JP4534046B2 - 臓器特異的幹細胞の増殖方法及び増殖装置 - Google Patents
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Description
幹細胞は種々の再生医療に応用できることから、生体外における幹細胞の培養技術に関して様々な試みがなされている。現在、ES細胞や成体幹細胞等において、多胚葉に分化可能な細胞レベルでの試験管内増殖の技術が確立しつつある。しかしながら、臓器特異的幹細胞については、試験管内増殖の増殖誘導は不可能である。
発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、幹細胞が生体内のニッチ領域で未分化性を維持し且つ静止期状態にあるという既存の概念が全ての現象を説明しうるものではなく、幹細胞が生体内のニッチ領域で未分化性を維持しながらも増殖可能であるといった環境を新規に見出すことに成功した。すなわち、本発明は以下を包含するものである。
(1) 臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とを緩やかに接着させた状態で培養する、臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(2) 上記臓器特異的幹細胞と上記血管内皮細胞とは、互いに偽足同士で接着していることを特徴とする(1)記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(3) 上記臓器特異的幹細胞及び上記血管内皮細胞では、レセプター型チロシンキナーゼTIE2が活性化していることを特徴とする(1)記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(4) 上記臓器特異的幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする(1)記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(5) 上記臓器特異的幹細胞と上記血管内皮細胞とを、多孔材料を介して接触させた状態で培養することを特徴とする(1)記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(6) 臓器特異的幹細胞に対する培養液と血管内皮細胞に対する培養液とを異なる組成とすることを特徴とする(1)記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
(7) 臓器特異的幹細胞を培養するための第1培養部と、
血管内皮細胞を培養するための第2培養部と、
上記第1培養部と上記第2培養部との間を区画する多孔部材と、
を備える臓器特異的幹細胞の培養装置。
(8) 上記多孔部材は多孔膜であり、当該多孔膜が上記第1培養部及び上記第2培養部の間に配設されたことを特徴とする(7)記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
(9) 上記多孔部材は、外周面に多孔を有する中空糸であり、上記第1培養部が当該中空糸の内部であり、上記第2培養部が当該中空糸の外部であることを特徴とする(7)記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
(10) 上記第1培養部に接続された臓器特異的幹細胞供給路と、上記第2培養部に接続された血管内皮細胞供給路とを更に備えることを特徴とする(7)記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004−119179号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、臓器特異的幹細胞の培養装置における臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞と接着状態を模式的に示す要部断面図である。
図3は、本発明を適用した臓器特異的幹細胞の培養装置の他の例を示す斜視図である。
図4は、本発明を適用した臓器特異的幹細胞の培養装置の更に他の例を示す斜視図である。
図5は、図4に示す培養装置における臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞と接着状態を模式的に示す要部断面図である。
図6は、TIE2抗体、c−Kit抗体或いはFlk−1抗体で免疫染色した胎児期マウスにおける臍腸間膜動脈近傍の写真である。
図7は、angiopoietin−1によるTIE2の活性化及び細胞接着誘導を検証した結果を示す写真である。
図8は、野生型マウス並びにTIE2遺伝子のノックアウトマウスにおける臍腸間膜動脈近傍の写真である。
図9Aは、胎児肝内における組織学的観察の結果を示し、血管内皮細胞からなる巣状網内で造血幹細胞が増殖している現場を示す写真である。
図9Bは、図9Aの一部を拡大した写真である。
図9Cは、成体骨髄内における組織学的観察の結果を示し、血管内腔において造血幹細胞が増殖する現場を示す写真である。
図10は、恒常的活性化型マウスTIE2遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける臍腸間膜動脈内で、造血幹細胞の増殖する現場を示す写真である。
図11は、恒常的活性化型TIE2あるいは野生型TIE2を発現するbEnd3と恒常的活性化型TIE2を発現するBa/F3細胞との細胞接着を検討した結果を示す写真である。
図12は、造血幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着した状態において、造血幹細胞が自己複製したことを示す写真である。
図13A及びBはそれぞれ、人の臍帯血から回収した造血幹細胞であっても、血管内皮細胞と緩やかな接着状態を作出することによって、増殖したことを示す写真である。
臓器特異的幹細胞の培養方法
本発明に係る臓器特異的幹細胞の培養方法においては、増殖目的である臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させて培養する。本発明において、臓器特異的幹細胞とは、特定の臓器への分化する機能を有する成体幹細胞である。臓器特異的幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、血管幹細胞、心筋幹/前駆細胞、神経幹細胞、肝幹細胞等をあげることができる。中でも本発明に係る臓器特異的幹細胞の増殖方法及び増殖装置では、臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を適用することが好ましい。
臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を使用する場合、造血幹細胞は、例えば、骨髄から回収した骨髄細胞群、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、胎児脾臓をはじめ全身から採取することができる。より具体的に造血幹細胞は、臍帯血あるいは骨髄や末梢血から回収した単核球成分から、フローサイトメトリー等を用いて、Lin陰性、c−Kit陽性及びCD34陽性(あるいは陰性)細胞として単離することができる。
また、血管内皮細胞は、例えば、骨髄から回収した骨髄細胞群、臍帯血、臍帯静脈、臍帯動脈を初め全身から採取することができる。より具体的に血管内皮細胞は、骨髄から回収した骨髄細胞群から、フローサイトメトリー等を用いて、CD45陰性及びCD31陽性細胞として単離することができる。
なお、臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞は、いかなる動物に由来するものであってもよいが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等を挙げることができる。特に本発明に係る増殖方法によって得られた臓器特異的幹細胞を再生医療に用いる場合には、再生医療対象の患者から採取した臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞を使用することが好ましい。
本発明に係る増殖方法では、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させる。緩やかな接着とは、組織学的な観察上、造血幹細胞が血管内皮細胞と完全には解離することなく血管内皮細胞の近傍で増殖していることから、血管内皮細胞の近傍に臓器特異的幹細胞が存在する状態を意味する。また、組織学的に緩やかな接着とは、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが偽足を介して接着した状態と定義することもできる。なお、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着している状態においては、少なくとも、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが分泌する分子の影響を互いに受けうる距離を有している。より具体的に臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着している状態においては、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞との距離が1〜10μm程度の距離を有していることが好ましい。より具体的に、中空糸の外側に血管内皮細胞、中空糸の内側に臓器特異的幹細胞を位置させることにより、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させることができる。
臓器特異的幹細胞を増殖させる際の培養条件としては、特に限定されず一般的に動物細胞の培養に用いられる培地及び各種条件(温度、pH、CO2等の条件)をそのまま或いは改変して適用することができる。培養液としては、例えば、DMEM培養液、MEM培養液、α−MEM培養液、RPMI培養液、DMEM/F12培養液等を挙げることができる。また、これら培養液に適量の牛血清を添加したものを使用してもよい。添加される牛血清の量は、特に限定されず、細胞の起源や種類に応じて適宜設定される。好ましくは0%〜20%、より好ましくは5%〜10%程度の牛血清を添加するとよい。牛血清に代えて、ニュートリドーマ(Boehringer社製)、ヒト血清等を使用してもよい。培養温度やCO2等の条件は、用いる細胞の性質に応じて適宜設定されるが、一般に4〜6%CO2、33〜37℃で行われる。細胞の培養期間も特に限定されず、臓器特異的幹細胞の増殖が終了するまで、適宜培地交換を行いながら培養を行えばよい。
なお、本発明に係る増殖方法によって臓器特異的幹細胞を増殖するとともに、増殖した臓器特異的幹細胞に分化を誘導してもよい。分化を誘導するには、細胞の分化増殖を促すサイトカインを適宜培養液に添加してもよい。そのようなサイトカインとしては、例えば、EGF、HB−EGF、FGF、HGF等のEGFファミリー、TGF−α、β、BMP等のTGFファミリー、IL−1〜17のILファミリー、GM−CSF、M−CSF、G−CSF、Epo、TPO、SCFなどのサイトカイン、VEGF−A等のVEGFファミリー、PDGF−BB等のPDGFファミリー、エフリンB等のエフリンファミリー、LIF、TNFαなどを挙げることができる。
添加されるサイトカインの量は、用いるサイトカインや細胞の性質に応じて適宜設定される。例えば、臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を使用した場合、IL−1〜17のILファミリー、GM−CSF、M−CSF、G−CSF、Epo、TPO、SCFなどのサイトカインによって造血幹細胞を血液細胞に分化させることができる。
臓器特異的幹細胞の培養装置
本発明に係る臓器特異的幹細胞の増殖装置は、上述したような臓器特異的幹細胞の増殖を可能とする、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させた状態を維持できる構成を有するものである。すなわち、本発明に係る増殖装置は、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させた状態を維持して当該臓器特異的幹細胞を培養する装置である。
このような増殖装置の一例としては、図1に示す増殖装置を挙げることができる。この増殖装置は、臓器特異的幹細胞を培養するための第1培養部1と、血管内皮細胞を培養するための第2培養部2と、第1培養部1及び第2培養部2の間を区画する多孔部材3とを備える。また、図示しないが、図1に示す増殖装置は、第1培養部1内に臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給するための供給路、及び第2培養部2内に血管内皮細胞を含む培養液を供給するための供給路を備えることが望ましい。
第1培養部1及び第2培養部2は、例えば、一般的に動物細胞の培養に使用される培養皿等の所定の厚みを有する容器を使用することができる。多孔部材3は、0.1〜30μm径、好ましくは1〜10μm径、より好ましくは2〜5μm径の孔4が形成された膜を使用することができる。多孔部材3は、1〜200μm、好ましくは2〜80μm、より好ましくは5〜10μmの厚みであることが好ましい。より具体的に多孔部材3としては、ポリエチレン、セルロースジアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリメチルメタクリレート、ポリフェニレンエーテル、ポリカーボネート、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドなどがあげられるがこれに限定されるものではない。
多孔部材3の表面には、細胞マトリックス成分がコーティングされていることが好ましい。細胞マトリックス成分をコーティングすることによって、多孔部材3の表面に対する臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞の接着を促進することができる。細胞マトリックス成分としては、特に限定されないが、ビトロネクチン及び/又はフィブロネクチンを使用することができる。
このように構成された増殖装置を用いて臓器特異的幹細胞を増殖させるには、先ず、第1培養部1に臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給するとともに、第2培養部2に血管内皮細胞を含む培養液を供給する。第1培養部1に供給された臓器特異的幹細胞及び第2培養部2に供給された血管内皮細胞とは、多孔部材3を介して緩やかに接着することとなる。すなわち、図2に模式的に示すように、血管内皮細胞6は、その細胞質を孔4から第1培養部1内に向かって突出させ、臓器特異的幹細胞5に対して緩やかに接着することとなる。
この状態で、上述した「臓器特異的幹細胞の培養方法」で記載した培養条件を設定することによって、第1培養部1内の臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。
また、本発明に係る増殖装置の他の例としては図3に示すような増殖装置を挙げることができる。図3に示す増殖装置は、複数の第1培養部1a、1bと、複数の第2培養部2a、2b、2cとを交互に重ね合わせた構成である。この増殖装置において、多孔部材3は、第2培養部2aと第1培養部1aの間、第2培養部2bと第1培養部1aの間、第2培養部2bと第1培養部1bの間、第2培養部2cと第1培養部1bの間にそれぞれ配設されている。また、図3に示す増殖装置は、複数の第1培養部1a、1b及び複数の第2培養部2a、2b、2cに独立して培養液等を供給できるように、複数の第1培養部1a、1b及び複数の第2培養部2a、2b、2cそれぞれに連結された供給路7及び排出路8を備えている。
このように構成された増殖装置であっても、図1に示した増殖装置と同様にして臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。また、複数の培養部1a及び1bにおいて、それぞれ異なる種類の臓器特異的幹細胞を増殖させることもできるし、同種の臓器特異的幹細胞を増殖させることも可能である。
さらに、本発明に係る増殖装置の他の例としては、図4に示すように、多孔部材からなる複数の中空糸10を備え、中空糸10の内側の空間を第1培養部とし、複数の中空糸10の外側に形成される間隙を第2培養部とする増殖装置を挙げることができる。なお、図4は、増殖装置を模式的に示す図であり、複数の中空糸10以外の構成は省略して示している。
多孔部材からなる中空糸10としては、例えば、ポリエチレン、セルロースジアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリメチルメタクリレート、ポリフェニレンエーテル、ポリカーボネート、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドなどを使用することができるがこれに限定されるものではない。
図4に示す増殖装置は、例えば、複数の中空糸10の両端部を除いた領域を、血管内皮細胞を含む培養液に浸漬するとともに、複数の中空糸10の一方端部から臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給して使用することができる。或いは、図4に示す増殖装置は、図示しないが、複数の中空糸10の全体を挿入するに足る形状の筒状部材を備えるものであってもよい。この場合、増殖装置は、筒状部材内部に複数の中空糸10を挿入した状態で、筒状部材内面と複数の中空糸10の外周面とで形成される空間に血管内皮細胞を含む培養液を供給するとともに、複数の中空糸10の一方端部から臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給して使用することができる。
図4に示す増殖装置においても、複数の中空糸10内に供給された臓器特異的幹細胞及び複数の中空糸10で形成される間隙に供給された血管内皮細胞とは、中空糸の外面(多孔部材)を介して緩やかに接着することとなる。すなわち、図5に模式的に示すように、血管内皮細胞6は、その細胞質を孔4から中空糸内に向かって突出させ、臓器特異的幹細胞5に対して緩やかに接着することとなる。
この状態で、上述した「臓器特異的幹細胞の培養方法」で記載した培養条件を設定することによって、中空糸内の臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。特に、中空糸の内腔で臓器特異的幹細胞を培養することによって、当該臓器特異的幹細胞が細胞塊を形成しやすい環境を実現することができる。すなわち、図4に示す増殖装置において中空糸の内腔で構築される環境は、生体における血管内をより正確に疑似させていると言える。
再生医療への応用
本発明に係る臓器特異的幹細胞の製造方法及び製造装置によれば、従来において困難であったインビトロにおける臓器特異的幹細胞の増殖が可能となる。また、得られた臓器特異的幹細胞の分化を誘導して所望の臓器細胞(血球細胞、神経細胞など)を取得することも可能となる。得られた臓器細胞或いは臓器特異的幹細胞は、再生医療に使用することができる。
特に、材料となる臓器特異的幹細胞や血管内皮細胞として、移植すべき哺乳動物個体のものを用いれば、当該哺乳動物において拒絶反応を起こすことなく移植可能な臓器特異的幹細胞や臓器細胞を得ることができる。すなわち、本発明の方法で得られる臓器特異的幹細胞や臓器細胞は、拒絶反応を防止した再生医療に好適に利用することができる。したがって、本発明による心再生は医療業界に対する多大な貢献をもたらす。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
本発明者等の既報(Takakura N.,Huang X.L.,Naruse T.,Hamaguchi I.,Dumont D.J.,Yancopoulos G.D.& Suda T.:Critical role of the TIE2 endothelial cell receptor in the development of definitive hematopoiesis.Immunity 9:677−686 1998)によれば、図6に示すように、胎児期の造血幹細胞は先ず、臍腸間膜動脈という胎児と卵黄嚢を連結する唯一の動脈内で発生している。そして、造血幹細胞は、当該動脈内において血管内皮細胞に接着し細胞塊を形成している。
また、同報によれば、造血幹細胞の膜に発現するレセプター型チロシンキナーゼTIE2が、そのリガンドであるangiopoietin−1により活性化することにより、コラーゲンやフィブロネクチンへの造血幹細胞の細胞接着が誘導される。つまり、造血組織において観察される造血幹細胞増殖領域において、血管内皮細胞へ造血幹細胞の接着は、造血幹細胞が分泌するangiopoietin−1が自らのTIE2を活性化することによって生じることが示唆されている(図7参照)。
さらに、同報によれば、TIE2ノックアウトマウスでは、胎児期の造血幹細胞の血管内皮細胞への接着とクラスター形成が観察される臍腸間膜動脈内で造血幹細胞の接着が認められない。このことから、TIE2は、マトリックスへの細胞接着機能を介して、造血幹細胞の血管内皮細胞への接着に関与していることが明らかとなっている(図8参照)。
さらにまた、造血組織である胎児肝における組織学的観察を行ったところ、図9A及びBに示すように、造血幹細胞は血管内皮細胞に包囲され、血管内皮細胞からなる巣状網内で造血幹細胞が増殖している現場が存在することを解明した。組織学的解析によって、図9A及びBに示す領域において造血幹細胞は、血管内皮細胞とは強固に接着せず、偽足様構造により連結した状態で増殖していることが明らかとなった。成体骨髄内の造血幹細胞の局在を解析したところ、図9Cに示すように、一部の血管領域で、血管内腔において造血幹細胞が増殖する現場を解明した。
図9A乃至Cの結果より、造血幹細胞は、血管内皮細胞と強固に接着せず、血管内皮細胞と緩やかに接着した状態で増殖することが明らかとなった。
先ず、恒常的活性化型マウスTIE2遺伝子を以下のように作製した。野生型マウスTIE2において、膜直下領域に位置する849番目のArgをTrpに変化させるように、変異型マウスTIE2遺伝子を構築した。恒常的活性化型マウスTIE2は、angiopoietin−1が結合することなしに、二量体を形成することができ、恒常的に活性化する。
次に、定法に従い、得られた恒常的活性化型マウスTIE2遺伝子を、TIE2プロモーター制御下で発現するようにしたトランスジェニックマウスを作製した。本マウスは妊娠10日目に貧血により死亡した。妊娠9日目の胎児をワックス内に包埋し、切片をこの時期の造血幹細胞と血管内皮細胞の両者に発現するCD31に対する抗体(Pharmingen社製)で免疫染色した。9日目の野生型マウス胎児では臍腸間膜動脈内で造血幹細胞の増殖する現場が観察されるが(図10左)、恒常的活性化型TIE2を発現するマウスでは血管内に存在するCD31陽性造血幹細胞が形態的に扁平な形状を呈して血管内皮細胞に強固に接着しており、正常マウスと比べ造血幹細胞数も減少していることが判明した(図10右)。
この結果より、造血幹細胞を増殖させるには、造血幹細胞の近傍に血管内皮細胞が存在せねばならないが、造血幹細胞と血管内皮細胞とが強固に接着した状態では造血幹細胞の増殖を阻害することが判明した。
先ず、pMyレトロウイルスベクターに、実施例2で作製した恒常的活性化型TIE2遺伝子および野生型のTIE2遺伝子を組み込み、常法に従いウイルス液を作製した。次に、ウイルス液を用いてBa/F3(Bリンパ球前駆細胞株=血液細胞株)とbEnd3(血管内皮細胞株)にレトロウイルスを感染させ、各細胞株に恒常的活性化型TIE2或いは野生型TIE2を発現させた。
次に、恒常的活性化型TIE2あるいは野生型TIE2を発現するbEnd3をPKH67(Sigma社製)で緑の蛍光色に染色し、通常のbEnd3細胞と104個の細胞同士を混ぜ合わせて、径3cmの培養皿で培養した。培養後、恒常的活性化型TIE2を発現するBa/F3細胞をPKH26(Sigma社製)で赤色の蛍光色にラベルし、先のbEnd3細胞上に104個を播種した。1時間静置後、培養皿内で浮遊する細胞を回収し、赤色の蛍光標識されたBa/F3細胞の接着状況を蛍光顕微鏡(IX−70:オリンパス社製)にて観察した。
結果を図11に示す。図11右は野生型TIE2を発現するbEnd3細胞上に恒常的活性化型TIE2を発現するBa/F3細胞を播種した結果を示し、図11左は恒常的活性化型TIE2を発現するbEnd3細胞上に恒常的活性化型TIE2を発現するBa/F3細胞を播種した結果を示す。
この結果より、恒常的活性化型TIE2を発現するbEnd3細胞と、恒常的活性化型TIE2を発現するBa/F3細胞とは選択的に接着することが明らかとなった。血管内皮細胞にもTIE2が発現することから、造血幹細胞が分泌するangiopoietin−1は、血管内皮細胞に発現するTIE2も活性化することが判明した。そして、造血幹細胞を増殖させるには、造血幹細胞に発現したTIE2及び血管内皮細胞に発現したTIE2が共に活性化していることが好条件であることが明らかとなった。
先ず、8週齢のC57B1/6マウスの骨髄から常法を用いて骨髄細胞を回収した。次に、骨髄細胞をCD45、CD31の抗体(いずれもPharmingen社製)にて染色して、CD45陰性CD31陽性の血管内皮細胞をフローサイトメトリー(Epics coulter社製)にて回収した。また、同時に血液細胞分化抗原(CD4,CD8,B220,Mac−1,Gr−1,TER119)に対する抗体(総称してLin抗体;いずれもPharmingen社製)およびc−Kit(Pharmingen社製)とTIE2に対する抗体で骨髄細胞を染色し、Lin陰性c−Kit陽性TIE2陽性の造血幹細胞を上記と同様に回収した。
次に、104個の血管内皮細胞を、コラーゲンコートした径3cmの培養皿(旭テクノグラス社製)上で、RPMI1640(Sigma社製)と10%牛血清を含む培養液にVEGF(Invitrogen社製)を最終濃度10ng/mlを添加した培養液で3日間培養した。培養後、生存した血管内皮細胞上に造血幹細胞を103個播種し、stem cell factor(SCF)を最終濃度50ng/mlとなるよう添加して更に培養した。
血管内皮細胞の近傍で増殖する造血幹細胞は、再度TIE2に対する抗体により免疫染色して、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)下で観察した。その結果を図12に示す。図12左は位相差顕微鏡画像であり、図12右は蛍光顕微鏡画像である。
この結果から、造血幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着した状態において、造血幹細胞が2〜3日の培養によって2〜3個に自己複製できることが証明された。
また、異なる実験系で同様にインビトロにおける造血幹細胞の増殖を検討した。
先ず、血管内皮細胞株MSS31を通常の培養皿上でRPMI1640(Sigma社製)を基本培地として10%牛血清を含む培養液中で培養しconfluentな状態とした。同時に、実施例3と同様にして恒常的活性化型TIE2を遺伝子導入したMSS31も同条件で培養しconfluentな状態とした。
次に、人の臍帯血よりフィコール(アマシャム社製)を用いて単核球成分を分画採取した。さらにヒトLin抗体(コールター社製)、c−Kit及びCD34に対する抗体(いずれもPharmingen社製)を用いてLin陰性c−Kit陽性CD34陽性細胞として造血幹細胞をフローサイトメトリー(Epics coulter社製)を用いて回収した。
次に、回収された造血幹細胞をPKH26(Sigma社製)で赤く蛍光標識した。得られた103個の造血幹細胞分画を前述した野生型MSS31及び恒常的活性化型TIE2導入MSS31上に播種し、stem cell factor(SCF)を最終濃度50ng/mlとなるよう添加して3日間培養し、幹細胞の状況を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果を図13A及びBに示す。図13A左は野生型MSS31を用いた場合の位相差顕微鏡画像であり、図13A右は野生型MSS31を用いた場合の蛍光顕微鏡画像である。図13B左は恒常的活性化型TIE2導入MSS31を用いた場合の位相差顕微鏡画像であり、図13B右は恒常的活性化型TIE2導入MSS31を用いた場合の蛍光顕微鏡画像である。
この結果から、人の臍帯血から回収した造血幹細胞であっても、血管内皮細胞と緩やかな接着状態を作出することによって、増殖可能であることが判明した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (4)
- 造血幹細胞と血管内皮細胞とを多孔材料を介して接触させ、互いに偽足同士で接着させた状態で培養する、造血幹細胞の増殖方法。
- 上記造血幹細胞及び上記血管内皮細胞では、レセプター型チロシンキナーゼTIE2が活性化していることを特徴とする請求項1記載の造血幹細胞の増殖方法。
- 造血幹細胞に対する培養液と血管内皮細胞に対する培養液とを異なる組成とすることを特徴とする請求項1記載の造血幹細胞の増殖方法。
- 上記多孔材料は外周面に多孔を有する中空糸であり、当該中空糸の内部に上記造血幹細胞を培養し、当該中空糸の外部に上記血管内皮細胞を培養することで、上記造血幹細胞と上記血管内皮細胞とを多孔材料を介して接触させ、互いに偽足同士で接着させた状態とすることを特徴とする請求項1記載の造血幹細胞の増殖方法。
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