JP4522861B2 - 条件複製起点をもつ環状dna分子、それらの製造方法、及び、遺伝子治療におけるそれらの使用 - Google Patents
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Description
−天然起原または合成起原のサプレッサーtRNAをコードする遺伝子、より好ましくはアンバーコドン(TAG)のサプレッサーtRNAである。
(a)少なくとも1つの変異を標的配列に導入する工程と、
(b)変異した前記標的配列をプラスミドを含む宿主細胞に形質転換するステップにおいて、前記プラスミドはuroIIIメチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記プラスミドのコピー数は前記標的配列の影響を受ける工程と、
(c)宿主細胞の培養物を生成するために前記ヌクレオチド配列を発現するという条件で前記宿主細胞を増殖させる工程と、
(d)前記宿主細胞の培養物に紫外線を照射する工程と、
(e)前記宿主細胞の培養物の蛍光発光を検出する工程と、
を含む方法を提供する。
a)複製起点及び選択マーカー遺伝子と、
b)部位特異的組換えを許可し、直方向で配置される2つの配列と、
c)前記配列b)の間に配置される1つまたは複数の重要な遺伝子と、を含む親プラスミドから生成する。
A)材料
1)培養培地
完全倍地LB、2XTY及びSOC、最小培地M9(Maniatisら,1989)を使用した。15gのGifco寒天の添加によってゲル化した培地を得た。更に、必要な場合には、抗生物質アンピシリンまたはカナマイシンをそれぞれ100mg/l及び50mg/lの濃度で培地に補充した。発色性基質X-Gal及びX-Glucを濃度40mg/lで使用した。
使用した大腸菌株、プラスミド及びバクテリオファージは、それぞれ以下の実施例に特定する。
1)DNAの操作
細菌DNA(プラスミド、ゲノム)及びファージDNA(M13の複製形態)の単離、制限エンドヌクレアーゼによる消化、DNAフラグメントの結合、アガロースゲル電気泳動(TBEバッファ中)及びその他の標準技術は、提供業者による酵素使用に関する指示に従って行うか、または“Molecular Cloning:a Laboratory Manual”(Maniatisら,1989)に記載の手順に従って行った。
配列3 5’-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’
配列4 5’-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3’
配列5 5’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3’
配列6 5’-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3’
50mMのトリス-HCl,pH 7.7、40mMのKCl、1mMのDTT、100μg/mlのBSA、3mMの MgCl2、1mMのEDTA、
DNAトポイソメラーゼIVに対しては:
60mMのトリス-HCl,pH 7.7、6mMのMgCl2、10mMのDTT、100μg/mlのBSA、1.5mMのATP、350mMのグルタミン酸カリウム、
DNAジャイレースに対しては:
50mMのトリス-HCl,pH 7.7、5mMのMgCl2、1.5mMのATP、5mMのDTT、100μg/mlのBSA、20mMのKCl。
大腸菌の形質転換はChung and Miller(1998)によって記載されたTSB(Transformation and Storage Buffer、形質転換及び蓄積バッファ)の方法に従って常法で行った。TG1のような菌株(Gibsonら,1984)の場合、得られる形質転換効率は、1μgのpUC4Kあたり約105-106の形質転換体が得られる割合である(Vieira&Messing; 1982)。より高い形質転換効率が必要な場合には、エレクトロポレーターを製造業者(Biorad)の推薦する手順に従って用いた電気穿孔によって細菌を形質転換した。この方法によれば、1μgのpUC4Kあたり約108-1010の形質転換体が得られる効率を達成し得る。
使用される細胞は、前日に24ウェルのプレートにウェルあたり50,000細胞の密度で播種されたマウス線維芽細胞NIH 3T3である。使用される培養培地は、4.5g/lのブドウ糖を含み10%のウシ胎仔血清及び1%の200mMグルタミン溶液と抗生物質(ストレプトマイシン5×103単位/ml、ペニシリン5×103μg/ml)(Gibco)とを加えたDMEM培地である。プラスミドDNA(25μlの0.9%NaCl中に1μg)を同量のリポフェクタントの懸濁液に混合する。“リポフェクタントの電荷/DNAの電荷”の比が及び9の4つの値である場合を試験する。これらの比は、1μgのプラスミドDNAが3.1nmolの負電荷を有し、リポフェクタントが分子あたり3つの正電荷を含むと考えて計算する。DNA/脂質複合体を形成し得る10分間の接触後に、50μlのDNA-リポフェクタント混合物を無血清培養培地(500μl)中の細胞に導入する。細胞を同じ培地で予め2回精製しておいた。これによって血清によるトランスフェクションの阻害が防止される。インキュベーション(CO2含有インキュベータ内で37℃で2時間)後に、10%のウシ胎仔血清を培地に加える。次いで、細胞を再度24時間インキュベートする。
ルシフェラーゼ活性の測定はトランスフェクションの24時間後に行う。ルシフェラーゼは、ATPとMg2+とO2との存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、これに伴なって光子発生させる。光度計によって測定された反応体(ルシフェラーゼアッセイシステム)をPromegaが勧める手順に従って使用する。細胞溶解後に各抽出物の不溶性画分を遠心分離によって除去する。細胞溶解バッファに希釈するかまたは非希釈の5μlの上清をアッセイに用いる。
この測定は、ニシンコニン酸(Wiechelmanら,1988)を用いるBCA法(Pierce)に従って行う。溶菌バッファ中でBSA標準を作成する(III-B-4参照)。アッセイサンプル及び標準サンプルを同量の0.1Mのヨードアセトアミドを含む0.1Mのトリスバッファ,pH 8.2によって37℃で1時間予備処理する。この処理によれば、アッセイのときに溶菌バッファ中に存在する還元剤(DTT)干渉を防止し得る。562nmでアッセイの読取りを行う。
使用される菌株は、大腸菌XAC-1株である(Normanlyら,1980)である。この菌株の利点は、この菌株のargE遺伝子のグルタミン-53(CAG)がアンバーコドン(TAG)に変異していることである(Meinnelら,1992)。argE遺伝子は、分岐オペロンargECBHに属し、アルギニン生合成酵素、N-アセチルオルチナーゼをコードしている。従って、XAC-1はアルギニンを合成せず、その結果として最小培地中で増殖しない。この菌株がサプレッサーtRNAの発現を許容するプラスミドを含んでいるならば、この栄養要求性は除去されるであろう。従って、最小培地中で培養することによって、このようなプラスミドを保有する細菌を選択することが可能でなる。R6Kに由来のプラスミドを細菌中で複製可能にするためには、相同的組換えによって、pir遺伝子をXAC-1のゲノムに導入することが必要であった。pir遺伝子(野生型または変異変異型)は、野生型uidA遺伝子をpir(またはpir116)遺伝子を割込ませているコピーで置換することによって遺伝子座uidAに導入される。uidA遺伝子はβ-グルクロニドの加水分解酵素であるβ-グルクロニダーゼをコードしている。この遺伝子は、β-グルクロニドが使用されていない従来の合成培地中では増殖に必須ではないため、失活させても問題はない。更に、β-グルクロニダーゼ活性は、加水分解によって青色顔料を放出する発色性基質X-Glucによって追跡できる。
細菌宿主を単独で使用し、有益なゲノムの修飾を最小にする戦略を使用した。ファージM13mp10(Messing&Vieira,1982)を自殺ベクター(Bumら,1989)として使用した。複製に必須の遺伝子II中のアンバー変異は、このM13の宿主スペクトルを、アンバーのサプレッサーtRNAを産生するTG1(supE)のような菌株に限定する。従って、XAC-1のような大腸菌のsup+株中でM13を複製することはできない。
採用した戦略及び関与する種々のイベントを図3に示す。
10、100、または2000ngの各RF(mp10-_uidA::pirまたはpir116)を用いた電気穿孔によってXAC-1株を形質転換した。各発現混合物の3分の1を、カナマイシンを収容したLB容器に平板培養し、37℃で一夜インキュベートしたファージmp10-_uidA::pirまたはpir116はXAC-1(sup+)株中では複製できない。従って、カナマイシン耐性(”KmR”)マーカーは、uidA遺伝子の野生型コピーを用いた相同的組換えを介して細菌のゲノムに組込まれない限り維持されることができない。XAC-1電気穿孔の結果を表1に示す。得られた形質転換効率は、1μgのpUC4Kあたり4×109の形質転換体が得られるという割合であった。
次に第二の組換えイベントを菌株のデオキシコール酸塩耐性(DocR)よって選択する。
二重組換えによって得られた菌株のPir+特性を確認するために、各構築物の3つのクローンをpBW30(Metcalfら,1994)によって形質転換させた。試験した全部の菌株で形質転換体が得られたが、このことは、XAC-1のゲノムに組込まれた遺伝子pir及びpir116が機能したことを示した。同じ条件で、親菌株XAC-1を試験したときには形質転換体は全く得られなかった。2つのXAC-1pirクローン(B及びC)及び2つのXAC1pir116クローン(E及びD)についての試験を継続した。
対立遺伝子置換を確認するために、遺伝子座uidAの両側のゲノム領域をPCR増幅によってコントロールした。各オリゴヌクレオチド対は、pirの内部領域に対応する1つのオリゴヌクレオチドと染色体uidAの近傍にあるが組換えに使用されたフラグメントには含まれていない領域に対応する第二のオリゴヌクレオチドとから構成されていた。この後者のオリゴヌクレオチドの配列は、Genbankの配列ECOUIDAA(アクセス番号:M14641)によって決定された。このようにして、細菌のゲノム中のpir遺伝子の正確な位置を確認できた。予測したサイズに一致するサイズをもつ増幅フラグメントの特性をMluIを用いた消化によって確認した。
R6Kのoriγとカナマイシン耐性遺伝子を含むベクターを構築した(pXL2666)。菌株BW19610(pir116)5(Metcalfら,1993)中でpXL2666のマルチマーが観測されたので、この現象に対するColE1のcerフラグメントの効果を試験した。次に、フェニルアラニンサプレッサー(sup Phe)tRNAの発現カセットをベクターoriγ-KmR-cer(pXL2730)に導入した。このベクターpXL2760は、遺伝子治療に使用可能なベクターを構築するための基材として使用できる。
a)構築物
構築された第一のプラスミドpXL2666中のカナマイシン耐性遺伝子はpUC4K(Vieira&Messing,1982)に由来し、417bpのEcoRI-BamHIフラグメントに含まれている複製起点は自殺ベクターpUT-T7pol(Herreroら,1990)に由来する(図4)。菌株BW19094及び19610(Metcalfら,1994)中へのpXL2666の導入は、プラスミドの量が、菌株pir中の同じプラスミドに比較して菌株pir116中で著しく増加していることを示した。しかしながら、非消化プラスミドを電気泳動によって分析すると、この現象がプラスミドの多数コピー間の分子間組換えに関係している可能性が大きい。また、cis作用によってプラスミドのダイマーを分解できることが証明されていた大腸菌ColE1の天然プラスミドのcerフラグメント(Summers&Sherrat,1984)を、pCL2666にクローニングすることによってpXL2730を構築した。使用したフラグメントは、ColE1の382bpのHpaIIフラグメントに対応する(Leungら,1985)。このフラグメントは、特異的分子間組換え部位を含む。このフラグメントが機能するためには、リコンビナーゼXerC及びXerDと副次的因子ArgR及びPepAとをもつ宿主の蛋白質だけが必要である(Stirlingら,1988,1989,Collomsら,1990)。観察された効果が確かにcerフラグメントによって得られたことを確認するために、cerフラグメントから165bpが欠失した対照プラスミドpXL2754を構成した。この欠失によって、マルチマーの分解に対するcerの作用が消滅することが証明された(Leungら,1985)。これらのプラスミドを構成するための種々のクローニング段階を図4に示す。
(i)アガロースゲル電気泳動による分析
構築した種々のプラスミドの電気泳動分析は、プラスミド種が使用した菌株次第で種々に異なることを証明した。非消化プラスミドのサイズを超コイルDNAマーカーとの比較によって測定した。菌株pir(BW19094)中で、プラスミドpXL2666、2754及び2730は、実質的に完全にモノマー形態である。各主要バンドの上方のバンドは、DNAジャイレースとpXL2730との作用後に観察されたプロフィルによって確認されるように、多少緩和された超コイル構造の種々のトポイソマーに対応する。
対立遺伝子pir116を保有している菌株中で観察された形態が特定のトポイソマーであるという仮説を否定するために、各プラスミド調製物にDNAトポイソメラーゼを作用させた。種々の酵素は実験条件で以下の活性、即ち大腸菌のDNAトポイソメラーゼIはDNAの緩和活性、大腸菌のDNAジャイレースは緩和DNAの負の超コイル形成活性、S. aureusのDNAトポイソメラーゼIVは絡み合ったDNAの解離及び超コイルDNAの緩和活性を有していた。DNAトポイソメラーゼIVの作用は、高分子量のプラスミド形態がプラスミドの複数の分子の絡み合いの結果として生じるのではないことを証明した。この場合にはプラスミドの複数の分子がモノマー種に変換されたと考えられる。絡み合ったDNA分子から成るキネトプラストDNA調製物に対する酵素の機能は確かにコントロールされていた(図示せず)。非処理対照中よりも泳動し難い種が得られるので緩和活性も観察できる。DNAジャイレースの作用によって、多少緩和されたトポイソマーが細菌から抽出された最多の超コイルをもつ種に変換された(主としてモノマーまたはダイマー)。DNAジャイレースの作用によって更に、調製されたDNAが主として超コイル形態であることが確認された。このようにして処理されたサンプルは、各構造物の大部分の種に関しては前述の結果の裏付けとなり得る。DNAトポイソメラーゼIは確かにDNAを緩和したが、この緩和は部分的でしかなかった。その原因は、この酵素に優先的に結合し得る一本鎖領域が実験したプラスミドにほとんど含まれていないからであると考えられる(Roca,1995)。
合成サプレッサーtRNA遺伝子(Phe)の発現カセットを使用した(Kleinaら,1990)。この遺伝子は、TAGコドンに応答してフェニルアラニンを形成することによってポリペプチド鎖に導入される。更に、この遺伝子は、アルギニン欠損培地中で有効に増殖するために十分に活性の蛋白質ArgEをXAC-1中で産生し得る。プラスミドpCT-2-F(Normanly,1986)上で、sup Pheは大腸菌lpp遺伝子のプロモーターPlppの配列に由来の合成プロモーターから構成的に発現される。転写終了は、この遺伝子下流の、大腸菌のオペロンrrnCの合成ターミネーターTrrnC(Normanlyら,1986)によって確保される。種々のクローニング段階を図5に示す。
1)リポーターベクターpXL2774の構築
遺伝子治療におけるプラスミドDNA産生系の有効性を試験するために、真核細胞中で使用可能なリポーター遺伝子をpXL2760に導入した。生物発光の測定試験は極めて好感度で、広い範囲で線形であり、真核細胞の内在活性に起因するバックグラウンドノイズが極めて弱いので、Photinus pyralisのルシフェラーゼをコードする遺伝子lucを使用した。luc遺伝子は高い割合で発現し得るヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子の増幅プロモーター配列(CMVプロモーター)のコントロール下にある。lucの3’位には、ポリアデニル化シグナル(ポリ(A)+)を含むSV40ウイルスに由来の非翻訳領域が存在する。使用できる制限部位の数を増加させる中間クローニング後に、“プロモーターCMV-luc-ポリ(A)+”のカセットを、マーカーKmRの代わりに最小ベクターoriγ-cer-sup Phe(pXL2760)に導入して形質転換した。得られたプラスミドをpXL2774と命名した。種々のクローニング段階を図6にまとめる。結合混合物を電気穿孔によってXAC-1pir116に導入して形質転換した。富化培地(SOC培地)中でインキュベーションを行うことによって細菌に選択マーカーを発現させる。従って、平板培養の前にM9培地で細胞を2回精製する必要があった。これによって、最小培地中の培養のバックグラウンドノイズの原因となる残留培地を除去し得る。
真核細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼを発現させるpXL2774の能力を、マウス線維芽細胞NIH 3T3へのトランスフェクションによって評価する。標準ベクターとしては、pXL2774と同じルシフェラーゼ発現カセットを異なるレプリコンに保有しているプラスミドpXL2622を選択した(このプラスミドはSV40プロモーターがCMVプロモーターによって置換されたPromegaのプラスミドpGL2である)。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を保有している6.2kbのColE1の誘導体である。このプラスミドを対照として使用する。ルシフェラーゼ活性(RLU、相対的発光量で表す)を表3に示す。
pCOR型のR6Kに由来のプラスミドが複製できないという特性を、プラスミドpUC4K(ori ColE1-KmR,(Vieira&Messing,1982))及びpXL2730(R6K-KmRのoriγ、実施例2参照)を大腸菌 JM109(Yanisch-Perronら,1985)に導入する電気穿孔実験で確認した。使用したエレクトロポレーターは、Biorad Gene Pulserであり、エレクトロコンピテント細胞JM109は製造業者の手順に従って調製し使用する(Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual. Catalog number 165-2098)。
5.1 菌株
大腸菌XAC-1pir116株(実施例1)中で最小プラスミドpXL2774を産生させる。このプラスミドは、ori R6K-cer-tRNAamsupPheとCMVプロモーターのコントロール下のlucリポーター遺伝子の発現カセット(実施例3)とをそのエレメントとして含んでいる。高い生産効率でこの種のプラスミドを産生する方法は開発されていた。
a)増殖培地
植込み培養物に対して使用した指定培地の組成:Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 0.5g/l、NH4Cl 1g/l、NH4H2PO4 3g/l、ブドウ糖5g/l、MgSO4 7H2O 0.24g/l、CaCl2 2H2O 0.015g/l、チアミン HCl 0.010g/l
プラスミドDNAの増殖及び産生の最適条件を決定するために、1リットルの培地を収容した2リットルの発酵槽(Setric France)中で試験を行った。定常増殖期の開始に到達した80mlの植込み培養物を発酵槽に播種した。
複合培地中、指定培地中及び種々の増殖率で種々の培養条件を試験した。どの場合にも、細菌株の初期バッチ培養と炭素源の消費の後、プレプログラムした添加計画に接続した蠕動ポンプによって発酵槽に補充培地を添加した。この添加計画は、培地の補充率を溶存酸素率または定常増殖率に従属させた先行実験に基づいて作成した。
−プラスミドは少なくとも50世代は選択圧を生じることなく安定である。
6.1 動物細胞中へのpXL2774のin vitro導入
種々の細胞系にトランスフェクトする最小プラスミドpXL2774の能力をヒト起原の細胞とマウス起原の細胞との双方についてin vitroで試験した。プラスミドPXL2784を対照として使用した。プラスミドpXL2784は、pXL2774と同じ真核細胞発現カセット(CMVプロモーター-ルシフェラーゼ-ポリA)を含むが、この発現カセットは、大腸菌中でカナマイシン耐性を与える遺伝子を含む6.4kbのColE1の誘導体である。
a)モデル1:マウスの前脛骨筋中の裸のDNA
“5%ブドウ糖、150mMのNaCl”中に溶解した裸のプラスミドDNAをOF1マウスの前脛骨筋に注射する。注射の7日後に筋肉を採取し、粉砕し、750μlの溶解バッファ(Promega細胞溶解バッファE153A)中でホモジェナイズし、次いで20,000×gで10分間遠心する。
以下のモデルを使用する。
1)pXL2774がヒト起原またはマウス起原の種々の細胞タイプにin vitroで有効にトランスフェクトする能力を有していること、
2)pXL2774がマウスの筋肉にin vivoでトランスフェクトする能力を有していること、
3)pXL2774がマウスに移植された腫瘍細胞にin vivoでトランスフェクトする能力を有していること、が証明された。
1)pir遺伝子(条件複製起点)を発現しない大腸菌の菌株中では検出可能な状態で複製されないこと、
2)抗生物質非含有の完全指定培地中で工業生産に好適な規模で産生され得ること、
3)in vitro及び特にin vivoで哺乳動物の細胞にトランスフェクトできること、
を示したので、これらのプラスミドが遺伝子治療で使用可能なベクターとして有効であることが証明された。
7.1 発現ベクターの構築
このような方法の実用化適性を証明するために、前述の基準(実施例2及び3)に従って発現ベクターを構築した。このベクターpXL3056は、
1)条件複製起点(oriγ)とColE1のcerフラグメントと細菌中の選択を確保する遺伝子(sup)とを含む細菌性部分と、
2)Studierによって記載された系(Studierら,1990)を基材とし、T7バクテリオファージの遺伝子10のプロモーターとlacOオペレーターとaFGF154(酸性線維芽細胞増殖因子、154個のアミノ酸から成る形態)(Jayeら,1986)、T7バクテリオファージのターミネーターTFとを含む発現カセットと、
を含んでいる。この発現カセットは、国際特許出願WO96/08572に記載されているプラスミドpXL2434上に存在する発現カセットと同じである。
プラスミドpXL3056を形質転換によって菌株XAC-1pir116に導入する。得られた菌株を次にプラスミドPT7pol23(Mertensら,1995)によって30℃で形質転換する。T7プロモーターのコントロール下で有益な遺伝子を発現させるために、細菌は、プラスミド上またはバクテリオファージ上でT7バクテリオファージのRNAポリメラーゼを発現させ得るカセットをそのゲノムに含んでいなければならない。記載の実施例では、pXL3056のようなR6Kの誘導体に和合性でT7バクテリオファージのRNAポリメラーゼの温度によって誘導発現され得るプラスミドPT7pol23を使用した。しかしながら、プラスミドだけを保存し温度でなくIPTGによってT7のRNAポリメラーゼの産生を誘発するために、菌株XAC-1pir116をラムダDE3(Studierら,1990)によって溶原化してもよい。
0.2%のカザミノ酸(DIFCO)とカナマイシン(25μg/ml)とを加えたM9最小培地中で、600nmの光学密度が0.6〜1.0になるまで菌株XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)を30℃で培養する。次いで、培養物の半量を42℃に加熱し(T7のRNAポリメラーゼの誘発)、残りの半量を30℃に維持する(陰性対照)。T7のRNAポリメラーゼの非存在下のaFGFの発現対照を構成する菌株XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)を用いて同じ実験を行う。
この実施例は、p53蛋白質をコードする核酸を含む本発明の条件複製型ベクターの構築について記載する。これらのベクターは、特に腫瘍細胞のような欠陥細胞(変異、欠失)中のp53型の活性を回復するために有用である。
2a)PCTフランス特許出願96/01111に記載の野生型p53蛋白質またはp53変異体をコードする核酸(V325変異体=ATGを含むKozak配列をもつV325)、
2b)Jaye M.(Sciences1986; 233(4763):451)、米国特許4,686,113及び欧州特許259475に記載のヒトFGFaまたはFGF-1をコードする核酸
2c)ヒト線維芽細胞のインターフェロン分泌シグナル(Taniguchiら)と、アミノ酸21〜154までの天然発生の切頂型ヒトFGF-1(Jayeら、及び米国特許5,849,538に記載)との融合遺伝子をコードする核酸
3)SV40のポリAポリアデニル化配列
これらのエレメントは、フラグメントAscI-XbaIの形態でpCORベクターのpXL2988のBssHII部位とSpeI部位との間に配置した。pXL2988は、ガンマ複製起点に隣接の17個のトリヌクレオチドGAAから成り、DNAの三重らせんを形成し得る配列を追加エレメントとして有していることを除けば、pXL2979(実施例7.1)に等しい。
大腸菌XAC-1pir116は、proB+lacI373lacZu118amを含有する約100kbの環状DNA分子F’エピソームを含む。多くのオス大腸菌実験菌株は、それらのエピソームにtraD36変異を含むが、XAC-1に関してF’転写の機能に影響を与える変異は記載されていない。遺伝子traDはtra(転写)オペロンの1つの5’遺伝子座にあり、DNA転写及びDNA代謝に直接関与する細胞質膜の蛋白質をコードする(Frostら,BBRC,1994,58:162-210)。遺伝子の92%を占めるtraDの2kbの中心フラグメントを、XAC-1pir116 endA-中の相同的組換えによってpHP45Ω(Prentki&Krisch,1984,Gene,29:303-313)の2kbのオメガエレメント(Genbankアクセス番号:M60473)に交換した。オメガエレメントは短い逆方向反復によってフランクされた抗生物質耐性遺伝子aadAを含む。遺伝子aadAはアミノグリコシド-3アデニルトランスフェラーゼをコードし、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンに対する耐性を与える(“SpR”)。オメガフラグメントはRNAと蛋白質の合成を早期に終了させてtraDオペロン全体を不活性にするため、実験に使用した。この新たなpCOR株XAC-1pir116 endA- traD::SpRをTEX1とする。ドナーがTEX1の場合には、任意の残留プラスミドpCORまたはpUCの転写は検出されなかった。
1)カセット“KmR-uidA:pir116;pir42”を保有している自殺ベクターの構築
実施例1に記載のM13wm33のカセットKmR-uidA:pir116(Metcalf Wら,Gene,1994,138(1-2):p.1-7)を、PCR(QuickChange部位特定的変異誘発キット,Stratagene,La Jolla CA)を用いた部位特定的変異誘発によって修飾し、pir42変異をpir116遺伝子に導入した。異なるクローニング/変異誘発段階を図13に示す。
5’-G TAT ATG GCG CTT GCT CTC ATC GAT AGC AAA GAA CC-3’
pir42 ClaI
アンチセンス・オリゴヌクレオチド番号11077(配列8)
5’-GG TTC TTT GCT ATC GAT GAG AGC AAG CGC CAT ATA C-3’
ClaI pir42
プライマー11089(配列10):5’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’
pCORプラスミドをTEX1及びTEX1pir42に形質転換し、2mlの選択M9培地で一夜増殖した。その後、Wizard SV plus miniprepsキット(Promega)を使用してプラスミドDNAを抽出し、双方の株中の相対プラスミドコピー数及びpCORプラスミドのトポロジーを評価した。
1)TEX1cop21の構築
実施例10に記載のTEX1pir42の場合と同様にTEX1cop21株を構築した。有向変異誘導によってcop21をpir116遺伝子に導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
5’-CG CAA TTG TTA ACG TCC AGC TTA CGC TTA AGT AGC C-3’
cop21
アンチセンス・オリゴヌクレオチド:11154(配列12)
5’-G GCT ACT TAA GCG TAA GCT GGA CGT TAA CAA TTG CG-3’
2.5kb KmRのpCORベクター(実施例7.1参照)であるpCL2979を含む種々のpCORプラスミドによってTEX1cop21を形質転換し、増加したコピー数をゲル電気泳動によって試験した。pXL2979を用いた実験を図17に示す。Promegaミニプレップキットで処理した各菌株の4つの独立クローンのプラスミドDNAをEcoRIによって直鎖化し、アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。各サンプルを600nmの光学濃度で測定した結果、類似した細菌量を示した。大腸菌TEX1cop21、XAC1pir、及びTEX1中で産生されたpCORのプラスミドpXL2979に対するアガロースゲル電気泳動の結果を図17に示す。この結果から、プラスミドがTEX1cop21株中で産生される場合、TEX1株の場合と比較してプラスミドのコピー数が増加しないことが明らかとなる。
先ず、TEX1のrecA - 誘導体を構築した。その後、pir42変異を結果として得られた株TEX2に導入してTEX2pir42を産生した。
5’に3つの翻訳終了コドン(各フレームに1つ)を含む欠失recA遺伝子をPCRによって得る。この欠失recA遺伝子を遺伝子置換(Blumら,J.Bacteriol,1989,171,pp.538-46)によってTEX1のゲノムに導入する。相同的組換えに使用する自殺ベクターの構築を図18に示す。recAフラグメントの増幅に使用したPCRプライマーを以下の表6に示す。
実施例10に記載の戦略に従って、TEX2pir42株を、二重相同組換えによって構築した。例外として、TEX2中の組換えは、相同組換えに必要なrecA+表現型を維持するために、大腸菌recA変異を補足する非相同性のrecA遺伝子を保有するプラスミドの存在下で実施した。
1)実験室規模のプラスミド生産の評価
TEX2pir42をpCORプラスミドpXL3179(2.4kb)で形質転換した。実験室規模のTEX1pir42中のpXL3179の産生について、その安定性(世代数)に加えて、プラスミドのコピー数を増加させる再現性及び培養条件について集中的に試験した。すべての試験において、プラスミドのコピー数は同じ条件下のTEX1中のpXL3179産生と比較して2〜5倍に増加した。比較実験として、TEX2pir42、TEX1pir42、及びTEX1中のpXL3179産生についてもプラスミドのコピー数を評価した。この実験では、600nmの光学濃度に基づいてプラスミドを同一の細菌バイオマスから抽出し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。このゲルは、電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色した。図20に示すアガロースゲル電気泳動は、高コピー数のプラスミドがTEX2pir42中で産生されること、また好ましくはTEX1pir42ではなくTEX2pir42中で産生された場合に、プラスミドマルチマーが減少することを明示している。
大規模の7リットル発酵槽中で得られた結果を以下に記載する。
接種培養物に対して使用した培地の組成:Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 0.5g/l、NH4Cl 1g/l、NH4H2PO4 3g/l、ブドウ糖5g/l、MgSO4 7H2O 0.24g/l、CaCl2 2H2O 0.015g/l、チアミン HCl 0.010g/l
3リットルのバッチ仕込み培地を含む7リットルの発酵槽を、1.2%の接種培養で食菌した。接種培養は以下のように生成した。2リットルフラスコに250mlの接種培地を入れ、大腸菌株TEX2pir42(pXL3179)の凍結細胞懸濁液0.25mlでインキュベートした。
最適条件下で大腸菌TEX1(pXL3179)を用いた100リットル発酵槽での産生と比較して最終結果を表10に示す。
細菌宿主細胞においてpCORプラスミドのコピー数を増加させるために、発明者らはpir遺伝子の多コピー変異バージョンをコードする遺伝子pir116を変異誘発した。これまでのところ、pCORの実施例のようなR6Kに由来するプラスミドのコピー数を増加させる変異はすべて、pir遺伝子内で検出されている。
↓
2200クローンを試験
↓
24候補
↓
そのうち16クローンについて、そのプラスミドコピー数、トポロジー、pir*(ゲル)の配列を確認及び評価
↓
更に研究を進めるための上位3クローンを選択
1. 自殺ベクター
大腸菌中の二重相同組換えによる遺伝子置換には自殺ベクターを使用する必要がある。これらのベクターは独自に複製可能な宿主中で構築及び産生され、その後独自に複製できない宿主のクロモソームへの組換えに使用される。
異なるマーカーを使用して、第二の組換えイベントを生じている細菌を選択した。このイベントによって、このマーカーは喪失し、クロモソームと自殺ベクターとの組換え後に遺伝子置換が行われることもある。例えば、BacillusのSacB遺伝子は、遺伝子を発現する細菌をスクロースを含む培地で培養する場合に致死である(Ried, J.L.&A. Collmer,Gene 57:239-46(1987))。別の実施例としては、テトラサイクリン耐性遺伝子はフザリン酸に対する感性を与える(Bochner, B.R.ら,J Bacteriol.,143(2):926-3(1980))。バクテリオファージM13による感染は、洗浄デオキシコールに対する感性を与える(Blum, P.ら,J Bacteriol.,171:538-46(1989))。
構築する小環ベクターのサイズを短縮するために、依然としてデオキシコールに対する感性を与える(Boeke, J.D.ら,Mol Gen Genet 186:185-92(1982))欠失型遺伝子III(遺伝子III’)を選択した。M13mp18独自のプロモーター(Yanisch-Perron, C.J. Vieiraら,Gene 33:103-19(1985))をBglII-XhoIフラグメントとして使用して、PCRで増幅した(図29参照)。
BglII
C19520:5’-CCGCTCGAGTTACGATTGGCCTTGATATTCACAAAC-3’(配列26)
XhoI
この自殺ベクターは複製起点を含まないため、小環プラスミドを一般的な自殺ベクターとして使用し得る。このため、カナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを追加して、第一相同的組換えイベントを選択しなければならない。第二の組換えイベントを生じなかった細菌に対する対抗を選択するために、遺伝子III’を小環ベクターに追加した。組換え用の小環を生成するために使用したプラスミドの構築を図29に示す。プラスミド上でattPとattBを組換える細菌のラムダインテグラーゼを挿入した後、pXL4235のようなプラスミドから小環を生成する(Darquet, A.M.ら,Gene Ther 4(12):1341-9(1997))。この組換えは米国特許出願09/981,803に記載の大腸菌株G6264中で、アラビノース依存様態のPBAD制御下で発現する。結果として得られた小環は、attL、精製配列を形成するTH(三重らせん)、選択マーカーTn903カナマイシン耐性遺伝子、対抗選択マーカー遺伝子III’、及びpXL4235の複数クローニング部位で複製された相同的組換えに重要なフラグメントを含む(図29)。
菌株を構築する組換え段階及び対応する表現型を図31に示す。
Seq11089:5’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’(配列28)
Seq6112:5’-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’(配列29)
Seq6113:5’-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3’(配列30)
Seq6115:5’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3’ (配列31)
Seq6116:5’-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3’ (配列32)
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Claims (16)
- pi蛋白質をコードする非相同性のpir遺伝子と、非相同性の治療用遺伝子及び条件複製起点を含有する染色体外DNA分子とを含む原核生物組換え体の宿主細胞であって、
原核生物組換え体の宿主細胞中での前記条件複製起点の機能にはpi蛋白質が必要であり、非相同性のpir遺伝子はpir116変異に加えて少なくとも1つの変異を含み、前記更なる変異は、pi蛋白質の130位をバリンとする変異である、前記原核生物組換え体の宿主細胞。 - pi蛋白質をコードする非相同性のpir遺伝子と、非相同性の治療用遺伝子及び条件複製起点を含有する染色体外DNA分子とを含む原核生物組換え体の宿主細胞であって、
原核生物組換え体の宿主細胞中での前記条件複製起点の機能にはpi蛋白質が必要であり、非相同性のpir遺伝子はpir116変異に加えて少なくとも1つの変異を含み、前記更なる変異は、pi蛋白質の292位をメチオニンとする変異である、前記原核生物組換え体の宿主細胞。 - pi蛋白質をコードする非相同性のpir遺伝子と、非相同性の治療用遺伝子及び条件複製起点を含有する染色体外DNA分子とを含む原核生物組換え体の宿主細胞であって、
原核生物組換え体の宿主細胞中での前記条件複製起点の機能にはpi蛋白質が必要であり、非相同性のpir遺伝子はpir116変異に加えて少なくとも1つの変異を含み、前記更なる変異は、pi蛋白質の117位をグリシンとする変異である、前記原核生物組換え体の宿主細胞。 - 前記非相同性pir遺伝子がプラスミドに存在する、請求項1から3のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記非相同性pir遺伝子が前記宿主細胞のゲノムに存在する、請求項1から3のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記条件複製起点が細菌プラスミドまたはバクテリオファージ由来である、請求項1から5のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記条件複製起点がR2K、R6K、R1、pSC101、Rts1、F、RSF1010、P1、P4、ラムダ、ファイ82またはファイ80由来である、請求項6に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記条件複製起点が細菌プラスミドR6K由来である、請求項7に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記条件複製起点が配列番号1の核酸配列を含む、請求項8に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記プラスミドがさらに抗生物質に耐性を与えない選択的遺伝子を含む、請求項6から9のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記選択的遺伝子が特定のコドンに対するサプレッサーtRNAをコードする、請求項10に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がendA遺伝子欠損型である、請求項1から11のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がtraD遺伝子欠損型である、請求項1から12のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がさらに変異recA遺伝子を含む、請求項1から13のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、Collection Nationale De Cultures de Micro−organismes(CNCM)にアクセス番号I−3109として寄託されている株である、請求項1から3のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞。
- 非相同性の治療用遺伝子と条件複製起点とを含むプラスミドを産生する方法であって、
原核生物の宿主細胞中での該条件複製起点の機能には前記宿主細胞に外来の複製開始蛋白質が必要であり、
(a)プラスミドが産生される条件下において、請求項1から15のいずれか1項に記載の原核生物組換え体の宿主細胞を培養すること;および
(b)プラスミドを分離すること、
を含む前記プラスミドを産生する方法。
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