JP4531132B2 - 増殖因子に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド - Google Patents
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Description
本明細書にはTGFβ、PDGF、およびhKGFに対する高親和性核酸リガンドを同定し、かつ調製する方法が記載される。このような核酸リガンドを同定するために本明細書において使用した方法は、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligans by EXponential enrichment)の頭字語であるSELEXと呼ばれる。本発明は、TGFβ、PDGF、およびhKGFの高親和性核酸リガンドを含む。さらにTGFβ1およびPDGFに対するRNAおよびDNAリガンド、およびhKGFに対するRNAリガンドを開示する。また、ピリミジンの2’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドも含まれる。さらに、2’−NH2−修飾または2’−F修飾を含有するTGFβ1およびhKGFに対するRNAリガンド、および2’−F修飾を含有するPDGFに対するRNAリガンドを開示する。本発明はまた、TGFβ1、PDGF、およびhKGFの高親和性核酸インヒビターも含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、薬剤または診断薬として有用である。
発明の背景
TGFβ
トランスフォーミング増殖因子−β(TGFβ)ポリペプチドは、多くの細胞型において増殖、分化、および遺伝子発現に影響を及ぼす。性状解析されたこのファミリーの第1のポリペプチドであるTGFβ1は、共有結合している2つの同一の112アミノ酸サブユニットを有する。TGFβ1は、非常に保存されたタンパク質であり、ヒト型をマウス型から区別しているのはわずか1個のアミノ酸である。TGFβ遺伝子ファミリーには哺乳動物において発現される2つの他のメンバーがある。TGFβ2はTGFβ1と71%相同である(デ・マーティン(de Martin)ら,(1987)EMBO J.6:3673−3677)が、一方TGFβ3はTGFβ1と80%相同である(デリンク(Derynck)ら,(1988)EMBO J.7:3737−3743)。核磁気共鳴により測定されるTGFβ1の構造的特徴(アーチャー(Archer)ら,(1933)Biochemistry 32:1164−1171)は、TGFβ2の結晶構造に一致している(ダオピン(Daopin)ら,(1992)Science 257:369−374;シュラネッガーとグルッター(Schlunegger and Grutter),(1992)Nature 358:430−434)。
TGFβ類は類似した三次元構造を有するが、これらは生理学的には決して同等ではない。受容体を有する細胞へのTGFβの膜通過シグナル生成に関与する、少なくとも3つの異なる細胞外受容体、I、IIおよびIII型が存在する。総説については、デリンク(Derynck)(1994)TIBS 19:548−553およびマッセーグ(Massague)(1990)Annu. Rev. Cell Biol 6:597−641を参照のこと。TGFβ2がII型TGFβ受容体と有効に相互作用するためには、III型受容体も存在することが必要である(デリンク(Derynck)(1994)TIBS 19:548−553)。血管内皮細胞にはIII型受容体が欠けている。代わりに内皮細胞は、エンドグリン(endoglin)と呼ばれる構造的に関連したタンパク質を発現する(チェイフェツ(Cheifetz)ら,(1992)J. Biol. Chem. 267:19027−19030)が、これは、TGFβ1およびTGFβ3のみに高親和性で結合する。すなわち、TGFβの相対活性は、細胞および臓器系において発現される受容体の型を反映している。
多因性シグナル生成経路における成分の制御に加えて、TGFβポリペプチドの合成の分布も生理学的機能に影響を及ぼす。TGFβ2およびTGFβ3の分布は、TGFβ1よりも限定されており(デリンク(Derynck)ら,(1988)EMBO J 7:3737−3743)、例えば、TGFβ3は、間充織由来の組織に限定されているが、一方TGFβ1は、間充織と上皮細胞の両方に存在する。
TGFβ1は、組織修復に決定的に重要な多機能性サイトカインである。高濃度のTGFβは、血小板顆粒により創傷部位に送達される(アソイアンとスポーン(Assoian and Sporn),(1986)J Cell Biol.102:1217−1223)。TGFβ1は、白血球、単球および繊維芽細胞のような細胞の走化性、さらには血管新生、組織修復に関連する細胞***促進および炎症応答に関連する増殖因子およびサイトカインの制御を含む治癒を促進する一連の事象を開始させる。TGFβ1はまた、細胞外マトリックス成分の合成も促進(ロバーツ(Roberts)ら,(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4167−4171;スポーン(Sporn)ら,(1983)Science 219:1329−1330;マッセーグ(Massague),(1987)Cell 49:437−438)し、TGFβ1の病理生理学を理解する上で最も重要なことには、TGFβ1はそれ自体の合成を自己制御する(キム(Kim)ら,(1989)J Biol Chem 264:7041−7045)。
多くの疾患は、TGFβ1の産生過剰に関連している。TGFβ1産生過剰に関連した繊維形成性疾患は、腎臓、肺および肝臓の繊維症のような慢性症状と、皮膚瘢痕および再狭窄のようなより急性症状に分類することができる。腫瘍細胞によるTGFβ1の合成と分泌は、進行性の脳腫瘍または乳癌の患者に見られるような免疫抑制を引き起こすこともある(アルティーガ(Arteaga)ら,(1993)J Clin Invest 92:2569−2576)。マウスにおけるリーシュマニア感染症の経過は、TGFβ1により激的に変化する(バラル−ネット(Barral-Netto)ら,(1992)Science 257:545−547)。TGFβ1は、この疾患を増悪させたが、一方TGFβ1抗体は、遺伝的に感受性のマウスにおけるこの疾患の進行を止めた。遺伝的に抵抗性のマウスは、TGFβ1の投与によりリーシュマニア感染症に感受性になった。
細胞外マトリックスの沈着に及ぼすTGFβ1の大きな作用は、総説されており(ロッコとジヤデ(Rocco and Ziyadeh),(1991)Contemporary Issues in Nephrology v23、ホルモン、オータコイドおよび腎臓(Hormones, autocoids and the kidney)、ジェイ・スタイン(Jay Stein)編、チャーチル・リビングストン(Churchill Livingston)、ニューヨーク、391−410頁;ロバーツ(Roberts)ら,(1988)Rec. Prog. Hormone Res. 44:157−197)、そして細胞外マトリックス成分の合成の促進と分解の阻害を含む。糸球体の構造と濾過性能は、主としてメサンギウムおよび糸球体膜の細胞外マトリックス組成により決定されるため、TGFβ1が腎臓に大きい作用を及ぼすことは驚くにあたらない。増殖性糸球体腎炎(ボーダー(Border)ら,(1990)Kidney Int. 37:689−695)および糖尿病性腎症(モウアー(Mauer)ら,(1984)J. Clin Invest. 74:1143−1155)におけるメサンギウムマトリックスの蓄積は、これらの疾患の明瞭かつ顕著な病的特性である。ヒトの糖尿病性糸球体硬化症(進行した腎症)ではTGFβ1レベルが上昇する(ヤマモト(Yamamoto)ら,(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1814−1818)。TGFβ1は、多くの動物モデルにおける腎繊維症の発生における重要なメディエーターである(ファン(Phan)ら,(1990)Kidney Int. 37:426;オクダ(Okuda)ら,(1990)J. Clin Invest. 86:453)。TGFβ1に対する抗血清により(ボーダー(Border)ら,(1990)Nature 346:371)、およびTGFβ1に結合することができる細胞外タンパク質のデコリン(decorin)により(ボーダー(Border)ら,(1992)Nature 360:361−363)、ラットにおいて実験的に誘導した糸球体腎炎の抑制が証明された。
TGFβ1が多すぎると皮膚瘢痕組織の形成が起こる。中和活性TGFβ1抗体をラットの治癒創傷の辺縁部に注入すると、創傷治癒の速度または創傷の引張力を妨げることなく瘢痕化を阻害することが証明された(シャー(Shah)ら,(1992)Lancet 339:213−214)。同時に、血管新生が低下し、マクロファージおよび単球の数が低下し、瘢痕組織への分解したコラーゲン繊維の沈着量が低下した。
TGFβ1は、バルーン血管形成術後の動脈の平滑筋の増殖および細胞外マトリックスの沈着により生じる動脈壁の進行性肥厚における一因であるかもしれない。再狭窄した動脈の直径は、この肥厚により90%低下することがあり、そして直径の低下は平滑筋細胞体よりはむしろ細胞外マトリックスのせいであるため、単に大量の細胞外マトリックス沈着を低下させることにより、これらの血管を50%まで拡げることができるかもしれない。インビボでTGFβ1遺伝子をトランスフェクションした無傷のブタ動脈において、TGFβ1遺伝子発現は、細胞外マトリックスの合成と過形成の両方に関係した(ネーベル(Nabel)ら,(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10759−10763)。TGFβ1誘導性過形成は、PDGF−BBで誘導したものほど大量ではなかったが、細胞外マトリックスはTGFβ1トランスフェクション体の方が大量であった。この遺伝子転移ブタモデルにおいてFGF−1(FGFの分泌型)誘導性過形成では細胞外マトリックス沈着は関係しなかった(ネーベル(Nabel)(1993)Nature 362:844−846)。
腫瘍により産生されるTGFβ1が有害である数種の癌が存在する。MATLyLuラット癌細胞(スタイナー(Steiner)とバラック(Barrack),(1992)Mol. Endocrinol. 6:15−25)およびMCF−7ヒト乳癌細胞(アルティーガ(Arteaga)ら,(1993)Cell Growth and Differ. 4:193−201)は、マウスTGFβ1を発現するベクターでトランスフェクション後、腫瘍形成性および転移性が高まった。乳癌において、予後の不良は、TGFβの上昇に関連しており(ディックソン(Dickson)ら,(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:837−841;カシッド(Kasid)ら,(1987)Cancer Res. 47:5733−5738;ダリー(Daly)ら,(1990)J Cell Biochem 43:199−211;バレット−リー(Barrett-Lee)ら,(1990)Br. J Cancer 61:612−617;キング(King)ら,(1989)J Steroid Biochem 34:133−138;ウェルチ(Welch)ら,(1990)Proc. Natl. Acad. Sci.87:7678−7682;ウォーカー(Walker)ら,(1992)Eur J Cancer 238:641−644)、タモキシフェン治療によるTGFβ1の誘導(ブッタ(Butta)ら,(1992)Cancer Res 52:4261−4264)が、乳癌のタモキシフェン治療の失敗と関連していた(トンプソン(Thompson)ら,(1991)Br. J Cancer 63:609−614)。抗TGFβ1抗体は、無胸腺マウスにおけるMDA−231ヒト乳癌細胞の増殖を阻害する(脾臓ナチュラルキラー細胞活性の増大に関連する処置)(アルティーガ(Arteaga)ら,(1993)J Clin Invest 92:2569−2576)。潜伏TGFβ1でトランスフェクションしたCHO細胞も、ヌードマウスにおけるNK活性の低下および腫瘍増殖の増大を示した(ワリック(Wallick)ら,(1990)J Exp Med 172:1777−1784)。すなわち、乳癌により分泌されるTGFβ1は、内分泌性の免疫抑制を引き起こしうる。
TGFβ1の高い血漿濃度は、進行した乳癌患者の予後不良を示すことが証明されている(アンシャー(Anscher)ら,(1993)N Engl J Med 328:1592−8)。高用量化学療法および自己骨髄移植の前に血中TGFβの高い患者は、肝静脈閉塞症(死亡率50%までの全患者の15−50%)および特発性間質性肺炎(全患者の40−60%)の高リスクを有する。これらの知見の意味するところは、1)TGFβ1の血漿レベルの上昇はリスク患者の同定に使用することができること、および2)TGFβ1の低下は乳癌患者に対するこれら普通の治療の罹患率と死亡率を低下させることができることである。
PDGF
血小板由来増殖因子(PDGF)は、もともと血小板溶解物から単離され、血清には存在するが血漿には存在しない主要な増殖促進活性として同定された。2つの相同的なPDGFアイソホームのPDGF AおよびBが同定されたが、これらは、別の遺伝子(染色体7および22上)によりコードされている。血小板からの最も豊富な分子種は、ABヘテロダイマーであるが、3つ全ての可能なダイマー(AA、ABおよびBB)が天然に存在する。翻訳後、PDGFダイマーはプロセシングを受けて約30kDaの分泌タンパク質になる。高親和性でPDGFに結合する2つの細胞表面タンパク質、aおよびβが同定された(ヘルディン(Heldin)ら,Proc. Natl. Acad. Sci.78:3664(1981);ウィリアムズ(Williams)ら,Proc. Natl. Acad. Sci.79:5867(1981))。両方の種とも、5つの免疫グロブリン様の細胞外ドメイン、単一の膜通過ドメインおよびキナーゼ挿入ドメインにより分離された細胞内チロシンキナーゼドメインを含有する。機能性の高親和性受容体はダイマーであり、PDGFによる受容体の細胞外ドメインの連動によりいくつかのチロシン残基の交差リン酸化(1つの受容体のチロシンキナーゼがダイマー中のもう一方をリン酸化する)が起こる。受容体リン酸化により、核への細胞***促進性または走化性のシグナルの変換に至るカスケード現象が起こる。例えば、PDGFβ受容体の細胞内ドメインにおいて、リン酸化されると、ホスホリパーゼC−g、ホスファチジルイノシトール3’−キナーゼ、GTPase−活性化タンパク質、およびShc、Grb2およびNckのようないくつかのアダプター分子を含む、異なるsrc−相同性2(SH2)ドメイン含有タンパク質と相互作用する9つのチロシン残基が同定されている(ヘルディン(Heldin), Cell, 80:213(1995))。最近数年間に、3つの受容体ダイマー(aa、aβ、およびββ)に対する3つのPDGFアイソホームの特異性が解明されている。a−受容体ホモダイマーは、3つ全てのPDGFアイソホームに高親和性で結合し、β−受容体ホモダイマーは、PDGF BBのみに高親和性で結合してPDGF ABには約10倍低い親和性で結合し、そしてaβ−受容体ヘテロダイマーは、PDGF BBおよびPDGF ABに高親和性で結合する(ウェスターマークとヘルディン(Westermark and Heldin), Acta Oncologica,32:101(1993))。これらの特異性のパターンは、A−鎖がa−受容体のみに、そしてB−鎖がaおよびβ−受容体サブユニットの両方に高親和性で結合する能力から生じる。
PDGF発現が悪性トランスフォーメーションに関係していることを最も早く示したのは、PDGF−B鎖のアミノ酸配列が、サル肉腫ウイルス(simian sarcoma virus)(SSV)のトランスフォーミングタンパク質のp28sisのそれと事実上同一であるという知見であった(ウォーターフィールド(Waterfield)ら,Nature, 304:35(1983);ジョンソン(Johnsson)ら,EMBOJ.,3:921(1984))。PDGF−B鎖遺伝子および少ないながらPDGF−A遺伝子のトランスフォーミング能力が、その後すぐに証明された(クラーク(Clarke)ら,Nature, 308:464(1984);ガジット(Gazit)ら,Cell, 39:89(1984);ベックマン(Beckmann)ら,Science,241:1346;バイウォーター(Bywater)ら,Mol. Cell. Biol., 8:2753(1988))。それ以来多くの腫瘍細胞加水分解がPDGFを産生および分泌し、そのいくつかはPDGF受容体も発現することが証明されている(レインズ(Raines)ら,ペプチド増殖因子およびこれらの受容体(Peptide Growth Factors and Their Receptors)、スプリンガー−フェアラーク(Springer-Verlag)、第I部、173頁(1990))。したがってPDGFによるパラクリン、およびいくつかの細胞株ではオートクリン増殖促進が可能である。例えば、ヒト神経膠腫からの生検の分析により、2つのオートクリンループの存在が明らかになった:腫瘍関連内皮細胞におけるPDGF−B/β−受容体、および腫瘍細胞におけるPDGF−A/a−受容体(ハーマンソン(Hermansson)ら,Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7748(1988);ハーマンソン(Hermansson)ら,Cancer Res., 52:3213(1992))。高度の神経膠腫への進行には、腫瘍関連内皮細胞におけるPDGF−Bとβ−受容体、および神経膠腫細胞におけるPDGF−Aの発現の増大が伴った。PDGFおよび/またはPDGF受容体の発現の増大は、繊維肉腫(スミッツ(Smits)ら,Am. J. Pathol., 140:639(1992))および甲状腺癌(ヘルディン(Heldin)ら,Endocrinology, 129:2187(1991))を含む他の悪性腫瘍においても観察されている。
増殖性疾患における重要性から考えて、PDGFのアンタゴニストは有用な臨床応用が見い出されるであろう。現在、PDGFに対する抗体(ジョンソン(Johnsson)ら,(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1721−1725;ファーンズ(Ferns)ら,(1991)Science 153:1129−1132;ヘレネット(Herrenet)ら,(1993)Biochimica et Biophysica Acta 1173,194−302)および可溶性PDGF受容体(ヘレネット(Herrenet)ら,(1993)Biochimica et Biophysica Acta 1173,194−302;デュアネット(Duanet)ら,(1991)J. Biol. Chem.266:413−418;タイスマン(Teisman)ら,(1993)J. Biol. Chem.268:9621−9628)がPDGFの最も強力で特異的なアンタゴニストである。PDGFに対する中和活性抗体は、SSVで形質転換した表現型を復帰させ(ジョンソン(Johnsson)ら,(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1721−1725)、かつ動脈損傷後の新脈管内膜病変の発生を阻害する(ファーンズ(Ferns)ら,(1991)Science 153:1129−1132)ことが証明されている。スラミン(ウィリアムズ(Williams)ら,(1984)J. Biol. Chem.259:5287−5294;ベトショルツ(Betsholtz)ら,(1984)Cell 39:447−457)、ネオマイシン(ヴァスボトン(Bassbotn)ら,(1992)J. Biol. Chem.267:15635−15641)およびPDGFアミノ酸配列から誘導されたペプチド(エングストローム(Engstroem)ら,(1992)J. Biol. Chem.267:16581−16587)のようなPDGFの他のインヒビターが報告されているが、これらは、良好な薬剤候補となるには、毒性が強すぎるか、または十分な特異性または活性に欠けている。臨床利用の可能性ある他の型のアンタゴニストは、PDGF受容体のチロシンキナーゼを選択的に阻害する分子である(ブックダンジャー(Buchdunger)ら,(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2558−2562;コバレンク(Kovalenk)ら,(1994)Cancer Res. 54:6106−6114)。
hKGF
a)hKGFの生化学的性質
ヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)は、小さな(26−28KD)塩基性のヘパリン結合増殖因子であり、FGFファミリーの一員である。hKGFは、比較的新規に同定された分子であり、これはFGF−7としても知られている(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。これは、上皮細胞に特異的な増殖因子であり(ルービン(Rubin)ら,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802−806)、その主な機能は、発生/形態形成(ワーナー(Werner)ら,(1994)Science 266:819−822)および創傷治癒(ワーナー(Werner)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6896−6900)におけるものである。インビボのhKGFの主要な供給源は、間質繊維芽細胞である(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。微小血管(microvascular)内皮細胞(スモラ(Smola)ら,(1993)J. Cell Biol. 122:417−429)、およびごく最近になって、活性化上皮内gdT細胞(ボイスメニュ(Boismenu)ら,(1994)Science 266:1253−1255)もhKGFを合成することが証明された。hKGF発現は、創傷内で促進されている(ワーナー(Werner)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6896−6900)。いくつかのサイトカインが、hKGF誘導物質であること(ブラウクル(Brauchle)ら,(1994)Oncogene 9:3199−3204)、そしてIL−1が最も強力であること(ブラウクル(Brauchle)ら,(1994)Oncogene 9:3199−3204;チェディッド(Chedid)ら,(1994)J. Biol. Chem.269:10753−10757)が証明された。bFGFとは異なり、hKGFは、シグナルペプチドを持っており、このため、産生細胞から分泌される(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。hKGFは大腸菌(E. coli)内で過剰発現させることができ、組換えタンパク質(〜19−21KD)は生物学的に活性である(ロン(Ron)ら,(1993)J. Biol. Chem.268:2984−2988)。大腸菌由来の組換えタンパク質は、天然のタンパク質よりも10倍細胞***促進性である(ロン(Ron)ら,(1993)J. Biol. Chem.268:2984−2988)。この差は、グリコシル化のためでろう。天然タンパク質は、強力なAsnグリコシル化部位を有する(ロン(Ron)ら,(1993)J. Biol. Chem.268:2984−2988)。
hKGFの生物活性は、特異的な細胞表面受容体により媒介される(ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75)。hKGF受容体は、FGF−R2のC末端細胞外領域の別のスプライシングに起因する修飾FGF受容体である(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246−250)。hKGF受容体でトランスフェクションしたNIH/3T3細胞は、hKGFに対する高親和性(〜200pM)結合部位を発現する(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246−250)。NIH/3T3細胞当たりの特異的結合部位の概数は、約500,000である(ディー・ボッタロ(D. Bottaro)とエス・アーロンソン(S. Aaronson)、私信)。hKGF受容体は、hKGFおよびaFGFに同様な親和性で結合し、bFGFには約20倍低い親和性で結合する(ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75;ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:246−250)。ヒト胃癌細胞株においてhKGF受容体の一変種が見い出されたが、これはK−SAMと呼ばれる増幅遺伝子(すなわち、1つの遺伝子、多数のコピー)であった(ハットリ(Hattori)ら,(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5983−5987)。
ヘパリンは、hKGFの生物活性のインヒビターであることが報告されている(ロン(Ron)ら,(1993)J. Biol. Chem.268:2984−2988)。このことは、aFGFに対するヘパリンのアゴニスト作用とは対照的である(スピバック−クロイクスマン(Spivak-Kroixman)ら,(1994)Cell 79:1015−1024)。
b)ヒトの疾患におけるhKGFの役割
組換えhKGF分子は、1993年から利用可能になったばかりである。したがって、ヒト疾患におけるhKGFの役割に関する情報は限られている。しかし発表された文献は、少なくとも2つのヒトの疾患、すなわち、乾癬と癌におけるhKGFの役割を強く示唆する証拠を含んでいる。hKGFは、炎症性腸疾患にも関与している(ピー・フィンチ(P. Finch)、私信)。
乾癬
乾癬は、皮膚炎症と共に、表皮の過増殖とケラチン細胞の不完全分化を特徴とする(エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American Medicine III−1〜III−18;グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine 332:581−588)、衰弱性の皮膚障害である(グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine 332:581−588)。未だ乾癬に対する有効な治療法はない(匿名,(1993)Drug & Market Development 4:89−101;エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American Medicine III−1〜III−18;グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine 332:581−588)。乾癬は、スカンジナビアにおいて最も発病率が高く人口の0.5〜2.8パーセントに起こる。1992年に米国では、乾癬に罹患した4〜8百万人が、そのどれもが非常に有効というものはない種々の薬剤および関連治療のために約6百万ドルを費やしたと推定された。この支出の大部分は、1年の治療に1,000〜1,500ドルを費やす重症乾癬の患者約400,000名により行われた。毎年約200,000の新規症例がある。
この疾患の根本原因は未知であるが、表皮のケラチン細胞***促進を制御する機構における原発性または続発性の欠陥に起因する(エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American Medicine III−1〜III−18)。乾癬は、ステロイドとシクロスポリンに応答し、この意味で免疫疾患として特徴付けられる(エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American Medicine III−1〜III−18)。hKGFはケラチン細胞に対する主要な特異的増殖因子であるため、この過剰発現および制御解除は、乾癬におけるケラチン細胞過増殖の原因として第一の候補である。免疫系がhKGF放出の最も重要な制御因子であるという証明(ボイスメニュ(Boismenu)ら,(1994)Science 266:1253−1255;ブラウクル(Brauchle)ら,(1994)Oncogene 9:3199−3204;チェディッド(Chedid)ら,(1994)J. Biol. Chem.269:10753−10757)は、hKGFの制御解除が乾癬の原因であるというこの意見を増強する。さらに、ブタの創傷にhKGFを適用すると、乾癬に類似した組織化学的外観を呈し(スタイアノ−コイコ(Staiano-Coico)ら,(1993)J Ex Med 178:865−878);トランスジェニックマウスにおけるケラチン細胞由来hKGFは、乾癬を暗示する病態を引き起こし(グオ(Guo)ら,(1993)EMBO J 12:973−986);インサイチューハイブリダイゼーション実験により、乾癬における、hKGFおよびhKGF受容体のそれぞれ中等度および強力なアップレギュレーションが証明された(ピー・フィンチ(P. Finch),私信)。インサイチューハイブリダイゼーション実験により、別の免疫疾患、すなわち、炎症性腸疾患へのhKGFの関与も証明された(ピー・フィンチ(P. Finch),私信)。
癌
増殖因子および増殖因子のhKGFおよび/またはその受容体の発現の制御解除が、いくつかのヒト癌におけるトランスフォーメーション事象であると予測されることは、文献上十分に確立されている。hKGF系のトランスフォーミング能力は、インビトロで証明されている(ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75)。別の研究において、癌細胞株は、hKGF受容体を発現し、かつaFGFではなくhKGFに応答し、一方肉腫細胞株は、hKGF受容体を発現せず、hKGFではなくaFGFに応答することが見い出された(イシイ(Ishii)ら,(1994)Cancer Res 54:518−522)。
消化器癌
いくつかの分化不全の胃癌は、K−samと呼ばれる増幅遺伝子を有するが、これはhKGF−受容体のアイソホームである(カトー(Katoh)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:2960−2964)。hKGFをラットにインビボで投与すると、膵管上皮細胞(イー(Yi)ら,(1994)Am J Pathol 145:80−85)、肝細胞、および消化管全体の上皮細胞の増殖が引き起こされる(ホウスリー(Housley)ら,(1994)J Clin Invest 94:1764−1777)。
肺癌
hKGFをラットに投与すると、肺癌の気管支肺胞細胞の一種に類似したII型肺細胞(pneumocyte)過形成が起こる(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)J Clin Invest 93:1298−1306)。
乳癌
インビボで、hKGFは、乳管拡張および暴発性上皮過形成を引き起こし、これらは両方とも乳癌の共通の特徴である(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868;イー(Yi)ら,(1994)Am J Pathol 145:1015−1022)。しかし、授乳ラットの乳管上皮は、hKGFの増殖促進作用に抵抗性であり、このことは、妊娠中の女性は乳癌に対する罹病性が低下し、乳牛はほとんど乳癌ができないという疫学的観察に関して重要である(クズマ(Kuzma),1977,***の病気(Breast in Pathology),モスビー社(Mosby Co.))。乳癌へのhKGFの関与を支持する別の証拠がある。hKGF mRNAは、健常なヒト***組織および試験した乳癌試料15個中12個において近年検出されている(クーズ(Koos)ら,(1993)J Steroid Biochem Molec Biol 45:217−225)。乳癌におけるhKGF mRNAの存在を、hKGFが、非腫瘍性乳腺に存在するという観察、およびhKGFが、***上皮の暴発性増殖を引き起こすという観察と関連させて考えると、これは、hKGFが、健常および腫瘍性の***上皮の増殖の制御において重要なオートクリンまたはパラクリン増殖因子であることを示唆している(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868)。浸潤性導管腺癌は、癌への防御的宿主応答を表すと言われている繊維形成性間質により特徴的に囲まれている(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868)。hKGFは、間質由来であるため、繊維形成性間質は腫瘍の増殖を阻害するよりもこれに寄与する可能性が高い。
前立腺癌
前立腺腫瘍に及ぼすアンドロゲンの増殖促進作用は、アンドロゲンが前立腺間質細胞におけるhKGFの発現を誘導するため、hKGFにより媒介されると考えられる(ヤン(Yan)ら,(1992)Mol Endo 6:2123−2128)。インビボでアンドロゲン依存性である前立腺腫瘍は、インビトロではアンドロゲン非依存性であるが、hKGF依存性である(ヤン(Yan)ら,(1992)Mol Endo 6:2123−2128)。アンドロゲンにより支配されるプロセスである、hKGFが、精嚢発生中の上皮誘導において機能するという観察は、アンドロメジン(andromedin)としてのhKGFの役割に一致している(アラリド(Alarid)ら,(1994)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91:1074−1078)。さらには、hKGFは、アンドロゲン受容体の異常な活性化を引き起こし、このため恐らく前立腺癌におけるアンドロゲン除去療法の失敗に寄与している(クリグ(Culig)ら,(1994)Cancer Res. 54:5474−5478)。この情報に基づき、遺伝子改変により、hKGFをアンドロゲン制御から解放し、こうしてアンドロゲン依存性腫瘍をアンドロゲン非依存性の非常に悪性の腫瘍に変換させることが可能である。このような腫瘍はなお、hKGFがアンドロゲン受容体の異常な活性化も引き起こすため、アンドロゲンに制御されるマーカーのPSAを発現することが可能であろう。また、hKGFは、老人男性の一般的な健康問題である良性前立腺肥大(BPH)の原因である可能性が高い。
d)hKGF競合物質
現在までに、モノクローナル抗体および短鎖hKGF−受容体由来ペプチド(25量体)がhKGF競合物質として報告されている(ボッタロ(Bottaro)ら,(1993)J. Biol. Chem. 268:9180−9183)。1G4と呼ばれるモノクローナル抗体は、hKGFに対して200pMのKdを有する。この短鎖ペプチドは、ヒト受容体を発現するNIH/3T3細胞の細胞表面へのhKGF結合を約1〜5μMのKiで阻害する。ボッタロ(Bottaro)ら(WO94/25057)は、hKGFとその受容体との間の結合を阻害するhKGF−受容体ペプチドを提供している。また、hKGF受容体が介在する細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を評価する方法も提供している。
e)受容体−増殖因子相互作用の評価
アンタゴニストを使用する、増殖因子およびリンホカインのこれらの細胞表面受容体との相互作用の阻止は、疾患治療の1つのアプローチである。このようなアンタゴニストの発見には、受容体−増殖因子またはリンホカイン相互作用の生化学的測定法が利用可能であることが必要である。古典的な測定法は、放射標識した増殖因子またはリンホカイン(トレーサー)のその細胞表面受容体への競合阻害である。これらの型の測定法は、表面に関連する受容体を発現する細胞株を利用して、種々の濃度のアンタゴニスト候補の存在下で細胞結合トレーサーの量を測定する。さらに、他の測定法は、関連する受容体を発現する細胞株からの膜抽出物を利用して、トレーサー結合に続いてフィルター結合を行う(ネンクエスト薬剤発見システム(Nenquest Drug Discovery System):ヒト腫瘍壊死因子−アルファ、エヌイーエヌリサーチプロダクツ(NEN Research Products)、イーアイデュポンデニモアーズ社(E.I.DePont de Nemours & Co.(Inc.))、ボストン、マサチューセッツ州を参照のこと)か、または膜抽出物を固相支持体上に固定化する(アーダル(Urdal)ら,(1988)J. Biol. Chem. 263:2870−2877;スミス(Smith)ら,(1991)Bioch Bioph Res Comm 176:335−342)。受容体が誘導したトレーサーの電気泳動移動度シフトを適用して、受容体をトレーサーに架橋して、次に変性ゲル上で解析することにより、細胞表面受容体の存在およびサイズを同定した(例えば、クル(Kull)ら,(1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:5756−5760;ホーマン(Hohmann)ら,(1989)J. Biol. Chem.264:14927−14934;スタウバー(Stauber)ら,(1989)L. Biol. Chem.264:3573−3576を参照のこと)。未変性ゲルおよび非架橋複合体の使用は増殖因子またはリンホカインおよびこれらの受容体について記載されていないが、核酸タンパク質相互作用の検討に広く適用されている(サムブルーク(Sambrook)ら,(1989)分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),コールドスプリングハーバー,ニューヨーク州)。
PCRによるhKGF受容体の存在に関する種々の癌細胞株のスクリーニングにより、全ての癌細胞株がhKGF受容体mRNAを発現するが、一方肉腫細胞株は発現しないことが明らかになった。mRNAの存在は、必ずしもhKGF受容体が、これらの細胞の表面上に存在することを意味するものではない。hKGFについては、Balb/MKケラチン細胞(ワイスマン(Weissman),(1983)Cell 32:599−606)またはhKGF受容体でトランスフェクションしたNIH/3T3細胞(ミキ(Miki),(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:246−250)を使用する細胞に基づく測定法のみが報告されている。
セレックス
標的分子に対して高特異性結合を有する核酸分子のインビトロでの進化方法が開発されている。この指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)(セレックス(SELEX)と呼ばれる)方法は、現在は放棄されている米国特許出願第07/536、428号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」)、1991年6月10日出願の米国特許出願第07/714,131号(標題「核酸リガンド」)、1992年8月17日出願の米国特許出願第07/931,473号(標題「核酸リガンド」(現在、米国特許第5,270,163号、PCT/US91/04078号も参照)に記載されており、この各々は本明細書に具体的に引用される。これらの各出願は本明細書においてまとめてセレックス(SELEX)特許出願と呼び、任意の所望の標的分子に対して核酸リガンドを作成するための基本的に新規な方法を記載している。
セレックス法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的選択法を用いる結合、分配および増幅の段階的繰り返しを用いて、結合親和性と選択性の事実上すべての所望の基準を達成する。セレックス法は、核酸の混合物(好ましくは、ランダム化された配列のセグメントからなる)から出発して、結合に好ましい条件下で標的に混合物を接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分離する工程、核酸−標的分子複合体を解離させる工程、核酸−標的分子複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸の混合物を得る工程、次に標的分子に対して高特異性、高親和性の核酸リガンドを得るのに必要な回数、結合、分離、解離および増幅工程を繰り返す工程からなる。
基本的なセレックス法は、多くの具体的な目的を達成するために修飾されている。例えば、1992年10月14日出願の米国特許出願第07/960,093号(標題「構造の基本に基づく核酸の選択方法」)は、ゲル電気泳動とともにセレックスを用いて、具体的な構造的特徴(例えば、ベントDNA)を有する核酸分子を選択する。1993年9月17日出願の米国特許出願第08/123,935号(標題「核酸リガンドの光選択」)は、標的分子に結合および/またはこれを架橋および/または光不活性化することができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するための、セレックスに基づく方法を記載する。1993年10月7日出願の米国特許出願第08/134,028号(標題「テオフィリンとカフェインを区別する高親和性核酸リガンド」)は、密接に関連した分子を区別することができる高特異性の核酸リガンドを同定するための方法(逆セレックス(Counter−SELEX)と呼ぶ)を記載する。1993年10月25日出願の米国特許出願第08/143,564号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化:溶液セレックス」)は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を有するオリゴヌクレオチドを効率よく分離する、セレックスに基づく方法を記載する。1992年10月21日出願の米国特許出願第07/964,624号(標題「核酸リガンドの製造方法」)は、セレックス実施後の改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。1995年3月8日出願の米国特許出願第08/400,440号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化:ケミ−セレックス(Chemi−SELEX)」)は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載する。
セレックス法は、リガンドに改良された特性(例えば、改良されたインビボの安定性または改良された送達特性)を与える修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび/またはリン酸塩および/または塩基の位置での化学的置換がある。修飾ヌクレオチドを含有するセレックスで同定される核酸リガンドは、1993年9月8日出願の米国特許出願第08/117,991号(標題「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」)に記載されており、これはピリミジンの5−および2’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許出願第08/134,028号(前述)は、2’−アミノ(2’−NH2)、2’−フルオロ(2’−F)、および/または2’−O−メチル(2’−O−Me)で修飾された1つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有する高特異性の核酸リガンドを記載する。1994年6月22日出願の米国特許出願第08/264,029号(標題「分子内求核性置換による2’修飾ピリミジンの新規調製法」)は、種々の2’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。
セレックス法は、1994年8月2日出願の米国特許出願第08/284,063号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化:キメラ−セレックス」)、および1994年8月28日出願の米国特許出願第08/234,997号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化:ブレンドセレックス」)に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組合せを包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形や他の性質および効率的な増幅や複製能を、他の分子の好ましい性質と組合せることを可能にする。基本的なセレックス法の修飾を記載する前述の出願の各々は、参考のためその全体が本明細書に引用される。
発明の簡単な要約
本発明は、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)、血小板由来増殖因子(PDGF)、およびヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)、および相同なタンパク質に対する核酸リガンドを同定および産生する方法、およびこうして同定および産生される核酸リガンドを含む。本出願の目的について、TGFβは、ヒトTGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3、およびこれらに実質的に相同的なTGFβ類を含む。実質的に相同的とは、70%以上のアミノ酸配列の同一性の程度を意味する。本出願の目的について、PDGFとは、PDGF AA、AB、およびBBアイソホームおよび相的同なタンパク質を意味する。具体的には、この定義にヒトPDGF AA、ABおよびBBアイソホームが含まれる。詳細には、TGFβ1、PDGF、およびhKGFに特異的に結合することができるRNA配列が提供される。また、TGFβおよびPDGFに特異的に結合することができるssDNA配列も提供される。具体的には、本発明には表3、13、16、および23に示されるRNAリガンド配列(配列番号:12〜42、128〜170、189〜262、272〜304)が含まれる。表3に示されるTGFβのRNAリガンド配列は、SELEXの前および後の修飾の両方を含む。また、本発明には表6、8、9、および図3、4、および9に示されるTGFβおよびPDGFのssDNAリガンド(配列番号:55〜89、93〜124、171〜176)も含まれる。本発明には、恐らくTGFβおよびhKGFのこれらの受容体との相互作用の阻害により、TGFβ1およびhKGFの機能を阻害する、TGFβ1およびhKGFのRNAリガンドも含まれる。本発明にはまた、恐らくPDGFのその受容体との相互作用の阻害により、PDGFの機能を阻害する、PDGFのssDNAリガンドも含まれる。
さらに本発明には、TGFβ、PDGF、およびhKGFよりなる群から選択される標的に対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法であって、(a)核酸の候補混合物を標的と接触させて、(b)標的に対する親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分離し、そして(c)選択された分子を増幅して、標的に対する結合の親和性が比較的高い核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得る工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
さらに具体的には、本発明は、表3および6に示されるリガンド(配列番号:12〜42、55〜89)を含む、上述の方法により同定されたTGFβに対するRNAおよびssDNAリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつTGFβに結合してTGFβの機能を阻害する実質的に同じ能力を有する、TGFβに対する核酸リガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されるリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつTGFβに結合してTGFβの機能を阻害する実質的に同じ能力を有する、TGFβに対する核酸リガンドも含まれる。
さらに本発明は、表8および13、および図3、4、および9に示されるリガンド(配列番号:93〜124、128〜176)を含む、上述の方法により同定されたPDGFに対するssDNAおよびRNAリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつPDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、PDGFに対するDNAおよびRNAリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されるリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつPDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、PDGFに対する核酸リガンドも含まれる。
さらに本発明は、表16および23に示されるリガンド(配列番号:189〜262、272〜304)を含む、上述の方法により同定されたhKGFに対するRNAリガンドを含む。また、上記リガンドのいずれかに実質的に相同的であり、かつhKGFに結合してhKGFのその受容体との相互作用を阻害する実質的に同じ能力を有する、hKGFに対するRNAリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されたリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつhKGFに結合してhKGFのその受容体との相互作用を阻害する実質的に同じ能力を有する、hKGFに対する核酸リガンドも含まれる。
本発明はまた、本明細書で同定されたRNAリガンドに基づく他の修飾ヌクレオチド配列、およびこれらの混合物も含む。
さらに本発明には、hKGF受容体−介在性細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を測定する方法であって、(a)試験化合物をhKGF核酸リガンドおよびケラチン細胞増殖因子と接触させる工程;そして(b)hKGF核酸リガンドとケラチン細胞増殖因子との間の結合を阻害する試験化合物の能力を検出する工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
また、本発明には、増殖因子のその原形質膜結合受容体との相互作用を阻害する試験化合物の能力を測定する方法であって、(a)原形質膜結合受容体を含む細胞を可溶化し;(b)細胞の原形質膜抽出物を作成し;(c)抽出物を、標識した増殖因子単独、および試験化合物の存在下でこれと反応させて複合体を作成し;(d)未変性条件下で電気泳動により複合体を解析し;(e)イメージングにより複合体を可視化し;そして(f)標識した増殖因子単独との抽出物のイメージを、試験化合物の存在下の抽出物のイメージと比較して、試験化合物が、増殖因子とその原形質膜結合受容体との間の相互作用を阻害したかどうか決定する工程を含むことを特徴とする方法も含まれる。
さらに本発明には、細胞が増殖因子原形質膜結合受容体を発現するかどうかを決定するための細胞の測定方法であって、(a)細胞を可溶化し;(b)細胞の原形質膜抽出物を作成し;(c)原形質膜抽出物を標識した増殖因子と反応させて;(d)未変性条件下で電気泳動により原形質膜抽出物と標識した増殖因子との間の反応を解析し;(e)工程(d)の電気泳動を標識した増殖因子の電気泳動と比較し;そして(f)電気泳動の結果を可視化して、標識した増殖因子単独の移動度に対して移動度が改変された複合体が形成されるかどうか決定する工程を含むことを特徴とする方法が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図1は、TGFβ1に対する40D7 DNAライブラリーの結合分析を示す。ラウンド19(三角形)およびラウンド0(円形)から得られた結合データが示される。
図2は、オリゴヌクレオチド(0.1μM)または抗TGFβ(60μg/ml)と共にインキュベートしたTGFβ1(10pM)のPAI−ルシフェラーゼ測定の結果を示す。
図3は、表9に示される配列セットのコンセンサス二次構造を示す。R=AまたはG、Y=CまたはT、K=GまたはT、NおよびN’は任意の塩基対を示す。
図4は、コンセンサス二次構造モチーフにより折り畳まれた最小リガンド20t、36tおよび41tを示す。[3’T]は、3’−エキソヌクレアーゼ分解を低下させるために付加した3’−3’結合したチミジンヌクレオチドを表す。
図5A、5Bおよび5Cは、それぞれPDGF−AA、ABおよびBBに対する最小の高親和性DNAリガンドの結合を示す。種々の濃度のPDGFに結合した32P5’末端標識DNAリガンドの画分は、ニトロセルロースフィルター結合法により測定した。試験した最小リガンドは、20t(○)、36t(△)、および41t(■)であった。これらの実験のオリゴヌクレオチド濃度は、〜10pM(PDGF−ABとPDGF−BB)および〜50pM(PDGF−AA)であった。非線形最小自乗法を用いて、データ測定点を式1(PDGF−AAへのDNAリガンドの結合に関して)または式2(PDGF−ABおよびBBへの結合に関して)に適合させた。結合反応は、結合緩衝液(0.01%HSAを含むPBSM)中で37℃で行った。
図6は、最小DNAリガンドとPDGF ABとの間の高親和性相互作用の解離速度測定を示す。全て0.17nMでPDGF AB(1nM)に結合した5’32P末端標識リガンド20t(○)、36t(△)、および41t(■)の画分を、500倍過剰の非標識競合物質の添加後の所定の時点でニトロセルロースフィルター結合により測定した。解離速度定数(Koff)値は、データ測定点を式3に適合させることにより求めた。実験は、結合緩衝液中で37℃で行った。
図7は、PAE細胞で発現されたPDGFa−受容体に対する125I−PDGF−BBと125I−PDGF−AAの結合に及ぼすDNAリガンドの作用を示す。
図8は、PAE細胞のPDGFβ−受容体発現に及ぼすPDGF−BBの細胞***促進効果に及ぼすDNAリガンドの作用を示す。
図9は、PDGF−ABへの高親和性結合に影響を及ぼさない2’−O−メチル−2’−デオキシ−および2’−フルオロ−2’−デオキシリボヌクレオチド−置換パターンを示す。下線の記号は2’−O−メチル−2’−デオキシヌクレオチドを示し;斜体の記号は2’−フルオロ−2’−デオキシヌクレオチドを示し;普通の字体は2’−デオキシリボヌクレオチドを示し;[3’T]は逆向き(3’3’)チミジンヌクレオチド(グレン・リサーチ(Glin Research)、スターリング、バージニア州)を示し;らせんIIおよびIIIのループ中のPEGはペンタエチレングリコールスペーサーホスホルアミダイト(グレン・リサーチ(Glin Research)、スターリング、バージニア州)を示す。
図10Aは、PC−3細胞の表面上の放射標識hKGFの飽和結合を示す。TB(全結合)は、競合する非標識hKGFの非存在下で観察される結合であり、一方NSB(非特異結合)は、100倍モル濃度過剰の非標識hKGFの存在下で観察される結合である。SB(特異的結合)は、特異的結合を示し、この曲線はTB曲線からNSB曲線を差し引くことにより誘導した。図10Bは、SB曲線について10Aに示されるデータ測定点のスキャチャード分析である。
図11は、PC−3細胞からの原形質膜抽出物による電気泳動移動度のシフトを示す。レーン1〜8において、膜抽出物は、各レーンの下に示される種々の濃度の放射標識hKGFと反応させた。レーン9〜12については放射標識hKGFに加えて(各レーンの下に示されるように)100倍モル濃度過剰の非標識hKGFを加えた。C1およびC2は、PC−3原形質膜抽出物中のhKGF結合残基の存在による2つの観察された複合体を表す。
図12A−Dは、2’Fおよび2’NH2リガンドの提唱される整列を示す。小文字の斜体の配列残基は、鋳型の定常領域を示す。コンセンサス配列において、各ファミリーの80%および60%以上に見い出される残基にはそれぞれ大文字および小文字が使用されている。KdおよびKi値も、各リガンドの呼称の次に示される。ここで示されるKi値は、式Ki=IC50/(1+(C/Kd))(式中、IC50は、例16に記載されるPC−3細胞測定において測定された各リガンドの最大阻害濃度の半分であり;Cは、125I−KGFの濃度であり;そしてKdは、その受容体に対するKGFの平衡解離定数(約150pM)である)を用いて計算した。星印を付けたリガンドは、二相性結合曲線を示す。
図12Aおよび12Bは、2’Fリガンドの提唱される整列を示す。多くの2’Fリガンドは、シュードナット(pseudoknot)構造に折り畳むことが可能である。記載されるように2つの分類が提案される。各クラスの要約構造も示される。ステム1(S1)に関係している塩基は、一本線で下線を引き、一方ステム2(S2)の塩基は二本線で下線を引いた。シュードナットの種々の要素の整列のためにスペースを入れた。
図12Cおよび12Dは、2’NH2リガンドの提唱される折り畳みを示す。これらのリガンドは2つのクラスに割り当てられる。要約構造に示されるように、クラス1およびクラス2のリガンドは、それぞれステム−ループおよびダンベル構造を形成することができる。配列を整列させるためにスペースを入れた。ステムに関係している残基に下線を引いた。要約構造において、ピリオド(.)は可変数の残基を示す。リガンド2Nおよび54Nは、同じダンベル構造の環状置換である。対応するループの整列のため、これらのリガンドは2本の線上に分けて描いた。
図13は、リガンド6Fおよび14FのhKGFへの結合に必要な最小配列を示す。各リガンドの予測される折り畳みが示される。リガンドの定常領域は小文字で示される。保存配列に下線を引いた。円形と三角形は、それぞれ活性および不活性の端を切り取った形の3’末端の目印である。
発明の詳細な説明
本出願は、セレックスとして知られている方法により同定されるTGFβ、PDGF、およびhKGFに対する高親和性核酸リガンドを記載する。セレックスは、現在は放棄されている米国特許出願第07/536,428号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」)、1991年6月10日出願の米国特許出願第07/714,131号(標題「核酸リガンド」)、1992年8月17日出願の米国特許出願第07/931,473号(標題「核酸リガンド」(現在、米国特許第5,270,163号、PCT/US91/04078号も参照)に記載されている。これらの出願の各々は本明細書に具体的に引用され、まとめてセレックス(SELEX)特許出願と呼ぶ。
最も基本的な形では、セレックス方法は以下の一連の工程により定義される:
1)異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に固定配列の領域(すなわち、候補混合物の各メンバーは同一位置に同一配列を含有する)とランダム化した配列を含む。固定配列領域は、(a)以下に記載される増幅工程を援助するため;(b)標的に結合することが公知の配列を模倣するため;または(c)候補混合物中の、特定の構造配置の核酸の濃度を上昇させるために、選択される。ランダム化された配列は、完全にランダム化(すなわち、任意の位置にある塩基を見い出す確率が4分の1)されるか、または一部のみがランダム化(すなわち、任意の位置にある塩基を見い出す確率が0と100パーセントの間の任意のレベルを選択しうる)されていてよい。
2)候補混合物を、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合のよい条件下で、選択された標的に接触させる。これらの状況下では、標的と候補混合物の核酸間の相互作用により、標的と、標的に対する最も強力な親和性を有する核酸との間の核酸−標的対を形成すると考えられる。
3)標的に対して最も高い親和性を有する核酸は、標的に対して低い親和性を有する核酸から分画される。高親和性核酸に相当する極く少数の配列(おそらく1分子の核酸)しか候補混合物中に存在しないため、一般に、分画中かなりの量(約5〜50%)の核酸が候補混合物に残るように、分画の基準を設定することが必要である。
4)分画中、標的に対して相対的に高い親和性を有するとして選択された核酸は次に、増幅されて、標的に対して相対的に高い親和性を有する核酸が濃縮されている新規な候補混合物を生成させる。
5)前述の分画と増幅工程を繰り返すことにより、新規に形成される候補混合物のユニークな配列の割合は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均の程度は一般に上昇する。極限まで進めれば、セレックス方法は、標的分子に対する最も高い親和性を有する、元の候補混合物からの核酸である1つあるいは少数のユニークな核酸を含有する候補混合物を生成させる。
セレックス特許出願は、この方法を非常に詳細に記載している。ここには、この方法に使用することができる標的;最初の候補混合物の調製方法;候補混合物内の核酸を分画する方法;および分画した核酸を増幅して、濃縮した候補混合物を生成する方法も含まれる。セレックス特許出願はまた、核酸結合蛋白である蛋白とそうでない両者の蛋白標的を含む、多くの標的種に対して得られたリガンド溶液を記載している。
本明細書に記載の核酸リガンドは、親油性化合物(例えば、コレステロール)と複合体を形成するか、または親油性成分(例えば、リポソーム)からなる複合体に結合またはカプセル化することができる。複合体を形成した核酸リガンドは、細胞内の標的への核酸リガンドの送達のために、細胞による核酸リガンドの細胞性摂取を増強することができる。1995年5月4日出願の米国特許出願第08/434,465号(標題「核酸リガンド複合体」)(参考のためこの全体が本明細書に引用される)は、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法を記載する。
本明細書に記載の方法およびこのような方法により同定される核酸リガンドは、治療および診断目的に有用である。治療用途には、治療用途には、ヒト患者の疾患または症状の治療または防止がある。診断用途には、インビボまたはインビトロの応用がある。セレックス法は一般に、そして本発明で具体的に教示され特許請求されるセレックス法は、特に診断応用に適している。セレックスは、高親和性および驚くべき特異性で標的に結合することができる核酸リガンドを同定する。これらの特性はもちろん診断用リガンドで当業者が求める好ましい性質である。
本発明の核酸リガンドは、当業者の使用するいくつかの方法に従って日常的に診断目的に適合させてもよい。診断薬は、使用者が特定の位置または濃度である標的の存在が識別できればよい。標的と結合対を形成する能力は、診断目的の陽性のシグナルを発生させるのに充分であろう。当業者はまた、核酸リガンドの存在を追跡するための標識物を取り込むために、当該分野で公知の方法により、このようなリガンドを適合させることができるであろう。このような標識物は、多くの診断法で使用できる。本明細書に記載の核酸リガンドは、TGFβ、PDGF、およびhKGFの同定に具体的に使用できる。
セレックスは標的分子に対する高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の分野では前例のないユニークな業績である。本発明は、セレックス法をTGFβ、PDGF、およびhKGFの具体的標的に応用する。後述の例のセクションにおいて、TGFβ、PDGF、およびhKGFに対する核酸リガンドを単離し同定するために使用される実験パラメータが記載される。
薬剤として有用な核酸を製造するために、核酸リガンドは、(1)標的に対して目的の効果を達成できる方法で標的に結合し;(2)目的の効果を得るためにできるだけ小さく;(3)できるだけ安定であり、;そして(4)選択されるリガンドに対して特異的なリガンドである、ことが好ましい。多くの場合、核酸リガンドは標的に対してできるだけ高い親和性を有することが好ましい。
同時係属中で同一出願人の1992年10月21日に出願された米国特許出願番号07/964,624号(’624)(現在米国特許第5,496,938号)には、セレックスが行われた後改良された核酸リガンドを入手するための方法が記載されている。この「核酸リガンドを産生するための方法」という標題の’624出願は、参考のために具体的に本明細書に引用されている。この出願には、核酸リガンドの3次元構造の決定方法が含有される。このような方法は、セレックス誘導リガンドの数学的モデリングと構造修飾(例えば、化学的修飾およびヌクレオチド置換)を含む。
本発明では、40または60個のランダム位置(40Nまたは60N)を含有する縮重ライブラリーからTGFβ1に対して特異的な高親和性を有するRNAおよびDNAリガンドを得るためにセレックス実験を行った(表1と5)。本発明は、例1および2に記載の方法により同定された表3(配列番号12〜42)に示すTGFβ1に対する特異的RNAリガンドを包含する。本発明はさらに、おそらくはTGFβ1とその受容体との相互作用を阻害することにより、TGFβ1機能を阻害するTGFβに対するRNAリガンドを包含する。本発明は、例5および6に記載の方法により同定された表6に示すTGFβ1に対する特異的ssDNAリガンド(配列番号55〜89)を包含する。
本発明では、40または50個のランダム位置(40Nまたは50N)を含有する縮重ライブラリーからPDGFに対して特異的な高親和性を有するssDNAおよびRNAを同定するために、2つのセレックス実験も行った。本発明は、例7および15に記載の方法により同定された、表8、9、および13および含む3、4、および9(配列番号93〜124、128〜176)に示すPDGFに対する特異的ssDNAおよびRNAリガンドを包含する。
本発明では、40個のランダム位置(40N)を含有する縮重ライブラリーからhKGFに対して特異的な高親和性を有するRNAリガンドを探索するために、セレックス実験も行った。本発明は、例16および17に記載の方法により同定された、表16および23(配列番号189〜262、272〜304)に示すhKGFに対する特異的RNAリガンドを包含する。本発明はさらに、hKGFとその受容体との相互作用を阻害するhKGFに対するRNAリガンドを包含する。
本発明により包含されるリガンドの範囲は、好ましくはセレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、TGFβ、PDGF、およびhKGFに対するすべての核酸リガンドを含む。さらに詳しくは本発明は、表3、6、8、9、13、16、および23、ならびに図3、4、および9に示すリガンドに実質的に相同的な核酸配列を包含する(配列番号12〜42、55〜89、93〜124、128〜176、189〜262、272〜304)。実質的に相同的とは、70%を超え、最も好適には80%を超える一次配列相同性を意味する。TGFβについて表3と6(配列番号12〜42、55〜89)、PDGFについて表8と13(配列番号93〜124、128〜170)、およびhKGFについて表16と23(配列番号189〜262、272〜304)に示す核酸リガンドの配列同族体を再検討すると、一次相同性がほとんどまたは全くない配列が、実質的に同じ結合能力で、ある標的に結合することがあることがわかった。このため本発明はまた、表3、6、8、9、13、16、および23、ならびに図3、4、および9(配列番号12〜42、55〜89、93〜124、128〜176、189〜262、272〜304)に示す核酸リガンドと実質的に同じ構造および実質的に同じTGFβ、PDGF、およびhKGFへの結合能力を有する核酸リガンドも包含する。PDGFについて実質的に同じ構造には、PDGFに親和性を与える図3に示す共通の構造成分を有するすべての核酸リガンドを含む。TGFβ、PDGF、またはhKGFに結合する実質的に同じ能力とは、親和性が、本明細書に記載のリガンドの親和性の数オーダーの範囲内であることを意味する。ある配列(本明細書に記載のものと実質的に相同的)がTGFβ、PDGF、またはhKGFに実質的に同じ能力で結合するか否かを決定することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明はまた、前記のリガンドを含有し、ここでリガンドのインビボの安定性を増加させるか、またはリガンドの送達を増強または媒介するためにいくつかの化学的修飾が行われる。そのような修飾の例には、ある核酸配列の糖および/またはリン酸および/または塩基位置の化学的置換がある。例えば、1993年9月9日出願の米国特許出願第08/117,991号(標題「修飾ヌクレオチド含有高親和性核酸リガンド」)を参照(これは参考のため本明細書に引用される)。他の修飾も当業者に公知である。このような修飾には、セレックス後(すでに同定された修飾されたまたは修飾されていないリガンドの修飾)またはセレックス操作中に取り込むことにより行われる。
例20は、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)に対する核酸リガンドのセレックス後修飾を記載する。核酸リガンドは、ホスホロチオエートキャップを付加し、いくつかのリボプリンを2−デオキシ−2’−O−メチルプリンの置換により修飾する。
前述のように、TGFβ、PDGF、およびhKGFに選択的に結合できる能力のため、本明細書に記載のTGFβ、PDGF、およびhKGFに対する核酸リガンドは薬剤として有用である。従って本発明はまた、TGFβに結合できる核酸リガンドを投与することによるTGFβ媒介性疾患の治療法、PDGFに結合できる核酸リガンドを投与することによるPDGF媒介性疾患の治療法、およびhKGFに結合できる核酸リガンドを投与することによるhKGF媒介性疾患の治療法、を包含する。
核酸リガンドの治療用組成物は、注射により非経口投与で投与されるが、他の有効な投与型(例えば、関節内注射、吸入ミスト、経***性製剤、経皮的イオン導入法または坐剤)も使用できる。1つの好適な担体は生理食塩水であるが、他の薬剤学的に許容される担体も使用可能である。1つの好適な実施態様において、担体とリガンドは生理的適合性のある徐放製剤を構成する。このような担体の主要な溶媒は、天然では水溶性または非水溶性である。さらに担体は、製剤のpH、浸透圧、粘性、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭いを修飾または維持するための他の薬剤学的に許容される賦形剤を含有してよい。同様に、担体は、リガンドの安定性、溶解、放出もしくは吸収速度を修飾または維持するための薬剤学的に許容されるさらに別の賦形剤を含有してよい。このような賦形剤は、単位服用量または複数回投与型の非経口投与用の製剤の製造に普通に使用される物質である。
治療用組成物がいったん製剤化されれば、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存される。このような製剤は、即時使用型または投与直前に復元を必要とする型で保存される。全身性送達のための核酸リガンドを含有する製剤の投与方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内に、または膣もしくは直腸坐剤で投与される。
以下の例は、本発明を説明し例示するものであり、決して本発明を限定するものではない。例1〜4は、TGFβ1に対する特異的高親和性を有するRNAを同定するための初期の実験を記載する。例1は、例2〜4で使用される種々の材料と実験方法を記載する。例2は、セレックス法によりTGFβ1に結合するRNAリガンドの代表的同定方法を記載する。例3は、TGFβ1に対してリガンドが有する親和性を記載し、リガンドはおそらくTGFβ1とその受容体との相互作用を阻害することにより、TGFβ1の機能を阻害することができることを証明する。例4は、TGFβ1結合、およびTGFβ1受容体結合の阻害に、リガンドのどの領域が必要と考えられるかを説明する。例5は、セレックス法による、TGFβ1に結合するRNAおよびDNAリガンドの別の代表的同定方法を記載する。例6は、ssDNAセレックスライブラリーの結合解析、バイオアッセイ、および配列について報告する。例7は、例8〜13に示すPDGFに対するssDNAリガンドの進化に使用される種々の材料と実験方法を記載する。例8は、PDGFに対するssDNAリガンド、および選択された核酸リガンドの予測される2次構造を記載する。例9は、高親和性結合に必要な最小の配列を記載する。例10は、PDGF−核酸リガンド複合体の動力学的安定性を記載する。例11は、選択されたリガンドの熱溶融性を記載する。例12は、核酸リガンドとPDGFの光架橋を記載する。例13は、培養細胞上のPDGFアイソフォームのDNAリガンドによる阻害、およびDNAリガンドによる細胞中のPDGFの細胞***促進作用の阻害を記載する。例14は、修飾ヌクレオチドによるPDGFに対する核酸リガンドの修飾を記載する。例15は、PDGFに対するRNAリガンドを進化するのに使用される実験法を記載し、リガンド配列を示す。例16は、例17〜19に記載のhKGFに対する核酸リガンドを進化するのに使用される種々の材料と実験法を記載する。例17は、hKGFに対するRNAリガンド、hKGFに対するリガンドが有する親和性、そしてhKGFに対するRNAリガンドの特異性を記載する。例18は、細胞表面受容体へのhKGF結合の阻害を記載する。例19は、選択されたリガンドによるhKGFの***促進活性の阻害を記載する。例20は、2−デオキシ−2’−O−メチルプリンを用いるbFGFに対する核酸リガンドの修飾を記載する。
例
例1.実験方法
本例は、例2〜4で使用され導入される一般的方法を提供する。
A.材料
このセレックス法で使用されるヒト組換えTGFβ1は、ジェネンテク(Genentech)から得た。ヒト組換えTGFβ1はまた、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州、米国)から購入した。
ビオチン化TGFβ1は、50mM NaHCO3中の3.6μMのTGFβ1を11倍モル過剰のスルホ−NHS−ビオチン(ピアス(Pierce)、ロックフォード(Rockford)、イリノイ州、米国)と、氷浴中で3時間反応させて調製した。反応物を0.036部の10%酢酸で酸性にし、シリコーン化ピペットチップ中に作成した40mgのバイダック(Vydac)(ザセパレーションズグルーグ(The Separations Group)、ヘスペリア(Hesperia)、カリホルニア州、米国)逆相カラムに適用し、反応しなかったビオチンをビオチン化TGFβ1から分離した。カラムを200μlのエタノールで次に200μlの1%酢酸で前洗浄し、ビオチン化反応物を適用し、遊離ビオチンを200μlの50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)、次に200μlの20%アセトニトリル、そして最後に200μlの60%アセトニトリルで洗浄した。試料を凍結乾燥し、50mM酢酸ナトリウム(pH5.0)に40μMで再懸濁し、4℃で保存した。回収率を追跡し、ビオチン化の前後にストレプトアビジンコーティングアガロースビーズ(ピアス(Pierce))に結合する放射能の割合を測定することによりビオチン化反応の成功を評価するために、TGFβ1に100,000cpmのヨード化TGFβ1を加えた。ビオチン化前後のTGFβ1のアリコートを、逆相クロマトグラフィーにかけた。ビオチン化TGFβ1は実質的に単一のピークとして移動し、非ビオチン化TGFβよりおそかった。少量(5%)の未反応TGFβ1が検出された。ヨード化されビオチン化されたTGFβ1のストレプトアビジン(SA)アガロースビーズ(30μl)への結合の効率は、セレックス分離法で使用した結合条件下で30%であった。
ヨード化TGFβ1は、バイオラッドエンザイモビーズ(Bio-Rad Enzymobeads)(バイオラッド(Bio-Rad)、リッチモンド、カリホルニア州、米国)を用いるラクトペルオキシダーゼ法(50mMリン酸ナトリウム(pH7.3)、0.16%グルコース)により調製し、結合したヨードを、50mM酢酸ナトリウム0.01%ツイーン中でG25セファデックスでゲル濾過して、遊離ヨードから分離した。
PAI1プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するミンク肺細胞株(アベ(Abe)ら(1994)Anal. Biochem.216:276−284)は、ダン・リフキン(Dan Rifkin)博士(細胞生物学部門、ニューヨークメディカルセンター、ニューヨーク、ニューヨーク州10016)からの供与である。ルシフェラーゼは、アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー(Analytical Luminescence Laboratory)、サンジエゴ、カリホルニア州、米国)から購入した試薬で測定した。
2’−NH2修飾CTPおよびUTPは、ピエケン(Peken)らの方法(1991,Science 253:314−317)に従って調製した。DNAオリゴヌクレオチドは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical, Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州、米国)またはオペロン・テクノロジーズ(Operon Technologies)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州、米国)で、標準的方法により合成された。すべての他の試薬および化学物質は、市販品を購入し、購入源を記載した。
B.セレックス法
TGFβ1に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第5,270,163号(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510)に記載の方法により得た。PCR鋳型の出発プールを作成するために、それぞれ16.1pmolの精製していない単一の標準的DNA(少なくとも全部で2×1012〜2×1013の異なる分子)を含有する20の別個のPCR反応物を、最初の転写の前にプールした。PCR条件は、シリコーン化マイクロ遠心管中、50mM KCl、10mMトリス−塩酸(pH9)、0.1%トリトンX−100、1.5mM MgCl2、0.2mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、2μMずつのプライマー、および100μlの0.075U/mlのTaqDNAポリメラーゼであった。すべてのPCRサイクルは、アンプリワックス(Ampliwax)(パークアンドエルマー(Perk and Elmer)、ノーウォーク(Norwalk)、コネチカット州、米国)を用いる、ホットスタートを利用した。最初のPCRは10サイクル持続した:PCRサイクルは、94℃−1分、52℃−1分、72℃−2分であった。最初の変性は、94℃で4分であり、最後の伸長は72℃で5分であった。PCR反応物を合わせ、フェノール/クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿(2.0M酢酸アンモニウム、50%イソプロパノール)させて、プライマーを除去した。
転写反応物は、200nM DNA、0.9mM GTP、0.9mM 2’−NH2−UTP、0.9mM 2’−NH2−CTP、0.5mM ATP、87mM トリス−塩酸(pH8.0)、17mM MgCl2、4.4mM スペルミジン、22mM DTT、100μg/mlアセチル化BSA(プロメガ(Promega)、マジソン、ウィスコンシン州、米国)、および4U/μlのT7 RNAポリメラーゼを含有した。(2’−F UTPと2’−F CTP(ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Biochemical)、クリーブランド、オハイオ州、米国)は、3.0mMで使用し、UTPとCTPは0.9mMで使用した)。転写反応は28℃で一晩行った(少なくとも10時間)。転写後、2μlのRQ1 Dnase(プロメガ(Promega))を加えて鋳型を28℃で15分間消化し、次にフェノール/クロロホルムで抽出し、次に酢酸アンモニウムから3回エタノール沈殿させた(3.9M酢酸アンモニウム、72%エタノール)。
RNA分子を、クレブス−リンゲル溶液(KR)(120mM NaCl、4.8mM KCl、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)、1.2mM MgSO4、2.6mM CaCl2)中で、下記のようにSAアガロースビーズに結合したTGFβ1とインキュベートした。この緩衝液をKRHTと呼ぶ。
ビーズを洗浄して、TGFβ1−RNA複合体を非結合RNAから分離した。アガロースビーズからの選択された2’−NH2またはFピリミジン修飾RNAの回収は、グアニジンチオシアネート抽出(5M GnSCN、10mMトリス−塩酸、0.1mM EDTA、pH7.0、0.1Mβ−メルカプトエタノール)が必要であったか、または2%SDS(0.1Mトリス−塩酸(pH7.5)、50mM NaCl、1mM Na2EDTA、2%SDS、1.5mM DTT)によりセラダイン(Seradyne)SAコーティングビーズから回収した。普通の2’−OH RNAは、0.2%SDSのみを含有するセラダインビーズに使用したものと同じ緩衝液を使用してあまり厳しくない条件下で容易に回収された。抽出し沈殿してRNAを精製し濃縮した後、RNaseH配列が欠如したクローン化したMMLV RTで試料を逆転写した。反応物は、16nM未満またはこれに等しいRNA、10μM 3’プライマー、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、75mM KCl、5mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM dNTPを含有した。緩衝液と塩の添加後、反応物を28℃で10分間アニーリングさせてから、600単位のスーパースクリプト(Superscript)逆転写酵素(ベセスダリサーチラボズ(Bethesda Research Labs)、ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州、米国)を加え、50℃で1時間合成させた。
C.セレックスの分離法
2.5pmolのビオチン化TGFβ1を、200μlのKRHT中の30μl SAアガロースビーズ(ピアス(Pierce))に結合させた。混合物を37℃で15〜30分インキュベートした。ベクターに、遠心分離と200μlの冷KRHTへの再懸濁を3回行って、非結合TGFβ1を除去し、最終容量500μlのKRHTに再懸濁した。2’−NH2ピリミジンを含有するRNAを70℃で3分間加熱し(2’−OHまたは2’−Fピリミジンを含有するRNAは95℃で加熱した)、SAビーズに結合したTGFβ1を含有するKRHT中に希釈した。RNAの最終濃度は1μMであり、TGFβ1は5nMであった。37℃で30分間回転させて結合を起こす。ビーズを200μlの結合緩衝液で3回遠心分離と再懸濁を行って、非結合RNAを除去する。前述のようにビーズからRNAを溶出した。
D.結合測定法
TGFβ1に対するリガンドについての2つの測定法は、いつも同等の結果を与えた。SAビーズ測定法では、ビオチン化TGFβ1をポリエチレン試験管(リンブロ(Linbro)、アイシーエヌ(ICN)、アービン(Irvine)、カリホルニア州、米国)中でKRHTで連続希釈し、前述のようにビーズに結合させた。非結合TGFβ1を洗い流した後、各試験管に微量の32P標識RNA(<0.1nM)を加え、ボルテックス混合した。37℃で30分間静止インキュベート後、非結合RNAを200μlのKRHTで3回洗浄して除去した。
ニトロセルロースフィルター結合測定法では、担体としてトリトンX−100の代わりに0.1%脱脂BSA(フルカ(Fluka)ラジオイムノ測定等級、フルカ(Fluka)、ハウパーゲ(Hauppauge)、ニューヨーク、米国)を使用して、TGFβ1を希釈した。RNAトレーサーとのインキュベートは前述のように行った。マルチマーウェルピペッターを用いて、湿ったバイオラッド(Bio-Rad)0.45ミクロンのニトロセルロースのシートを有するマルチウェルマニホールドに、試料を入れ、吸引し、そして200μlのKRH(BSAは含有しない)で3回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、液体シンチレーションカウンター(ベックマンインスツルメンツ(Beckman Instruments)、パロアルト(Palo Alto)、カリホルニア州)で計測した。
TGFβ1へのリガンドの結合を適合させるのに使用した式は、質量作用の法則に従い、単一の結合部位がある受容体(この場合TGFβ1)へのリガンドの結合を記載する:Y=Bmax*X/(Kd+X)、ここでYは、結合したリガンドの割合、Bmaxは結合したリガンドの最大の割合、XはTGFβ1の濃度、そしてKdはTGFβ1とリガンドの解離定数である。データ点は、コンピュータープログラムグラフパッドプリズム(Graphpad Prism)(グラフパッドソフトウェア(Graphpad Software)、サンジエゴ、カリホルニア州)を用いて、非線形回帰法で適合させた。アルゴリズムは、曲線からの点の実際の距離の平方の和を最小にするものである。2つの連続的繰り返しによる、平方和の変化が0.01%未満の場合、収束したものとした。
E.クローニングと配列決定
セレックス実験は、表2に記載する。セレックス実験1と2からのプライマーは、制限エンドヌクレアーゼSacI(5’プライマーT7SacBam;配列番号7)とXbaI(3’プライマー3XH;配列番号9)の認識部位を含有する。セレックス実験1と2からのPCR産物は、SacI/XbaI消化したpGem9zf(プロメガ(Promega))中に方向をそろえてクローン化した。5’プライマーT7SB2N(配列番号8)と3’プライマー3XH(配列番号9)は、セレックス実験3〜9に使用した。セレックス実験3〜9からのPCR産物は、修飾したpGem9zf:BamHIクローニングベクターのBamHI/XbaI部位に方向をそろえてクローン化した。BamHI部位を、以下のようにしてpGem9zf中に作成した。TGFβ1(配列は示していない)に結合しなかったライブラリー2(lib2−6−2)から単離したクローンを、BamHIとXbaIで消化した。修飾pGem9zfベクターのクローニング部位に隣接する配列を、表1に示す(配列番号10〜11)。
プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで消化しCIP(コウシ小腸ホスファターゼ)で脱リン酸化後、ベクターをゲル精製した。挿入体を結合させ、組換えプラスミドを大腸菌(E. coli)DH10B株(ベセスダリサーチラボズ(Bethesda Research Labs))に形質転換した。プラスミドDNAをアルカリ溶解、ミニプレプ法により調製した。9つのユニーク配列を示す22クローンを、ライブラリー1と2からランダムに配列決定した。単一のジデオキシG反応(Gトラックと呼ぶ)を使用して、ライブラリー3〜9から50クローンの配列を決定した。配列決定ラダーを比較し、類似性について並べた。各ファミリーから選択されたクローンを、完全な配列決定解析のために選んだ。各ライブラリーで異なるG配列を示す転写体について、TGFβ1結合測定法を行った。全部で140の結合測定中、27リガンドは10nM未満のKdで結合し、これらのうち21を配列決定した。クローンはシーケナーゼプロトコール(ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Biochemical Corporation)、クリーブランド、オハイオ州)を用いて配列決定した。
F.リガンドのトランケーション
TGFβ1へのRNAリガンドの高親和性結合に必要な最小配列を決定するために、トランケーション(truncation)実験を行った。3’境界の決定のために、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して5’末端をγ−32P−ATPで標識した。5’境界は、α−32P−pCpとT4 RNAリガーゼを用いて、3’末端標識リガンドで確立した。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識RNAリガンドを、1nM〜50nM濃度のTGFβ1とインキュベートし、タンパク質結合RNAをニトロセルロース分離法により分離した。RNAトランケートを、高分解能変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。G−残基で終止する放射能標識リガンドのラダーを、部分的RNaseT1消化で作成し、マーカーとして使用した。
G.TGFβ1機能の阻害
TGFβ1シグナル導入は、細胞表面受容体への結合で始まり、種々の遺伝子の転写が導入される。これらの遺伝子の1つが、Pailである。TGFβ1測定法は、Pailプロモーターに融合したルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するミンク肺上皮細胞(MLEC)を利用する。MLECはその細胞表面にTGFβ1を有する。すなわち、一定の誘導時間後ルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより、TGFβ1に対する細胞の応答および培地中のTGFβ1の有効濃度を測定できる。
Pai1/luc作製体を有するミンク肺上皮細胞(MLEC)は、10%胎児牛血清と400μg/mlG418を含有するDME中で維持した。MLEC−Pai1/luc細胞を、96ウェルファルコン(Falcon)プレートのウェル当たり3.2×104細胞で、100μlのDME+10%胎児牛血清中に一晩蒔いた。培地をオートクレーブした水から作成した。無血清DME+溶液A(1:1)で細胞を3回洗浄した(100μl)。溶液Aは、30mMヘペス(pH77.6)、10mMグルコース、3.0mM、KCl、131mM NaCl、1.0mMリン酸塩二ナトリウムである。試料(100μl)を、20mMヘペス(pH7.5)と0.1%BSA(フルカ(Fluka)ラジオイムノ測定等級)を含有するDMEに加えた。すべての試料は3重測定である。5%CO2インキュベータ中37℃で6時間後、培地を除去し、冷PBSで3回洗浄した(100μlずつ)。溶解緩衝液(75μl)(アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー(Analytical Luminescence Laboratory))を加え、プレートを氷上で20分間インキュベートした。プレートを密封し、測定するまで−80℃で凍結した。アナリティカル・ルミネセンス・ラボラトリー(Analytical Luminescence Laboratory)(サンジエゴ、カリホルニア州、米国)のエンハンストルシフェラーゼ測定キット(Enhance Luciferase Assay Kit)を用いて、製造業者の説明書に従ってベルトールドミクロルマット(Berthold Microlumat)LB96Pルミノメータを使用して、試料(25μl)のルシフェラーゼ活性を測定した。発光は、再現性よく培地に加えたTGFβ1濃度の関数である。
TGFβ1活性の阻害について試験したリガンドは、最小の5つの濃度で試験した。リガンドをポリプロピレン試験管中でDME、20mMヘペス(pH7.5)、0.1%フルカ(Fluka)BSAで連続希釈し、12pMのTGFβ1を含有する等量の培地を各試験管に加え、ボルテックスし、さらにインキュベートすることなく細胞に移した。各プレートに含まれるTGFβ1標準曲線から、測定した発光の低下により、阻害リガンドの存在下でTGFβ1の有効濃度を求めた。あるリガンドは3pMおよび6pMのTGFβ1で試験し、同じ結果を得た。IC50(TGFβ1活性を50%低下させるのに必要なセレックスリガンドの濃度)を測定するために、各リガンドについて得られた5つの値をプロットし、データの双曲線適合を仮定し非線形回帰を使用してグラフパッドプリズム(Graphpad Prism)を用いて、50%阻害の値をグラフから求めた。
例2.TGFβ1に対するRNAリガンド
A.セレックス実験
TGFβ1に対するRNAリガンドを作成するために、例1に記載の方法を使用して、9つのセレックス実験(表2に要約)を行った。表1に示すように、RNAプールは、分子の中心部分に存在するランダム塩基の数が異なる:40N6(配列番号2)セレックス中の40ヌクレオチド、および64N6とlib2−6−1RN6(配列番号1,3)セレックス実験中の64ヌクレオチド。目標はTGFβ1に結合するだけでなく受容体結合を阻止するRNAリガンドを選択することであったため、大きなランダム領域(64N)を選択した。2つの実験で、短いランダム領域(40N)も含めた。TGFβ1に対するリガンドは40Nではまれであり、定性的には選択した64N6リガンドと同じであった。
セレックス実験からのクローンの配列を表3(配列番号12〜42)に示す。種々のセレックス実験で使用したピリミジンは、糖の2’位で異なっていた(表2)。最初の2つのセレックス実験で、リガンドを2’−OHピリミジンとして進化させた。リガンドは、TGFβ1結合を保持しているかどうかを調べるために、2’−NH2または2’−F置換ピリミジンでセレックス後修飾した。2’置換はリガンドをRNaseA耐性にしたため、TGFβ1活性の阻害について細胞培養測定法でも試験した。このようなリガンドの1つであるlib2−6−1(D群、表3;配列番号35)は2’−NH2−UTPおよび2’−F CTPで置換した時、ティーG−カルテット受容体媒介活性を阻害することが証明された。より多くのリガンドを選択するために、進化プロセスで2’−Fおよび2’−NH2置換ピリミジンを使用して、さらに6つの独立したセレックス実験(lib3−7およびlib9)を行った。実験lib8で、生物活性を有するクローンlib2−6−1(配列番号35)をランダム化し、クローンの結合および阻害挙動が改善されるか否かについて再選択した。lib8は2’−OHピリミジンRNAとして進化した。ある場合には、例えば2’−Fピリミジン置換で進化させたリガンドが2’−NH2置換でも結合するか否かを調べるために、実験3〜9で得られたTGFβ1リガンドのセレックス後修飾を行った。
セレックス実験の各出発プールは、3×1014のRNA分子(500pmol)を含有した。TGFβ1に対する出発RNAの親和性は、50mMより大きいと推定した。4ラウンドのセレックス後、進化するプールの親和性は約10nM改善し、以後のラウンドで大きく変化しなかった。RNAをバルク配列決定した結果、非ランダムであることがわかり、クローン化した。
ラウンド15までは最適濃度のTGFβ1を使用しなかったためlib1の進化に20ラウンドが必要であり、ラウンド8まではセレックスの分離工程で結合リガンドの回収のために最適条件を導入しなかったため、ライブラリー5、6、および7では、進化により長くかかった。最適のTGFβ1濃度および分離条件を例1に記載する。
B.RNA配列
セレックスライブラリー中の多くのクローンは、配列が同じかまたは似ている。ライブラリーをGトラックによりスクリーニングし、各Gトラック型の代表的のもののみを結合測定法で試験した。結合測定法は5点(16.5nM、5.5nM、1.8nM、0.6nM、および0.2nM)であり、Kdが10nMより小さいセレックスクローンのみが検出できた。結合測定法で良好に(Kd<10nM)結合したRNAリガンドのみを配列決定した。配列は肉眼で検査し、核酸配列を整列させて折り畳んで2次構造の領域を予測させるコンピュータープログラムを使用して解析した。配列相同性によりリガンドを5群(A,B、C、D、およびオーファン)に分類した。各群は特徴的な可能な2’置換を有した。
A群リガンドに属させるための7つの別個のセレックス実験からGトラックにより、58クローンを同定した(表3;配列番号12〜42)。15クローンを配列決定した;13は似ていたが同じではなく、3つのクローン(lib3−13(配列番号12)、lib5−6、およびlib5−13)は同じであった。A群リガンドは、2’−NH2、2’−OHまたは2’−F置換ピリミジンとして進化するライブラリー、ならびに2’−F UTP、2’−NH2−CTPとして進化するライブラリーを含有する8つのセレックスライブラリーのうち7つから回収した。セレックス後修飾は、2’−NH2−UTP、2’−F CTPはTGFβ1へのlib8−9の結合を破壊せず、従ってA群リガンドの構造は、結合を維持するためにピリミジン糖上に特異的な2’残基を必要としないようであることを示す。
B群リガンドは、2’−NH2および2’−Fピリミジン置換RNAの両方に結合する。3つのライブラリーからGトラック解析により、28個のB群クローンを検出した。ライブラリーの2つは、2’−NH2として、そして1つは2’−Fライブラリーとして進化した。4クローンを配列決定し、2つは同じであった(lib5−47およびlib4−12(配列番号28)。B群ではlib3−44として内部欠失が起きることがある。40Nオーファン、lib3−42は、2次構造に基づき、B群に入れた。lib3−44の内部欠失、結合親和性、生物活性、および境界実験はすべて、lib3−44をこの群に入れることを支持する。
C群リガンドのメンバーはlib1で2’−OHリガンドとして進化しlib6で2’−Fピリミジン置換リガンドとして進化したため、この群は予測されたように2’−OHまたは2’−Fリガンドとして結合する。lib1−20−3(配列32)を2’−F誘導体としてセレックス後修飾した。lib1−20−3は、取り込まれた2’−NH2ピリミジンには結合しなかった。
D群リガンドlib2−6−1(配列番号35)は2’−OHセレックス後単離されたが、セレックス後修飾され、2’−NH2−UTPおよび2’−F CTPピリミジン誘導体としてよく結合する。lib2−6−1は、2’−NH2、2’−Fまたは2’−F UTP、2’−NH2−CTP置換ピリミジンではTGFβ1によく結合しない。D群の変種は他の2つのセレックスでのみ再セレックスを行い(lib8、2’−OHライブラリー、およびlib9、2’−NH2−UTP、2’−F CTPライブラリー)、このリガンドでは2’ピリミジン位に対する特異性があるという観察結果を支持している。
群名をつけたオーファンはたがいに相同的ではなく、これらのリガンドの変種配列は測定されていない。Gトラックは、lib3−45に類似の8つの40Nクローンが、2つのライブラリーから単離されたことを示す。8つのうち2つの配列を決定し、その結果同じであった。lib3−45(配列番号39)は、それが2’−NH2または2’−F置換ピリミジンを含有しようが、2’−F UTP、2’−NH2−CTP組合せを含有しようが、結合する。2’−OHリガンドとして単離されたlib1−20−5(配列番号40)は2’−Fとして結合し、一方lib1−20−12(配列番号41)およびlib2−6−8(配列番号42)は2’−OHピリミジンとしてのみ良好に結合し、2’−NH2または2’−Fセレックス後修飾は許容しない。
異なる修飾を有する異なるセレックス実験から同様の配列が得られることはあまりないため、例5と6(後述)に記載のようにTGFβ1に対するRNAおよびssDNAリガンドを探索するために別のセットのセレックス実験を行った。
例3.TGFβ1受容体結合の阻害
A群リガンドについて表4に記載のKdとBmaxは、特に明記しない場合はリガンドの2’−NH2置換したものについてのものである。A群リガンドのBmaxは0.38±0.12(n=14)であり、これはニトロセルロースフィルター上の測定されたTGFβ1の保持に一致する。A群ライブラリーのKdはすべて似ており、2.2±1.1nM(n=14)であった。測定した場合、ニトロセルロースとSAアガロースビーズ結合測定法は同等の結果を与えた。
特に明記しない場合は、A群リガンドについての表4のIC50はすべて、2’−NH2ピリミジン置換リガンドで試験した。2’−NH2リガンドはバイオアッセイの条件下で最も大きな安定性を示したため、これを組織培養バイオアッセイで使用した。試験したA群の10個のリガンドのうち5つは、TGFβ1受容体活性を阻害した。このインヒビターのIC50値は、典型的にはTGFβ1のKdより25倍大きかった。データは再現性があり、lib3−13のKdは0.83±0.11nM(n=3)であり、lib3−13(配列番号12)のIC50は25±14nM(n=4)であった。バイオアッセイのRNA濃度はすべて、仮定した吸光係数とリガンドの純度100%に基づく推定値である。従ってRNA濃度は、バイオアッセイで過大に推定されており、従ってIC50は過大に推定されているであろう。
A群の別の5つのリガンドは、TGFβ受容体結合活性を阻害しなかった。生物活性のないリガンドであるlib2−6−4(配列番号20)、lib5−48(配列番号19)、およびlib6−23(配列番号21)と、生物活性のあるリガンドの差は、ヌクレオチド72での置換である。lib7−21(配列番号23)およびlib7−43(配列番号24)は、2’−F UTP、2’−NH2−CTPリガンドとして生物活性を試験した。これらのリガンドは、TGFβに対して高い親和性を有するにもかかわらず生物活性はなかった。結論として、結合と生物活性は、TGFβ A群リガンドの異なる機能である。
B群のリガンドは、A群リガンドとは異なる結合性を有する(表4)。B群リガンドでは、Kd(0.63±0.5nM、n=4)およびBmax(0.14±0.04、n=4)ともに低い。B群の1つのインヒビターであるlib4−12(配列番号28)は、実際位低濃度で組織培養バイオアッセイでTGFβ1活性を刺激するようである。この混合したアゴニスト/アンタゴニスト挙動の基礎は、決定されていない。この群の最も良いインヒビターであるlib3−42(配列番号30)はIC50が22nMであり、試験した濃度範囲でアゴニスト挙動はなかった。
C群のリガンドは、2’−F誘導体として試験したが、生物活性はなかった。2’−Fオーファンlib1−20−5(配列番号40)も同じであった。2’−NH2、40Nオーファンであるlib3−45は、TGFβ1に対する高親和性を有するがTGFβ1受容体結合を阻害する能力を持たないリガンドの別の例である。
D群リガンドは、2’−NH2−UTP、2’−F CTP誘導体としてバイオアッセイで試験した。lib2−6−1(配列番号35)と端を切り取ったlib2−6−1−81(配列番号36)は、TGFβ1受容体結合を阻害することができる。しかし、53位のCからGへの単一の突然変異が、クローンlib8−23の生物活性を低下させる。同様にlib2−6−1(配列番号35)のヌクレオチド67と68に対応する位置のクローンlib6−30(配列番号34)中の2塩基対の欠失が、結合を10倍上昇させ、生物活性を排除する。
lib2−6−1(配列番号35)は、TGFβ1にのみ有効であり、TGFβ2とTGFβ3には有効ではないことが証明された。lib2−6−1(配列番号35)は、0.1%BSA以外に細胞培養培地中に10%ウマ血清の存在下で生物活性があった。すなわち、このリガンドは、測定法中にウマ血清が存在しても妨害されないTGFβ1に対する特異性を示す。TGFβ1受容体結合の阻害は特異的な現象であることの最大の意味は、必ずしもすべてのTGFβ1リガンドが受容体結合を阻止するのではなく、阻止するものは再現性よく阻止するということである。TGFβ1受容体結合活性を阻止してTGFβ1に結合しないリガンドの例はない。
要約すると、TGFβ1受容体結合を阻止することができるRNAリガンドは、リガンドのサブセットである。結合はバイオアッセイに必要であるが、充分ではない。試験した高親和性リガンドの約50%はインヒビターであった。インヒビターのうち30%は良好なインヒビターであった(IC50<25nM)。
例4.境界解析
結合に必要なヌクレオチドを決定するために、多くのTGFβ1リガンドについてトランケーション実験を行った。A群リガンドのlib3−13(配列番号12)とlib8−9(配列番号16)の端を切り取り、一貫した結果を得た。断片lib3−13−79はTGFβ1に結合し、従ってlib3−13中のヌクレオチド3’〜ヌクレオチド79までのいずれも結合には必須ではない。同様にヌクレオチド5’〜38のすべてが欠失されても、残りの断片lib3−13−(38−123)はまだTGFβ1に結合することができる。5’境界は配列lib6−23(配列番号21)に一致し、これはlib3−13(配列番号25)のヌクレオチド19〜36に対応する欠失を有するが、TGFβ1に結合する。A群クローンのすべての高親和性結合決定基は、ランダム領域内にあり、42ヌクレオチド断片lib3−13−(38−79)に対応するかも知れない。A群の多くのリガンドは、lib3−13−(72−81)に対応する領域中の予測された必須の結合ドメイン内の欠失または置換を有する。lib4−32中の欠失と置換は、lib3−13のヌクレオチド80に対応する3’境界には影響を及ぼさない。すなわち、3’境界はおそらく正しく、ヌクレオチド配列72〜81の変化は、結合に必要な核酸構造を大きく変化させることはないものである。しかし、この領域の突然変異(顕著にはヌクレオチド72)は、前述のようにTGFβ1受容体結合を阻止するリガンドの能力を変化させるかも知れない。
B群のリガンドlib4−12(配列番号28)の3’末端の境界解析は、ヌクレオチド72より先はTGFβ1結合に必要でないことを予測させる。lib4−12の5’境界を決定すると、最初の3つのヌクレオチド以外が結合に必要であり、これは5’定常領域は、少なくとも全長リガンドの境界が決定される時はリガンドの必須の部分であることを示している。lib3−44(配列番号29)はlib4−12(配列番号28)と同様の結合決定基を有すると仮定すると、lib4−12のヌクレオチド37〜42は、lib3−44とlib3−42(配列番号30)では欠失しているため、結合に必要ではないと結論できる。
C群とD群のリガンドでは、3’定常領域は結合に必要ではない。いずれのリガンド型も、定常領域内のこの3’ヌクレオチド無しで結合する。lib1−20−3−82(lib1−20−3(配列番号32)の82ヌクレオチドの端を切り取ったもの)は、全長lib1−20−3のように結合する。lib2−6−1の同様の結合と生物活性は、lib2−6−1−81(配列番号36)中に存在する3’末端の切り取りにより影響を受けない。
例5.実験方法
好適な実施態様において、40個のランダム位置(40N)を有する縮重ライブラリーから、TGFβ1に対する特異的高親和性を有するRNAおよびDNAリガンドを探すため、第2のセットのセレックス実験を行った。本例は、例6で使用し導入した一般的方法を示す。
A.材料
M−MLVスーパースクリプト逆転写酵素は、ギブコビーアールエル(GibcoBRL)(ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)から購入した。T7 RNAポリメラーゼは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical, Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州、米国)の標準的方法に従って精製した。TaqDNAポリメラーゼ(アンプリタク(Amplitaq))は、パーキンエルマー/シータス(Perkin Elmer/Cetus)、リッチモンド、カリホルニア州)から得た。T4ポリヌクレオチドキナーゼ、DNAポリメラーゼ(クレノウ断片)、およびアルカリ性ホスファターゼは、ニューイングランドバイオラボズ社(New England Biolabs, Inc.)(ビバリー(Bevery)、マサチューセッツ州)から購入した。2’−アミノ置換ヌクレオチド三リン酸であるアミノ−UTPおよびアミノ−CTPは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical, Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)の標準的方法に従って合成した。この実験で使用した他の試薬は、入手できる最も高品質のものである。
B.核酸
RNAは、2本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびT7 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により合成した。DNAオリゴヌクレオチド(表5)は、オペロン社(Operon INc.)、アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)から購入し、6%分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。PCR増幅は、50mM KCl、10mMトリス−塩酸(pH8.6)、2.5mM MgCl2、170mg/ml BSA、およびdNTP(各1mM)中で行った。TaqDNAポリメラーゼは、0.1ml反応物当たり100単位で使用し、5’プライマーおよび3’プライマーは、1mMで存在した。転写は、40mM NaCl、10mMジチオスレイトール、50mMトリス−酢酸(pH8.0)、8mM酢酸マグネシウム、2mMスペルミジン、および2mM NTP中で行った。T7 RNAポリメラーゼは1U/mlで存在した。反応物は28℃で16時間インキュベートし、次に20単位のDNAseIで37℃で10分間処理した。反応物は半分量の添加緩衝液(93%ホルムアミド、10mM EDTA、pH8.0)を加えて停止させ、95℃で3分間加熱した後、6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルで電気泳動した。RNA転写体をUVシャドーイングで可視化し、ゲルから切り出し、TE緩衝液(10mMトリス−酢酸(pH8.0)、2mM EDTA)に溶出した。RNA転写体をエタノール沈殿させ、真空下で乾燥し、蒸留水に再溶解した。RNAの濃度ならびに1本鎖DNAの濃度は、A260を測定し、1A260単位は、それぞれ40mg/mlと33mg/mlと仮定して定量した。
C.高親和性リガンドの進化
TGFβ1に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第5,270,163号(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)に記載の方法により、表5に記載のオリゴヌクレオチド(配列番号43〜54)を使用して得た。DNA鋳型は、混合ヌクレオチドDNA合成により作成した40ヌクレオチド(40N)可変配列、ならびに鋳型の増幅に必要な5’および3’固定配列を含有した。オリゴヌクレオチド40N7(配列番号43)と40N8(配列番号49)の5’固定配列はまた、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを含有した。最初のラウンドのRNAセレックスのためのRNAは、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて1本鎖DNA鋳型40N7と40N8上でプライマー伸長して作成した2本鎖DNA鋳型から転写した。RNAセレックスは、15ラウンドまでのRNA合成、標的への結合、結合と非結合RNAのニトロセルロース濾過による分離、cDNA合成、および2本鎖DNA鋳型を再生するためのPCR増幅から構成された。RNAプールによる標的への結合は、結合緩衝液A(120mM NaCl、2.5mM KCl、0.12mM MgSO4、40mMヘペス、20mM NaH2PO4/Na2HPO4、pH7.4、0.01%HSA)中で37℃で少なくとも10分間行った後濾過した。これに対して、1本鎖DNAセレックスの最初のラウンドは、合成法で合成したオリゴヌクレオチド40D7と40D8を直接用いて行った。セレックスは、25ラウンドの標的への結合、結合と非結合1本鎖DNAのニトロセルロース濾過による分離、2本鎖DNA集団を再生するためのPCR増幅、および次のラウンドのセレックスのための1本鎖DNAを精製するための分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動から構成された。1本鎖DNAプールへの標的の結合は、結合緩衝液B(150mM NaCl、10mMトリス−酢酸(pH7.5)、0.001%BSA)中で37℃で少なくとも15分間行った後濾過した。RNAおよびDNAレパートリーの放射能標識は、10mlの容量中の5ピコモルの核酸、2単位のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ、および6mlの[γ32P]ATP(800Ci/mmol)を37℃で30分間インキュベートして行った。各ラウンドのセレックス実験の核酸の濃度は、1500nMと1nMの間で変動し、標的TGF−β1の濃度は150nMと0.03nMの間で変動した。
D.リガンドのクローニングと配列決定
核酸レパートリーのクローニングは、PCR増幅によりRNAレパートリーから作成した2本鎖DNAを用いて、ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510の方法により行った。PCR増幅したDNAを、制限酵素SphIとHindIIIで消化し、pGEM内の適合する部に結合させた。結合プラスミドを大腸菌(E. coli)内に形質転換し、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトシド、イソプロピルチオガラクトシドと100mg/mlアンピシリンを含有するLB寒天上に蒔いた。β−ガラクトシダーゼを発現しないコロニーを解析した。DNAの配列決定は、サンガー(Sanger)ら(1977)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74:5463−5467のジデオキシヌクレオチド法を使用して、ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)が記載したように行った。プラスミドは、アルカリ分解ミニプレップ法(マニアティス(Maniatis)ら(1982)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク州)により、大腸菌(E. coli)から単離した。DNAを、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM酢酸マグネシウム、および1mM DTT中で0.4mM dNTPと0.2mMのジデオキシ−NTPと、48℃で20分間インキュベートした。DNAポリメラーゼは、反応物中4単位で存在した。添加緩衝液10mlを加えて95℃に3分間加熱して反応を停止し、次に6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。Gトラック配列決定は既に記載したように行い、これは異なる配列のリガンドのクローン化ライブラリーを迅速にスクリーニングするための便利な方法である。簡単に説明すると、Gトラックスクリーニング反応物は、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM酢酸マグネシウム、および1mM DTTを、0.4mM dNTP、0.2mMのジデオキシ−NTP、および4単位のDNAポリメラーゼとともに含有した。反応を48℃で20分間行い、10μlの添加緩衝液を加えて95℃に3分間加熱して反応を停止し、次に6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。
例6.結合解析、バイオアッセイ結果、およびssDNAライブラリーの配列
TGF−B1の40D7 DNAライブラリーの結合解析は、図1に示す。ラウンド19(三角)とラウンド0(丸)から得た結合データを示す。実験は、核酸(1nM未満)と結合緩衝液(150mM NaCl、10mMトリス−酢酸(pH8.2)、0.001%BSA)中で記載した濃度のTGF−b1を、0.1ml容量中で37℃で15分間インキュベートして行った。試料をニトロセルロースで濾過し、直ちに3mlのTE緩衝液(10mMトリス−酢酸(pH8.0)、0.1mM EDTA)を加えた。ニトロセルロースフィルターに保持された放射能標識物と結合反応に加えた総放射能標識物の量から、結合した放射能標識のパーセントを計算した。結果は、40D7ライブラリーの見かけのKdは1nMであり、出発プールの見かけのKdは30nMであることを示す。すなわち、40D7ライブラリーは、約3倍の結合の上昇を示す。
例5で作成した核酸ライブラリーの存在下でTGF−b1を検出するためのPAI−ルシフェラーゼ測定法は、アベ(Abe)ら(1994)Anal. Biochem. 216:276−284に記載のように行った。PAI−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するミンク肺上皮細胞を、TGF−b1(10pM)およびDNAライブラリーからのオリゴヌクレオチドまたは抗TGFB抗体(60μg/ml)とともにインキュベートした。ミンク肺上皮細胞を18時間インキュベートし、オリゴヌクレオチドをTGF−b1とプレインキュベートしてから測定を行い、8時間後再度加えた。細胞培養物へのオリゴヌクレオチド単独(100nM)の添加は、測定に影響しなかった(データは示していない)。オリゴヌクレオチドライブラリーの本体ならびにルシフェラーゼ活性へのその影響は、図2に示す。ssDNAライブラリー40D7は、TGF−B1の活性を完全に阻害し、一方対照(等しい濃度のランダム化核酸)はTGF−B1活性のわずかな刺激を示した。
結合解析とPAI−ルシフェラーゼ測定の結果に基づき、40N7ライブラリーからのDNAリガンドを、例5に記載のように配列決定した。配列を表6に示す(配列番号55〜89)。DNA 40N7ライブラリーはPAI−ルシフェラーゼバイオアッセイで阻害を示したため、ライブラリーからの各クローンはTGFβ1結合物質であることを示唆する。
例7.実験方法
本例は、PDGFに対する核酸リガンドの進化のために例8〜15で使用し導入した一般的方法を示す。
A.材料
組換えヒトPDGF−AA(分子量=29,000)、PDGF−AB(分子量=27,000)およびPDGF−BB(分子量=25,000)は、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州、米国)から、凍結乾燥型で担体タンパク質のない形で購入した。すべての3つのアイソフォームは、成熟ヒトPDGF A−鎖の長い型(ベトショルツ(Betsholtz 9ら,(1986)Nature 320:695−699)およびヒトPDGF B−鎖の天然に存在する成熟型(ジョンソン(Johnsson)ら,(1984)EMBO J. 3:921−928)の配列に基づく合成遺伝子から、大腸菌(E. coli)中で産生した。ランダム化されたDNAライブラリー、PCRプライマー、およびDNAリガンドと5’−ヨード−2’−デオキシウリジン置換DNAリガンドは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical, Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)またはオペロン・テクノロジーズ(Operon Technologies)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)により、標準的固相ホスホラミダイト(phosphoramidites)法(シンハ(Sinha)ら,(1984)Nucleic Acids Res. 12:4539−4557)を使用して合成した。
B.1本鎖DNA(ssDNA)セレックス
セレックス法の基本的な特徴は、セレックス特許出願に(またツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505;ジェリネック(Jellinek)ら,Biochemistry, 33;10450(1994);ジェリネック(Jellinek)ら,Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11227(1993))に詳細に記載されており、これらは参考のため本明細書に引用される。不変配列のプライマーアニーリング領域(表7;配列番号90)が隣接する、連続的なランダム化された40ヌクレオチド濃縮領域を含有する初期のssDNAライブラリーは、4つのホスホラミダイト等モル混合物を使用する固相ホスホラミダイト法によりランダム化された位置を作成して合成した。ssDNAライブラリーを、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して精製した。全長DNAに対応するバンドをUV光で可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出し、エタノール沈殿させ、遠心分離してペレットにした。ペレットを真空下で乾燥し、1mM MgCl2を補足したリン酸緩衝化生理食塩水(PBSM=10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、1mM MgCl2、pH7.4)緩衝液に再懸濁した。タンパク質とインキュベートする前に、ssDNAをPBSM中で90℃で2分間加熱し、氷上で冷却した。約500pmol(3×1014分子)の5’32P末端標識ランダムssDNAをPDGF−ABと結合緩衝液(0.01%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBSM)中でインキュベートして、最初の選択を開始した。混合物を4℃で一晩インキュベートし、次に37℃で短時間(15分間)インキュベートした。8%ポリアクリルアミドゲル(1:30ビスアクリルアミド:アクリルアミド)で4℃で5V/cmで、2mM EDTAを含有する89mMトリス−ホウ酸(pH8.3)を泳動緩衝液として使用して電気泳動して、PDGF−ABに結合したDNAを、非結合DNAから分離した。遊離ssDNAの電気泳動度の約半分で泳動するPDGF−ssDNA複合体に対応するバンドを、オートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出した。次の親和性選択で、ssDNAをPDGF−ABと37℃で15分間結合緩衝液中でインキュベートし、PDGF結合ssDNAを、既に記載されているように(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695)ニトロセルロース濾過により、非結合DNAから分離した。すべての親和性選択したssDNAプールをPCRで増幅し、ここでDNAは、50mM KCl、7.5mM MgCl2、0.05mg/mlウシ血清アルブミン、1mMデオキシヌクレオチド三リン酸、5μMプライマー(表7)および0.1単位/μl Taqポリメラーゼを含有する10mMトリス−塩酸(pH8.4)中で、12〜20回の熱サイクリング(93℃で30秒、52℃で10秒、72℃で60秒)を行った。5’PCRプライマーをポリヌクレオチドキナーゼと[γ−32P]ATPで5’末端標識し、3’プライマーは、ビオチンホスホラミダイト(グレンリサーチ(Glen Research)、スターリング(Sterling),バージニア州)を使用してビオチン化した。PCR増幅後、ビオチン化プライマーに対して10倍モル過剰で、精製されていないPCR反応混合物にストレプトアビジン(ピアス(Pierce)、ロックフォード(Rockford),イリノイ州)を加えて、室温で15分間インキュベートした。等量の停止溶液(90%ホルムアミド、1%ドデシル硫酸ナトリウム、0.025%ブロモフェノールブルー、およびキシレンシアノール)を加え、室温で20分間インキュベートしてdsDNAを変性させた。放射能標識した鎖を、12%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して、放射能標識した鎖をストレプトアビジン結合ビオチン化鎖から分離した。速く泳動する放射能標識(非ビオチン化)ssDNA鎖をゲルから切り出し、前述のように回収した。ssDNAの量は、33μg/ml/吸収単位の吸光係数を用いて260nmでの吸収から推定した(サムブルーク(Sambrook)ら(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第2版、第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor))。
C.クローニングと配列決定
セレックスラウンド12からの増幅された親和性濃縮したプールを、12%ポリアクリルアミドゲルで精製し、大腸菌(E. coli)のJM109株中のHindIIIとPstI部位の間にクローン化した(サムブルーク(Sambrook)ら(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第2版、第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor))。各クローンを、アルカリ溶解法によりプラスミドを調製するのに使用した。前進配列決定プライマーとシーケナーゼ2.0(アマシャム(Amersham)、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州)を使用して製造業者のプロトコールに従って、プラスミドを挿入領域で配列決定した。
D.見かけの平衡解離定数と解離速度定数の決定
種々の濃度のPDGFへの低濃度のssDNAリガンドの結合は、既に記載されているニトロセルロースフィルター結合法により測定した(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695)。PDGFストック溶液の濃度(PBS中)は、280nmでの吸光度から、アミノ酸配列から計算したe280値(エス・シー・ギルとピー・エィチ・フォン・ヒペル(Gill, S.C., and von Hippel, P.H.)(1989)Anal. Biochem. 182:319−326):PDGF−AAは19,500M-1cm-1、PDGF−ABは15,700M-1cm-1、PDGF−BBは11,800M-1cm-1)に従って求めた。すべての結合実験のssDNAは、8%(>80ヌクレオチド)または12%(<40ヌクレオチド)ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して精製した。すべてのssDNAリガンドを90℃で結合緩衝液中で高希釈(約1nM)で2分間加熱し、氷で冷却して、タンパク質溶液にさらに希釈した。結合混合物は典型的には37℃で15分間インキュベートしてから、ニトロセルロースフィルターで分離した。
PDGF−AA(P)へのDNAリガンド(L)の結合は、2分子結合モデルで説明され、平衡での結合DNAの割合(q)は、式1により与えられる、
q=(f/2[L]t){[P]t+[L]t+Kd−[([P]t+[L]t+Kd)2−4[P]t[L]t]1/2} (1)
ここで、[P]tと[R]tは総タンパク質および総DNA濃度であり、Kdは平衡解離定数であり、fはニトロセルロースフィルター上のタンパク質−DNA複合体の保持効率である(アービン(Irvine)ら(1991)J. Mol. Biol. 222:739−761;ジェリネック(Jellinek)ら,(1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11227−11231)。
PDGF−ABおよびPDGF−BBへのDNAリガンドの結合は2相性であり、DNAリガンドは、対応する解離定数Kd1とKd2で説明される異なる親和性でタンパク質に結合する2つの非交換性成分(L1とL2)からなるモデルで説明できる(ジェリネック(Jellinek)ら,(1993)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11227−11231)。この場合、結合DNAの割合(q)の明確な解は、式2で与えられる、
ここで、χ1とχ2(=1−χ1)はL1とL2のモル分率である。PDGFへのDNAリガンドの結合のKd値は、非線形最小自乗法によりデータ点を式1(PDGF−AAについて)または式2(PDGF−BBについて)を適合させて計算される。
解離速度定数(koff)は、500倍過剰の非標識リガンドの添加後、分離法としてニトロセルロースフィルター結合を用いて、時間の関数としてPDGF−AB(1nM)に結合した32P末端標識最小リガンド(0.17nM)の量を測定して、求めた。koff値は、データ点を一次速度式(式3)にデータ点を適合させて求めた
(q−q∞)/(q0−q∞)=exp(−kofft) (3)
ここで、q、q0およびq∞は、それぞれ任意の時間(t),t=0、およびt=∞のPDGF−ABに結合したDNAの割合である。
E.最小リガンド測定
3’末端から連続的に端を切り取った5’末端標識DNAリガンド集団を作成するために、DNAリガンド鋳型(端を切り取ったプライマー5N2、表7;配列番号92)の3’不変配列領域に相補的なプライマーを、[γ−32P]−ATPとT4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端で標識し、鋳型にアニーリングし、そしてシーケナーゼ(アマシャム(Amersham)、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州)と4つのdNTPとddNTPの混合物で伸長した。結合緩衝液中で37℃で15分間インキュベート後、PDGF−ABに対する高親和性を保持するこの集団の断片を、ニトロセルロースフィルター分離により、弱い親和性を有するものから分離した。親和性選択の前後の、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルによる断片の電気泳動分離は、3’境界の決定を可能にする。5’末端から連続的に端を切り取った3’末端標識DNAリガンド集団を作成するために、DNAリガンドを、[γ−32P]−コルディセピン−5’−三リン酸(ニューイングランドヌクレア(New England Nuclear)、ボストン、マサチューセッツ州)とT4 RNAリガーゼ(プロメガ(Promega)、マジソン、ウィスコンシン州)3’末端で標識し、ATPとT4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端でリン酸化し、そしてラムダエキソヌクレアーゼ(ギブコビーアールエル(GibcoBRL)(ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)で部分的に消化した。7mMグリシン−KOH(pH9.4)、2.5mM MgCl2、1μg/ml BSA、15μg tRNA、および4単位のラムダエキソヌクレアーゼを有する100μl容量中で、37℃で15分間10ピコモルの3’標識リガンドの部分的消化を行った。5’境界を、3’境界に記載の方法と類似の方法で決定した。
F.融解温度(T m )測定
最小DNAリガンドの融解プロフィールは、ケリー(Cary)モデル1E分光光度計で得た。オリゴヌクレオチド(320〜400nM)をPBS、PBSM、または1mM EDTAを含有するPBS中で95℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行う。試料を1℃/分の速度で15から95℃に加熱し、0.1℃毎に吸光度を測定して融解プロフィールを作成した。プロッティングプログラムであるカレイダグラフ(Kaleidagraph)(シネジ・ソフトウェア(Synergy Software)、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州)を用いて、データ点の一次導関数を計算した。一次導関数値は、各側の27個のデータ点で各点を平均する55点平滑化関数を用いて、平滑化した。平滑化一次導関数曲線のピークを用いて、Tm値を推定した。
G.PDGF−ABへの5−ヨード−2’−デオキシウリジン−置換DNAリガンドの架橋
チミジンの5’−ヨード−2’−デオキシウリジンによる単一のまたは複数の置換を有するDNAリガンドを、固相ホスホラミダイト法を使用して合成した。架橋する能力について試験するために、微量の5’32P末端標識リガンドを、結合緩衝液中でPDGF−AB(100nM)と37℃で15分間インキュベートした後照射した。結合混合物を、サーモスタットで37℃に温度を維持した1cm長のキュベットに移し、XeCl荷電ルモニクス(Lumonics)モデルEX748エキシマレーザーを使用して、20Hzで308nmで25〜400秒照射した。焦点のエネルギーは175ミリジュール/パルスで、キュベットを収束レンズの焦点の24cm上に置いた。照射後、アリコートを、0.1%SDSを含有する等量のホルムアミド添加緩衝液と混合し、95℃で5分間インキュベート後、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで遊離リガンドから架橋PDGF/リガンド複合体を分離した。
リガンド20t−I4について架橋のタンパク質部位を同定するために、結合および照射をより大規模に行った。PDGF−ABと5’32P末端標識リガンド(それぞれPBSM中1μM)を前記したように1mlの反応容器中でインキュベートし照射(300秒)した。反応混合物を合わせ、エタノール沈殿し、0.3mlのトリス−塩酸緩衝液(100mM、pH8.5)に再懸濁した。PDGF−AB/リガンド架橋複合体を、0.17μg/μl修飾トリプシン(ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim))で37℃で20分消化した。消化混合物をフェノール/クロロホルム、クロロホルムそして次にエタノールで抽出した。ペレットを水と、5%(v/v)β−メルカプトエタノール(SDS無し)を含有する等量のホルムアミド添加緩衝液に再懸濁し、95℃で5分間インキュベートし、40cmの8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルに溶解した。2つの密接に接近したバンドとして遊離リガンドの約1.5cm前に泳動する架橋トリプシンペプチド/リガンドをゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出し、エタノール沈殿させた。乾燥した架橋ペプチド(比活性に基づき約160ピコモル)をエドマン分解により配列決定した(ミッドウェストアナリティカル社(Midwest Analytical,Inc.)、セントルイス、ミズーリ州)。
H.受容体結合測定法
PDGF α−またはβ−受容体でトランスフェクションしたブタ大動脈内皮(PAE)細胞への125I−PDGF−AAおよび125I−PDGF−BBの結合を、前記したように行った(ヘルディン(Heldin)ら,(1988)EMBO J.7,1387−1394)。異なる濃度のDNAリガンドを、1mg/mlのウシ血清アルブミンを補足した0.2mlのリン酸緩衝化生理食塩水中で125I−PDGF−AA(2ng、100,000cpm)または125I−PDGF−BB(2ng、100,000cpm)とともに、細胞培養物(1.5cm3)に加えた。4℃で90分インキュベート後、細胞培養物を洗浄し、細胞に結合した放射能をガンマカウンターで測定した(ヘルディン(Heldin)ら,(1988)EMBO J.7,1387−1394)。
I.[ 3 H]チミジン取り込み測定法
20ng/mlのPDGF−BBまたは10%胎児牛血清に応答してかつ消化ベクター濃度のDNAリガンドの存在下で、PDGFβ−受容体を発現するPAE細胞への[3H]チミジン取り込みを、既に記載されているように行った(モリ(Mori)ら,(1991)J.Biol. Chem. 266,21158−21164)。37℃で24時間インキュベート後、DNAに取り込まれた3H−放射能をβカウンターを使用して測定した。
例8.PDGFのssDNAリガンド
40個の連続的な位置でランダム化された1本鎖DNA(表7;配列番号90)の約3×1014分子(500pmol)のライブラリーから、セレックス法によりPDGF−ABに対する高親和性DNAリガンドを同定した。最初のラウンドでポリアクリルアミドゲル電気泳動により、そして以後のラウンドでニトロセルロースフィルター結合により、PDGF結合DNAを非結合DNAから分離した。12ラウンドのセレックス後、親和性が濃縮されたプールは見かけの解離定数(Kd)約50pMでPDGF−ABに結合した(データは示していない)。これは、初期のランダム化されたDNAライブラリーに比較して約700倍の親和性の改善である。この親和性の濃縮されたプールを使用してクローニングライブラリーを作成し、ここでから39個の単離体を配列決定した。これらのリガンドの32はユニークな配列を有した(表8;配列番号93〜124)。最小配列決定を行ったリガンドには、クローン番号の隣に星印(*)を付けた。最小リガンドとして高親和性結合を保持することがわかったクローン番号は、斜体で書いてある。表8に示すすべてのリガンドは、ニトロセルロースフィルター結合法を用いて、PDGF ABに結合する能力について試験した。この群から最適のリガンドを同定するために、PDGF−ABに結合した5’32P末端標識リガンドの割合を、タンパク質濃度の範囲にわたって測定することにより、PDGF−ABへの相対的親和性を測定した。高親和性でPDGF−ABに結合するリガンドについては、PDGF−BBとPDGF−AAについての親和性も調べた。すべての場合で、PDGF−ABとPDGF−BBに対するリガンドの親和性は同等であり、PDGF−AAはかなり低かった(データは示していない)。
32のユニークなリガンドのうち31は、表9に示す配列ファミリーに分類することができる。最初はランダム化された領域(大文字)の配列を、コンセンサス3方向らせんジャンクションモチーフに従って整列させた。配列不変領域(小文字)中のヌクレオチドは、予測される2次構造に参加する場合のみ示してある。環状置換によるコンセンサスモチーフへの関連を示すため、いくつかのリガンドを「切断」した(同等性のシンボル)。塩基対に参加すると予測されるヌクレオチドは、下線を引いた逆さの矢印で示し、矢の先端はらせんのジャンクションに向いている。配列は、らせんジャンクション(AまたはG、らせんIIとIIIの間)の最初の1本鎖ヌクレオチド(5’末端から)に基づき、2群(AとB)に分けた。らせん領域で一致しないものは、対応する文字の下に点で示す(G−TおよびT−G塩基対は許容される)。単一のヌクレオチドバルジがある場所では、一致しないヌクレオチドは、その近辺の配列の残りの部分の上に示す。
この分類は一部はこれらのリガンド内の配列相同性に基づくが、大部分は共通の2次構造モチーフ(分岐点に3つのヌクレオチドループを有する3方向らせんジャンクション)に基づく(図3)。これらのリガンドはさらに2群に分類される。A群のリガンドでは分岐点のループは不変配列AGCを有し、B群ではこの配列はG(T/G)(C/T)である。提唱されるコンセンサス2次構造モチーフは、らせん内の非保存ヌクレオチドの塩基対共変動により支持される(表10)。3方向ジャンクションは連続的DNA鎖内にコードされているため、らせんの2つは、ジャンクションから遠い末端のループで終わる。これらのループは、長さおよび配列の両方の変動性が高い。さらに、コンセンサスモチーフの環状置換のために、ループは3つのらせんで起きるが、らせんIIとIIIで最も高頻度である。これらの観察結果はまとめると、らせんジャンクションから遠い領域は、PDGF−ABへの高親和性結合に重要であることを示唆する。高度に保存されたヌクレオチドは確かにらせんジャンクションの近くに見いだされる(表9、図3)。
例9.境界解析
PDGF−ABに対する6つの最適のリガンドについて、高親和性結合に必要な最小の配列を決定した。一般的に3’および5’最小配列境界の情報は、核酸リガンドを部分的に断片化し、次に標的に対する高親和性を保持する断片を選択することにより得られる。RNAリガンドでは、断片は穏やかなアルカリ加水分解により作成される(ツエルク(Tuerk)ら,J. Mol. Biol. 213:749−761;ジェリネック(Jellinek)ら,Biochemistry, 33;10450(1994);ジェリネック(Jellinek)ら,(1995)Biochemistry, 34:11363−11372;グリーン(Green)ら,(1995)J. Mol. Biol. 247:60−68)。DNAは塩基に対してより耐性であり、DNAについて断片を作成するための別の方法が必要である。3’境界を決定するために、ジデオキシ配列決定法を使用してDNAリガンドの3’不変配列にアニーリングした5’末端標識プライマーを伸長して、3’末端で連続的に端を切り取ったリガンド断片の集団を作成した。この集団をニトロセルロースフィルターにより親和性選択し、PDGF−ABへの高親和性結合を保持している最も短い断片(3’末端から端を切り取った)をポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定した。5’境界も同様に決定したが、5’末端で連続的に端を切り取った3’末端標識リガンド断片の集団は、ラムダエキソヌクレアーゼで限定消化して作成した。次に最小リガンドは、2つの境界の間の配列として規定した。これらの実験から得られる情報は有用であるが、境界は1回に1つの末端が調べられるため、示唆された境界は絶対的なものではないことに注意すべきである。端を切り取っていない(放射能標識)末端は、結合を増強するか、低下させるか、または影響を及ぼさない(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)Biochemistry, 34:10450−10456)。
実験的に境界を決定した6つの最小のリガンドのうち、2つ(20t(配列番号172)と41t(配列番号174);リガンド20と41の端を切り取ったもの)は、全長類似体と同等(2倍以内)の親和性で結合し、4つは非常に低い親和性を有した。PDGFへの高親和性結合を保持した2つの最小のリガンド(20tと41t)は、予測された3方向らせんジャンクション2次構造モチーフを有する(図4)。高親和性でPDGF−ABに結合する第3の最小のリガンド(36t(配列番号173))は、コンセンサスモチーフの情報から推定された(図4)。以後の実験で、我々はリガンド20tの5’末端の1本鎖領域は、高親和性結合に重要ではないことを見いだした。さらに、リガンド36t(GCAとCCA)中のらせんIIとIII内のトリヌクレオチドループは、ペンタエチレングリコールスペーサー(後述)で置換できる。これらの実験は、PDGF−ABへの高親和性結合においてらせんジャンクション領域の重要性をさらに支持している。
異なる濃度のPDGF−AA、PDGF−ABおよびPDGF−BBへの最小のリガンド20t、36t、および41tの結合を、図5A、5Bおよび5Cに示す。全長類似体の結合性に一致して、最小のリガンドはPDGF−AAに対するよりPDGF−ABとPDGF−BBに対して実質的に高い親和性で結合する(図5A、5Bおよび5C、表11)。実際、PDGF−AAに対するこれらの親和性は、ランダムDNAのそれに匹敵するものである(データは示していない)。PDGF−AAへの結合は1相性結合式で充分に説明され、一方PDGF−ABとPDGF−BBに対する結合は、明らかに2相性である。以前のセレックス実験で、2相性結合は、異なる親和性で標的タンパク質に結合する別個の核酸分子種の存在の結果であることが見いだされている(ジェリネック(Jellinek)ら,(1995)Biochemistry, 34:11363−11372)、および未公表のデータ)。高親和性画分と低親和性画分の本体は現在不明である。これらの記載されたリガンドは化学的に合成されたため、低親和性でPDGF−ABやPDGF−BBに結合する画分は、化学的に不完全なDNAである可能性がある。あるいは、高親和性および低親和性分子種は、異なる親和性でPDGF B−鎖に結合する安定なコンフォメーション異性体かも知れない。いずれにしても、高親和性結合成分は、すべての場合で最も多いリガンド種である(図5Bと5C)。比較のために、Kdが0.5nMでヒトトロンビンに結合し、予測されたステム−ループ構造を有する39量体DNAリガンド(リガンドT39(配列番号177):
5’-CAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTCGTGGAA[3’T]、ここで[3’T]は、3’−エキソヌクレアーゼ分解を低下させるために加えられた3’−3’結合チミジンヌクレオチドである)は、Kdが0.23μMでPDGF−ABに結合する(データは示していない)。
例10.PDGF−核酸リガンド複合体の動力学的安定性
PDGF−AB/DNA複合体の動力学的安定性を調べるために、最小のリガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)のPDGF−ABとの複合体の解離速度を、PDGF−AB(1nM)に結合した放射能標識リガンド(0.17nM)の量を、過剰の非標識リガンドの添加後の時間の関数として測定して、求めた(図6)。これらのタンパク質およびDNAリガンドの濃度で、DNAリガンドの高親和性画分のみがPDGF−ABに結合する。解離速度定数の以下の値は、図6のデータ点を一次速度式に適合させて得られた:リガンド20tは4.5±0.2×10-3s-1(t1/2=2.6分)、リガンド36tは3.0±0.2×10-3s-1(t1/2=3.8分)、リガンド41tは1.7±0.1×10-3s-1(t1/2=6.7分)。解離定数と解離速度定数について計算された会合速度(kon=koff/Kd)は、20tは3.1×107M-1s-1、36tは3.1×107M-1s-1、そして41tは1.2×107M-1s-1である。
例11.熱融解性
最小のリガンド20t、36t、および41tが折り畳み構造を取る能力を試験するために、PBSMまたはPBSE緩衝液中のUB吸光度対温度プロフィールからその溶融温度(Tm)を決定した。これらの実験で使用したオリゴヌクレオチド濃度(320〜440nM)では、非変性ポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドとしてモノマー種が観察された(データは示していない)。リガンド20tと41tは、PBSM緩衝液中のTmがそれぞれ43.8±0.4℃および49.2±0.5℃である直線的な傾きのベースライン(ピーターシェイムとターナー(Petersheim and Truener)、(1983)Biochem.22:256−263)を有する2状態(折り畳みおよび非折り畳み)モデルによりよく説明される温度溶融性を示した。PBSE緩衝液では同様のTm値が得られた:リガンド20tでは44.8±0.5℃、そしてリガンド41tでは48.0±0.5℃。リガンド36tは、より複雑な溶融プロフィールを示し、2つの明確な遷移が観察された。この場合、データは、充分に折り畳まれた状態と広がった状態が、部分的に広がった中間的結果により連結されている、3状態モデルによりよく説明された。このモデルを用いて、リガンド36tのTm値が得られた:PBSM緩衝液中で47.0±0.9℃および67.1±3.8℃、そしてPBSE緩衝液中で44.2±1.7℃および64.3±4.1℃。
例12.核酸リガンドとPDGFの光架橋
密接に接触しているDNAリガンドとPDGF上の部位を決定するために、5’−ヨード−2’−デオキシウリジン(IdU)−置換DNAリガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)を用いて一連の光架橋実験を行った。308nmで単色光励起により、5−ヨード−および5−ブロモ−置換ピリミジンヌクレオチドは、最初のnからπ*遷移システム間横断により、反応性トリプレット状態を占める。励起されたトリプレット状態は次に、近接している電子の豊富なアミノ酸残基(例えば、Trp、TyrおよびHis)と反応して共有架橋を与える。この方法は、光傷害を最小にする>300nmの光での照射を可能にするため、核酸−タンパク質相互作用の研究に広く使用されている(ウィリス(Willis)ら,(1994)Nucleic Acids Res. 22:4947−4952;ダブリュー・ティー・スタンプとケー・ビー・ホール(Stump, W.T., and Hall, K.B.)(1995)RNA 1:55−63;ウィリス(Willis)ら,(1993)Science 262:1255−1257;ジェンセン(Jensen)ら,(1995)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:12220−12224)。リガンド20t、36t、および41tの類似体は、固相ホスホラミダイト法を使用してIdU残基ですべてのチミジン残基を置換して、合成した。PDGF−ABへのこれらのIdU置換リガンドの親和性は、非置換リガンドに比較してやや増強されており、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上の遅い電気泳動度を有するバンドの出現に基づき、すべての3つの5’末端標識IdU置換リガンドは、308nmの照射でPDGF−ABに架橋した(データは示していない)。最も高い架橋効率は、IdU置換リガンド20tで観察された。観察された架橋の原因である特異的IdU位を同定するために、20tの7つの単一のまたは複数のIdU置換類似体を、PDGF−ABに光架橋する能力について試験した:リガンド20t−I1〜20t−I7(5’-TGGGAGGGCGCGT1T1CT1T1CGT2GGT3T4ACT5T6T6T6AGT7CCCG-3’(配列番号178〜184)、ここで番号は、7つのリガンドについて記載したチミジンヌクレオチドでのIdU置換を示す)。これらの7つのリガンドのうち、PDGF−ABの効率的な架橋は、リガンド20t−14でのみ観察された。光活性IdU位置は、らせんジャンクションのループ中の3’近接チミジンに対応する(図4)。
PDGF上の架橋したアミノ酸残基を同定するために、5’末端標識20t−14とPDGF−ABの混合物を37℃で15分間インキュベートし、次に308nmで照射した。次に反応混合物を、修飾トリプシンで消化し、架橋した断片を8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで分離した。遊離DNAバンドに最も近く泳動したバンドから回収したペプチド断片のエドマン分解により、アミノ酸配列KKPIXKK(配列番号185)(ここで、Xは20個の誘導体化アミノ酸標準物質で同定できなかった修飾アミノ酸を示す)が明らかになった。このペプチド配列(ここでXはフェニルアラニンである)は、PDGF−B鎖(ジョンソン(Johnsson)ら,(1984)EMBO J.:921−928)中のアミノ酸80〜86に対応し、これはPDGF−B鎖の結晶構造の中で溶媒に露出したループIIIの一部を含む(エフナー(Oefner)ら,(1992)EMBO J.:3921−3926)。PDGF−A鎖中では、このペプチド配列は存在しない(ベツホルツ(Betsholtz)ら,(1986)Nature 320、695−699)。まとめるとこれらのデータは、リガンド20t中の特異的チミジン残基とPDGF−B鎖のフェニルアラニン84の間の点接触を確立する。
例13.核酸リガンドによるPDGFの阻害
PDGFに対するDNAリガンドが、培養細胞に及ぼすPDGFアイソフォームの作用を阻害することができるかどうかを調べるために、トランスフェクションによりブタ大動脈内皮(PAE)細胞中で安定に発現されるPDGFα−およびβ−受容体への125I標識PDGFアイソフォームの結合に及ぼす影響を調べた。リガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)はすべて、PDGFα−受容体(図7)またはPDGFβ−受容体(データは示していない)への125I−PDGF−BBの結合を効率的に阻害し、最大効果の半分は約1nM DNAリガンドであった。トロンビンを標的とし対照として含めたDNAリガンドT39は、作用はなかった。いずれのリガンドもPDGFα−受容体(図7)への125I−PDGF−AAの結合を阻害することができず、PDGF−BBおよびPDGF−ABに対するリガンド20t、36t、および41tの観察された特異性に一致していた。
PDGFβ−受容体を発現するPAE細胞に及ぼすPDGF−BBの***促進因子作用を阻害するDNAリガンドの能力を調べた。図8に示すように、[3H]チミジン取り込みに及ぼすPDGF−BBの刺激作用を、リガンド20t、36t、および41tにより中和した。リガンド36tは、2.5nMの半分最大阻害を示した。リガンド41tはやや効率が低く、20tはさらに効率が低かった。対照リガンドT39は何の作用もなかった。さらにいずれのリガンドも、これらの細胞で[3H]チミジン取り込みに及ぼす胎児牛血清の刺激作用を阻害せず、阻害作用はPDGFに特異的であることを証明している。
例14.セレックス後ヌクレオチド置換
ヌクレアーゼに対する核酸の安定性は、核酸ベースの治療薬を開発するのに重要な考慮点である。実験では、セレックス誘導リガンド中の多くの(ある場合はほとんどの)ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に耐性の修飾ヌクレオチドと置換しても、高親和性結合を犠牲にしないことを証明した(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695;グリーン(Green)ら,J. Mol. Biol. 247,60−68)。ここで報告したDNAリガンドを用いるこの種の実験は、多くの位置で修飾ヌクレオチドによる置換が可能であることを示唆する(図9;配列番号175〜176)。具体的には、我々は、一カ所がまたは複数の箇所が置換されたリガンド36tのPDGF−AB結合性を調べるために、リガンド36t中の2’−デオキシリボヌクレオチドを2’−O−メチル−2’−デオキシ−および2’−フルオロ−2’−デオキシリボヌクレオチドで置換した。図9に示す置換パターンは、PDGF−ABへの高親和性結合に一致する。さらにこのリガンドは、らせんIIとIIIの末端のトリヌクレオチドループのペンタエチレングリコールスペーサー(グレン・リサーチ(Glin Research)、スターリング、バージニア州)の代用を許容する。従って、これらのDNAリガンドは、PDGF−ABおよびPDGF−BBの新規なクラスの特異的アンタゴニストの主要な化合物である。
例15.PDGFに対する2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAリガンドの進化ための実験法および得られたRNA配列
A.2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAセレックス
表12に示すようにプライマー鋳型(配列番号125〜127)を使用して、PDGF−ABを標的とする2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンを用いるセレックスを、前記したように行った(前記参照、およびジェリネック(Jellinek)ら,(1993,1994)前述)。簡単に説明すると、親和性選択ための2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAを、T7 RNAポリメラーゼを使用して合成DNA鋳型からインビトロ転写により調製した(ミリガン(Milligan)ら,Nucleic Acids Res., 15:8783(1987))。すでに詳細に記載されているインビトロ転写の条件(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)前述)を使用したが、ATPおよびGTP(1mM)に対してより高濃度(3mM)の2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンヌクレオシド三リン酸(2’−F UTPと2’−F CTP)を使用した。0.01%ヒト血清アルブミンを含有するPBS中でPDGF−ABを2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAと37℃で少なくとも15分間インキュベートして、親和性選択を行った。タンパク質結合RNAからの遊離RNAの分離は、既に記載されているように(ジェリネック(Jellinek)ら,(1993,1994)前述)、ニトロセルロースフィルターにより行った。親和性選択RNAの逆転写とPCRによる増幅は、既に記載されているように(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)前述)行った。19ラウンドのセレックスを行い、典型的には投入RNAの1〜12%を選択した。選択の最初の8ラウンドで、スラミン(suramin)(3〜15μM)を、選択緩衝液に加えて選択圧力を増加させた。親和性濃縮したプール(ラウンド19)をクローン化し、既に記載されているように(シュナイダー(Schneider)ら,(1992)前述)配列決定した。46のユニーク配列を同定し、配列を表13に示す(配列番号128〜170)。ユニーク配列リガンドを、高親和性でPDGF−ABに結合する能力についてスクリーニングした。ランダム2’−フルオロピリミジンRNA(表12)は解離定数(Kd)35±7nMでPDGFに結合したが、多くの親和性選択リガンドは、約100倍高い親和性でPDGF−ABに結合した。ユニークリガンドのうち、クローン9(Kd=91±16pM)、11(Kd=120±21pM)、16(Kd=116±34pM)、23(Kd=173±38pM)、25(Kd=80±22pM)、37(Kd=97±29pM)、38(Kd=74±39pM)、および40(Kd=91±32pM)は、PDGF−ABに対して最も高い親和性を示した(PDGF−ABへのこれらのリガンドの結合は2相性であり、高親和性結合成分のKdが与えられる)。
例16.実験方法
本例は、例17〜19で使用し導入した、hKGFに対する核酸リガンドの進化ための一般的方法を提供する。
A.材料と方法
組換えヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)とヒト上皮増殖因子(hEGF)は、アップステートバイオテクノロジー社(Upstate Biotechnology Inc.)(レークプラシッド(Lake Placid)、ニューヨーク州)から購入し、haFGF、hbFGF、PDGF−AB、TGFβ1、および抗KGF中和モノクローナル抗体は、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州)から購入した。組換えラットKGFは、キューイーディーアドバンストリサーチテクノロジーズ(QED Advanced Research Technologies)(サンジエゴ、カリホルニア州)から購入した。ヒトトロンビンはエンザイムリサーチラボラトリーズ(Enzyme Research Laboratories)(サウスベント(South Bend)、インディアナ州)から購入した。T4 DNAリガーゼ、HpaIIメチラーゼ、および制限酵素は、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)(ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州)から購入した。pCR−Script AmpSK(+)クローニングキットは、ストラタジーン(Stratagene)(ラホイヤ、カリホルニア州)から購入した。AMV逆転写酵素は、ライフサイエンシーズ(Life Sciences)(セントピーターズバーグ(St. Petersburg)、フロリダ州)から購入した。TaqDNAポリメラーゼは、パーキンエルマー(Perkin Elmer)(フォスターシティ(Foster City)、カリホルニア州)から購入した。高純度ヌクレオチド三リン酸は、ファルマシア(Pharmacia)(ピスカタウェイ(Piscataway),ニュージャージー州)から購入した。α−32p−ATP、γ−32p−ATP、および5’32p−シチジン3’,5’−ビス(ホスフェート)(5’32p−pCp)は、デュポンNENリサーチプロダクツ(Dupont NEN Research Products)(ボストン、マサチューセッツ州)から得た。125I標識KGFは、既に記載されているように(ボッタロ(Bottaro)ら,(1990)J. Biol. Chem. 265:12767−12770)調製した。PC−3前立腺ガン細胞は、ATCC(カタログ番号CRL1435)から得た。Balb/MK細胞と、ヒトKGF受容体でトランスフェクションしたNIH3T3(NIH3T3/KGFR)は、エス・アーロンソン(S. Aaronson)(マウントサイナイメディカルセンター(Mt. Sinai Medical CEnter),ニューヨーク州)からの供与であり、別のところ(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:246−250;ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75;ワイスマン(Weissman)ら,(1983)Cell 32:599−606)に記載されている。T7 RNAポリメラーゼ、2’−NH2−および2’−F−修飾CTPおよびUTPは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical, Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)から得た。DNAオリゴヌクレオチドは、オペロン・テクノロジーズ(Operon Technologies)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)から得た。ニトロセルロース/酢酸セルロース混合マトリックス(0.45μm)HAフィルターは、ミリポア(Millipore)(ベッドフォード(Bedford),マサチューセッツ州)から得た。カルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)は、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)から購入した。化学物質は、少なくとも試薬等級であり、市販品を購入した。
B.セレックス
セレックス法は、米国特許第5,270,163号などに詳細に記載されている(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)。転写により最初のランダム配列RNAプールを作成するための2本鎖(dsDNA)鋳型を作成するために1本鎖DNA(ssDNA)プールを使用した。DNA鋳型は、PCRとcDNA合成のためのプライマーアニーリング部位のための、5’および3’固定領域が隣接する40ランダムヌクレオチドを含有した(表14;配列番号186〜188)。5’プライマーは、インビトロ転写のためのT7プロモーター配列を含有する。鋳型は、50mM KCl、10mM トリス−塩酸(pH9.0)、0.1%トリトンX−100、3mM MgCl2、0.5mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、0.1U/mlのTaqDNAポリメラーゼ、および2.5nMずつの3G7と5G7プライマー(表14;配列番号187〜188)中で、93℃で3.5分の最初の変性、次に15サイクルの、93℃で30秒の変性、60℃で1分のアニーリング、および72℃で1分の伸長により、PCR増幅した。hKGFのセレックス実験は、RNAのランダム配列プール(ここで、すべてのピリミジンは2’−NH2修飾、または2’−F修飾されている)で開始した。転写反応は、約5μM DNA鋳型、5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ、40mM トリス−塩酸(pH8)、12mM MgCl、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002%トリトンX−100、4%PEG8000、2〜4mMずつの2’−OHATP、2’−OH GTP、2’−NH2または2’−F CTP、2’−NH2または2’−F UTP、および0.25μM α32P 2’−OH ATP(800Ci/mmol)で行った。全長転写体は、使用前にゲル精製した。結合反応物を調製するために、RNA分子を、0.01%ヒト血清アルブミンを含有するカルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州、カタログ番号21300−025)中で組換えhKGFとインキュベートした。室温でインキュベート(10分間〜10時間)後、タンパク質−RNA複合体を、ニトロセルロースで濾過して非結合RNAから分離した。ニトロセルロースフィルター結合RNAを、フェノール/尿素抽出により回収した。分離したRNAは、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM 酢酸マグネシウム、10mM DTT、50pmol DNA 3’プライマー(表14)、0.4mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、1U/μlのAMV RT中で48℃で60分、AMV逆転写酵素によりcDNAに逆転写した。cDNAをPCR増幅し、次のセレックスサイクルの開始に使用した。
C)ニトロセルロースフィルター分離法
タンパク質−RNA複合体を分離するために、結合反応物を、ニトロセルロース/酢酸セルロース混合マトリックス(0.45μm孔径)(ミリポア(Millipore)(ベッドフォード(Bedford),マサチューセッツ州))で濾過した。濾過のために、フィルターを真空マニホールドにのせ、DPBS 5mlを吸引して湿潤させた。結合反応物をフィルターから吸引し、5mlで洗浄後、フィルターをシンチレーションカウンター(ベックマン(Beckman))で計測した。表15に示すように、選択の厳密性を増加させる手段として、DPBSまたは0.5M尿素を含有するより多量の洗浄量を使用した。ゲル精製し、内部にα−32p−ATP標識転写体を、DPBS中の種々の濃度のhKGFと37℃で10分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド−タンパク質混合物を、あらかじめ湿潤させた孔径0.45μmのHAフィルターで濾過し、次にDPBS 5mlで洗浄した。フィルターに保持された放射能を計測し、タンパク質の非存在下でバックグランド結合について補正した。ソフトウェアパッケージであるカレイダグラフ(Kaleidagraph)(シネジ・ソフトウェア(Synergy Software)、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州)を用いて、非線形最少自乗法により、データを1相性または2相性結合曲線に適合させ、平衡解離定数Kdを得た(ジェリネック(Jellinek)ら,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11227−11231)。2相性結合は、平衡状態にない2つの親和性分子種の結合であるとして説明される。
D)クローニングと配列決定
ラウンド8フィルターから回収されたRNAを逆転写し、PCR増幅した。QIAクイックスピンカラム(キアゲン社(Quiagen Inc.)、チャッツワース(Chattsworth)、カリホルニア州)でカラムを精製後、エタノール沈殿し、増幅したDNAをHpaIIメチラーゼでメチル化した(ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)、ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州)。メチル化したDNAを、pCR−Script AmpSK(+)クローニングキット(ストラタジーンクローニングシステムズ(Stratagene Cloning Systems)、ラホイヤ、カリホルニア州)を使用して、pCR−Script Direct SK(+)プラスミドのSrfI制限部位にクローン化した。シーケナーゼ配列決定キット(ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Biochemical Corporation)、クリーブランド、オハイオ州)を使用して、約80クローンを配列決定した。配列解析と2次構造予測は、既に記載されているようにコンピューターソフトウェアを使用して行った(フェングとドリトル(Feng and Doolittle)(1987)J. Mol. Evol. 25:351−360;イエーガー(Jaeger)ら,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:7706−7710;イエーガー(Jaeger)ら,(1990)Methods Enzymol.183:281−306;ツッカー(Zucker)(1989)Sceince 244:48−52)。
E.結合に必要な最小配列の決定
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−32p−ATPで5’末端を標識したか、または5’−32P−pCpとT4 RNAリガーゼで3’末端で標識したオリゴヌクレオチドリガンドを用いて、それぞれ3’境界と5’境界を確立した(フィッツウォーター(Fitzwater)ら,(1996)Methods Enzymol.267:275−301)。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識オリゴヌクレオチドを、0.1、0.6、および3.0nM hKGFとインキュベートし、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質をニトロセルロース濾過により単離した。ニトロセルロースに保持されたオリゴヌクレオチドトランケートを、高分解変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。部分的RNaseAT1消化により作成されるアルカリ加水分解ラダーとG残基で停止する放射能標識リガンドのラダーを使用して、3’境界および5’境界をマッピングした。
F.プロフィールの熱変性
オリゴヌクレオチドの融解プロフィールは、ケリー(Cary)モデル1E分光光度計を使用して得た。オリゴヌクレオチドをPBS(サムブルーク(Sambrook)ら,(1989)分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第2版,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor),ニューヨーク州)、または10mMリン酸緩衝液中で95℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行った。作成された溶融プロフィールは、温度の関数としての260nmの吸光度の変化を示す。記録の間、試料を1℃/分の速度で20〜95℃まで1℃/分の速度で加熱した。
例17.hKGFに対するRNAリガンド
A.セレックス
hKGFのRNAリガンドを作成するために、2つの平衡セレックス実験を開始した(1つは40個の連続的位置でランダム化された2’−NH2、および他の1つは2’−Fピリミジン修飾RNA分子)。各ラウンドのセレックス条件と結果は、表15に示す。出発プールは、それぞれ5×1014(500ピコモル)と2.5×1014(250ピコモル)の2’−NH2および2’−Fピリミジン修飾RNA分子を含有し、KDが約30nMでhKGFに結合した。8ラウンドのセレックス後、進化したプールは、KDが0.6nMで結合した。以後の2つのラウンドでKDのさらなる改善が観察された。前記したように、第8ラウンドのRNAプールを逆転写し、PCR増幅し、クローン化した。
B.RNA配列
2’−NH2セレックスで、31クローンのうち29は、ユニークであった。配列決定したセレックスのすべての43クローンは、ユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから3つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると定義される。表16は、配列決定したすべてのクローンの配列(配列番号189〜262)を、1文字コードで示す(コーニッシュ−ボウデン(Cornish-Bowden),1985 Nucleic Acids Res. 13:3021−3030)。コンピューターによる全体的および局所的整列は、クローンの間で広範な相同性は示さず、明らかなファミリーはなかった。2’−NH2クローンは一般的にプリンが豊富であり、2’−Fクローンはピリミジンが豊富であった。整列パラメータを緩めると、フェング/ドリトル(Feng/Doolittle)アルゴリズムにより2’−NH2クローンが1つのファミリーに分類され、2’−Fクローンが別の群に分類された。配列を肉眼で観察すると、2’−NH2と2’−Fリガンドについてそれぞれ2つおよび3つの可能なファミリーが示唆された。保存された予測2次構造を使用して、38の2’−Fリガンドが2つのクラスに割り当てられた(図12Aと12B)。同様に、15の2’−NH2リガンドが2つのクラスに割り当てられた(図12Cと12D)。2’−Fリガンドの2つの提唱されるクラスは、シュードナット構造に折り畳まれる(ワイアット(Wyatt)ら,(1993)The RNA World 465−496;イー・テン・ダム(ten Dam, E.)(1992)Biochemistry 31:1665−1676)。これらの構造は非常に関連があり、実際これらは共通の構造の環状置換である。クラス1シュードナットのループ3(L3)は、保存配列5’RRYuyを示し、クラス2リガンドのループ1(L1)は配列5’AsYYを示す。これらの配列の両方とも、コンセンサス5’RRYYを含有する。2’−Fリガンドのあるものは、RRYY配列の2〜3コピーを含有する(図12Aと12B)。これらの構造の別の特徴は、ステム1(S1)中のプリンとピリミジンの均等でない分布である。このステムの1つの鎖は、ほとんどプリンを含有し、他の鎖はピリミジンを含有する。
2’−NH2リガンドのクラス1は、8つのメンバーを含有し、これらは内部対称または非対称ループを有するステムループ構造に折り畳まれる。ステムは3つの連続的GC塩基対を有する。末端ループは長く、保存配列5’GGAA(N)1-14YAA(n)1-7RCRR(配列番号263)を示す。クラス1リガンドの内部非対称ループの両側は、配列5’AAを含有する。クラス2は、可変サイズのループを有するダンベルに折り畳むことができる。1つのループは保存配列5’YGAYを含有し、他のループは保存配列5’GGAA(N)0-4YGA(配列番号264)を含有する。クローン2Nと54Nは、残存する5クローンの環状置換である。
C.親和性
hKGFリガンドの解離定数は、表17に記載のニトロセルロースフィルター結合により決定した。41個の2’−F リガンドのうち8個は2相性に結合した。残りの2’−Fおよび2’−NH2リガンドは1相性に結合した。タンパク質過剰では、2相性結合は、リガンドは平衡状態にない2つの親和性分子種(おそらくイソコンフォーマー)として存在することを示唆する。2’−F修飾リガンドであるK14Fは、それぞれ0.3〜3pMと2〜10nMの高親和性および低親和性解離定数で2相性に結合する。種々のクローンとランダムRNAについてKD測定で変動がいくつか観察されている。KD測定の実験的変動にもかかわらず、K14Fの高親和性分子種は、ランダムRNAより1,000〜5,000倍親和性が高い。1相性2’−F修飾リガンドのうち、K38Fは0.3nMの最もよいKDを有した。最良の2’−NH2修飾リガンドは、KDが0.4nMで結合し、これはランダムRNAに対して75倍の改善である。
D.結合に必要な最小配列の測定
結合に必要な最小配列を測定するために、さらに2つの2’−F リガンド(6Fと14F)(配列番号223と231)を試験した。3’末端と5’末端で標識したアルカリ加水分解ラダーをhKGFに結合させて、配列境界を決定した。部分的断片をニトロセルロース濾過により親和性精製し、高分解変性ゲルで解析した。両方のリガンドについて、境界は3’末端でのみ観察され(図13)、図12Aに示すクラス1の提唱された折り畳みに一致する。次に端を切り取った鋳型を使用して境界を確認した(図13)。7つの連続的ピリミジンでは境界の正確なマッピングができなかったため、3つのトランケートを6Fについて試験した。これらの3つのトランケートから、1つは図13に示すようにKGF結合活性を阻止した。単一の14Fトランケート(14F3’Tと命名)を試験した。提唱されたシュードナット構造のステム2(S2)を伸長するために、このトランケートは観察された境界より2塩基長かった。14F3’Tの端を切り取ったリガンドは、全長リガンドに類似の親和性で結合活性を保持した。全長リガンドのように、14F3’TはKGFに2相性に結合し、高親和性分子種は分子の約20%であり、Kd値約0.3〜3pMであった。これらの高親和性分子種は、KGFへの親和性の差に基づき低親和性分子種から部分的に分離した時、中点が0.3〜3pMにあり最大のプラトーが約70%である結合曲線を示した(データは示していない)。図13は、それぞれ53および49塩基の長さの6Fと14Fの最も短い活性トランケートの予測された折り畳みを示す。いずれの提唱されたシュードナット構造も、相対的に長いステムを含有する。6Fの2つの提唱されるステムは、非H型シュードナットを形成する単一の塩基により分離される。提唱される6F構造は、MMTV RNA中に存在するフレームシフト成分からの類似のシュードナットモチーフの溶解構造に似ている(シェン(Shen)ら,(1995)J. Mol. Biol. 247:963−978)。14Fの2つのステム(S1とS2)は、全長が16塩基対の同軸で重なったらせんとして描くことができるであろう(H型シュードナット)。同様のシュードナット構造が、NMRデータに基づき提唱されている(ヅ(Du)ら,(1996)Biochemistry 35:4187−4198)。L1は短いため、リガンド14Fは非H型シュードナット(ここで、S1の最後のGU塩基対は形成されず、より柔軟性のあるらせん領域とより長いL1を可能にする)を形成することができる。14Fと14F3’Tの温度融解曲線は、このリガンドの顕著な熱安定性を示唆する(データは示していない)。これらの融解曲線は、150mMの塩中で濃度依存性で2相性のようである。2相性融解曲線は、すでにtRNAでも観察されており(ヒルアース(Hilbers)ら,(1976)Biochemistry 15:1874−1882)、RNA分子の三次折り畳みが原因であるとされている。RNAシュードナットについて多相温度遷移が提唱されている(ヅ(Du)ら,(1996)Biochemistry 35:4187−4198)。観察される2相性曲線は、約55℃の低Tmと85〜90℃以上の高Tmを含む。10mMの塩では、14Fの低Tmは観察されず、高Tmは75〜78℃まで移動してくる。14Fの融解プロフィールは、Tmは同じでも14F3’Tより平らなようである。このデータは、観察された熱安定性は最小の49量体が原因であることを示唆する。
結合を保持したより短いKGFリガンドを同定するために、リガンド14Fの最も短いトランケート(すなわち、14F3’T)の種々の欠失の結合活性を試験した。欠失は、提唱されたシュードナット構造のすべての構造成分で試験された。結果を表23に要約する(配列番号272〜304)。2’−Fピリミジンと2’−OHプリンを含有するRNA転写体は、合成DNA鋳型を使用するインビトロ転写により得られた。各リガンドの活性は、14F3’T結合曲線の高(H)および低(L)活性成分を+(活性)または−(不活性)に採点して示す。トランケートT35とT36は、14F3’T分子の2つの相補的な半分ずつであり、等モル混合物中でさらに試験した。提唱されたシュードナット構造の構造成分は、(|)で分離され、記号S1(ステム1)、S2(ステム2)、L1(ループ1)、およびL3(ループ3)により示される。14F3’Tの提唱されるシュードナット構造は、非H型シュードナットであり、L2(ループ2)が欠如している。S1(S1とS1’)とS2(S2とS2’)を形成する相補的な配列は、1本および2本の下線で示す。表にした配列において、欠失した塩基はピリオド(.)で置換してある。提唱されたシュードナット構造のステムS1とS2の欠失を試みると、14F3’Tリガンドで観察されたように、結合曲線の高(H)および低(L)活性成分の両方が喪失した。しかし、ループ3(L3)内の欠失は、RRYYボックスの少なくとも1つのコピーが完全である限り、完全であった。活性を保持した最も短いリガンドは、43量体であるT22である。L3の端を切り取ってより短いリガンドを得るために、突然変異体であるT22(T22muと呼ぶ)を使用し、ここでは6位のGからUへの突然変異により、S1の最後のGC塩基対を除去した。この突然変異の意味は、S1とS2の間の対をなさない塩基を可能にして、このリガンドの2本鎖領域の柔軟性を増強することである。この突然変異はT22の結合に影響を与えなかったが、これはL3中のさらなる活性なトランケーションを許容しなかった。
E.hKGFに対するRNAリガンドの特異性
K14Fリガンドの特異性を、ラットhKGF、およびヘパリン結合ヒト増殖因子、aFGF、bFGF、およびPDGFに対してKDを測定して試験した(表18)。結果は、hKGFを除いて、K14FはランダムRNAのようにすべての試験した標的に結合すること、そしてファクター400〜40,000でhKGFと他の類似のタンパク質を区別することができることを示唆する。
種々のヘパリン結合タンパク質に対してそのKdを測定して、リガンド14F3’Tの特異性を試験した。表22に要約した結果は、リガンド14F3’Tは、ファクター1.2×104〜3×1010でhKGFと他のすべてのヘパリン結合タンパク質を区別することができることを示す。リガンド14F3’Tは高親和性でKGFにのみ結合し、一方これは、ランダムRNAのように試験した他のすべてのヘパリン結合タンパク質に結合する。14F3’TのラットKGF(これは、ヒトKGFと91%同じである)への結合は、親和性が約5〜10倍低い。Balb/MK細胞のKGF誘導DNA合成の阻害の間、同様の特異性が観察された。リガンド14F3’Tは、Kiが1.8nMでKGF誘導性DNA合成を阻害し、これはヒトKGFで観察されたKiより25〜50倍高い。リガンド14F3’Tは、EGF刺激ではなくKGF刺激の結果である時のみ、Balb/MK細胞のDNA合成を阻害する(データは示していない)。
例18.細胞表面受容体へのhKGF結合の阻害
A.受容体結合測定法
その細胞表面受容体へのhKGFの結合を競合的に阻害するhKGFリガンドの能力を試験するために、2つの細胞株を使用した。最初の細胞株(PC−3)は、グレードIVの前立腺腫からの単離物である(ATCC CRL 1435)。第2の細胞株は、NIH3T3/FGFR−2と呼び、約0.5×106の高親和性KGF結合部位/細胞で、ヒトhKGF受容体を有する組換えNIH/3T3細胞株である(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:246−250)。
PC−3細胞を、約105細胞/ウェルで24ウェルプレートに蒔いた。48〜36時間増殖後、細胞に24時間血清を欠如させ、500μlの冷DPBSで2回洗浄し、次に0〜0.8nMの範囲の種々の濃度の125I−標識KGFを含有する、500μlの結合緩衝液(BB1;DPBS、0.5mM MgCl2、0.2%BSA、0.02%アジ化ナトリウム)でインキュベートした。4℃で3〜3.5時間インキュベート後、結合混合物を吸引し、ウェルに接着した細胞を1mlのBB1で2回洗浄し、0.5M NaClを補足した1mlのBB1で洗浄した。残りの結合した標識hKGFを、600μlの0.5%SDS/0.1M NaOH中で可溶化し、ガンマカウンター(ベックマン(Beckman))で計測した。非特異結合を、100倍モル過剰の非標識hKGFの存在下で測定した。競合的測定法のために、標識hKGFを0.3nMで一定に維持し、0〜1,000nMの範囲の結合反応物中に、種々の濃度の競合物質分子を含有させた。結合曲線を以下の式に適合させた:
[結合トレーサー]=([総トレーサー]*[受容体])/(KD+[総トレーサー])
ここで、[総トレーサー]と[結合トレーサー]は固定して、ソフトウェアのカレイダグラフ(Kaleidagraph)(シネジ・ソフトウェア(Synergy Software)、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州)を用いて、回帰解析によりKDと[受容体]を求めた。
NIH3T3/KGFR細胞を、約105細胞/ウェルで24ウェルプレートに蒔いた。一晩増殖後、細胞に1〜5時間血清を欠如させ、500μlの結合緩衝液(BB2;無血清MEM増殖培地、0.1%BSA、25mMヘペス、pH7.4)で2回洗浄し、次に1μg/mlのヘパリン(ウシ肺から、シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)、0.03nMの125I標識hKGF、および種々の濃度の競合物質分子(300nM〜0nM)を含有する250μlのBB2とインキュベートした。室温で1時間インキュベート後、結合混合物を吸引し、ウェルを250μlの冷DPBSで2回洗浄し、0.5M NaClを補足した250μlの冷DPBSで1回洗浄した。結合した標識hKGFを、500μlの0.5%SDS中で可溶化し、シンチレーションカウンター(ベックマン(Beckman))で計測した。
RNAリガンドの阻害定数(Ki)を、データの非線形回帰解析により求めた。
PC−3細胞の表面上のKGF受容体を探索するために、100倍モル過剰の非標識hKGFの存在下で異なる濃度(0.002M〜0.8nM)の125I−hKGFを使用し、PC−3細胞の表面上のトレーサーの飽和結合を観察した。図10は、トレーサーの総濃度の関数としての結合トレーサーの濃度のプロット、ならびに同じデータのスキャチャード解析を示す。データの解析は、細胞当たり約5,000個の、hKGFに対するKDが100〜200pMの特異的hKGF結合部位があることを示唆する。このKDは、報告されているhKGFに対するKD200pMによく一致する(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246−250)。
PC−3原形質膜抽出物は、未変性ゲル電気泳動で、放射能標識hKGFの電気泳動度(ゲルシフト)を変化させたことがわかった(図11)。電気泳動度シフトゲルのために、約3×107のPC−3細胞を静かに遠心分離し、PBSで洗浄し、次に、等量の溶解緩衝液(40mMヘペス(pH7.4)、150mM NaCl、20%グリセロール、2%トリトンX−100、0.1%アジ化ナトリウム、3mM MgCl2、3mM EGTA、2μMアプロチニン、2μMロイペプチン(leupeptin)、2mM PMSF、および400μMオルソバナジン酸ナトリウムを含有する)と混合して溶解させた。氷上で15分間インキュベート後、抽出物を11,000gで4℃で30分間遠心分離して破片を除去し、上清を一定量に分割し、−70℃で保存した。ゲル解析のために、25μlの結合反応物を、0.01%HSA中3μlの10倍希釈PC−3膜抽出物を含有するDPBS、0.01%HSA、2mM MgCl2、および種々の濃度の125I標識hKGF中に入れた。室温で10分間インキュベート後、6×の添加色素を加えて1×濃度を達成し、試料を5%または10%の未変性のTBEポリアクリルアミドゲルにのせた。ゲルを室温で100ボルトであらかじめ流した。のせてから、ゲルを200ボルトで5分間流し、次に100ボルトで室温で30〜60分流した。次に、放射性バンドをオートラジオグラフィーで可視化した。放射能標識hKGFのゲルシフトは、100倍モル過剰の非標識hKGFの存在下で観察され(図11)、PC−3膜抽出物中に見いだされる成分とhKGFの間の特異的相互作用を示している。ゲルシフト実験から推定されるKDは約8nMである。
文献(ミキ(Miki)ら,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:246−250)に報告された競合的実験に一致して、非標識hKGFとbFGFならびに無関係の小さい塩基性タンパク質(すなわち、ライソザイム)を用いてゲルシフト競合曲線が得られた。表21は、この実験で得られたIC50を示す。従来の報告に一致して、表21に示すデータは、bFGFは、PC−3原形質膜抽出物中に存在するhKGF受容体への結合について、hKGFより競合は約20倍劣ることを示す。もう1つの陽性荷電したリソザイムは、PC−3膜抽出物:hKGF複合体に対して、hKGF単独より約100倍劣る親和性で競合するため、ゲルシフトで観察される相互作用は、FGFについての特異的な相互作用であり、電荷−電荷相互作用によるものではないようである。
PC−3測定法で得られた種々のRNAリガンドのIC50値を表19に示す。これらのリガンドのサブセットをNIH3T3/FGFR−2で試験した。競合阻害定数(Ki)は、完全な競合曲線から求め、これを表20に要約する。Ki値の決定に際して、3T3細胞は500,000結合部位/細胞を有し、PC−3細胞は5,000結合部位/細胞を有すると仮定した。
データは、いくつかのhKGFリガンドが、その細胞表面受容体へのhKGFの結合を競合的に阻害することができることを示す。これらのリガンドのいくつか(例えば、K14F)は、低nM範囲のKiの強力な競合活性を有する。
この研究は、hKGFの核酸競合物質が得られることを証明するばかりでなく、小分子、抗体およびペプチドなどのhKGF競合物質をスクリーニングするための新しい測定法も同定する。この新しい測定法は、前立腺ガン細胞株(PC−3)を使用する。
2つの細胞株(PC−3とNIH3T3/FGFR−2)は、わずかに異なる結果を与える(表20)。PC−3細胞へのKGFの結合は、いくつかのリガンドおよびヘパリンによる阻害に対して感受性が高い。しかしランダムRNAは、PC−3細胞上のKGF結合について有効に競合する。NIH3T3/FGFR−2へのKGFの結合は、いくつかのRNAリガンドやヘパリンによる阻害に耐性である。これは、NIH3T3/KGFR測定法が1μg/mlのヘパリンの存在下で行われるため、より厳密性であるためである。NIH3T3/FGFR−2のランダムオリゴヌクレオチド競合曲線は、Ki>10-4Mで完全に平たんである。2つの2’−NH2リガンド(14Nと29N)のみが、PC−3細胞に良好な活性を示す(Ki値1.4nM)。これらの2つのリガンドから、14NのみがNIH3T3/FGFR−2測定法で阻害活性を示し、Ki値100nMを示す。これらのリガンドは、KGFの代わりにEGFで誘導された細胞に非増殖活性を有するものではないため(データは示していない)、これらのリガンドによるKGF***促進活性の観察された阻害は、細胞株の増殖活性への非特異作用によるのではない。
この研究は、hKGFの核酸競合物質が得られることを証明するばかりでなく、小分子、抗体およびペプチドなどのhKGF競合物質をスクリーニングするための新しい測定法も同定する。この新しい測定法は、前立腺ガン細胞株(PC−3)を使用する。
例19.KGFの***促進活性の阻害
KGFの生物学的作用の1つは、上皮細胞の増殖の刺激である(ルビン(Rubin)ら,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:802−806)。KGFのこの増殖作用は、KGFへの暴露後の応答細胞の[3H]チミジン取り込みの刺激により測定できる。これらのこのような細胞株はすでに記載されている(ルビン(Rubin)ら,(1989)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:802−806)。種々のリガンドの抗***促進活性を試験するために、2つの細胞株を使用した。1つは、サルの上皮の継代数の小さい細胞株である4MBr−5(ATCC#CCL208)(カプト(Caputo)ら,(1979)In Vitro 15:222−223)であり、他の1つは、形質転換されたラットケラチン細胞株であるBalb/MKである(ワイスマンとアアロンソン(Weissman and Aaronson)(1983)Cell 32:599−606)。30ng/ml、EGF、および10%FCSを含有するF12K中で増殖させた4MBr−5細胞をトリプシン処理し、10mMヘペス(pH7.4)、および10%FCSを含有するM199に1.4×105細胞/mlで再懸濁した。96マイクロタイタープレートに100μlの細胞懸濁液を接種し、10ng/ml(0.5nM)のKGFを加え、種々の濃度(0〜1000nMの範囲)のK14Fを加えた。各インキュベート反応物を少なくとも三重測定でセットした。37℃で24時間インキュベート後、1μCi/ウェルの[3H]チミジンを10nMの非標識チミジンとともに加えた。細胞をさらに24時間インキュベートし、上清を吸引し、残存する細胞を、20μlの0.2N NaOHで溶解して採取した。[3H]チミジン取り込みの程度を、TCA沈殿とGFCフィルターディスク(ワットマン(Whattman),ヒルスボロ(Hillsboro),オレゴン州)を用いる濾過により測定した。
10%FCS(透析および熱不活性化)と5ng/ml rhEGFを含有する低Ca++EMEM中で増殖させたBalb/MKをトリプシン処理し、1%FCS(透析および熱不活性化)と0.5ng/ml rhEGFを含有する低Ca++EMEM中に再懸濁し、100μlの総容量中4〜6×104細胞/ウェルで、96ウェルのフィブロネクチンコーティング培養プレートに広げた。一晩増殖後、培地をFCSまたはrhEGFを含まない低Ca++EMEMで置換し、血清を約30時間欠乏させた。次にそれぞれ16および49nMのヒト組換えKGFまたはrhEGFを、種々の濃度の競合物質(0〜1000nM)とともに加えた。一晩インキュベート後、[3H]チミジンを0.2μCi/ウェルで加えて、さらに7〜8時間インキュベートを続けた。[3H]チミジン取り込みの程度を、TCA沈殿とGFCフィルターディスクを用いる濾過により測定した。
オリゴヌクレオチドリガンドの阻害定数(Ki)を、既に記載されているように(ギル(Gill)ら,(1991)J. Mol. Biol. 220:307−324)非線形回帰解析解析により求めた。
2つの測定法はわずかに異なる結果を与えた。4MBr−5測定法は胎児牛血清の存在下で行い、Balb/MKは血清欠乏後に行った。Balb/MK測定法はより高感度であり、KGF誘導性***促進活性の原型的測定法である。PC−3細胞で得られる結果と同様に、4MBr−5測定法はリガンド14Fについて良好な活性を示した(Ki値9.8nM、しかし不完全な阻害)。同じ測定法において、ランダムオリゴヌクレオチドは、Ki値>1μMを示し、中和性モノクローナル抗体はKi値2.9nMを示した。リガンド14Fは中和性モノクローナル抗体より良好またははるかに良好なようであり、リガンド14Nは約20〜40%でプラトーになり、これはこれらの抗体がKGF***促進活性を完全には除去しないことを示唆している。モノクローナル抗体に対して、リガンド14Fは、4MBr−5細胞に及ぼすKGF***促進活性を完全に阻止する。Balb/MK測定法では、14NはKi値10nM(不完全な阻害)を示し、ランダムオリゴヌクレオチドはKi値約300nMを示した。6Fと14Fに対するKi値は、それぞれ830および92pMである。4MBr−5測定法と同様に、リガンド14Fは、Ki値980pMを示す中和性モノクローナル抗体より良いということはなくても同程度に良好なようである。最良の阻害活性は、Ki値34pMを有する14F3’Tで観察された。
例20
塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)に結合する核酸リガンドが、すでに米国特許第5,459,015号(米国特許第5,270,163号およびツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)に記載のようにセレックス法で得られている。配列5’−GGGAGACAAGAAUAACGCUCAAGUAGACUAAUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC(配列番号265)を有する21Aと呼ぶ2’−NH2修飾核酸リガンドを、欠失解析により、bFGFへの高親和性結合に必要な最小配列情報について調べた。この解析により、端を切り取ったリガンド21A−t(GGUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGuuc(配列番号266)、ここで下線を引いたGは、転写効率を改善するために加えたグアニンであり、小文字は定常領域からのものである)が得られた。
ヌクレアーゼによる分解に対するリガンド21A−tの安定性を上昇させるために、短いホスホラミダイトキャップを5’末端と3’末端に付加した。さらに、グリーン(Green)ら,(1995)Chem. Biol. 2:683−695に記載の方法を使用して、bFGFに対する結合親和性を失うことなく2’−デオキシ−2’−O−メチルプリンで置換できる9つのリボプリン位置を同定し、NX−286(5’−TsTsTsTs mGmGaU rGaUrG aUrGrG mArArG mAaCrA rGaCmG mGmGaU mGmGaU aUaC TsTsTsTsT−3’(配列番号267)、ここで、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合、aUとaCはそれぞれ2’−デオキシ−2’−O−アミノシチジンと2’−デオキシ−2’−O−アミノシチジンであり、mAとmGはそれぞれ2’−デオキシ−2’−O−メチルアデノシンとグアノシン残基であり、rAとrGはアデノシンとグアノシン残基であり、Tは2’−デオキシチミジンである)と呼ぶリガンドが得られた。この修飾核酸リガンドは、電気泳動度シフト測定法により、Kd 0.4nMを有していた。
配列リスト
(1)一般情報:
(i)出願人: ラリー・ゴールド(LARRY GOLD);ネボジャ・ジャンジック(NEBOJSA JANJIC);スティーブン・リングキスト(STEVEN RINGQUIST);ニコス・パグラティス(NIKOS PAGRATIS);ペネロピ・ジェイ・トゥースマン(PENELOPE J. TOOTHMAN)
(ii)発明の名称:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)、血小板由来増殖因子(PDGF)およびヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド
(iii)配列の数:304
(iv)連絡住所:
(A)宛名:スワンソンおよびプラットシュン、エルエルシー(Swanson & Bratschun, L.L.C.)
(B)通り:8400東、プレンティス・アベニュー、スイート200(8400 E. Prentice Avenue, Suite 200)
(C)市:イングルウッド(Englewood)
(D)州:コロラド
(E)国:米国
(F)郵便番号:80111
(v)コンピューターで読める形式:
(A)媒体の型:ディスケット、3.5インチ、容量1.44Mb
(B)コンピューター:IBMコンパチブル
(C)オペレーティング・システム:MS−DOS
(D)ソフトウェア:ワードパーフェクト6.1(WordPerfect 6.1)
(vi)現行出願のデータ:
(A)出願番号:US96/
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/458,423
(B)出願日:1995年6月2日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/458,424
(B)出願日:1995年6月2日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/465,594
(B)出願日:1995年6月5日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/465,591
(B)出願日:1995年6月5日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/479,725
(B)出願日:1995年6月7日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/479,783
(B)出願日:1995年6月7日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/618,693
(B)出願日:1995年3月20日
(viii)弁理士/代理人情報:
(A)氏名:バリー・ジェイ・スワンソン(Barry J. Swanson)
(B)登録番号:33,215
(C)参照/整理番号:
(ix)電話連絡先情報:
(A)電話:(303)793−3333
(B)ファックス:(303)793−3433
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:2:
(2)配列番号:3の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:123塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:3:
(2)配列番号:4の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:4:
(2)配列番号:5の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:5:
(2)配列番号:6の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:6:
(2)配列番号:7の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:7:
(2)配列番号:8の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:8:
(2)配列番号:9の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:9:
(2)配列番号:10の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:50塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:10:
(2)配列番号:11の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:33塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:11:
(2)配列番号:12の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:125塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:12:
(2)配列番号:13の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:125塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:13:
(2)配列番号:14の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:125塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:14:
(2)配列番号:15の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:116塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:15:
(2)配列番号:16の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:123塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:16:
(2)配列番号:17の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:17:
(2)配列番号:18の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:123塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:18:
(2)配列番号:19の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:115塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:19:
(2)配列番号:20の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:116塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:20:
(2)配列番号:21の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:98塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:21:
(2)配列番号:22の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:113塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:22:
(2)配列番号:23の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:116塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:23:
(2)配列番号:24の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:116塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:24:
(2)配列番号:25の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:25:
(2)配列番号:26の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:26:
(2)配列番号:27の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:78塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:27:
(2)配列番号:28の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:28:
(2)配列番号:29の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:108塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:29:
(2)配列番号:30の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:30:
(2)配列番号:31の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:69塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−アミノ(2’NH2)修飾されている
(xi)配列:配列番号:31:
(2)配列番号:32の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:32:
(2)配列番号:33の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:33:
(2)配列番号:34の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:116塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:34:
(2)配列番号:35の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:35:
(2)配列番号:36の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:81塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:36:
(2)配列番号:37の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:37:
(2)配列番号:38の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:115塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:38:
(2)配列番号:39の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:39:
(2)配列番号:40の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:111塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:40:
(2)配列番号:41の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:41:
(2)配列番号:42の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:119塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:42:
(2)配列番号:43の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:43:
(2)配列番号:44の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:44:
(2)配列番号:45の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:16塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:45:
(2)配列番号:46の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:46:
(2)配列番号:47の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:47:
(2)配列番号:48の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:48:
(2)配列番号:49の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:49:
(2)配列番号:50の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:50:
(2)配列番号:51の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:51:
(2)配列番号:52の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:52:
(2)配列番号:53の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:53:
(2)配列番号:54の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:54:
(2)配列番号:55の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:55:
(2)配列番号:56の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:56:
(2)配列番号:57の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:57:
(2)配列番号:58の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:58:
(2)配列番号:59の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:59:
(2)配列番号:60の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:60:
(2)配列番号:61の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:61:
(2)配列番号:62の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:62:
(2)配列番号:63の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:63:
(2)配列番号:64の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:64:
(2)配列番号:65の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:65:
(2)配列番号:66の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:66:
(2)配列番号:67の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:67:
(2)配列番号:68の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:68:
(2)配列番号:69の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:69:
(2)配列番号:70の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:70:
(2)配列番号:71の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:71:
(2)配列番号:72の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:72:
(2)配列番号:73の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:73:
(2)配列番号:74の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:74:
(2)配列番号:75の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:75:
(2)配列番号:76の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:76:
(2)配列番号:77の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:77:
(2)配列番号:78の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:78:
(2)配列番号:79の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:79:
(2)配列番号:80の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:80:
(2)配列番号:81の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:81:
(2)配列番号:82の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:82:
(2)配列番号:83の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:67塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:83:
(2)配列番号:84の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:84:
(2)配列番号:85の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:85:
(2)配列番号:86の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:86:
(2)配列番号:87の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:87:
(2)配列番号:88の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:88:
(2)配列番号:89の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:89:
(2)配列番号:90の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:90:
(2)配列番号:91の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:28塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:91:
(2)配列番号:92の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:92:
(2)配列番号:93の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:93:
(2)配列番号:94の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:94:
(2)配列番号:95の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:95:
(2)配列番号:96の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:96:
(2)配列番号:97の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:97:
(2)配列番号:98の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:98:
(2)配列番号:99の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:99:
(2)配列番号:100の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:100:
(2)配列番号:101の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:101:
(2)配列番号:102の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:102:
(2)配列番号:103の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:103:
(2)配列番号:104の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:104:
(2)配列番号:105の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:105:
(2)配列番号:106の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:106:
(2)配列番号:107の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:107:
(2)配列番号:108の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:108:
(2)配列番号:109の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:109:
(2)配列番号:110の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:110:
(2)配列番号:111の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:111:
(2)配列番号:112の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:112:
(2)配列番号:113の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:113:
(2)配列番号:114の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:114:
(2)配列番号:115の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:115:
(2)配列番号:116の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:116:
(2)配列番号:117の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:117:
(2)配列番号:118の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:118:
(2)配列番号:119の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:119:
(2)配列番号:120の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:120:
(2)配列番号:121の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:121:
(2)配列番号:122の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:122:
(2)配列番号:123の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:123:
(2)配列番号:124の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:124:
(2)配列番号:125の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:125:
(2)配列番号:126の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:126:
(2)配列番号:127の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:127:
(2)配列番号:128の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:128:
(2)配列番号:129の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:91塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:129:
(2)配列番号:130の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:130:
(2)配列番号:131の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:131:
(2)配列番号:132の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:132:
(2)配列番号:133の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:133:
(2)配列番号:134の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:134:
(2)配列番号:135の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:135:
(2)配列番号:136の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:136:
(2)配列番号:137の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:137:
(2)配列番号:138の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:138:
(2)配列番号:139の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:139:
(2)配列番号:140の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:140:
(2)配列番号:141の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:141:
(2)配列番号:142の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:142:
(2)配列番号:143の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:143:
(2)配列番号:144の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:144:
(2)配列番号:145の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:145:
(2)配列番号:146の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:146:
(2)配列番号:147の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:147:
(2)配列番号:148の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:148:
(2)配列番号:149の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:149:
(2)配列番号:150の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:150:
(2)配列番号:151の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:151:
(2)配列番号:152の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:152:
(2)配列番号:153の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:153:
(2)配列番号:154の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:98塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:154:
(2)配列番号:155の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:155:
(2)配列番号:156の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:156:
(2)配列番号:157の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:157:
(2)配列番号:158の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:97塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:158:
(2)配列番号:159の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:159:
(2)配列番号:160の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:160:
(2)配列番号:161の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:161:
(2)配列番号:162の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:162:
(2)配列番号:163の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:163:
(2)配列番号:164の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:164:
(2)配列番号:165の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:97塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:165:
(2)配列番号:166の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:166:
(2)配列番号:167の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:167:
(2)配列番号:168の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:168:
(2)配列番号:169の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:169:
(2)配列番号:170の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:170:
(2)配列番号:171の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1位および23位のNは相互に塩基対を形成し、1−4塩基対の長さであってよい
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5位および10位のNは任意の塩基対である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および9位のNは任意の塩基対である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:7位および8位のNは任意の塩基対である
(xi)配列:配列番号:171:
(2)配列番号:172の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド38は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:172:
(2)配列番号:173の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド40は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:173:
(2)配列番号:174の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド45は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:174:
(2)配列番号:175の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:8、11、25および26位のCは2’−O−メチル−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:9、10、17、19および35位のGは2’−O−メチル−2’−デオキシグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:12、24および27位のAは2’−O−メチル−2’−デオキシアデノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:34位のUは2’−O−メチル−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および22位のUは2’−フルオロ−2’−デオキシウリジンである(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:23、32および33位のCは2’−フルオロ−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド36は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:175:
(2)配列番号:176の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:8位のCは2’−O−メチル−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:9、17、および31位のGは2’−O−メチル−2’−デオキシグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:22位のAは2’−O−メチル−2’−デオキシアデニンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:30位のUは2’−O−メチル−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および20位のUは2’−フルオロ−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:21、28および29位のCは2’−フルオロ−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:10位および23位のNはペンタエチレングリコールホスホルアミダイトスペーサーである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド32は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:176:
(2)配列番号:177の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド39は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:177:
(2)配列番号:178の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:13、14、16および17位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:178:
(2)配列番号:179の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:20位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:179:
(2)配列番号:180の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:23位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:180:
(2)配列番号:181の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:24位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:181:
(2)配列番号:182の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:27位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:182:
(2)配列番号:183の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:28−30位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:183:
(2)配列番号:184の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:33位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:184:
(2)配列番号:185の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:7アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:ペプチド
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5位のXaaは同定できなかった修飾アミノ酸である
(xi)配列:配列番号:185:
(2)配列番号:186の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:186:
(2)配列番号:187の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:187:
(2)配列番号:188の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:16塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:188:
(2)配列番号:189の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:189:
(2)配列番号:190の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:190:
(2)配列番号:191の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:191:
(2)配列番号:192の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:192:
(2)配列番号:193の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:193:
(2)配列番号:194の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:194:
(2)配列番号:195の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:195:
(2)配列番号:196の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:196:
(2)配列番号:197の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:197:
(2)配列番号:198の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:198:
(2)配列番号:199の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:199:
(2)配列番号:200の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:200:
(2)配列番号:201の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:201:
(2)配列番号:202の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:202:
(2)配列番号:203の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:203:
(2)配列番号:204の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:57塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:204:
(2)配列番号:205の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:205:
(2)配列番号:206の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:206:
(2)配列番号:207の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:207:
(2)配列番号:208の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:69塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:208:
(2)配列番号:209の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:209:
(2)配列番号:210の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:210:
(2)配列番号:211の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:211:
(2)配列番号:212の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:212:
(2)配列番号:213の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:82塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:213:
(2)配列番号:214の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:214:
(2)配列番号:215の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:53塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:215:
(2)配列番号:216の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:216:
(2)配列番号:217の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:217:
(2)配列番号:218の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:218:
(2)配列番号:219の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:219:
(2)配列番号:220の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:220:
(2)配列番号:221の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:221:
(2)配列番号:222の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:222:
(2)配列番号:223の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:223:
(2)配列番号:224の情報:
(i)配列の特色:
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(xi)配列:配列番号:224:
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(i)配列の特色:
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(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:225:
(2)配列番号:226の情報:
(i)配列の特色:
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(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(i)配列の特色:
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(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:235:
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(i)配列の特色:
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(B)型:核酸
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:236:
(2)配列番号:237の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:237:
(2)配列番号:238の情報:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:238:
(2)配列番号:239の情報:
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(ii)分子の型:RNA
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:239:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:240:
(2)配列番号:241の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:241:
(2)配列番号:242の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:242:
(2)配列番号:243の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:243:
(2)配列番号:244の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
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(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:244:
(2)配列番号:245の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:245:
(2)配列番号:246の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:246:
(2)配列番号:247の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:247:
(2)配列番号:248の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:248:
(2)配列番号:249の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:249:
(2)配列番号:250の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:250:
(2)配列番号:251の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:251:
(2)配列番号:252の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:252:
(2)配列番号:253の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:253:
(2)配列番号:254の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:69塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:254:
(2)配列番号:255の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:255:
(2)配列番号:256の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:256:
(2)配列番号:257の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:257:
(2)配列番号:258の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:258:
(2)配列番号:259の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:259:
(2)配列番号:260の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:260:
(2)配列番号:261の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:261:
(2)配列番号:262の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:262:
(2)配列番号:263の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:263:
(2)配列番号:264の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:9塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:264:
(2)配列番号:265の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:76塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−NH2 2 シトシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2 2 ウラシルである
(xi)配列:配列番号:265:
(2)配列番号:266の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−NH2 2 シトシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2 2 ウラシルである
(xi)配列:配列番号:266:
(2)配列番号:267の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUおよびCは2’−デオキシ−2’−アミノウリジンおよび2’−デオキシ−アミノシチジン残基である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:14位および17位のAは2’−デオキシ−2’−O−メチルアデノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5、6、22、23、24、26および27位のGは2’−デオキシ−2’−O−メチルグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−4位および31−35位のTは2’−デオキシチミジンである
(xi)配列:配列番号:267:
(2)配列番号:268の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:268:
(2)配列番号:269の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:269:
(2)配列番号:270の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:21塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:270:
(2)配列番号:271の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:11塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:271:
(2)配列番号:272の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:272:
(2)配列番号:273の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:47塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:273:
(2)配列番号:274の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:274:
(2)配列番号:275の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:275:
(2)配列番号:276の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:276:
(2)配列番号:277の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:277:
(2)配列番号:278の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:278:
(2)配列番号:279の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:47塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:279:
(2)配列番号:280の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:280:
(2)配列番号:281の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:281:
(2)配列番号:282の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:282:
(2)配列番号:283の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:283:
(2)配列番号:284の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:284:
(2)配列番号:285の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:285:
(2)配列番号:286の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:286:
(2)配列番号:287の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:287:
(2)配列番号:288の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:288:
(2)配列番号:289の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:289:
(2)配列番号:290の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:290:
(2)配列番号:291の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:291:
(2)配列番号:292の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:292:
(2)配列番号:293の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:293:
(2)配列番号:294の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:294:
(2)配列番号:295の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:295:
(2)配列番号:296の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:296:
(2)配列番号:297の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:297:
(2)配列番号:298の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:298:
(2)配列番号:299の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:12塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:299:
(2)配列番号:300の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:300:
(2)配列番号:301の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:301:
(2)配列番号:302の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:302:
(2)配列番号:303の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:303:
(2)配列番号:304の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:304:
Claims (35)
- 以下の配列:
(i) N1G2G3C4N5N6N7
(ii) N’7N’6N’5G4RKYA8Y9Y10
(iii) R10R9T8C3C2N’1
(N1−N’1、N5−N’5、N6−N’6及びN7−N’7はいずれも任意の塩基対であり、RはA又はGであり、YはC又はTであり、KはG又はTであり、G2−C2、G3−C3、C4−G4、A8−T8、Y9−R9及びY10−R10は塩基対である);
又は、以下の配列:
(a) C1A2G3G4C5U6A7C8G9
(b) C10G11T12A13G14A15G16C17A18U19C20A21
(c) T22G23A24T25C26C27U28G29
(C1−G29、A2−U28、G3−C27、G4−C26、C5−G14、U6−A13、A7−T12、C8−G11、G9−C10、A18−T25、U19−A24、C20−G23及びA21−T22は塩基対である)
を含む、血小板由来増殖因子(PDGF)に特異的に結合する核酸リガンドであって、3方向らせんジャンクション2次構造モチーフは、配列(i)、(ii)及び(iii)との間、あるいは配列(a)、(b)及び(c)との間の前記塩基対合により形成される、上記核酸リガンド。 - 前記配列RKYは、AGCである、請求項1又は2に記載の核酸リガンド。
- 前記配列RKYは、GTC、GTT、GGC及びGGTのいずれか1つである、請求項1又は2に記載の核酸リガンド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号175に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号175に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号175に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じPDGFに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号176に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号176に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号176に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じPDGFに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号171に記載の塩基配列を含むか、あるいは、配列番号171に記載の塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ配列番号171に記載の塩基配列を含む核酸リガンドと同じPDGFに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号175又は176に記載の塩基配列を含む核酸リガンドのPDGFへの結合についての解離定数に対して1又は2桁以内の範囲内にあるPDGFへの結合についての解離定数を有する、上記核酸リガンド。
- 請求項1又は2に記載の核酸リガンドであって、該リガンドは、配列番号172〜174のいずれか1つに記載の塩基配列を含むか、あるいは、該塩基配列の中に数個の欠失、置換若しくは付加を有する塩基配列を含み、かつ該塩基配列を含む核酸リガンドと同じPDGFに対する結合特異性を有する、上記核酸リガンド。
- PDGFに特異的に結合し、かつPDGFのPDGF受容体への結合を阻止する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- PDGF−AB及び/又はPDGF−BBの特異的アンタゴニストである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 請求項13に記載の核酸リガンドであって、前記修飾は、該リガンドのインビボ安定性を増加させるか、又は該リガンドの送達を増強若しくは媒介し、かつ糖、リン酸塩及び/又は塩基の位置での化学的置換を含む、上記核酸リガンド。
- デオキシリボ核酸である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 1本鎖である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 精製され単離された、請求項1〜16のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 治療用である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGFは、PDGF−BBダイマーである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGFは、PDGF−ABヘテロダイマーである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGFは、PDGF−AAダイマーである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGF受容体は、ααホモダイマーである、請求項11に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGF受容体は、αβヘテロダイマーである、請求項11に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGF受容体は、ββホモダイマーである、請求項11に記載の核酸リガンド。
- 前記PDGF及びPDGF受容体は、ヒトPDGF及びヒトPDGF受容体である、請求項11に記載の核酸リガンド。
- PDGF媒介疾患の治療のための医薬組成物の製造のための、請求項1〜18のいずれか1項に記載のPDGFに特異的に結合する核酸リガンドの使用。
- 前記疾患は、増殖性疾患である、請求項26に記載の使用。
- 前記疾患は、腫瘍である、請求項27に記載の使用。
- 前記PDGFは、PDGF−BBダイマーである、請求項26〜28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記PDGFは、PDGF−ABヘテロダイマーである、請求項26〜28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記PDGFは、PDGF−AAダイマーである、請求項26〜28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記核酸リガンドはPDGFのPDGF受容体への結合を阻害し、ここで当該PDGF受容体は、ααホモダイマーである、請求項29〜31のいずれか1項に記載の使用。
- 前記核酸リガンドはPDGFのPDGF受容体への結合を阻害し、ここで当該PDGF受容体は、αβヘテロダイマーである、請求項29又は30に記載の使用。
- 前記核酸リガンドはPDGFのPDGF受容体への結合を阻害し、ここで当該PDGF受容体は、ββホモダイマーである、請求項29又は30に記載の使用。
- 前記核酸リガンドはPDGFのPDGF受容体への結合を阻害し、ここで当該PDGF及びPDGF受容体は、ヒトPDGF及びヒトPDGF受容体である、請求項26〜34のいずれか1項に記載の使用。
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