JP4545605B2 - 細胞培養材料 - Google Patents
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Description
(1)プロピオニル化ポリアリルアミンを表面に保持させてなる細胞培養材料、
(2)該プロピオニル化ポリアリルアミンのプロピオニル化率が5〜40モル%である前記(1)記載の細胞培養材料、ならびに
(3)細胞培養における前記(1)または(2)記載の細胞培養材料の使用
に関するものである。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン1の作製
50重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-HCl-3L、重量平均分子量15000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物(和光純薬社製)1.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、pH試験紙で確認しながら水酸化ナトリウム水溶液を添加して副生したプロピオン酸を中和した。その後、透析チューブ(スペクトラ/ボア、分画分子量3500、フナコシ社製)を用いて透析した後、凍結乾燥して白色粉末状のプロピオニル化ポリアリルアミン1(以下、pNPPAA-1と略記する)を得た。このpNPPAA-1のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ3.0モル%であった。
エチレン−ビニルアルコール共重合体フィルム(EP-F、エチレン含量32モル%、クラレ社製、以下、EVOHフィルムと略記する)をグルタルアルデヒド(以下、GAと略す)2.3g/L、硫酸33g/Lおよび硫酸ナトリウム180g/Lを含む水溶液に60℃で60分浸漬させることにより、GA化EVOHフィルムを作製した。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン2の作製
20重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-H-HCl、重量平均分子量60000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物5.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてプロピオニル化ポリアリルアミン2(以下、pNPPAA-2と略記する)を得た。pNPPAA-2のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ18モル%であった。
pNPPAA-2を用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNPPAA-2固定化材料を作製した。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン3の作製
50重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-HCl-3L、重量平均分子量15000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物5.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてプロピオニル化ポリアリルアミン3(以下、pNPPAA-3と略記する)を得た。pNPPAA-3のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ22モル%であった。
pNPPAA-3を用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNPPAA-3固定化材料を作製した。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン4の作製
20重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-H-HCl、重量平均分子量60000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物9.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてプロピオニル化ポリアリルアミン4(以下、pNPPAA-4と略記する)を得た。pNPPAA-4のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ36モル%であった。
pNPPAA-4を用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNPPAA-4固定化材料を作製した。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン5の作製
50重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-HCl-3L、重量平均分子量15000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物9.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてプロピオニル化ポリアリルアミン5(以下、pNPPAA-5と略記する)を得た。pNPPAA-5のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ40モル%であった。
pNPPAA-5を用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNPPAA-5固定化材料を作製した。
(1)プロピオニル化ポリアリルアミン-6の作製
20重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-H-HCl、重量平均分子量60000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、プロピオン酸無水物14.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてプロピオニル化ポリアリルアミン6(以下、pNPPAA-6と略記する)を得た。pNPPAA-6のプロピオニル化率を元素分析結果から算出したところ58モル%であった。
pNPPAA-6を用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNPPAA-6固定化材料を作製した。
実施例1で用いたEVOHフィルムを比較材料とした。
(1)アセチル化ポリアリルアミンの作製
20重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-H-HCl、重量平均分子量60000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、無水酢酸7.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてアセチル化ポリアリルアミン(以下、pNAPAAと略記する)を得た。pNAPAAのアセチル化率を元素分析結果から算出したところ38モル%であった。
pNAPAAを用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNAPAA固定化材料を作製した。
(1)ブチリル化ポリアリルアミンの作製
50重量%ポリアリルアミン水溶液(PAA-HCl-3L、重量平均分子量15000、日東紡績社製)を水で希釈して調製した10重量%ポリアリルアミン水溶液100gに、酪酸無水物6.0gを徐々に添加しながら、25℃で4時間反応した。その後、実施例1と同様にしてブチリル化ポリアリルアミン(以下、pNBPAAと略記する)を得た。pNBPAAのブチリル化率を元素分析結果から算出したところ20モル%であった。
pNBPAAを用いて、pNPPAA-1固定化材料の作製と同様に行い、pNBPAA固定化材料を作製した。
相転移温度はアシル化ポリアリルアミン溶液の濁度の温度依存性を測定することにより求めた。pNPPAA-1の場合、pNPPAA-1をリン酸緩衝生理食塩液(以下、PBSと略記する)に溶解し、濃度20重量%の溶液を調製した。温度を少しずつ変えて、pNPPAA-1溶液の波長500nmにおける光線透過率を、分光光度計を用いて測定した。光線透過率は低温側で高く、高温側で低かった。これはpNPPAA-1が低温側で親水性を示しPBSに溶解しているが、高温側で疎水性を示し濁りを生じたことを示している。光線透過率が50%のときの温度を相転移温度として求めたところ、pNPPAA-1の相転移温度は18℃であった。同様にしてpNPPAA-2、pNPPAA-3、pNPPAA-4、pNPPAA-5、pNPPAA-6、pNAPAAおよびpNBPAAの相転移温度を測定したところ、それぞれ10℃、23℃、18℃、28℃、22℃、34℃、58℃、0℃以下であった。
直径35mmの細胞培養用ポリスチレン製ディッシュ(BDサイエンス社製)の底面に、実施例1で作製したpNPPAA-1固定化材料を底面の大きさに切り取って敷いた。これに、牛胎児血清(FCS、三光純薬社製)およびペニシリン−ストレプトマイシン溶液(P071、シグマ社製)をそれぞれ最終濃度が10重量%、100U/mLになるように添加したDMEM培地(D5795、シグマ社製)に縣濁させた肝癌由来ヒト肝細胞HepG2(大日本製薬社製)を240000個播種し、炭酸ガス濃度5%、37℃のインキュベーター中で180分静置した。その後、接着していない細胞をPBSで洗浄して除去した後、接着していた細胞をトリプシン処理して剥がし、細胞数を計測した。播種細胞数に対する接着細胞数を細胞接着率(%)として算出した。
試験例2と同様に細胞を接着し、接着していない細胞をPBSで洗浄して除去した後、細胞培養材料を4℃に冷却し脱着した細胞数を計測した。播種した細胞数に対する脱着した細胞数を細胞回収率(%)として算出した。
比較例1で作製したEVOHフィルムに試験例2と同様に細胞を接着し、接着していない細胞をPBSで洗浄して除去した後、トリプシン溶液(T4049、シグマ社製)に5分浸漬して、EVOHフィルムから細胞を剥離させた。その後、遠心分離法にて細胞を回収して細胞数を計数し、試験例3と同様に細胞回収率(%)を算出した。
試験例2で脱着した細胞および比較例4で回収した細胞について、トリパンブルー法(生存細胞ではトリパンブルーによって染色されないが、死亡細胞では染色されるという原理を利用した細胞数の計測方法)を用いて細胞数の計測を行い、脱着した細胞または回収した細胞に対するトリパンブルー法を用いて計測した生存細胞数を細胞生存率(%)とした。
Claims (3)
- プロピオニル化ポリアリルアミンを表面に保持させてなる細胞培養材料。
- 該プロピオニル化ポリアリルアミンのプロピオニル化率が5〜40モル%である請求項1記載の細胞培養材料。
- 細胞培養における請求項1または2記載の細胞培養材料の使用。
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