JP4543202B2 - Liposome production apparatus and production method using multiple ultrasonic irradiation - Google Patents
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Description
本発明は、超音波を利用した微細リポソームの製造装置、及びその製造方法に関するものであり、更に詳しくは、複数の異なる周波数の超音波を利用することにより、数十ｎｍから１５０ｎｍの大きさにおいて、粒度分布が狭く、異物の混入がない高品質のリポソームを高効率に製造し、提供することが可能な上記リポソームの製造装置、及びその製造方法に関するものである。本発明は、リポソームの製造に、低周波超音波と高周波超音波を用い、超音波作用の周波数依存性を巧みに組み合わせることにより、また、超音波照射方法、試料溶液の流通方法に多くの工夫を盛り込むことにより上述の性能を有するリポソームを実現し、提供することを可能とするものである。本発明により製造されるリポソームは、薬物運搬体あるいは複合型薬剤として、医薬品の技術分野で重要な物質であり、その他にも化粧品、食品等多くの分野で利用可能な重要製品である。 The present invention relates to an apparatus for producing fine liposomes using ultrasonic waves, and a method for producing the same, and more particularly, in a size of several tens to 150 nm by using ultrasonic waves having a plurality of different frequencies. The present invention relates to an apparatus for producing the liposome, and a method for producing the same, which can efficiently produce and provide high-quality liposomes having a narrow particle size distribution and no contamination with foreign substances. The present invention uses a low-frequency ultrasonic wave and a high-frequency ultrasonic wave in the production of liposomes, and skillfully combines the frequency dependence of the ultrasonic action, and also has many contrivances in the ultrasonic irradiation method and the sample solution distribution method. It is possible to realize and provide a liposome having the above-mentioned performance by incorporating. Liposomes produced according to the present invention are important substances in the technical field of pharmaceuticals as drug carriers or complex drugs, and are also important products that can be used in many fields such as cosmetics and foods.
リポソームに関する製造技術としては、その医薬品応用としての重要性から各種のものが開発されており、例えば、超音波法、逆相蒸発法、エタノール注入法、押し出し法、界面活性剤法、及び超臨界法等が知られている（非特許文献１、２参照）。一般に、逆相蒸発法、超臨界法あるいは界面活性剤法では、一枚膜の数μｍ程度の大きなリポソームの作製が可能であるとされており、同法で製造されるリポソームは、薬物等の水溶性物質の保持効率が高いという長所を有する。しかしながら、その大きさゆえに、体内目的部位への搬送や細胞浸透においては、大きな制限が存在する。一方、本発明により製造するリポソームの大きさは、数十ｎｍから１５０ｎｍまでを目標としたものであり、作用機構や薬物修飾法において、従来品とは大きな差異が存在する。 Various manufacturing technologies related to liposomes have been developed due to their importance as pharmaceutical applications. For example, ultrasonic methods, reverse phase evaporation methods, ethanol injection methods, extrusion methods, surfactant methods, and supercritical methods have been developed. Laws and the like are known (see Non-Patent Documents 1 and 2). In general, the reverse phase evaporation method, the supercritical method or the surfactant method is considered to be capable of producing large liposomes of several μm in a single membrane. It has the advantage of high retention efficiency of water-soluble substances. However, due to its size, there are significant limitations in transport to the target site in the body and cell penetration. On the other hand, the size of the liposome produced according to the present invention is targeted from several tens of nm to 150 nm, and there is a great difference from conventional products in the action mechanism and drug modification method.
エタノール注入法については、製造途中でリポソーム濃度が希釈されるために、限外ろ過等による濃縮操作が必要であることや、エタノールをリポソームから完全に除去することが難しいといった欠点がある。押し出し法においては、３０−１５０ｎｍといった小さなリポソームの製造に特徴を有するが、粒径分布の制御が細孔透過を利用していることから、細孔以下の大きさのリポソームに対しては効果的ではなく、また、細孔の目詰まりによる操作性の悪さ等が指摘されている。 The ethanol injection method has the disadvantages that the concentration of liposomes is diluted during production, so that a concentration operation such as ultrafiltration is necessary, and it is difficult to completely remove ethanol from liposomes. The extrusion method is characterized by the production of small liposomes of 30-150 nm, but is effective for liposomes with a size smaller than the pores because the control of the particle size distribution utilizes pore permeation. In addition, it is pointed out that the operability is poor due to clogging of the pores.
一方、超音波法は、リポソームに関する研究の創成期から現在まで使用されている効果的なリポソーム製造方法であり、短時間で効率的に微細（例えば、１００ｎｍ）なリポソーム製造が可能であること、製造装置としては大型のものは必要がなく、簡便に用いることができること等の利点がある。例えば、逆相蒸発法に従って、脂質と薬物の混合物を、リポソーム調製装置の試料容器に供給し、減圧による溶媒留去及び超音波照射を用いて、乳化−ベシクル形成の一連の工程を同一容器内で行い、次いで希釈して試料容器からリポソームを回収するリポソーム調製装置（特許文献１参照）が提案されている。また、他に、有用物質、リン脂質を含有する脂質成分と水が共存する状態で、超音波処理することによりリポソームを製造する方法（特許文献２参照）、金属ポルフィリン錯体を安全に生体内に投与することが可能な、金属ポルフィリン錯体包埋リポソームの製造に、超音波処理を使用する方法（特許文献３参照）、等が提案されている。しかしながら、従来の超音波法によるリポソームの製造法では、キャビテーションに基づくリポソーム内包物の損傷や、超音波ホーンの材料である金属微粉の混入等が難点とされていた。更に、超音波照射できる溶液量がごく少量に限られること、超音波照射により溶液温度が上昇し、その結果、原料の分解や変性が見られること、超音波照射にムラが見られること等の欠点を有していた。 On the other hand, the ultrasonic method is an effective method for producing liposomes that has been used from the inception of research on liposomes to the present time, and enables the production of fine (for example, 100 nm) liposomes efficiently in a short time. There is an advantage that a large-sized manufacturing apparatus is not necessary and can be easily used. For example, according to the reverse phase evaporation method, a mixture of lipid and drug is supplied to a sample container of a liposome preparation apparatus, and a series of steps of emulsification and vesicle formation is performed in the same container by using solvent distillation by reduced pressure and ultrasonic irradiation. A liposome preparation device (see Patent Document 1) is proposed in which the liposome is diluted and then diluted to recover the liposome from the sample container. In addition, a method of producing liposomes by ultrasonic treatment in the presence of a useful substance, a lipid component containing phospholipids and water (see Patent Document 2), a metal porphyrin complex can be safely put in vivo. A method using ultrasonic treatment (see Patent Document 3), etc., has been proposed for the production of liposomes embedded with metalloporphyrin complexes that can be administered. However, in the conventional method for producing liposomes by the ultrasonic method, damage to the liposome inclusions due to cavitation, mixing of metal fine powder as the material of the ultrasonic horn, and the like have been difficult. Furthermore, the amount of solution that can be irradiated with ultrasonic waves is limited to a very small amount, the temperature of the solution increases due to irradiation with ultrasonic waves, and as a result, decomposition and modification of raw materials are observed, and unevenness is observed in ultrasonic irradiation. Had drawbacks.
ホーン先端からの金属微粉混入に関しては、Ｆｒｅｉｔａｓらが金属／ガラス２重管式の照射装置を提案しているが（特許文献４参照）、その適用例としては、エマルジョン形成といった比較的弱い超音波での応用であるとともに、振動面から試料液までに、多くの界面や壁面が存在することから、超音波照射効率に問題があると考えられる。 Regarding mixing of fine metal powder from the horn tip, Freitas et al. Have proposed a metal / glass double tube type irradiation device (see Patent Document 4). As an application example thereof, relatively weak ultrasonic waves such as emulsion formation are proposed. In addition, since there are many interfaces and wall surfaces from the vibration surface to the sample liquid, it is considered that there is a problem in the efficiency of ultrasonic irradiation.
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上記従来技術の諸問題を解決することが可能な微細リポソームの製造技術を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、物理的分散作用に優れた低周波超音波を、超音波ホーン先端金属片の混入のおそれなく照射することと、更に、低周波超音波とは作用機構の異なる高周波超音波を相補的に用いることにより、効果的に、しかも、キャビテーションによる変性影響の少ない高品質のリポソームの作製が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。 Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive research with the goal of developing a production technology for fine liposomes that can solve the problems of the above-mentioned conventional technology in view of the above-mentioned conventional technology. As a result, it is possible to irradiate low-frequency ultrasonic waves with excellent physical dispersion action without fear of contamination of the tip of the ultrasonic horn, and to complement high-frequency ultrasonic waves with a different mechanism of action from low-frequency ultrasonic waves. As a result, it has been found that high-quality liposomes can be produced effectively and with little influence of denaturation due to cavitation, and the present invention has been completed.
我が国の高齢化社会の到来とともに、医薬に対する関心はますます高まりつつある。医薬品産業は、これまでに新規な医薬の開発に注力してきたが、その開発リスクは高く、「副作用がある」、「薬効は高いが製造コストが高くつく」等の理由で日の目を見なかったものも多い。これらの問題を解決し得る最も有効な手段の一つが、必要最低限の量の医薬を必要な場所に運搬するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）であり、その運搬体の一種として最も有用なものがリポソームである。このような応用分野におけるリポソーム製造において特に要求される事項としては、人体に投与するゆえに、（１）超高純度であること、（２）サイズが１５０ｎｍ以下であること、が挙げられる。本発明は、このような新規な医薬の開発において要望されている事項を備えたリポソームを調製することができるリポソームの製造装置、及び製造方法の提供を目的とするものである。 With the arrival of an aging society in Japan, interest in medicine is increasing. The pharmaceutical industry has so far focused on the development of new medicines, but its development risk is high and it has not seen the sun for reasons such as "having side effects" and "high efficacy but high manufacturing costs" There are many things. One of the most effective means that can solve these problems is a drug delivery system (DDS) that transports a minimum amount of medicine to a required place, and the most useful one of the carriers is a liposome. It is. Particularly required items in the production of liposomes in such application fields include (1) ultra-high purity and (2) size of 150 nm or less because they are administered to the human body. An object of the present invention is to provide a liposome production apparatus and a production method capable of preparing liposomes having the items required in the development of such a new medicine.
また、本発明は、低周波超音波と高周波超音波を用いることにより、効率良く、しかもキャビテーションによる変性影響の少ない高品質のリポソームを作製することを可能とするリポソームの製造装置、及び製造方法の提供を目的とするものである。また、本発明は、循環型超音波照射系と間接照射方式の採用により、サイズ均一性の高いリポソームを、効率良く、外部雰囲気の影響を低減させて製造することを可能とするリポソームの新規製造技術の提供を目的とするものである。更に、本発明は、リポソームの大量生産から実験室での微量の試料まで、広範囲の試料に対して適用が可能なリポソームの製造装置及びその製造方法を提供することを目的とするものである。 The present invention also provides an apparatus and a method for producing liposomes, which can produce high-quality liposomes efficiently and with little degeneration effect due to cavitation by using low-frequency ultrasound and high-frequency ultrasound. It is for the purpose of provision. In addition, the present invention provides a novel production of liposomes that can efficiently produce liposomes with high size uniformity by reducing the influence of the external atmosphere by adopting a circulating ultrasonic irradiation system and an indirect irradiation method. The purpose is to provide technology. Furthermore, an object of the present invention is to provide a liposome production apparatus and a production method thereof that can be applied to a wide range of samples from mass production of liposomes to a small amount of samples in a laboratory.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）超音波照射によりリポソームを製造するための装置において、複数の異なる周波数の超音波を照射する超音波照射手段を有するリポソームの製造装置であって、
超音波照射手段が、２０−５０ｋＨｚの低周波超音波照射手段、及び５００ｋＨｚ−２０ＭＨｚの高周波超音波照射手段を有することを特徴とするリポソームの製造装置。
（２）原料液を循環させながら、低周波超音波照射手段及び高周波超音波照射手段による超音波照射を可能とする循環流路を有する上記（１）に記載のリポソームの製造装置。
（３）低周波超音波、及び高周波超音波の間接照射系を有する上記（１）又は（２）に記載のリポソームの製造装置。
（４）１）キャビテーションによる損傷が少なく、２）ナノメートルサイズに揃った粒子径と均一な球形の形態を有するリポソームを調製することができる上記（１）から（３）のいずれか１項に記載のリポソームの製造装置。
（５）粒子径が、ナノレベルオーダーのリポソームを調製することができる上記（１）から（４）のいずれか１項に記載のリポソームの製造装置。
（６）複数の異なる周波数の超音波を原料液に照射することにより、微細リポソームを調製するリポソームの製造方法であって、
２０−５０ｋＨｚの低周波超音波、及び５００ｋＨｚ−２０ＭＨｚの高周波超音波を照射することを特徴とするリポソームの製造方法。
（７）原料液を循環させながら、低周波超音波及び高周波超音波を照射する上記（６）に記載のリポソームの製造方法。
（８）間接照射系により、低周波超音波、及び高周波超音波を照射する上記（６）又は（７）に記載のリポソームの製造方法。
（９）１）キャビテーションによる損傷が少なく、２）ナノメートルサイズに揃った粒子径と均一な球形の形態を有するリポソームを調製することができる上記（６）から（８）のいずれか１項に記載のリポソームの製造方法。
（１０）粒子径が、ナノレベルオーダーのリポソームを調製する上記（６）から（９）のいずれか１項に記載のリポソームの製造方法。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) An apparatus for preparing liposomes by ultrasonic irradiation, a manufacturing apparatus of azure liposomes that have a ultrasound irradiation means for irradiating ultrasonic waves of a plurality of different frequencies,
The apparatus for producing liposomes, wherein the ultrasonic irradiation means has a low frequency ultrasonic irradiation means of 20-50 kHz and a high frequency ultrasonic irradiation means of 500 kHz-20 MHz.
(2) while circulating the raw material solution, liposome producing apparatus according to the above (1) having a circulation passage to allow ultrasonic irradiation by low-frequency ultrasonic irradiation means及beauty high frequency ultrasound irradiation means.
( 3 ) The liposome production apparatus according to ( 1) or (2) above, which has an indirect irradiation system of low-frequency ultrasound and high-frequency ultrasound.
( 4 ) In any one of the above (1) to ( 3 ), liposomes having 1) little damage due to cavitation and 2) a nanometer-sized particle diameter and a uniform spherical shape can be prepared. The manufacturing apparatus of the liposome described.
( 5 ) The liposome production apparatus according to any one of (1) to (4), wherein a liposome having a particle size of nano-level order can be prepared.
(6) by ultrasonic waves of a plurality of different frequencies is irradiated to the raw material liquid, a manufacturing method of lapis lazuli liposomes to prepare a fine liposomes,
A method for producing a liposome, comprising irradiating a low frequency ultrasonic wave of 20-50 kHz and a high frequency ultrasonic wave of 500 kHz-20 MHz.
(7) while circulating the raw material liquid, a manufacturing method of liposome according to the above (6) for irradiating the low frequency ultrasonic sound spreading beauty high frequency ultrasound.
( 8 ) The method for producing a liposome according to ( 6) or (7) , wherein the low frequency ultrasonic wave and the high frequency ultrasonic wave are irradiated by an indirect irradiation system.
( 9 ) In any one of the above ( 6 ) to ( 8 ), liposomes having 1) little damage due to cavitation and 2) a nanometer-sized particle diameter and a uniform spherical shape can be prepared. The manufacturing method of the liposome of description.
(10) particle size, production method of liposome according to any one of (6) you prepare liposomes nano-level order (9).
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、低周波超音波照射、及び高周波超音波照射により、キャビテーションによる損傷が少なく、ナノメートルサイズの平均粒径と、均一な球形の粒形を有するリポソームを調製する製造装置、及び製造方法に係るものであり、本発明の特徴は、（１）複数の異なる周波数の超音波を照射する機構、及び（２）循環型の超音波間接照射系を有することの２点である。本発明では、原料液を、振幅を大きく取りやすい低周波超音波によりマイクロレベルの粒径に分散させ、次いで、加速度が大きくなる高周波超音波によりナノレベルまで微細化させてナノメートルオーダーのリポソームを調製するものである。また、本発明では、原料液を循環して超音波照射することにより、外部雰囲気の影響を制御、低減することができる。
Next, the present invention will be described in more detail.
The present invention relates to a production apparatus and a production method for preparing liposomes having a nanometer-size average particle diameter and a uniform spherical particle shape with less damage due to cavitation by low-frequency ultrasonic irradiation and high-frequency ultrasonic irradiation. The features of the present invention are two points: (1) a mechanism for irradiating a plurality of ultrasonic waves having different frequencies, and (2) a circulation type ultrasonic indirect irradiation system. In the present invention, the raw material liquid is dispersed to a micro-level particle size by low-frequency ultrasonic waves that can easily take a large amplitude, and then finely divided to nano-levels by high-frequency ultrasonic waves that increase acceleration to form nanometer-order liposomes. To be prepared. In the present invention, the influence of the external atmosphere can be controlled and reduced by circulating the raw material liquid and irradiating with ultrasonic waves.
次に、（１）複数の異なる周波数の超音波を照射する機構について説明すると、本発明においては、原料をマイクロレベルの粒径に分散させる低周波超音波（２０−５０ｋＨｚ、好適には２８−４０ｋＨｚ）による照射と、更に、キャビテーション損傷の少ない条件下で、リポソーム粒径をナノレベルまで極微細化、均一化する作用を有する高周波超音波（５００ｋＨｚ−２０ＭＨｚ、好適には１−５ＭＨｚ）による照射の併用を特徴とするものである。本発明は、２つの異なる周波数の超音波、すなわち、振幅を大きくとりやすい低周波の超音波と、加速度が大きくなる高周波の超音波を組み合わせることにより、微細なリポソーム（超音波リポソーム）を高収率で調製し得る画期的な機構を有する。 Next, (1) a mechanism for irradiating a plurality of ultrasonic waves having different frequencies will be described. In the present invention, low frequency ultrasonic waves (20-50 kHz, preferably 28- 40 kHz) and irradiation with high frequency ultrasonic waves (500 kHz to 20 MHz, preferably 1 to 5 MHz) having the effect of miniaturizing and homogenizing the liposome particle size to the nano level under conditions with little cavitation damage. It is characterized by the combined use. The present invention achieves high yield of fine liposomes (ultrasound liposomes) by combining two different frequency ultrasonic waves, that is, a low frequency ultrasonic wave that easily takes a large amplitude and a high frequency ultrasonic wave that increases acceleration. It has an innovative mechanism that can be prepared at a high rate.
低周波領域においては、振動振幅を増幅する機構であるホーンを使用することが容易であり、１０−２０倍程度の増幅が可能である。このような大きな振動振幅により、活発なキャビテーションがホーン直下に形成され、キャビテーション気泡からの衝撃波や、激しい渦流によるせん断力等がリポソーム原料の微細化に極めて有効となる。しかしながら、極めて強力な超音波場が形成されるために、ホーン先端からの材料金属の飛散が問題となる。 In the low frequency region, it is easy to use a horn that is a mechanism for amplifying the vibration amplitude, and amplification of about 10 to 20 times is possible. Due to such a large vibration amplitude, active cavitation is formed immediately below the horn, and shock waves from cavitation bubbles, shearing force due to intense vortex flow, and the like are extremely effective for refining the liposome raw material. However, since an extremely strong ultrasonic field is formed, scattering of the material metal from the horn tip becomes a problem.
そこで、ホーンの利点を活かしつつ、金属片の混入を防ぐために、試料とホーンの間にカップリング材を介した間接照射とする。カップリング材に求められる性能は、超音波エネルギーの吸収が少ないこと、強力な超音波場においても損傷を受けにくいこと、生体に対して有害でないこと等である。有害でないこと、という観点から、多くの金属は対象外となる。通常、ホーンに使用される金属であるチタンは、生体に与える害毒が比較的小さい金属であるが、金属微粉の混入により細胞損傷等の恐れが高まり望ましいものではない。 Therefore, in order to prevent the mixing of metal pieces while taking advantage of the horn, indirect irradiation is performed between the sample and the horn via a coupling material. The performance required for the coupling material is that it absorbs less ultrasonic energy, is not easily damaged even in a strong ultrasonic field, and is not harmful to a living body. Many metals are excluded from the point of view that they are not harmful. Usually, titanium, which is a metal used in a horn, is a metal that has a relatively small poisonous effect on a living body, but is not desirable because of the risk of cell damage due to the mixing of metal fine powder.
一方、ガラスやセラミックス材料等について、カップリング材としての可能性を検討したが、石英ガラス、アルミナやジルコニア等、ほとんどのセラミックス系の材料において短時間（１０分程度）で表面の損傷が顕著となり、１時間以上の長時間にわたる超音波照射に耐性のある材料を見出すことができなかった。そこで、シリコーンゴム等の可とう性高分子系材料について試験を行ったところ、耐性があることが判明した。この際、超音波の吸収を少なくするためには０．５ｍｍ以下の厚さが好ましいとともに、ホーン先端に形成される強力音場を有効に利用するためには、ホーンからの距離をとることなく、接触させて設置することが望ましいことを見出した。これらの知見により、低周波超音波による高エネルギー密度の反応場を、金属片等の不純物混入の恐れなく、形成することが可能となった。この結果、リポソーム原料の粒径をマイクロメートルレベルの大きさまで容易に減少させることが可能となった。 On the other hand, the possibility of coupling materials such as glass and ceramic materials was examined. However, surface damage was noticeable in most ceramic materials such as quartz glass, alumina and zirconia in a short time (about 10 minutes). It was not possible to find a material resistant to ultrasonic irradiation for a long time of 1 hour or longer. Then, when it tested about flexible polymer materials, such as silicone rubber, it became clear that it had tolerance. At this time, in order to reduce the absorption of ultrasonic waves, a thickness of 0.5 mm or less is preferable, and in order to effectively use the strong sound field formed at the tip of the horn, the distance from the horn is not taken. It has been found that it is desirable to place it in contact. Based on these findings, it has become possible to form a reaction field with high energy density by low-frequency ultrasonic waves without fear of contamination of metal pieces or the like. As a result, it became possible to easily reduce the particle size of the liposome raw material to the micrometer level.
また、カップリング材としての膜を介しての間接照射とすることにより、試料溶液と空気との接触を制御することが容易となり、リポソームの空気による酸化等、従来法でしばしば問題となっていた点を克服することができる、という利点も同時に付加されることを見出した。このように、低周波超音波を、ホーンを用いて振幅増幅し、更に、間接照射することによって、不純物混入のない、効率的にリポソーム原料の微細化を達成することが可能となる。 Indirect irradiation through a membrane as a coupling material makes it easy to control the contact between the sample solution and air, which has often been a problem in conventional methods such as the oxidation of liposomes with air. It has been found that the advantage that the point can be overcome is also added at the same time. In this way, by amplifying the amplitude of low-frequency ultrasonic waves using a horn and further indirectly irradiating them, it is possible to efficiently miniaturize the liposome raw material without mixing impurities.
しかしながら、超音波リポソーム作製においてしばしば問題とされるキャビテーション由来の原料損傷については、このような機構だけで解決することは難しい。そこで、高周波超音波の照射を付加するという本発明のもう一つの要点が重要となる。キャビテーションは超音波による気泡の発生を原因とするが、発生した気泡の膨張−収縮により酸化剤や衝撃波の生成が起きる。キャビテーション閾値は超音波の周波数に対して指数的に上昇することが知られており、高周波超音波を使用することによりキャビテーションの弊害を取り除くことが可能となる（Ｔ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｌｏｒｉｍｅｒ、“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２００２）参照）。 However, cavitation-derived material damage, which is often a problem in ultrasonic liposome production, is difficult to solve by such a mechanism alone. Therefore, another important point of the present invention of adding irradiation of high-frequency ultrasonic waves is important. Cavitation is caused by the generation of bubbles by ultrasonic waves, but oxidant and shock waves are generated by the expansion and contraction of the generated bubbles. It is known that the cavitation threshold increases exponentially with respect to the frequency of the ultrasonic wave, and the adverse effect of cavitation can be eliminated by using high-frequency ultrasonic waves (TJ Mason, JP). Lorimer, “Applied Sonochemistry,” Wiley-VCH (2002)).
一方、キャビテーション気泡によって生成される酸化剤の量は、気泡内への水分蒸発量等との関連から２００−５００ｋＨｚの領域においてピークを持つことが知られている
（Ｓ．Ｋｏｄａ，Ｔ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．Ｋｏｎｄｏ，Ｈ．Ｍｉｔｏｍｅ， Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０（２００３）１４９−１５６参照）。
On the other hand, the amount of oxidant generated by cavitation bubbles is known to have a peak in the region of 200 to 500 kHz because of the relationship with the amount of water evaporation into the bubbles (S. Koda, T. Kimura, T. Kondo, H. Mitome, Ultrasonics Sonochemistry, 10 (2003) 149-156).
そこで、これらのキャビテーションによる酸化剤形成の影響を小さくするためには、酸化剤生成の活発な周波数領域を大きく上回る１−２０ＭＨｚといった高周波超音波の照射が望ましい。このような領域における超音波の作用機構は、低周波超音波とは異なり、超音波による加速度に由来するとの考え方が一般的であるが、現状では明確な根拠は無い（実吉純一、菊池喜充、能本乙彦、”超音波技術便覧 新訂版”、ｐｐ．１２１、日刊工業新聞（１９７８）参照）。 Therefore, in order to reduce the influence of oxidant formation due to these cavitations, it is desirable to irradiate high-frequency ultrasonic waves of 1 to 20 MHz that greatly exceed the active frequency region of oxidant generation. Unlike the low-frequency ultrasound, the mechanism of action of ultrasound in such a region is generally derived from the acceleration of ultrasound, but there is currently no clear basis (Junichi Miyoshi, Yoshimitsu Kikuchi) Notomoto Otohiko, “Ultrasonic Technology Handbook, New Edition”, pp. 121, Nikkan Kogyo Shimbun (1978)).
高周波超音波による作用は、ホーンを使用した場合の低周波のような力強さは無いものの、洗浄におけるナノサイズ汚れの除去や、ナノエマルションの安定化に有効であるといわれている（Ｋ．Ｋａｍｏｇａｗａ，Ｇ．Ｏｋｕｄａｉｒａ，Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．Ｓａｋａｉ，Ｈ．Ｓａｋａｉ ａｎｄ Ｍ．Ａｂｅ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０ （２００４）２０４３−２０４７参照）。 The action of high-frequency ultrasonic waves is said to be effective for removal of nano-size dirt in washing and stabilization of nanoemulsions, although there is no strength as low frequency when a horn is used (K. Kamogawa, G. Okudaira, M. Matsumoto, T. Sakai, H. Sakai and M. Abe, Langmuir, 20 (2004) 2043-2047).
そこで、低周波超音波による微細化を必要最小限の短時間行うとともに、微細化されたリポソーム原料を、更に、目的とする１５０ｎｍ以下の大きさで分布の狭いものにそろえるという作用を高周波超音波で分担し、キャビテーションによる原料損傷を最小限に押さえ込むというプロセスを確立した。ここで、高周波超音波においては、ホーンの作製が不可能であることから、凹レンズ型あるいはとい型の２つの集束型照射機構について比較検討し、超音波の作用効率を高めることとした。 Therefore, the high-frequency ultrasonic wave has the effect of performing the miniaturization by the low-frequency ultrasonic wave for the minimum necessary time and further aligning the miniaturized liposome raw material with a target having a size of 150 nm or less and a narrow distribution. And established a process for minimizing material damage due to cavitation. Here, since it is impossible to produce a horn in high-frequency ultrasonic waves, two focusing irradiation mechanisms of a concave lens type and a spiral type are compared and examined to increase the working efficiency of ultrasonic waves.
得られた結果としては、凹レンズ型集束型照射機構は１点に強い音場を形成できるが、作用領域が狭く、極端に高い音圧は、たとえ高周波であってもキャビテーション発生の可能性を高めることから好ましいものではなかった。一方、パイプ状の流れに沿って超音波を集束できるとい型照射機構では良好な結果が得られた。更に、このようなパイプ状の流通型照射機構とすることにより、低周波超音波照射部分で実現された間接照射とすることによるメリット、すなわち、試料溶液と雰囲気との接触を制御することが容易となり、空気による酸化等、従来法でしばしば問題となっていた点を克服することができるという利点を引き続き保持することが可能となる。 As a result, the concave lens focusing type irradiation mechanism can form a strong sound field at one point, but the working area is narrow, and the extremely high sound pressure increases the possibility of cavitation even at high frequencies. Therefore, it was not preferable. On the other hand, a good result was obtained with a die irradiation mechanism that can focus ultrasonic waves along a pipe-like flow. Furthermore, by adopting such a pipe-shaped flow-type irradiation mechanism, it is easy to control the merit of indirect irradiation realized in the low-frequency ultrasonic irradiation part, that is, contact between the sample solution and the atmosphere. Thus, it is possible to continue to maintain the advantage of overcoming problems often encountered in the conventional methods, such as oxidation with air.
次に、（２）循環型の超音波間接照射系について説明すると、本発明においては、低周波超音波照射部位、及び高周波超音波照射部位の双方を間接照射とすることにより、外部雰囲気の影響を制御、低減した循環流路系のプロセスとすることができる。このような流れ系を実現することによるメリットとしては、１）空気酸化等の雰囲気からの悪影響を取り除くことが容易となる、２）製品への不純物混入を押さえ高純度品の製造に有利である、３）反応原料を一度に大量に処理することが可能である、４）逆に試料量が少ない場合でも操作が可能である、５）照射部位が固定されるため、すべての試料溶液に対して均一なエネルギー照射を可能とする、等が挙げられる。このことは、サイズ均一性の高い超音波リポソーム調製に有利となる。また、６）温度調節が容易である、７）プロセスの進行状況をモニタすることが容易である、といった、これまでにない多くの利点を達成することができる。 Next, (2) the circulation-type ultrasonic indirect irradiation system will be described. In the present invention, both the low-frequency ultrasonic irradiation site and the high-frequency ultrasonic irradiation site are used as indirect irradiation, thereby affecting the influence of the external atmosphere. Can be controlled and reduced in the circulation flow path system process. Advantages of realizing such a flow system are as follows: 1) It is easy to remove adverse effects from atmosphere such as air oxidation, etc. 2) It is advantageous for manufacturing high-purity products by preventing impurities from entering the product. 3) It is possible to process a large amount of reaction raw materials at a time. 4) On the contrary, operation is possible even when the amount of sample is small. 5) Because the irradiation site is fixed, For example, enabling uniform energy irradiation. This is advantageous for preparation of ultrasonic liposomes with high size uniformity. In addition, many unprecedented advantages can be achieved, such as 6) temperature adjustment is easy, and 7) it is easy to monitor the progress of the process.
更に、強制的に試料を循環させる方式によってもたらされる流れの影響は、リポソームの調製プロセス自体にも好影響を及ぼすことが確認された。すなわち、ナノメートルオーダーのリポソーム調製においては、超音波による脂質集合体の分散作用が重要となるが、一方で、微細化されたリポソームの再集合化も起きており、必ずしも長時間の超音波照射が微細化に結びつかない。特に、超音波による定在波が形成されると、リポソームは特定の空間に捕捉されるようになり、リポソーム間の衝突回数が増加し、再集合化が顕著となる。一方、試料を流れによって輸送する効果を付加した循環型照射系においては、リポソームが空間の特定位置に止まることなく移動するので、再集合化が抑制され、リポソームの微細化の進行に益するところとなる。 Furthermore, it has been confirmed that the flow effect brought about by the forced circulation of the sample has a positive effect on the liposome preparation process itself. In other words, in the preparation of nanometer-order liposomes, the action of dispersing lipid aggregates by ultrasound is important, but on the other hand, re-aggregation of micronized liposomes has also occurred, and it is not always necessary to irradiate for a long time. Does not lead to miniaturization. In particular, when a standing wave by ultrasonic waves is formed, the liposome is trapped in a specific space, the number of collisions between the liposomes is increased, and reassembly becomes remarkable. On the other hand, in the circulation type irradiation system that adds the effect of transporting the sample by flow, the liposome moves without stopping at a specific position in the space, so that reassembly is suppressed and it is beneficial for the progress of the miniaturization of the liposome. It becomes.
次に、本発明の装置について、図面を参照しながらその一例を説明する。
本発明の超音波照射装置は、例えば、図１に示すように、循環流路を構成する回路に、流路変更用の３方コック（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）、低周波超音波照射デバイス（ＬＦ）、高周波超音波照射デバイス（ＨＦ）、循環用ポンプ（Ｐ）、及び反応液貯留槽（Ｒ）、が配置された構造を有する。まず、反応液貯留槽（Ｒ）に収容された反応液（原料液）は、ポンプ（Ｐ）により低周波超音波照射デバイス（ＬＦ）へ送られ、そこで反応液に低周波が照射されて、リポソーム原料の粒径は、マイクロメートルレベルの大きさにまで減少する。このとき、３方コックＣ１、Ｃ２を操作して、貯留槽（Ｒ）と低周波超音波照射デバイス（ＬＲ）を含む循環流路を形成することにより、反応液を、この流路中で循環させながら低周波超音波照射を複数回行ってもよい。リポソーム原料は、マイクロメートルレベルの微粒子となり、貯留槽（Ｒ）中に貯留される。
Next, an example of the apparatus of the present invention will be described with reference to the drawings.
For example, as shown in FIG. 1, the ultrasonic irradiation apparatus of the present invention includes a three-way cock (C1, C2, C3) for changing a flow path, a low-frequency ultrasonic irradiation device ( LF), a high-frequency ultrasonic irradiation device (HF), a circulation pump (P), and a reaction liquid storage tank (R). First, the reaction liquid (raw material liquid) stored in the reaction liquid storage tank (R) is sent to the low frequency ultrasonic irradiation device (LF) by the pump (P), where the reaction liquid is irradiated with low frequency, The particle size of the liposome material is reduced to a micrometer level. At this time, the reaction liquid is circulated in the flow path by operating the three-way cocks C1 and C2 to form a circulation flow path including the storage tank (R) and the low-frequency ultrasonic irradiation device (LR). The low frequency ultrasonic irradiation may be performed a plurality of times. The liposome raw material becomes micrometer-level fine particles and is stored in the storage tank (R).
次に、上記工程で調製され、貯留槽（Ｒ）中に貯留された、マイクロメートルレベルのリポソーム原料は、ポンプ（Ｐ）により高周波超音波照射デバイス（ＨＦ）へ送られ、そこで高周波超音波が照射されて、リポソーム粒径がナノメートルレベルの大きさにまで微粒化される。このとき、３方コックＣ２、Ｃ３、Ｃ１を操作することにより、貯留槽（Ｒ）と高周波超音波照射デバイス（ＨＦ）を含む循環流路を形成し、反応液をこの流路中で循環させながら高周波超音波を複数回照射してもよい。低周波超音波及び高周波超音波を照射してナノメートルサイズの微粒リポソームを調製し、貯留槽（Ｒ）中に貯留させて製品とする。また、貯留槽（Ｒ）、低周波超音波照射デバイス（ＬＦ）、高周波超音波照射デバイス（ＨＦ）を含む循環流路を形成して、ナノメートルサイズのリポソームを製造することができる。 Next, the liposome raw material of micrometer level prepared in the above process and stored in the storage tank (R) is sent to the high frequency ultrasonic irradiation device (HF) by the pump (P), where the high frequency ultrasonic waves are transmitted. Upon irradiation, the liposome particle size is atomized to a nanometer level. At this time, by operating the three-way cocks C2, C3, and C1, a circulation channel including the storage tank (R) and the high frequency ultrasonic irradiation device (HF) is formed, and the reaction liquid is circulated in the channel. However, high-frequency ultrasonic waves may be irradiated multiple times. Nanometer-sized fine liposomes are prepared by irradiation with low-frequency ultrasonic waves and high-frequency ultrasonic waves, and stored in a storage tank (R) to obtain a product. Moreover, a circulation channel including a storage tank (R), a low-frequency ultrasonic irradiation device (LF), and a high-frequency ultrasonic irradiation device (HF) can be formed to produce nanometer-sized liposomes.
図２に示す高周波超音波照射デバイス（ＨＦ）は、循環用チューブが両端に接続された照射チューブ、及びとい型高周波振動子が恒温水槽中に設置され、照射チューブ中を連続して通過する反応液に高周波超音波が照射される構造を有している。また、図３に示す低周波超音波照射デバイス（ＬＦ）は、循環用チューブが両端に接続された照射液槽が恒温槽中に設置され、照射液槽中を連続して通過する反応液に、低周波超音波ホーンにより低周波超音波が、照射膜（カップリング材）を介して、照射される構造を有している。 The high-frequency ultrasonic irradiation device (HF) shown in FIG. 2 is a reaction in which an irradiation tube having a circulation tube connected to both ends and a spiral high-frequency vibrator are installed in a thermostatic water tank and continuously pass through the irradiation tube. The liquid has a structure in which high-frequency ultrasonic waves are irradiated. In addition, the low-frequency ultrasonic irradiation device (LF) shown in FIG. 3 has an irradiation liquid tank in which a circulation tube is connected to both ends and is installed in a thermostatic tank. The reaction liquid continuously passes through the irradiation liquid tank. The low-frequency ultrasonic horn emits low-frequency ultrasonic waves via an irradiation film (coupling material).
上記の低周波超音波照射により調製されたリポソームには、図４に示すように、粒径のばらつきが大きく、数ミクロンサイズの大きな脂質集合体の残存が認められるが、低周波超音波の照射に続いて、高周波超音波を照射すると、図５に示すように、球形粒子で形状が揃った、ナノメートルサイズの高品位なリポソームが得られる。 As shown in FIG. 4, the liposomes prepared by the above-mentioned low-frequency ultrasonic irradiation have a large variation in particle size and large lipid aggregates of several micron size are observed. Subsequent to irradiation with high-frequency ultrasonic waves, nanometer-sized high-quality liposomes having a uniform shape with spherical particles are obtained as shown in FIG.
本発明により、（１）現行の超音波リポソーム調製法の中で金属混入を防げるものは、浴型超音波照射装置を用いて試験管に照射を施すという、「家内制手工業」的な方法であり、この方法の主な欠点は、（ａ）大量調製が困難であること、（ｂ）照射効率及び収率が低いであるが、本発明では、（イ）循環機構の採用により大量調製・自動化が可能となる、（ロ）複数周波数の超音波照射により製品の品質を均一に保つことができるという効果が得られる、（２）超音波リポソームの原料としては、卵黄フォスファチジルコリン、大豆フォスファチジルコリン等の、比較的安価な脂質から、高付加価値を有する高価なもの（例えば、新規合成脂質）まで幅広く使用することができる、（３）本発明は、大量調製を可能とする循環機構を提供できるとともに、超音波リポソームの実用化のための基礎研究での少量調製への対応といったニーズへも適用が可能である、（４）照射装置の小型化により、ごく少量の出発原料に対しても効率的な超音波照射が可能であり、１ないし１０ミリリットル程度の少量の試料に対しても有効な超音波照射が可能となる、という効果が奏される。 According to the present invention, (1) the current ultrasonic liposome preparation method that prevents metal contamination is a “household industry” method in which a test tube is irradiated using a bath-type ultrasonic irradiation device. The main drawbacks of this method are (a) difficulty in large-scale preparation and (b) low irradiation efficiency and yield. In the present invention, (b) a large-scale preparation and It can be automated. (B) The product quality can be kept uniform by irradiating with multiple frequency ultrasonic waves. (2) The raw materials for ultrasonic liposomes are egg yolk phosphatidylcholine, soybean It can be used widely from relatively inexpensive lipids such as phosphatidylcholine to expensive ones with high added value (for example, newly synthesized lipids). (3) The present invention enables mass production. Provides circulation mechanism It can also be applied to the needs of small-scale preparations in basic research for the practical application of ultrasonic liposomes. (4) Even with very small amounts of starting materials, the irradiation equipment is downsized. Efficient ultrasonic irradiation is possible, and effective ultrasonic irradiation is possible even for a small sample of about 1 to 10 ml.
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited at all by the following Examples.
本実施例では、脂質として、卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ，Ｐ３５５６）を使用してリポソームを調製した。まず、粉末状態の脂質を、洗浄済みのガラスの試験管に２５ｍｇ秤り取り、クロロホルムを加えて溶解させた後、ドラフト中でパスツールピペット先端からのＮ２ガスのフローで溶媒を蒸発させて、試験管の底面に脂質をフィルム状に乾かした。試験管の口をアルミホイルで軽く蓋をして、真空デシケータ内に入れ、ロータリーポンプで一晩真空状態におき、有機溶媒を除去した。 In this example, liposomes were prepared using egg yolk-derived phosphatidylcholine (Sigma, P3556) as the lipid. First, 25 mg of lipid in a powder state is weighed into a cleaned glass test tube and dissolved by adding chloroform, and then the solvent is evaporated in a draft with a flow of N 2 gas from the tip of a Pasteur pipette. The lipid was dried in a film on the bottom of the test tube. The mouth of the test tube was lightly covered with aluminum foil, placed in a vacuum desiccator, and placed in a vacuum state with a rotary pump overnight to remove the organic solvent.
次に、真空デシケータから取り出した試験管に洗浄したガラスビーズを１ｇ程度入れ、更に、バッファー液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を２．５ｍｌ入れ、振動型ミキサーで数分間強く攪拌して脂質を分散させた。このように準備した多層ベシクルの分散液を１０倍に希釈した後、超音波を照射した。図１の３方コック、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３を操作することにより、試料液を循環させながら低周波超音波（２０ｋＨｚ）による照射を１０分間行った。超音波出力は５０Ｗとした。次に、３方コック、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３を操作することにより、高周波超音波（１ＭＨｚ）による照射を３０分間行った。この時の超音波出力は３０Ｗとした。 Next, about 1 g of the washed glass beads was put into a test tube taken out from the vacuum desiccator, and further 2.5 ml of a buffer solution (Phosphate Buffered Saline) was added, and the lipid was dispersed by vigorously stirring for several minutes with a vibration mixer. . The multilayer vesicle dispersion prepared in this way was diluted 10 times, and then irradiated with ultrasonic waves. By operating the three-way cocks C1, C2, and C3 in FIG. 1, irradiation with low frequency ultrasonic waves (20 kHz) was performed for 10 minutes while circulating the sample liquid. The ultrasonic output was 50 W. Next, irradiation with high frequency ultrasonic waves (1 MHz) was performed for 30 minutes by operating the three-way cock, C1, C2, and C3. The ultrasonic output at this time was 30 W.
低周波超音波照射時に得られたリポソームには、粒径のばらつきが大きく、数ミクロンサイズの大きな脂質集合体の残存が認められた。更に、比較的小さな粒子の集合体を観察すると、棒状のリポソームが認められた（図４参照）。一方、高周波超音波を照射後のものは、ほとんどが球形の形態になるとともに、粒子径も数十ｎｍから１５０ｎｍ程度に揃ったものとなり、好ましい形態と粒径分布へと変化していることが確認された（図５参照）。 The liposomes obtained at the time of low-frequency ultrasonic irradiation had a large variation in particle size, and a large lipid aggregate having a size of several microns was observed. Furthermore, when an aggregate of relatively small particles was observed, rod-shaped liposomes were observed (see FIG. 4). On the other hand, after irradiation with high-frequency ultrasonic waves, most of them have a spherical shape, and the particle diameters are aligned from about several tens of nm to 150 nm, and have changed to a preferable form and particle size distribution. It was confirmed (see FIG. 5).
以上詳述したように、本発明は、複数の異なる周波数の超音波照射によるリポソームの製造装置、及びその製造方法に係るものであり、本発明により、リポソーム原料液に複数の異なる周波数の超音波を照射することにより、ナノメートルレベルの粒径を有し、粒径分布が狭く、異物が混入することなく、高品位なリポソームを調製することが可能なリポソーム製造装置、及び製造方法を提供することが可能となる。本発明は、物理的分散作用に優れた低周波超音波照射を行い、更に、この低周波超音波とは作用機構が異なる高周波超音波を相補的に用いることにより、効率良く微細リポソームを製造することを可能とするリポソームの新しい製造技術の提供を可能とするものである。本発明のリポソーム製造技術により、超音波ホーン等からの金属混入がなく、しかも、キャビテーションによる障害の少ない、高品位のリポソームを製造することができる。更に、本発明は、必要最低限の量の医薬を、必要な場所に運搬するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の運搬体として有用な、ナノキャリア（リポソーム）を提供し、人体に投与するゆえに要求される、超高純度であること、サイズが数十ｎｍから１５０ｎｍであることを満たすリポソームの製造装置、及び製造方法の提供を可能とするものである。 As described above in detail, the present invention relates to an apparatus for producing liposomes by ultrasonic irradiation with a plurality of different frequencies, and a method for producing the same. According to the present invention, ultrasonic waves having a plurality of different frequencies are applied to a liposome raw material liquid. Are provided with a liposome production apparatus and a production method capable of preparing high-grade liposomes having a nanometer level particle size, a narrow particle size distribution, and no contamination by foreign matter. It becomes possible. The present invention irradiates low-frequency ultrasonic waves excellent in physical dispersion action, and further, by using complementary high-frequency ultrasonic waves having a different action mechanism from the low-frequency ultrasonic waves, efficiently produce fine liposomes. Therefore, it is possible to provide a new production technology for liposomes. The liposome production technology of the present invention can produce high-quality liposomes that are free from metal contamination from an ultrasonic horn or the like and that are less susceptible to cavitation. Furthermore, the present invention provides a nanocarrier (liposome) that is useful as a carrier for a drug delivery system (DDS) that transports a minimum amount of medicine to a necessary place, and is required because it is administered to the human body. It is possible to provide a liposome production apparatus and production method satisfying the ultra high purity and the size of several tens to 150 nm.
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３：３方コック
ＨＦ：高周波超音波照射デバイス
ＬＦ：低周波超音波照射デバイス
Ｐ：循環用ポンプ
Ｒ：反応液貯留槽
C1, C2, C3: 3-way cock HF: High-frequency ultrasonic irradiation device LF: Low-frequency ultrasonic irradiation device P: Circulation pump R: Reaction liquid storage tank
Claims (10)
超音波照射手段が、２０−５０ｋＨｚの低周波超音波照射手段、及び５００ｋＨｚ−２０ＭＨｚの高周波超音波照射手段を有することを特徴とするリポソームの製造装置。 An apparatus for preparing liposomes by ultrasonic irradiation, a manufacturing apparatus of azure liposomes that have a ultrasound irradiation means for irradiating ultrasonic waves of a plurality of different frequencies,
The apparatus for producing liposomes, wherein the ultrasonic irradiation means has a low frequency ultrasonic irradiation means of 20-50 kHz and a high frequency ultrasonic irradiation means of 500 kHz-20 MHz.
２０−５０ｋＨｚの低周波超音波、及び５００ｋＨｚ−２０ＭＨｚの高周波超音波を照射することを特徴とするリポソームの製造方法。 Ultrasound of a plurality of different frequencies by irradiating the raw material liquid, a manufacturing method of lapis lazuli liposomes to prepare a fine liposomes,
A method for producing a liposome, comprising irradiating a low frequency ultrasonic wave of 20-50 kHz and a high frequency ultrasonic wave of 500 kHz-20 MHz.
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