、コントロールとした。
量子ドット−ナノゲル複合体溶液、コントロールの試料を培地（10%ウシ胎児血清および1%ピルビン酸ナトリウム添加、Dulbecco’sModified Eagle Medium、GIBCO）により10倍に希釈し、量子ドットを含む培地を調製した。量子ドットを含む培地に含まれる量子ドットの濃度は1nMとし、CHPおよびCHPNH2(25)の濃度は100nMとした。
<Materials and methods>
The same quantum dots and nanogels as in Example 1 were used. The nanogel used for the preparation of the quantum dot-CHPNH 2 composite was a cholesterol-substituted pullulan (CHP) (cholesterol substitution rate of 1.4 / 100 monosaccharide) with an amino group introduced. The amino group introduction rate into CHP was CHPNH 2 (25) with an amino group introduction rate of 25/100 monosaccharide, and CHPNH 2 (11) with an amino group introduction rate of 11/100 monosaccharide.
The quantum dot-nanogel complex solution was prepared as follows. Quantum dots -CHP complex was dissolved in 1 00 ml 1 mg / ml CHP and 2 mM Protein A labeled quantum dots 189 mL phosphate buffer of 1ml of (PBS) (pH7.4), 10 at 70 ° C. Prepared by treating for minutes. A quantum dot-CHPNH 2 complex was also prepared in the same manner. A sample obtained by diluting 2 mM quantum dots with PBS to 1 nM was used as a control.
Quantum dot-nanogel complex solution and control sample were diluted 10 times with medium (10% fetal bovine serum and 1% sodium pyruvate added, Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO) to prepare a medium containing quantum dots . The concentration of quantum dots contained in the medium containing quantum dots was 1 nM, and the concentrations of CHP and CHPNH 2 (25) were 100 nM.
細胞数6.25×105/ウェルのHeLa細胞を、24 ウェルプレートに播き、37℃にて5％CO2の存在下で2日間培養した。培地を吸引し、前記の量子ドットを含む培地を1ml加え、37℃にて5％CO2の存在下で3時間培養した。培養後、培地を吸引しPBSで3回洗浄した後、新しい培地（量子ドットを含まないもの）を添加した。その後、HeLa細胞の位相差像および蛍光像を蛍光顕微鏡により観察した（倍率10倍）。使用したフィルターはWBVである。 HeLa cells having a cell number of 6.25 × 10 5 / well were seeded in a 24-well plate and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 2 days. The medium was aspirated, 1 ml of the medium containing the quantum dots was added, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 hours. After culturing, the medium was aspirated and washed 3 times with PBS, and then a new medium (without quantum dots) was added. Thereafter, a phase contrast image and a fluorescence image of HeLa cells were observed with a fluorescence microscope (magnification 10 times). The filter used was WBV.
＜結果＞
HeLa細胞への取り込みについて、量子ドット 、量子ドット−CHP複合体および量子ドット−CHPNH2複合体を比較した。図７〜図９に観察された位相差像および蛍光像を示す。
<Result>
Quantum dots, quantum dots-CHP complexes, and quantum dots-CHPNH 2 complexes were compared for uptake into HeLa cells. 7 to 9 show the observed phase difference images and fluorescence images.
図８に示すように、量子ドットのみの場合は所々に量子ドットの凝集物らしきものが確認された（図７矢印部分）。また、細胞部分からも非常に弱い蛍光が観察された。図８に示すように量子ドット−CHP複合体では、量子ドットのみの場合に観察された凝集物はまったく見られなかった。また、細胞部分からは蛍光はほとんど見られなかった（図８）。さらに、図９に示すように量子ドット−CHPNH2(25)複合体では、細胞部分から蛍光がはっきりと観察された。また、量子ドット−CHPNH2(25)複合体については、量子ドットの培地中濃度を0.25nMにしても、蛍光を観察することができた。アミノ基の導入率の異なるCHPNH2について細胞への取り込みを比較した。量子ドット−CHPNH2(11)複合体では量子ドット−CHPNH2(25)複合体と比べて、細胞への取り込み効率が劣ることが分かった。 As shown in FIG. 8, in the case of only quantum dots, the appearance of an agglomerate of quantum dots was confirmed in some places (arrow portion in FIG. 7). Also, very weak fluorescence was observed from the cell part. As shown in FIG. 8, in the quantum dot-CHP composite, the aggregates observed only with the quantum dots were not seen at all. Further, almost no fluorescence was seen from the cell portion (FIG. 8). Furthermore, as shown in FIG. 9, in the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex, fluorescence was clearly observed from the cell portion. Further, with respect to the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex, fluorescence could be observed even when the concentration of quantum dots in the medium was 0.25 nM. The uptake into cells of CHPNH 2 with different amino group introduction rates was compared. It was found that the quantum dot-CHPNH 2 (11) complex was inferior in the efficiency of cell uptake compared to the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex.
この結果より、CHPNH2(25)により、量子ドットの細胞への取り込みを促進できることが確認された。これはCHPNH2(25)の正電荷が細胞膜の負電荷と相互作用したためと考える。これに対し、電荷を有さないCHPは細胞へはほとんど取り込まれなかった。したがって、ナノゲルの正電荷を変えることで細胞への量子ドットの取り込みを制御し得ることが明らかになった。 From this result, it was confirmed that CHPNH 2 (25) can promote uptake of quantum dots into cells. This is thought to be because the positive charge of CHPNH 2 (25) interacted with the negative charge of the cell membrane. In contrast, CHP having no charge was hardly taken up into cells. Therefore, it was revealed that the uptake of quantum dots into cells can be controlled by changing the positive charge of the nanogel.
実施例５
（量子ドット−ナノゲル複合体と細胞との相互作用の共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による観察）
＜材料および方法＞
量子ドット、ナノゲルは実施例４と同じものを用いた。量子ドット−ナノゲル複合体溶液は次のように調製した。量子ドット−CHP 複合体および量子ドット−CHPNH2複合体は、1mg/mLCHPまたはCHPNH2水溶液と2mM量子ドットを10：1（体積比）で室温において混合し、PBSで希釈して量子ドットの終濃度が1nMとなるように調製した。また、2mM量子ドットをPBSにより1nMに希釈した試料を、コントロールとした。調製した量子ドット−ナノゲル複合体溶液、コントロールの試料を培地（10%ウシ胎児血清および1%ピルビン酸ナトリウム添加、Dulbecco’sModified Eagle Medium、GIBCO）により10倍に希釈し、量子ドットを含む培地を調製した。
Example 5
(Observation of interaction between quantum dot-nanogel complex and cells by confocal laser scanning fluorescence microscope)
<Materials and methods>
The same quantum dots and nanogel as in Example 4 were used. The quantum dot-nanogel complex solution was prepared as follows. Quantum dot-CHP complex and quantum dot-CHPNH 2 complex are prepared by mixing 1 mg / mL CHP or CHPNH 2 aqueous solution and 2 mM quantum dot at a volume ratio of 10: 1 at room temperature and diluting with PBS to terminate the quantum dot. The concentration was adjusted to 1 nM. A sample obtained by diluting 2 mM quantum dots with PBS to 1 nM was used as a control. Dilute the prepared quantum dot-nanogel complex solution and control sample 10-fold with medium (10% fetal bovine serum and 1% sodium pyruvate, Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO). Prepared.
細胞数5×104/ディッシュのHeLa細胞を、コラーゲンコートしたガラスボトムディッシュに播き、37℃にて5％CO2の存在下で1日間培養した。培地を吸引し、前記の量子ドットを含む培地を1ml加え、37℃にて5％CO2の存在下で3時間培養した。培養後、培地を吸引しPBSで3回洗浄した後、新しい培地（量子ドットを含まないもの）を添加した。細胞内における量子ドットの分布を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡（LSM510META、Zeiss）により観察した。励起光は543nm、検出する蛍光は633 nmとした。 HeLa cells with a cell number of 5 × 10 4 / dish were seeded on a collagen-coated glass bottom dish and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 1 day. The medium was aspirated, 1 ml of the medium containing the quantum dots was added, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 hours. After culturing, the medium was aspirated and washed 3 times with PBS, and then a new medium (without quantum dots) was added. The distribution of quantum dots in the cells was observed with a confocal laser scanning fluorescence microscope (LSM510META, Zeiss). The excitation light was 543 nm, and the detected fluorescence was 633 nm.
＜結果＞
図１０に細胞内における量子ドットの分布を示す。得られた蛍光は、量子ドット−CHPNH2(25)複合体で最も強く、次いで量子ドット−CHPNH2(11)複合体、量子ドットであり、量子ドット−CHP複合体では複合化していない量子ドットよりも細胞への導入量が少ないことが分かった。量子ドット−CHPNH2(25)複合体では、細胞への導入量が著しく増加した。また、細胞内へはエンドサイトーシスの機構で取り込まれていることが示唆された。
<Result>
FIG. 10 shows the distribution of quantum dots in the cell. The obtained fluorescence is the strongest in the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex, followed by the quantum dot-CHPNH 2 (11) complex, the quantum dot, and the quantum dot not complexed in the quantum dot-CHP complex It was found that the amount introduced into the cells was less than that. In the quantum dot-CHPNH 2 (25) complex, the amount introduced into the cells was remarkably increased. Moreover, it was suggested that it was taken up into the cell by the mechanism of endocytosis.
上記のように、本発明において提供する量子ドット−ナノゲル複合体は、コロイド安定化し、量子ドットの細胞への導入効率を著しく向上する。本発明の量子ドット−ナノゲル複合体は、量子ドットプローブの細胞内輸送におけるキャリアーとして非常に有用である。 As described above, the quantum dot-nanogel complex provided in the present invention stabilizes the colloid and significantly improves the efficiency of introducing the quantum dots into the cells. The quantum dot-nanogel complex of the present invention is very useful as a carrier in intracellular transport of quantum dot probes.
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| JP2006143808A (en) | 2006-06-08 |
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