JP4509007B2 - エマメクチンおよびその類似化合物に対する抗体の製造方法、抗体、ハイブリドーマ、その免疫学的測定方法および測定キット - Google Patents
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ここで、エマメクチンとは、エマメクチンB1aとエマメクチンB1bの混合物をいい、
エマメクチンB1aとは、化学名『(10E,14E,16E,22Z)−(1R,4S,5’S,6S,6’R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)−6’−[(S)−sec−ブチル]−21,24−ヒドロキシ−5’,11,13,22-テトラメチル−2−オキソ−3,7,19−トリオキサテトラシクロ[15,6,1,14,8,020,24]ペンタコサ−10,14,16,22−テトラエン−6−スピロ−2’−(5’,6’−ジヒドロ−2’H−ピラン)−12−イル 2,6−ジデオキシ−3−O−メチル−4−O−(2,4,6−トリデオキシ−3−O−メチル−4−メチルアミノ−α−L−リキソ−ヘキソピラノシル)−α−L−アラビノ−ヘキソピラノシド』と表される物質をいい、
エマメクチンB1bとは、化学名『(10E,14E,16E,22Z)−(1R,4S,5’S,6S,6’R,8R,12S,13S,20R,21R,24S)−21,24−ヒドロキシ−6’−イソプロピル−5’,11,13,22−テトラメチル−2−オキソ−3,7,19−トリオキサテトラシクロ[15,6,1,14,8,020,24]ペンタコサ−10,14,16,22−テトラエン−6−スピロ−2’−(5’,6’−ジヒドロ−2’H−ピラン)−12−イル 2,6−ジデオキシ−3−O−メチル−4−O−(2,4,6−トリデオキシ−3−O−メチル−4−メチルアミノ−α−L−リキソ−ヘキソピラノシル)−α−L−アラビノ−ヘキソピラノシド』と表される物質をいう。
で表される構造を有する16員環マクロライド系殺虫剤で、害虫の神経系に作用し速やかに殺虫効果を発揮して食害を抑制する。ミナミキイロアザミウマ,チャノキイロアザミウマ等のアザミウマ目害虫,シンクイムシ類,チャノホソガ,キンモンホソガ,ギンモンハモグリガ,モモハモグリガ,ミカンハモグリガ等の鱗翅目害虫,更にはマメハモグリバエ等の双翅目害虫やハダニ類などの幅広い害虫に低薬量で卓効を示し、既存薬剤に抵抗性を示す害虫に対しても優れた効果を示す作物に対して安全性の高い化合物である。
で表されるエマメクチンの代謝生成物(以後、R1:−NH2をアミノ体、−NHCHOをホルミルアミノ体、−N(CH3)CHOをN−メチルホルミルアミノ体と称する)はその化学構造がエマメクチンに非常に類似していることから、エマメクチンの糖鎖の末端部分のアミノ基の部分にリンカーを導入したハプテン由来の抗体を作製した場合、その抗体はエマメクチンのみならずその代謝生成物に対しても高い反応性が期待でき、エマメクチンとその代謝生成物を同時に測定できる可能性が高い。
で表わされる構造を有する化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることによるエマメクチンに対する抗体の製造方法である(請求項1)。
で表わされる構造を有する化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることによるエマメクチンに対する抗体の製造方法を提供する。該製造方法は、エマメクチンおよびその類似化合物の製造方法として好適に使用される。
で示す方法は、高収率で化合物を得ることから好適に用いられる。
詳細な合成方法は、実施例に記載する。
用いる担体は、96穴、48穴、192穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常0.01μg/mLから100μg/mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
ブロッキング剤としては、BSAもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース(大日本製薬社製)等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約4℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記(1)と同じ緩衝液を使用することができる。
酵素結合ハプテンの調製は、エマメクチン誘導体を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
エマメクチンおよびその類似化合物と酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約25℃で約1時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。
固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のエマメクチンおよびその類似化合物の量を決定する。
標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンまたはo−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約10分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、450nmの吸光度を測定する。o−フェニレンジアミンを使用する場合、492nmの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、630nmの吸光度も同時に測定することが望ましい。
標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばp−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、NaOH溶液を加えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を測定する方法が挙げられる。
エマメクチンおよびその類似化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して、エマメクチンおよびその類似化合物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のエマメクチンおよびその類似化合物を添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のエマメクチンおよびその類似化合物の濃度を算出することができる。
用いる担体は、通常のELISAに用いる担体であれば特に制限されないが、96穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常0.01μg/mLから100μg/mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
反応は、通常室温、1〜2時間程度で行うことができる。
エマメクチンおよびその類似化合物は、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、エマメクチンおよびその類似化合物を溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、ジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミドなどが挙げられ、含有量は5〜50重量%程度である。
固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体(マウス抗体を認識する抗体)を添加して測定することができる。例えばエマメクチンおよびその類似化合物に対する抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識(例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等)した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したエマメクチンおよびその類似化合物に対する抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記(3)と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
例えば、測定対象物が土壌または食品の場合、エマメクチンおよびその類似化合物が抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノールに転溶させて緩衝液で希釈後、測定試料にする。簡便法として、メタノールで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。具体的には、例えば試料5gに、メタノール5mLを加えて20分間振とうする。室温で30分間静置した後、抽出物の上層2mLを2500Rpmで10分間遠心分離する。上清を蒸留水で1:4に希釈し、これを前記工程(3)に供する。
また、測定対象物が環境水の場合、抽出工程を必要とせず、直接測定試料とすることが可能である。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
20mLのシュレンクチューブにエマメクチン30mg(0.034mmol)、コハク酸6.0mg(0.051mmol)および4−ジメチルアミノピリジン4.0mg(0.034mmol)を入れ、アルゴン置換した。さらに窒素気流下にて塩化メチレンを2mL加え、アイスバスにて0℃に冷却した。次にジシクロヘキシルカルボジイミド14.0mg(0.068mmol)を加えて室温にて12時間攪拌した。得られた反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=10/1)で単離精製し、8.0mgの無色透明粘稠液体の生成物を得た。
免疫原として、スカシ貝へモシアニン(KLH)と本発明エマメクチンハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
実施例1で製造した4”−epi−[N−(4−カルボキシプロピオニル)−N−メチルアミノ]−4”−デオキシアベルメクチンB1a/B1b (エマメクチンハプテン)1.5mg、N−ヒドロキシスクシンイミド1.2mgおよび1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩1.9mgを、N,N−ジメチルホルムアミド200μLに溶解し、この溶液を25℃の暗所に1.5時間放置しエマメクチンハプテン溶液とした。
別途、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.0)1mLにKLHを10mg加え、一晩攪拌することにより、KLH溶液を得た。
このKLH溶液に、先に調製したエマメクチンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で1.5時間攪拌した。反応終了後、4℃で2日間生理的リン酸緩衝液(PBS、10mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH7.0)に対して透析した後、−40℃で貯蔵した。このようにして得られたエマメクチンハプテンとKLHとの結合体を免疫原として使用した。
固相化抗原としてウシ血清アルブミン(BSA)とエマメクチンハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
エマメクチンハプテン1.5mg、N−ヒドロキシスクシンイミド1.2mgおよび1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩1.9mgを、N,N−ジメチルホルムアミド200μLに溶解し、この溶液を25℃の暗所に1.5時間放置しエマメクチンハプテン溶液とした。
別途、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.0)1mLにBSAを10mg加え、一晩攪拌することにより、BSA溶液を得た。
このBSA溶液に、先に調製したエマメクチンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で1.5時間攪拌した。反応終了後、4℃で一晩PBS緩衝液(PBS、10mMリン酸緩衝液、150mM NaCl.pH7.0)に対して透析した後、30℃で貯蔵した。このようにして得られたエマメクチンハプテンとBSAとの結合体を固相化抗原として使用した。
実施例2で調製した免疫原を2mg/mLとなるようにPBS緩衝液(0.4%BSA、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(以下「NaPB」という)、150mM NaCl、pH7.0)に溶解し、これに等量の完全アジュバント(商品名:フロイント完全アジュバント;FCA)を等量混合しエマルジョン化し、その100μLを7週齢のメスのBALB/cマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント(商品名:フロイント不完全アジュバント;FICA)を等量混合し、2週間後に追加免疫した。更に0.25mg/mLの免疫原を不完全アジュバントと等量混合し、その100μLを2週間毎に追加免疫した。4回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価とエマメクチンに対する阻害を間接競合法で確認した。
(1)4回の免疫から1週間後に、マウスの眼底から採血し、血清部分を10%ブロックエース−PBS緩衝液で100倍希釈し抗血清希釈液とした。
(2)実施例3で調製した固相化抗原をPBS緩衝液で5.0μg/mLに調製し、96穴マイクロプレートに100μL/ウェルずつ分注、4℃で一晩静置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、25%ブロックエース−PBS緩衝液を300μg/ウェル分注、4℃で一晩静置することによりブロッキングを行い固相化プレートとした。
(3)抗血清希釈液を10%ブロックエース−PBS緩衝液で順次希釈し、固相化プレートに100μL/ウェルずつ分注、20℃で1時間静置反応させた後、プレートを洗浄した。
(4)ブロックエースで4000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウスIgGヤギ抗体(第2抗体)の10%PBS溶液を100μL/ウェル加え、室温℃で1時間静置した後、プレートを洗浄した。
(5)HRP基質溶液(100μg/mLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジンおよび0.006%過酸化水素を添加した0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5))を100μL/ウェル加え、25℃で10分間反応、発色させた。1N硫酸を100μL/ウェル加えて酵素反応を止め、450nmの吸光度を測定した。最終希釈倍数が800倍で約1.0の吸光度を示す2匹のマウス(No1、No2)の抗血清について、以下のようにしてエマメクチンに対する阻害試験を行った。
(6)0.2%BSA−PBS緩衝液で400倍に希釈した抗血清溶液と10%ブロックエースBSA−PBS緩衝液で希釈した各種濃度のエマメクチン標準液を等量混合し、固相化プレートに100μL/ウェルずつ分注して、25℃に1時間静置反応させた。
(7)以後の操作は(4)、(5)と同様に行った。抗血清の間接阻害試験結果を図1に示す。
十分に力価が高くなったことを確認し、1週間後に最終免疫として免疫原10μg/100μL・PBSを尾静脈から投与した。その3日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
摘出した脾臓を無血清DMEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために5分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、1500rpmで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清DMEMを添加して細胞を浮遊させた。この操作を2回繰り返した。
あらかじめ培養してあったミエローマ細胞(P3X63Ag8.653)を回収し、遠沈、上清除去、無血清DMEM培地で再浮遊を2回繰り返した。
それぞれの細胞数を計数して脾細胞とミエローマ細胞との比率が10:1〜7.5:1になるように混合し、1500rpmで5分間遠心して、上清を吸引除去した。
遠沈管を激しく攪拌しながら50%ポリエチレングリコール(分子量1500)溶液2mLを約60秒かけて添加した。次いで約10mLの無血清DMEMを攪拌しながら3〜4分かけて添加した。
遠沈管を1000rpm,5分で遠心して上清を完全に吸引除去し、脾細胞が2.5×106個/mLになるようにHT培地(ヒポキサンチン、チミジン、10%牛胎児血清入DMEM培地)に浮遊させ、96穴培養プレートに100μL/ウェル分注し、37℃、8%炭酸ガス、加湿条件下で培養を開始した。
翌日に約40μL/ウェルのHAT培地(ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、10%牛胎児血清入DMEM培地)を添加し、ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマ細胞のコロニーが形成されるまで観察を続け、以後は細胞の状態を見ながらHT培地を添加した。
培養開始から10日後に培養液を採取し、間接競合阻害法でエマメクチンに対する抗体を産生しているウェルを選別し、96ウェル、48ウェル、24ウェルと順次培養スケールを上げた。
24ウェルの段階で限界希釈法によるクローニングを行い、エマメクチンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株 [EMT2−17H7−2]を得た。
実施例6で得られたハイブリドーマ株を10%牛胎児血清入りDMEMで培養し、約2×107個の細胞をBALB/cメスマウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。
得られた腹水はプロテインG カラムによりIgG精製を行い、抗エマメクチン抗体MET2−17H7−2を得た。
直接競合ELISAにおいてトレーサーとして用いるため、活性エステル法によりエマメクチンハプテンとHRPとの結合体を調製した。エマメクチンハプテン1.5mg、N−ヒドロキシスクシンイミド1.2mgおよび1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩1.9mgを、N,N−ジメチルホルムアミド200μLに溶解し、この溶液を25℃の暗所に1.5時間放置しエマメクチンハプテン溶液とした。
別途、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.0)1mLにHRPを10mg加え、一晩攪拌することにより、HRP溶液を得た。
このHRP溶液に、先に調製したエマメクチンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で1.5時間攪拌した。反応終了後、4℃で一晩生理的リン酸緩衝液(PBS、10mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH7.0)に対して透析した後、30℃で貯蔵した。ゲル濾過で精製を行い、濃度の測定はDCプロテインアッセイで行った。
(1)抗マウスIgGヤギ抗体をPBS緩衝液(10mM NaPB,150mM NaCl)で10μg/mLに希釈し、96穴マイクロプレートに100μg/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、PBS緩衝液(0.4%BSA、10mM NaPB、150mM NaCl、pH7.0)を300μg/ウェル分注し、4℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
(2)実施例7で得られたモノクローナル抗体EMT2−17H7−2をPBS緩衝液(0.2%BSA、10mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH7.0)で0.05μg/mLに希釈し、(1)で作製した抗マウスIgGヤギ抗体固相化プレートに100μg/ウェルずつ分注し、20℃で1時間静置した後、PBSで洗浄し抗体固相化プレートとした。
(3)HRPとエマメクチンハプテンの結合体をPBS緩衝液(0.4%BSA、10mMリン酸緩衝液、150mM NaCl、pH7.0)で0.12μg/mLに希釈しHRP希釈液とした。
(4)上記HRP希釈液と10%メタノール溶液に溶解したエマメクチンの標準溶液(0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5および10μg/mL)を等量混合し、その混合液の100μg/ウェルを(2)で得られた抗体固相化プレートに加え、20℃で1時間静置した後、PBSで洗浄した。
(5)HRP基質溶液(100μg/mLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジンおよび0.006%過酸化水素を添加した0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5))100μLをウェルに加え、25℃で10分間インキュベーションした後、1N硫酸100μLをウェルに加えて酵素反応を止め、450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
モノクローナル抗体EMT2−17H7−2溶液についての直接競合阻害法によるエマメクチンの標準阻害曲線を図2に示す。モノクローナル抗体EMT2−17H7−2溶液を用いた直接競合ELISA法によるエマメクチンの測定可能な範囲は0.25ng/mL〜3ng/mLであり、50%阻害を示す値(IC50値)は0.7ng/mLであった。
エマメクチンと化学構造が類似している農薬および代謝物、および抗生物質農薬について抗体EMT2−17H7−2の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例9に記載の方法と同様にして試験化合物のIC50値を求め、次式により計算し交差反応率を算出した。
交差反応率(%)=(エマメクチンのIC50値/試験化合物のIC50値)×100
その結果、殺ダニ剤アバメクチン〔化5〕(日本未登録)、エマメクチン代謝物のアミノ体、ホルミルアミノ体、N−メチルホルミルアミノ体に対しては高い交差反応性を示したのに対し、ミルベメクチン〔化6〕、スピノサド、ストレプトマイシンに対しいずれも交差反応性は0.1%以下であり、抗体EMT2−17H7−2はエマメクチン、その類縁体のアバメクチンおよび代謝生成物のアミノ体、ホルミルアミノ体、N−メチルホルミルアミノ体に特異的な抗体と云える。
抗体EMT2−17H7−2を用いた直接競合ELISA法におけるエマメクチン代謝生成物(アミノ体、ホルミルアミノ体、N−メチルホルミルアミノ体)、アバメクチンに対する交差反応性を、表1に示す。
Claims (9)
- 前記高分子化合物が、KLHである、請求項1に記載の製造方法。
- 請求項1または2に記載の製造方法にて得られるエマメクチン、アミノ体エマメクチン、ホルミルアミノ体エマメクチン、およびN−メチルホルミルアミノエマメクチンに対する抗体または抗原と結合可能なそのフラグメント。
- エマメクチン、アミノ体エマメクチン、ホルミルアミノ体エマメクチン、およびN−メチルホルミルアミノエマメクチンに対する抗体またはそのフラグメントがポリクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいはモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項3に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 請求項3または4記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- ハイブリドーマがEMT2−17H7−2(FERM P−20667)である、請求項5記載のハイブリドーマ。
- EMT2−17H7−2(FERM P−20667)で表示されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
- 請求項3、4、または7記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなるエマメクチンおよびその類似化合物の免疫学的測定方法。
- 請求項3、4、または7記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなるエマメクチンおよびその類似化合物の測定キット。
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