JP4492140B2 - Biochip substrate and biochip - Google Patents
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本発明は、射出成形による作成が容易であり、特殊な処理を要することなく、表面に生体分子を固定することができ、さらには、耐熱性に優れたバイオチップ用基板およびバイオチップに関するものである。 The present invention relates to a biochip substrate and a biochip that can be easily produced by injection molding, can immobilize biomolecules on the surface without requiring special treatment, and are excellent in heat resistance. is there.
従来より、微量試料の分析・検出にはキャピラリーガスクロマトグラフィーやキャピラリー液体クロマトグラフィー等で分離し、質量分析計で検出するＧＣＭＳやＬＣＭＳが使用されてきた。しかし、ＧＣＭＳやＬＣＭＳは質量分析計が大きく、患者のベッドサイドや、汚染河川、廃棄物処理場近辺等の測定現場において、用いるには困難が伴う。また、医療診断用途では、血液等の患者由来の検体への接触が問題となることから、このような場合の設備は、感染性廃棄物の対象となり、基本的にディスポーザブルとすることが求められている。 Conventionally, GCMS and LCMS, which are separated by capillary gas chromatography or capillary liquid chromatography and detected by a mass spectrometer, have been used for analysis and detection of a small amount of sample. However, GCMS and LCMS have large mass spectrometers, and are difficult to use at measurement sites such as patient bedsides, contaminated rivers, and near waste disposal sites. In medical diagnostic applications, contact with patient-derived specimens such as blood is a problem, so facilities in such cases are subject to infectious waste and are basically required to be disposable. ing.
以上の問題点を解決するために、１０センチから数センチ角程度以下のガラス等のチップ（マイクロチップ）の表面に微細な溝を刻み、その溝における分離・反応を利用して微量試料の分析を行うｍｉｃｒｏ（ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ） ｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（μＴＡＳ）の研究が行われている。μＴＡＳでは、検体量、検出に必要な試薬量、検出に用いた消耗品等の廃棄物量、廃液の量等がいずれも少なくなる上、検出に必要な時間もおおむね短時間ですむという利点がある。 In order to solve the above problems, a minute groove is formed on the surface of a chip (microchip) such as a glass having a size of about 10 cm to several centimeters, and analysis of a small amount of sample is performed using separation / reaction in the groove. A micro (miniaturized) total analysis system (μTAS) has been studied. μTAS has the advantage that the amount of sample, the amount of reagent necessary for detection, the amount of waste such as consumables used for detection, the amount of waste liquid, etc. are all reduced, and the time required for detection can be reduced to a short time. .
また、その他のバイオチップとしては、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として開発されたＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）がある。これは、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。ＤＮＡチップは、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。 As another biochip, there is a DNA microarray method (DNA chip method) developed as a technique for analyzing many gene expressions at once. In principle, this is the same as the conventional method in that it is a nucleic acid detection / quantification method based on a nucleic acid / nucleic acid hybridization reaction, and is between proteins / proteins or between sugar chains / sugar chains or sugar chains / It can also be applied to the detection and quantification of proteins and sugar chains based on hybridization between proteins. The DNA chip is characterized in that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are aligned and fixed on a flat glass substrate called a microarray or chip at a high density. As a specific method of using the microarray method, for example, a sample obtained by labeling a gene expressed in a cell to be studied with a fluorescent dye or the like is hybridized on a flat substrate piece, and complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other. There are a method of reading the part at high speed with a high resolution analyzer and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction. Thus, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated.
従来、上記の微量分析装置に用いられるマイクロチップには、加工性や精度の観点からガラス板や石英板、シリコン板等の無機材料が使用されてきた。例えば、遺伝子解析等に用いられるＤＮＡチップの基材としては、スライドガラスに代表されるガラスが使用されてきた。これは、ガラスの自体の自己蛍光性が小さいためである。すなわち、ＤＮＡチップ上に並べたＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）と、調べたい試料（ＤＮＡ）に蛍光物質で標識を付けたもの（ターゲットＤＮＡ）を含む溶液をチップ上に流し、ターゲットＤＮＡがチップ上のどのＤＮＡとハイブリダイゼーションしたかを、レーザースキャナーで読み取り検出するが、ターゲットＤＮＡの蛍光は非常に微弱であるため、ＤＮＡチップ基材の自己蛍光性が高いとバックグラウンドが上がり、シグナル検出感度の低下を招くことになるためである。このようなＤＮＡチップに代表されるバイオチップは、その他広範な分野での適応が期待されていることから、チップの大量生産が前提となる。この場合、ガラス基板では、検出のための光の透過性を確保する目的と、接合工程の生産性を高める目的のために、ガラス基板の両面を鏡面研磨する等の表面加工が必要となり、生産効率が極めて低くなることが問題となる。 Conventionally, inorganic materials such as a glass plate, a quartz plate, and a silicon plate have been used for the microchip used in the above-described microanalyzer from the viewpoint of processability and accuracy. For example, a glass typified by a slide glass has been used as a base material of a DNA chip used for gene analysis or the like. This is because the glass itself has low autofluorescence. That is, a solution containing a DNA fragment (probe DNA) arranged on a DNA chip and a sample (DNA) to be examined labeled with a fluorescent substance (target DNA) is flowed on the chip, and the target DNA is placed on the chip. The DNA that has been hybridized is read and detected with a laser scanner, but the fluorescence of the target DNA is very weak, so if the DNA chip base material is highly fluorescent, the background increases and the signal detection sensitivity decreases. It is because it will invite. Biochips typified by such DNA chips are expected to be applied in a wide range of other fields, and therefore are premised on mass production of chips. In this case, surface processing such as mirror polishing of both surfaces of the glass substrate is necessary for the purpose of ensuring the light transmission for detection and the purpose of increasing the productivity of the bonding process. The problem is that the efficiency is very low.
上記の問題を解決する手段として、ガラス基板マイクロチップに代えて樹脂製マイクロチップの検討が行われている。例えば、特許文献１には透明樹脂を用いたキャピラリーおよび平板からなる電気泳動装置が、また特許文献２には毛細管形状の溝を有する高精度分離用有機ポリマー基板が、さらに非特許文献１にはアクリル樹脂製チップを用いた電気泳動分析システムが開示されている。 As means for solving the above problems, resin microchips have been studied in place of glass substrate microchips. For example, Patent Document 1 discloses an electrophoresis apparatus composed of a capillary and a flat plate using a transparent resin, Patent Document 2 includes a high-precision separation organic polymer substrate having a capillary-shaped groove, and Non-Patent Document 1 discloses An electrophoresis analysis system using an acrylic resin chip is disclosed.
上記開示技術には、基板樹脂として、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）やポリカーボネート（ＰＣ）等の透明樹脂が使用されている。 In the disclosed technique, a transparent resin such as polymethyl methacrylate (PMMA) or polycarbonate (PC) is used as the substrate resin.
しかしながら、基板樹脂としてＰＭＭＡやＰＣをそのまま用いると、μＴＡＳにおいては、例えばタンパク質などを取り扱う際に、微細な溝表面へタンパク質が吸着してしまい、分析が困難になることが考えられる。このような吸着を防ぐために予め溝表面に他のタンパク質などを固定化することが必要であると考えられる。また、ＤＮＡチップにおいても、オリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１０〜１００塩基までのものをいう）をチップ表面に共有結合にて固定化することが必要であるが、上記の公知例においては、タンパク質やＤＮＡのような生物由来の分子を樹脂からなる基板表面に固定化する方法については何ら言及されていない。 However, if PMMA or PC is used as it is as the substrate resin, in μTAS, for example, when proteins are handled, the proteins are adsorbed on the surface of fine grooves, which makes analysis difficult. In order to prevent such adsorption, it is considered necessary to immobilize other proteins on the groove surface in advance. Also in a DNA chip, it is necessary to immobilize oligo DNA (oligo DNA having a base number of 10 to 100 bases) on the chip surface by covalent bonding. No mention is made of a method for immobilizing biological molecules such as proteins and DNA on the surface of a resin substrate.
また、バイオチップのうちＤＮＡチップにおいて、必須の工程であるハイブリダイゼーション工程では、加熱が必要となることが多い。また、μＴＡＳでも、基板上でＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応などの加熱を必要とする反応を行うものも提案されている。従って、ガラス転移温度Ｔｇが低い樹脂は、基材としての使用が難しいという問題があった。この問題を解決するため、特許文献３には、環状ポリオレフィンを使用したＤＮＡチップ用基板が開示されている。確かに、該ＤＮＡチップ基板は、耐熱性に優れるものの、特許文献３においては、基板表面へのＤＮＡの固定化については、何ら言及されていない
したがって、本発明は、射出成形による作成が容易であり、基板表面にタンパク質やＤＮＡなど容易に固定化でき、耐熱性に優れたバイオチップ用基板およびバイオチップを得ることを課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to obtain a biochip substrate and a biochip that can be easily produced by injection molding, can be easily immobilized on a substrate surface, such as protein and DNA, and have excellent heat resistance.
さらには、次の問題も解決する選択性結合物質を固定化したバイオチップを得ることも課題とする。すなわち、平坦なガラスの基板にＤＮＡなどの選択結合性物質を固定化した場合、以下のような問題点があった。１）ハイブリダイゼーションを行った時、ガラスが親水的なので、プローブＤＮＡを固定したスポット以外の部分にも非特異的に検体ＤＮＡが吸着し易く、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、この非特異的に吸着した検体をも検出してしまい、ガラス自体の自家蛍光が小さくても、結果的にノイズが大きくなるという問題点と、２）ガラスが剛体のため、これに共有結合したオリゴＤＮＡの空間的な自由度が妨げられるという推定理由から、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション効率が低いので、シグナル強度が小さく、結果的にＳ／Ｎ比が十分でないといった問題があった。本発明では、上記のようなＳ／Ｎ比の悪化を防ぎ、検出感度の高い選択結合性物質が固定化されたバイオチップをも提供することができる。 Furthermore, another object is to obtain a biochip on which a selective binding substance that solves the following problems is immobilized. That is, when a selective binding substance such as DNA is immobilized on a flat glass substrate, there are the following problems. 1) Since the glass is hydrophilic when hybridization is performed, the sample DNA is likely to be adsorbed nonspecifically to portions other than the spot where the probe DNA is immobilized, and this fluorescence is detected when an apparatus called a scanner is used. Even if the specifically adsorbed specimen is detected and the autofluorescence of the glass itself is small, the resulting noise increases. 2) Since the glass is rigid, the oligo DNA covalently bound thereto Because of the presumed reason that the spatial freedom is hindered, the efficiency of hybridization with the sample DNA is low, so that there is a problem that the signal intensity is small and the S / N ratio is not sufficient. The present invention can also provide a biochip on which a selective binding substance with high detection sensitivity is immobilized while preventing the deterioration of the S / N ratio as described above.
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、酸無水物単位を有する熱可塑性共重合体で構成される基板が、その表面にタンパク質やＤＮＡなどを容易に固定化でき、さらに耐熱性に優れ、バイオチップ用基板として有用であることを見出し、本発明に到達した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention can easily immobilize proteins, DNA, etc. on the surface of a substrate composed of a thermoplastic copolymer having an acid anhydride unit, Furthermore, the present inventors have found that it has excellent heat resistance and is useful as a substrate for biochips, and has reached the present invention.
すなわち本発明は、
［１］（Ａ）（ｉ）酸無水物単位を有する熱可塑性共重合体で構成されるバイオチップ用基板であって、該基板には選択結合性物質が固定化される凹凸部が設けられており、選択結合性物質が該凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されることを特徴とするバイオチップ用基板、
［２］（Ａ）熱可塑性共重合体が、（ii）不飽和カルボン酸単位を有することを特徴とする上記［１］に記載のバイオチップ用基板、
［３］（Ａ）熱可塑性共重合体が、（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位を有することを特徴とする上記［１］または［２］に記載のバイオチップ用基板、
［４］（Ａ）熱可塑性共重合体が、芳香族環含有単位を有しないことを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板、
［５］（Ａ）熱可塑性共重合体中の（ｉ）酸無水物単位が下記一般式（１）で表されるグルタル酸無水物単位であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板、
That is, the present invention
[1] (A) (i) A biochip substrate composed of a thermoplastic copolymer having an acid anhydride unit, wherein the substrate is provided with an uneven portion to which a selective binding substance is immobilized. A biochip substrate, wherein the selective binding substance is immobilized on the upper surfaces of the plurality of convex portions of the concave and convex portions ,
[2] (A) a thermoplastic copolymer, (ii) a biochip substrate according to above [1], characterized in that it comprises an unsaturated carboxylic acid unit,
[3] (A) a thermoplastic copolymer, (iii) a biochip substrate according to above [1] or [2], which has an unsaturated carboxylic acid alkyl ester unit,
[4] (A) a thermoplastic copolymer, characterized in that it does not have an aromatic ring-containing units, the above-mentioned [1] to [3] biochip substrate according to any one of,
[5] The above [1] to [4], wherein the (i) acid anhydride unit in the (A) thermoplastic copolymer is a glutaric anhydride unit represented by the following general formula (1): ] The biochip substrate according to any one of
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一または相異なる水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を表す）
［６］上記［１］から［５］のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板を用いたバイオチップであって、該バイオチップには凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されていることを特徴とする選択結合性物質が固定化されたバイオチップ、
［７］該凹凸部の凸部上面が実質的に平坦であり、選択結合性物質が固定化された凸部上面の高さが、略同一である上記［６］に記載の選択結合性物質が固定化されたバイオチップ、
［８］該バイオチップには平坦部が設けられていることを特徴とする上記［６］または［７］に記載の選択結合性物質が固定化されたバイオチップ、
［９］選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部の高さと、最も低い凸部の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする上記［６］〜［８］のいずれか１項に記載の選択結合性物質が固定化されたバイオチップ、
［１０］凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする上記［６］〜［９］のいずれか１項に記載の選択結合性物質が固定化されたバイオチップ、
を提供するものである。
(In the above formula, R 1 and R 2 represent the same or different hydrogen atoms or alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms )
[6] A biochip using the substrate for the biochip according to any one of the above [1] to [5], the said biochip is uneven portion is provided, the selective binding substance A biochip on which a selective binding substance is immobilized, characterized in that it is immobilized on the upper surfaces of a plurality of convex portions of the concavo-convex portion,
[7] the convex upper surface of the uneven portion is substantially flat, the height of the protrusion upper surface selective binding substance is immobilized, serial mounting of selective binding to [6] is substantially the same Biochip with immobilized substance,
[ 8 ] The biochip on which the selective binding substance according to [ 6 ] or [ 7] is immobilized, wherein the biochip is provided with a flat portion,
[ 9 ] The above [ 6 ], wherein the difference between the height of the highest convex portion and the height of the lowest convex portion among the plurality of convex portions to which the selective binding substance is immobilized is 50 μm or less. ~ [8] the biochip selective binding substance according is immobilized in any one of,
[10] selective binding substance according to any one of the above [6] to [9], wherein the difference in height between the flat portion of the top surface of the convex portion of the concavo-convex portion is 50μm or less Is an immobilized biochip,
Is to provide.
本発明により、射出成形による作成が容易であり、特殊な処理を要することなく、表面に生体分子を固定することができ、さらには、耐熱性に優れたバイオチップ用基板、バイオチップおよび選択結合性物質が固定化されたバイオチップを得ることができる。さらに、検出の際のＳ／Ｎ比が良好な選択結合性物質が固定化されたバイオチップを得ることができる。 According to the present invention, it is easy to produce by injection molding, and it is possible to immobilize biomolecules on the surface without requiring special treatment, and furthermore, a biochip substrate, biochip and selective bonding excellent in heat resistance A biochip in which a sex substance is immobilized can be obtained. Furthermore, a biochip on which a selective binding substance having a good S / N ratio at the time of detection is immobilized can be obtained.
以下、本発明のバイオチップ用基板、バイオチップおよび選択結合性物質が固定化されたバイオチップについて具体的に説明する。本発明でいう選択結合性物質が固定化されたバイオチップとは、マイクロアレイまたはチップと呼ばれる基板上に、選択結合性物質（ＤＮＡ断片やタンパク質、糖鎖等）を固定化したものである。ここでいう選択結合性物質とは、被検物質と直接的または間接的に、選択的に結合しうる物質を意味し、代表的な例として、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ、ＰＮＡ）、タンパク質、糖類およびその他の抗原性化合物を挙げることができる。さらに、本発明で言うバイオチップとは、基板上に微細な溝やチャンバーを作製し、その中で液体を使用して反応を行うものであり（すなわち、いわゆるμＴＡＳやマイクロリアクターと呼ばれるものを指す）、かつ、基板の表面に核酸、糖鎖、タンパク質が固定化されているものも含む。 Hereinafter, the biochip substrate, the biochip, and the biochip on which the selective binding substance is immobilized will be described in detail. The biochip on which the selective binding substance referred to in the present invention is immobilized is one in which a selective binding substance (DNA fragment, protein, sugar chain, etc.) is immobilized on a substrate called a microarray or chip. As used herein, the selective binding substance means a substance that can selectively bind to a test substance directly or indirectly, and representative examples include nucleic acids (DNA, RNA, PNA), proteins, saccharides. And other antigenic compounds. Furthermore, the biochip referred to in the present invention is a device in which a minute groove or chamber is produced on a substrate and a reaction is carried out using a liquid therein (that is, a so-called μTAS or microreactor). ), And nucleic acids, sugar chains, and proteins immobilized on the surface of the substrate.
本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体は、（ｉ）酸無水物単位を有することを特徴とする。ここでいう（ｉ）酸無水物単位は、（Ａ）熱可塑性共重合体の主鎖や側鎖の骨格中や末端に存在する単位である。（ｉ）酸無水物単位の構造としては、特に制限はなく、（メタ）アクリル酸無水物単位、グルタル酸無水物単位、マレイン酸無水物単位、イタコン酸無水物単位、シトラコン酸無水物単位、アコニット酸無水物単位等が挙げられるが、マレイン酸無水物単位、グルタル酸無水物単位が好ましく、なかでも、下記一般式（１） The (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is characterized by having (i) an acid anhydride unit. The (i) acid anhydride unit referred to here is a unit present in the skeleton or terminal of the main chain or side chain of the thermoplastic copolymer (A). (I) The structure of the acid anhydride unit is not particularly limited, and is a (meth) acrylic anhydride unit, glutaric anhydride unit, maleic anhydride unit, itaconic anhydride unit, citraconic anhydride unit, Examples thereof include aconitic acid anhydride units, but maleic acid anhydride units and glutaric acid anhydride units are preferable. Among them, the following general formula (1)
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2は、同一または相異なる水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を表す）
で表されるグルタル酸無水物単位が好ましい。
(In the above formula, R 1 and R 2 represent the same or different hydrogen atoms or alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms)
A glutaric anhydride unit represented by
本発明で用いられる（Ａ）熱可塑性共重合体の構造は、（ｉ）酸無水物単位を含有していれば特に制限はないが、下記一般式（２） The structure of the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it contains (i) an acid anhydride unit, but the following general formula (2)
（ただし、Ｒ3は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表す）
で表される（ii）不飽和カルボン酸単位を有していることが好ましい。ここでいう（ii）不飽和カルボン酸単位とは、不飽和カルボン酸単量体を、共重合することにより得られる単位であり、この際に用いられる不飽和カルボン酸単量体としては特に制限はなく、他のビニル化合物と共重合させることが可能ないずれの不飽和カルボン酸単量体も使用可能である。好ましい不飽和カルボン酸単量体として、下記一般式（３）
(However, R 3 represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms)
(Ii) It preferably has an unsaturated carboxylic acid unit. The (ii) unsaturated carboxylic acid unit here is a unit obtained by copolymerizing an unsaturated carboxylic acid monomer, and the unsaturated carboxylic acid monomer used in this case is particularly limited. However, any unsaturated carboxylic acid monomer that can be copolymerized with other vinyl compounds can be used. As a preferable unsaturated carboxylic acid monomer, the following general formula (3)
（ただし、Ｒ3は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表す）
で表される化合物、マレイン酸、及びさらには無水マレイン酸の加水分解物などが挙げられるが、特に熱安定性が優れる点でアクリル酸、メタクリル酸が好ましく、より好ましくはメタクリル酸である。これらはその１種または２種以上用いることができる。
(However, R 3 represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms)
In particular, acrylic acid and methacrylic acid are preferred, and methacrylic acid is more preferred from the viewpoint of excellent thermal stability. These can be used alone or in combination.
本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体は、（ｉ）酸無水物単位を含有していれば特に制限はないが、下記一般式（４） The (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it contains (i) an acid anhydride unit, but the following general formula (4)
（ただし、Ｒ4は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ5は炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基又は１個以上炭素数以下の数の水酸基若しくはハロゲンで置換された炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基を示す）
で表される（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位を有していることが好ましい。ここでいう（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位とは、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体を、共重合することにより得られる単位であり、ここで、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体としては特に制限はないが、好ましい例として、下記一般式（５）で表されるものを挙げることができる。
(However, R 4 represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R 5 represents an aliphatic or alicyclic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, or a hydroxyl group or halogen having a number of 1 to 5 carbon atoms. A C1-C6 aliphatic or alicyclic hydrocarbon group substituted with
It is preferable that it has (iii) unsaturated carboxylic acid alkylester unit represented by these. The (iii) unsaturated carboxylic acid alkyl ester unit referred to here is a unit obtained by copolymerizing an unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer, and here, the unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer. Although there is no restriction | limiting in particular as that, As a preferable example, what is represented by following General formula (5) can be mentioned.
（ただし、Ｒ4は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ5は炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基又は１個以上炭素数以下の数の水酸基若しくはハロゲンで置換された炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基を表す）
これらのうち、炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基又は置換基を有する該炭化水素基を持つアクリル酸エステルおよび／またはメタクリル酸エステルが特に好適である。
(However, R 4 represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R 5 represents an aliphatic or alicyclic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, or a hydroxyl group or halogen having a number of 1 to 5 carbon atoms. Represents an aliphatic or alicyclic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms substituted with
Among these, an acrylate ester and / or a methacrylic ester having an aliphatic or alicyclic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms or the hydrocarbon group having a substituent is particularly preferable.
不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体の好ましい具体例としては、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ｎ−プロピル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｎ−へキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸クロロメチル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸３−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシルおよび（メタ）アクリル酸２，３，４，５−テトラヒドロキシペンチルなどが挙げられ、なかでもメタクリル酸メチルが最も好ましく用いられる。これらはその１種または２種以上を用いることができる。 Preferable specific examples of the unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n-propyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, (meth ) T-butyl acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, chloromethyl (meth) acrylate, 2-chloroethyl (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate , (Meth) acrylic acid 3-hydroxypropyl, (meth) acrylic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl and (meth) acrylic acid 2,3,4,5-tetrahydroxypentyl Of these, methyl methacrylate is most preferably used. These can be used alone or in combination of two or more thereof.
また、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体においては、本発明の効果を損なわない範囲で、その他のビニル系単量体を用いてもかまわない。その他のビニル系単量体の好ましい具体例としては、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレンおよびｐ−ｔ−ブチルスチレンなどの芳香族ビニル系単量体、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、エタクリロニトリルなどのシアン化ビニル系単量体、アリルグリシジルエーテル、スチレン−ｐ−グリシジルエーテル、ｐ−グリシジルスチレン、無水マレイン酸、無水イタコン酸、Ｎ−メチルマレイミド、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ブトキシメチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルメタクリルアミド、アクリル酸アミノエチル、アクリル酸プロピルアミノエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸エチルアミノプロピル、メタクリル酸フェニルアミノエチル、メタクリル酸シクロヘキシルアミノエチル、Ｎ−ビニルジエチルアミン、Ｎ−アセチルビニルアミン、アリルアミン、メタアリルアミン、Ｎ−メチルアリルアミン、ｐ−アミノスチレン、２−イソプロペニル−オキサゾリン、２−ビニル−オキサゾリン、２−アクロイル−オキサゾリンおよび２−スチリル−オキサゾリンなどを挙げることができるが、バイオチップ基板の自家蛍光の抑制の点で芳香環を含まない単量体がより好ましく使用できる。これらは単独ないし２種以上を用いることができる。 In the thermoplastic copolymer (A) used in the present invention, other vinyl monomers may be used as long as the effects of the present invention are not impaired. Preferable specific examples of other vinyl monomers include fragrances such as styrene, α-methylstyrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, o-ethylstyrene, p-ethylstyrene, and pt-butylstyrene. Group vinyl monomers, vinyl cyanide monomers such as acrylonitrile, methacrylonitrile, ethacrylonitrile, allyl glycidyl ether, styrene-p-glycidyl ether, p-glycidyl styrene, maleic anhydride, itaconic anhydride, N-methylmaleimide, N-ethylmaleimide, N-cyclohexylmaleimide, N-phenylmaleimide, acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, butoxymethylacrylamide, N-propylmethacrylamide, aminoethyl acrylate, acrylic acid Propylaminoethyl, dimethylaminoethyl methacrylate, ethylaminopropyl methacrylate, phenylaminoethyl methacrylate, cyclohexylaminoethyl methacrylate, N-vinyldiethylamine, N-acetylvinylamine, allylamine, methallylamine, N-methylallylamine, Examples include p-aminostyrene, 2-isopropenyl-oxazoline, 2-vinyl-oxazoline, 2-acryloyl-oxazoline, and 2-styryl-oxazoline, but an aromatic ring in terms of suppressing autofluorescence of the biochip substrate. A monomer containing no is more preferably used. These may be used alone or in combination of two or more.
さらに本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体においては、オレフィン系単量体を（共）重合したものであってもよく、また、これを（共）重合したものを（ｉ）酸無水物単位を導入するための主鎖としたものであってもよい。上記オレフィン系単量体としては、エチレン、プロピレン、ブテン−１、ペンテン−１、イソブテン、４−メチル−ペンテン−１、３−メチル−ペンテン−１、３−メチル−ブテン−１、等の直鎖状または分岐状の鎖状オレフィン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘプテン、ノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセン等の環状オレフィン等が挙げられる。 Further, the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention may be a (co) polymerized olefin monomer, or (i) an acid anhydride obtained by (co) polymerizing the olefin monomer. It may be a main chain for introducing a physical unit. Examples of the olefinic monomers include ethylene, propylene, butene-1, pentene-1, isobutene, 4-methyl-pentene-1, 3-methyl-pentene-1, 3-methyl-butene-1, and the like. Examples thereof include linear or branched chain olefins, cyclic olefins such as cyclobutene, cyclopentene, cyclohexene, cycloheptene, norbornene, dicyclopentadiene, and tetracyclododecene.
本発明に用いる（Ａ）熱可塑性共重合体の製造方法に特に制限はないが、例えば以下に示す方法により製造することができる。すなわち、(1)（ｉ）酸無水物単位を与える不飽和酸無水物単量体を共重合することにより、（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する方法、(2)（ｉ）酸無水物単位を与える不飽和酸無水物単量体を、主鎖となる（共）重合体の存在下、必要に応じてラジカル開始剤を用いて加熱反応させる、いわゆるグラフト法を使用することにより、（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する方法、あるいは(3)後の加熱工程により（ｉ）酸無水物単位を与える不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体及び不飽和カルボン酸単量体と、その他のビニル系単量体単位を含む場合には該単位を与えるビニル系単量体とを共重合させ、（Ｂ）原共重合体とした後、かかる（Ｂ）原共重合体を適当な触媒の存在下あるいは非存在下で加熱し、（イ）脱アルコールおよび／または（ロ）脱水による分子内環化反応を行わせることにより、本発明に用いる（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する方法などが挙げられる。この場合、典型的には、（Ｂ）原共重合体を加熱することにより２単位の（ii）不飽和カルボン酸単位のカルボキシル基が脱水されて、あるいは、隣接する１単位の（ii）不飽和カルボン酸単位と１単位の（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位からアルコールの脱離により１単位のグルタル酸無水物単位が生成される。 Although there is no restriction | limiting in particular in the manufacturing method of (A) thermoplastic copolymer used for this invention, For example, it can manufacture by the method shown below. (1) (i) a method of producing a thermoplastic copolymer by copolymerizing an unsaturated acid anhydride monomer giving an acid anhydride unit, (2) (i) acid anhydride By using a so-called graft method in which an unsaturated acid anhydride monomer that gives a physical unit is heated and reacted with a radical initiator as necessary in the presence of a (co) polymer as a main chain, (A) a method for producing a thermoplastic copolymer, or (3) an unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer and an unsaturated carboxylic acid monomer that give an acid anhydride unit by a subsequent heating step; When it contains other vinyl monomer units, it is copolymerized with a vinyl monomer that gives the units to give (B) a raw copolymer, and then the (B) raw copolymer is suitably used. Heating in the presence or absence of a catalyst to (a) dealcoholate and / or ( ) By causing an intramolecular cyclization reaction by dehydration, a method of manufacturing the (A) used in the present invention the thermoplastic copolymer. In this case, typically, by heating the (B) raw copolymer, the carboxyl group of 2 units of the (ii) unsaturated carboxylic acid unit is dehydrated or adjacent to 1 unit of the (ii) One unit of glutaric anhydride unit is produced by elimination of the alcohol from the saturated carboxylic acid unit and one unit of (iii) the unsaturated carboxylic acid alkyl ester unit.
上記(1)あるいは(2)の方法により、（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する際に使用される不飽和酸無水物単量体としては、共重合あるいは反応可能な不飽和結合を有していれば、特に制限はないが、好ましくは、（メタ）アクリル酸無水物、マレイン酸無水物、イタコン酸無水物、シトラコン酸無水物、アコニット酸無水物等が挙げられる。 The unsaturated acid anhydride monomer used when producing the thermoplastic copolymer (A) by the above method (1) or (2) has an unsaturated bond that can be copolymerized or reacted. If there is no particular limitation, (meth) acrylic anhydride, maleic anhydride, itaconic anhydride, citraconic anhydride, aconitic anhydride and the like are preferable.
上記(1)の方法により（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する場合、特に制限はないが、上記のような不飽和酸無水物単量体とこれと共重合可能なその他の単量体を共重合することにより製造できる。不飽和酸無水物単量体としては、（メタ）アクリル酸無水物、マレイン酸無水物、イタコン酸無水物、シトラコン酸無水物、アコニット酸無水物等が挙げられる。その他の単量体としては、上記したような不飽和カルボン酸単量体、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体、その他のビニル系単量体、オレフィン系単量体などが挙げられ、これらは一種または二種以上で用いることができる。 When the (A) thermoplastic copolymer is produced by the method (1), there is no particular limitation, but the unsaturated acid anhydride monomer and other monomers copolymerizable therewith are as described above. Can be produced by copolymerization. Examples of the unsaturated acid anhydride monomer include (meth) acrylic acid anhydride, maleic acid anhydride, itaconic acid anhydride, citraconic acid anhydride, aconitic acid anhydride, and the like. Examples of the other monomers include unsaturated carboxylic acid monomers, unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomers, other vinyl monomers, olefin monomers, etc. It can be used alone or in combination of two or more.
（Ａ）熱可塑性共重合体の好ましい具体例としては、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）等の不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体、スチレン等の芳香族ビニル系単量体、エチレン、プロピレン、環状オレフィン等のオレフィン系単量体等と、上記したような酸無水物単量体との共重合体が挙げられるが、より具体的には、ＭＭＡとマレイン酸無水物の共重合体、スチレンとマレイン酸無水物の共重合体、スチレン・アクリロニトリル・マレイン酸無水物の３元共重合体等が挙げられるが、より優れた効果を発揮する点で芳香族環単位を含有しない共重合体であることが好ましく、具体的にはＭＭＡとマレイン酸無水物の共重合体が特に好ましい。 (A) Preferred specific examples of the thermoplastic copolymer include unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomers such as methyl methacrylate (MMA), aromatic vinyl monomers such as styrene, ethylene, propylene, and cyclic olefins. And the like, and the above-mentioned copolymer of an acid anhydride monomer, and more specifically, a copolymer of MMA and maleic anhydride, styrene and maleic. An acid anhydride copolymer, a styrene / acrylonitrile / maleic anhydride ternary copolymer, etc. may be mentioned, but the copolymer should not contain an aromatic ring unit in terms of exhibiting a more excellent effect. More specifically, a copolymer of MMA and maleic anhydride is particularly preferable.
上記(2)の方法により、（Ａ）熱可塑性共重合体を製造する場合、特に制限は無いが、ポリエチレン、ポリプロピレン、環状ポリオレフィン等のオレフィン系（共）重合体、あるいはさらにこれと共重合可能な単量体（例えば不飽和カルボン酸単量体、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体、その他のビニル系単量体など）を共重合した（共）重合体などに不飽和酸無水物単量体、あるいはこれとその他の共重合可能な単量体をグラフト（共）重合することにより製造することができる。このような（Ａ）熱可塑性共重合体の好ましい具体例としては、（メタ）アクリル酸無水物、マレイン酸無水物、イタコン酸無水物、シトラコン酸無水物、アコニット酸無水物等とのグラフト共重合体が挙げられるが、より好ましい具体例として、ポリエチレンとマレイン酸無水物とのグラフト共重合体、ポリプロピレンとマレイン酸無水物とのグラフト共重合体、環状ポリオレフィンとマレイン酸無水物とのグラフト共重合体等が挙げられるが、最も好ましい具体例は、耐熱性の観点から、環状ポリオレフィンとマレイン酸無水物とのグラフト共重合体が挙げられる。 When (A) a thermoplastic copolymer is produced by the above method (2), there is no particular limitation, but olefinic (co) polymers such as polyethylene, polypropylene, and cyclic polyolefin, or further copolymerizable therewith. Unsaturated monomers (such as unsaturated carboxylic acid monomers, unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomers, other vinyl monomers) copolymerized with (mono) polymers. It can be produced by graft (co) polymerization of a monomer or other copolymerizable monomer. Preferable specific examples of such (A) thermoplastic copolymer include graft copolymer with (meth) acrylic anhydride, maleic anhydride, itaconic anhydride, citraconic anhydride, aconitic acid anhydride, etc. More preferred specific examples include a graft copolymer of polyethylene and maleic anhydride, a graft copolymer of polypropylene and maleic anhydride, and a graft copolymer of cyclic polyolefin and maleic anhydride. Although a polymer etc. are mentioned, the most preferable specific example includes the graft copolymer of cyclic polyolefin and maleic anhydride from a heat resistant viewpoint.
これらグラフト共重合体を得る際には必要に応じて有機過酸化物などのラジカル開始剤を用いてもよい。 In obtaining these graft copolymers, a radical initiator such as an organic peroxide may be used as necessary.
上記(3)の方法に従い、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体を（Ｂ）原共重合体から製造する際には、不飽和カルボン酸単量体、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体、所望に応じてその他のビニル系単量体を原料として共重合して（Ｂ）原共重合体を製造し、その後分子内環化反応を行わせることにより製造することができる。（Ｂ）原共重合体の重合方法については、基本的にはラジカル重合による、塊状重合、溶液重合、懸濁重合、乳化重合等の公知の重合方法を用いることができるが、不純物がより少ない点で溶液重合、塊状重合、懸濁重合が特に好ましい。 According to the above method (3), when the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is produced from the (B) raw copolymer, the unsaturated carboxylic acid monomer, unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer It can be produced by copolymerizing a monomer and, if desired, another vinyl monomer as a raw material to produce a raw copolymer (B) and then carrying out an intramolecular cyclization reaction. (B) Regarding the polymerization method of the original copolymer, known polymerization methods such as bulk polymerization, solution polymerization, suspension polymerization, emulsion polymerization, etc., basically by radical polymerization can be used, but there are fewer impurities. Particularly preferred are solution polymerization, bulk polymerization and suspension polymerization.
また、（Ｂ）原共重合体を９５℃以下の重合温度で製造することが、加熱処理後の無色透明性の面で好ましく、より好ましい重合温度は８５℃以下であり、特に好ましくは７５℃以下である。また、重合温度の下限は、重合が進行する温度であれば、特に制限はないが、重合速度を考慮した生産性の面から、通常５０℃以上、好ましくは６０℃以上である。重合収率あるいは重合速度を向上させる目的で、重合進行に従い重合温度を昇温することも可能であるが、この場合も昇温する上限温度は９５℃以下に制御することが好ましく、重合開始温度も７５℃以下の比較的低温で行うことが好ましい。また重合時間は、必要な重合率を得るのに十分な時間であれば特に制限はないが、生産効率の点から６０〜３６０分間の範囲が好ましく、９０〜１８０分間の範囲が特に好ましい。 In addition, it is preferable that the (B) raw copolymer is produced at a polymerization temperature of 95 ° C. or less in terms of colorless transparency after the heat treatment, and a more preferable polymerization temperature is 85 ° C. or less, particularly preferably 75 ° C. It is as follows. The lower limit of the polymerization temperature is not particularly limited as long as the polymerization proceeds, but is usually 50 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher from the viewpoint of productivity considering the polymerization rate. For the purpose of improving the polymerization yield or the polymerization rate, it is possible to raise the polymerization temperature according to the progress of the polymerization. In this case, the upper limit temperature is preferably controlled to 95 ° C. or less, and the polymerization start temperature Is preferably performed at a relatively low temperature of 75 ° C. or lower. The polymerization time is not particularly limited as long as it is a time sufficient to obtain a necessary polymerization rate, but is preferably in the range of 60 to 360 minutes, particularly preferably in the range of 90 to 180 minutes from the viewpoint of production efficiency.
（Ｂ）原共重合体の製造時に用いられる単量体混合物の好ましい割合は、該単量体混合物を１００重量％として、不飽和カルボン酸単量体が５〜５０重量％、より好ましくは１０〜４０重量％、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体は好ましくは５０〜９５重量％、より好ましくは６０〜９０重量％である。これらに共重合可能な他のビニル系単量体を用いる場合、その好ましい割合は０〜３５重量％であるが、他のビニル系単量体が、芳香族環を含有する場合、その好ましい割合は０重量％である。 (B) A preferable ratio of the monomer mixture used in the production of the original copolymer is 5 to 50% by weight of the unsaturated carboxylic acid monomer, more preferably 10%, based on 100% by weight of the monomer mixture. -40 wt%, unsaturated carboxylic acid alkyl ester monomer is preferably 50-95 wt%, more preferably 60-90 wt%. When other vinyl monomers copolymerizable with these are used, the preferred ratio is 0 to 35% by weight, but when other vinyl monomers contain an aromatic ring, the preferred ratio. Is 0% by weight.
不飽和カルボン酸単量体量が５重量％未満の場合には、（Ｂ）原共重合体の加熱による上記一般式（１）で表されるグルタル酸無水物単位の生成量が少なくなる傾向がある。一方、不飽和カルボン酸単量体量が５０重量％を超える場合には、（Ｂ）原共重合体の加熱による環化反応後に、不飽和カルボン酸単位が多量に残存する傾向があり、無色透明性、滞留安定性が低下する傾向がある。 When the amount of the unsaturated carboxylic acid monomer is less than 5% by weight, the amount of the glutaric anhydride unit represented by the general formula (1) generated by heating the (B) raw copolymer tends to decrease. There is. On the other hand, when the amount of the unsaturated carboxylic acid monomer exceeds 50% by weight, there is a tendency that a large amount of unsaturated carboxylic acid units remain after the cyclization reaction by heating the (B) raw copolymer. There is a tendency for transparency and retention stability to decrease.
（Ｂ）原共重合体を加熱し、（イ）脱アルコールおよび／または（ロ）脱水による分子内環化反応を行い、グルタル酸無水物単位を含有する（Ａ）熱可塑性重合体を製造する方法は、特に制限はないが、ベントを有する加熱した押出機に通して製造する方法や窒素気流中または真空下で加熱脱気できる装置内で製造する方法が好ましい。なお、上記の方法により加熱脱気する温度は、（イ）脱アルコールおよび／または（ロ）脱水による分子内環化反応が生じる温度であれば特に限定されないが、好ましくは１８０〜３００℃の範囲、特に２００〜２８０℃の範囲が好ましい。また、この際の加熱脱気する時間は特に限定されず、所望する共重合組成に応じて適宜設定可能であるが、通常、３分間〜６０分間、好ましくは５分間〜３０分間、さらに好ましくは８分間〜２０分間の範囲が好ましい。 (B) The raw copolymer is heated and (i) dealcoholization and / or (b) intramolecular cyclization reaction by dehydration is performed to produce (A) a thermoplastic polymer containing glutaric anhydride units. The method is not particularly limited, but a method of manufacturing through a heated extruder having a vent or a method of manufacturing in an apparatus capable of heating and degassing in a nitrogen stream or under vacuum is preferable. The temperature for heat degassing by the above method is not particularly limited as long as it is a temperature at which (i) dealcoholization and / or (b) intramolecular cyclization reaction by dehydration occurs, but is preferably in the range of 180 to 300 ° C. In particular, a range of 200 to 280 ° C. is preferable. In addition, the heating and degassing time in this case is not particularly limited and can be appropriately set according to the desired copolymer composition, but is usually 3 minutes to 60 minutes, preferably 5 minutes to 30 minutes, more preferably A range of 8 minutes to 20 minutes is preferred.
また、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体を、（Ｂ）原共重合体から製造する際には、（Ａ）熱可塑性共重合体の重量平均分子量を５万〜１５万とすることが好ましい。このような分子量を有する（Ａ）熱可塑性共重合体は、（Ｂ）原共重合体の重合時に、所望の分子量、すなわち重量平均分子量で５万〜１５万に予め制御しておくことにより、達成することができる。重量平均分子量が、１５万を越える場合、後工程の加熱脱気時に着色する傾向が見られる。一方、重量平均分子量が、５万未満の場合、成形品の機械的強度が低下する傾向が見られる。 When the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is produced from the (B) raw copolymer, the weight average molecular weight of the (A) thermoplastic copolymer is 50,000 to 150,000. It is preferable. The (A) thermoplastic copolymer having such a molecular weight is preliminarily controlled to a desired molecular weight, that is, a weight average molecular weight of 50,000 to 150,000 at the time of polymerization of the (B) original copolymer, Can be achieved. When the weight average molecular weight exceeds 150,000, there is a tendency to color at the time of heat degassing in the subsequent step. On the other hand, when the weight average molecular weight is less than 50,000, the mechanical strength of the molded product tends to decrease.
（Ｂ）原共重合体の分子量制御方法については、特に制限はなく、例えば通常公知の技術を適用することができる。例えば、アゾ化合物、過酸化物等のラジカル重合開始剤の添加量、あるいはアルキルメルカプタン、四塩化炭素、四臭化炭素、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、トリエチルアミン等の連鎖移動剤の添加量等により、制御することができる。特に、重合の安定性、取り扱いの容易さ等から、連鎖移動剤であるアルキルメルカプタンの添加量を制御する方法が好ましく使用することができる。 (B) There is no restriction | limiting in particular about the molecular weight control method of an original copolymer, For example, a conventionally well-known technique is applicable. For example, controlled by the amount of radical polymerization initiators such as azo compounds and peroxides, or the amount of chain transfer agents such as alkyl mercaptans, carbon tetrachloride, carbon tetrabromide, dimethylacetamide, dimethylformamide, triethylamine, etc. can do. In particular, a method of controlling the amount of alkyl mercaptan added as a chain transfer agent can be preferably used from the viewpoint of stability of polymerization, ease of handling, and the like.
本発明に使用されるアルキルメルカプタンとしては、例えば、ｎ−オクチルメルカプタン、ｔ−ドデシルメルカプタン、ｎ−ドデシルメルカプタン、ｎ−テトラデシルメルカプタン、ｎ−オクタデシルメルカプタン等が挙げられ、なかでもｔ−ドデシルメルカプタンが好ましく用いられる。 Examples of the alkyl mercaptan used in the present invention include n-octyl mercaptan, t-dodecyl mercaptan, n-dodecyl mercaptan, n-tetradecyl mercaptan, and n-octadecyl mercaptan. Among them, t-dodecyl mercaptan is mentioned. Preferably used.
これらアルキルメルカプタンの添加量としては、特に制限はないが、通常、単量体混合物の全量１００重量部に対して、０．８〜５．０重量部であり、好ましくは０．９〜４．０重量部、より好ましくは１．０〜３．０重量部である。
（Ｂ）原共重合体を上記方法等により加熱する際に、滞留安定性を損なわない範囲で、グルタル酸無水物への環化反応を促進させる触媒として、酸、塩基、塩化合物の１種以上を添加することができる。その添加量は、（Ｂ）原共重合体１００重量部に対し、０．１重量部未満であることが好ましい。また、これら酸、塩基、塩化合物の種類についても特に制限はなく、酸触媒としては、塩酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、リン酸、亜リン酸、フェニルホスホン酸、リン酸メチル等が挙げられる。塩基性触媒としては、金属水酸化物、アミン類、イミン類、アルカリ金属誘導体、アルコキシド類、水酸化アンモニウム塩等が挙げられる。さらに、塩系触媒としては、酢酸金属塩、ステアリン酸金属塩、炭酸金属塩等が挙げられる。塩系触媒の中には、水溶液とすることにより酸性あるいは塩基性を示すものが含まれるが、これらは塩系触媒とし、酸触媒あるいは塩基性触媒と区別する。これら触媒は本発明の目的を損なわない範囲で１種または２種以上添加することができる。中でも、塩基性触媒が、比較的少量の添加量で、優れた反応促進効果を示すため、好ましく使用することができる。具体的には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムフェノキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムフェノキシド等のアルコキシド化合物、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム等の有機カルボン酸塩等が挙げられ、とりわけ、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、酢酸リチウム、酢酸ナトリウムを好ましく使用することができる。
The addition amount of these alkyl mercaptans is not particularly limited, but is usually 0.8 to 5.0 parts by weight, preferably 0.9 to 4. parts by weight based on 100 parts by weight of the total amount of the monomer mixture. 0 parts by weight, more preferably 1.0 to 3.0 parts by weight.
(B) When heating the original copolymer by the above method or the like, as a catalyst for promoting the cyclization reaction to glutaric anhydride within a range not impairing the retention stability, one kind of acid, base and salt compound The above can be added. The addition amount is preferably less than 0.1 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the (B) raw copolymer. There are no particular restrictions on the types of these acids, bases, and salt compounds, and examples of the acid catalyst include hydrochloric acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, phosphoric acid, phosphorous acid, phenylphosphonic acid, and methyl phosphate. It is done. Examples of the basic catalyst include metal hydroxides, amines, imines, alkali metal derivatives, alkoxides, ammonium hydroxide salts and the like. Furthermore, examples of the salt-based catalyst include metal acetates, metal stearates, metal carbonates, and the like. Among salt-based catalysts, those that show acidity or basicity when made into an aqueous solution are included. These are salt-based catalysts, and are distinguished from acid catalysts or basic catalysts. These catalysts can be added singly or in combination as long as the object of the present invention is not impaired. Among them, the basic catalyst can be preferably used because it exhibits an excellent reaction promoting effect with a relatively small addition amount. Specifically, hydroxides such as lithium hydroxide, sodium hydroxide, and potassium hydroxide, alkoxide compounds such as sodium methoxide, sodium ethoxide, sodium phenoxide, potassium methoxide, potassium ethoxide, and potassium phenoxide, lithium acetate And organic carboxylates such as sodium acetate, potassium acetate, and sodium stearate. Among them, sodium hydroxide, sodium methoxide, lithium acetate, and sodium acetate can be preferably used.
本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体中の（ｉ）酸無水物単位の含有量は、好ましくは（Ａ）熱可塑性共重合体１００重量％中に０．１〜５０重量％、より好ましくは０．５〜４５重量％であり、特に（Ａ）熱可塑性共重合体の主鎖骨格がポリオレフィンである場合、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜１５重量％である。また、該酸無水物単位およびの定量には、赤外分光光度計が使用できる。例えば、グルタル酸無水物単位は、１８００ｃｍ-1及び１７６０ｃｍ-1の吸収が特徴的であり、（ii）不飽和カルボン酸単位および（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位から区別することができる。なお、本発明の（Ａ）熱可塑性共重合体中に含有される各成分の定量には、上記した赤外分光光度計による方法とともに、1Ｈ−ＮＭＲによる方法を使用することができる。例えば、グルタル酸無水物単位、メタクリル酸、メタクリル酸メチルからなる共重合体の場合、スペクトルの帰属を、０．５〜１．５ｐｐｍのピークがメタクリル酸、メタクリル酸メチルおよびグルタル酸無水物環化合物のα−メチル基の水素、１．６〜２．１ｐｐｍのピークはポリマー主鎖のメチレン基の水素、３．５ｐｐｍのピークはメタクリル酸メチルのカルボン酸エステル（−ＣＯＯＣＨ3）の水素、１２．４ｐｐｍのピークはメタクリル酸のカルボン酸の水素と、スペクトルの積分比および上記赤外分光光度計による測定結果を併せて共重合体組成を決定することができる。 The content of the (i) acid anhydride unit in the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention is preferably 0.1 to 50% by weight in 100% by weight of the (A) thermoplastic copolymer. Preferably, the content is 0.5 to 45% by weight, and particularly when the main chain skeleton of the thermoplastic copolymer (A) is a polyolefin, preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 0.5 to 15% by weight. %. An infrared spectrophotometer can be used for quantification of the acid anhydride unit. For example, glutaric anhydride units, absorption of 1800 cm -1 and 1760 cm -1 are characteristic can be distinguished from (ii) an unsaturated carboxylic acid units and (iii) an unsaturated carboxylic acid alkyl ester unit. In addition, the method by < 1 > H-NMR can be used for fixed_quantity | quantitative_assay of each component contained in the (A) thermoplastic copolymer of this invention with the method by the above-mentioned infrared spectrophotometer. For example, in the case of a copolymer consisting of a glutaric anhydride unit, methacrylic acid, and methyl methacrylate, the attribution of the spectrum is 0.5 to 1.5 ppm. The peak of methacrylic acid, methyl methacrylate, and glutaric anhydride ring compound Hydrogen of α-methyl group, 1.6 to 2.1 ppm peak is hydrogen of methylene group of the polymer main chain, 3.5 ppm peak is hydrogen of carboxylic acid ester of methyl methacrylate (—COOCH 3 ), 12. The peak of 4 ppm can determine the copolymer composition by combining hydrogen of carboxylic acid of methacrylic acid, the integral ratio of the spectrum, and the measurement result by the infrared spectrophotometer.
また、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体中に、（ii）不飽和カルボン酸単位が含有される場合、その含有量は０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜１５重量％、最も好ましくは１〜１０重量％である。（ii）不飽和カルボン酸単位量が２０重量％を超える場合には、滞留安定性が低下する傾向がある。 また（iii）不飽和カルボン酸アルキルエステル単位が含有される場合、その含有量は好ましくは５０〜９５重量％、より好ましくは５５〜９０重量％、共重合可能な他のビニル系単量体は好ましくは０〜３５重量％であるが、他のビニル系単量体が、芳香族環を含有する場合、その好ましい割合は０重量％である。 In addition, when (ii) an unsaturated carboxylic acid unit is contained in (A) the thermoplastic copolymer used in the present invention, the content thereof is 0.1 to 20% by weight, more preferably 0.5 to 15% by weight, most preferably 1 to 10% by weight. (Ii) When the unsaturated carboxylic acid unit amount exceeds 20% by weight, the residence stability tends to be lowered. When (iii) an unsaturated carboxylic acid alkyl ester unit is contained, the content thereof is preferably 50 to 95% by weight, more preferably 55 to 90% by weight. The content is preferably 0 to 35% by weight, but when the other vinyl monomer contains an aromatic ring, the preferable ratio is 0% by weight.
また、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体の極限粘度に特に制限はないが、ウベローデ型粘度計でジメチルホルムアミド溶液、３０℃で測定した極限粘度が０．０５〜０．８ｄｌ／ｇであることが好ましく、より好ましくは０．１〜０．７ｄｌ／ｇ、さらに好ましくは０．３〜０．６ｄｌ／ｇである。 Further, the intrinsic viscosity of the thermoplastic copolymer (A) used in the present invention is not particularly limited, but the intrinsic viscosity measured at 30 ° C. with a dimethylformamide solution with an Ubbelohde viscometer is 0.05 to 0.8 dl / g. More preferably, it is 0.1-0.7 dl / g, More preferably, it is 0.3-0.6 dl / g.
本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体は、ガラス転移温度が１３０℃以上であることが、バイオチップ基板としての実用耐熱性の面で好ましく、さらに好ましくは１４０℃以上である。なお、ここでいうガラス転移温度とは、示差走査熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＤＳＣ−７型）を用いて昇温速度２０℃／分で測定したガラス転移温度である。 The (A) thermoplastic copolymer used in the present invention preferably has a glass transition temperature of 130 ° C. or higher in terms of practical heat resistance as a biochip substrate, and more preferably 140 ° C. or higher. The glass transition temperature here is a glass transition temperature measured at a heating rate of 20 ° C./min using a differential scanning calorimeter (DSC-7 manufactured by Perkin Elmer).
このようなガラス転移温度を有する（Ａ）熱可塑性共重合体は、（ｉ）酸無水物単位の含有量を高目に設計することにより得ることができる。 The (A) thermoplastic copolymer having such a glass transition temperature can be obtained by designing the content of (i) acid anhydride units to be high.
本発明のバイオチップ用基板の製造方法には、公知の方法を使用することができる。すなわち、押出成形、圧縮成形、射出成形等の製造法が使用できるが、好ましくは、生産性および形状の自由度の観点から射出成形が使用できる。射出成形による製造法の場合、射出成形機中の温度は、（ｉ）酸無水物単位を含有する共重合体の種類にも依るが、好ましくは１５０〜３５０℃、より好ましくは２００〜３００℃である。また、射出成形による製造法の場合、着色抑制の観点から、射出成形機のシリンダー内を窒素気流下あるいは窒素雰囲気下とすることが好ましい。また、射出成形による製造法の場合、（Ａ）熱可塑性共重合体を射出成形機に供する形状（ペレット状等）にするため、前処理として単軸あるいは二軸押出スクリューのついたエクストルーダ型溶融押出装置等が使用できる。本発明のバイオチップ用基板を製造するための溶融混練温度は、（ｉ）酸無水物単位を含有する共重合体の種類にも依るが、好ましくは１５０〜３５０℃、より好ましくは２００〜３００℃である。また、溶融押出装置を使用し溶融混練する場合、着色抑制の観点から、ベントを使用し減圧下での溶融混練あるいは窒素気流下での溶融混練を行うことが好ましい。 A well-known method can be used for the manufacturing method of the board | substrate for biochips of this invention. That is, manufacturing methods such as extrusion molding, compression molding, and injection molding can be used. Preferably, injection molding can be used from the viewpoint of productivity and flexibility of shape. In the case of the production method by injection molding, the temperature in the injection molding machine depends on the type of the copolymer containing (i) an acid anhydride unit, but is preferably 150 to 350 ° C, more preferably 200 to 300 ° C. It is. Moreover, in the case of the manufacturing method by injection molding, it is preferable to make the inside of the cylinder of an injection molding machine under nitrogen stream or nitrogen atmosphere from a viewpoint of coloring suppression. In addition, in the case of the production method by injection molding, (A) an extruder type melter with a single screw or a twin screw extrusion is used as a pretreatment in order to make the thermoplastic copolymer into a shape (pellet shape, etc.) for use in an injection molding machine. An extrusion device or the like can be used. The melt kneading temperature for producing the biochip substrate of the present invention depends on the type of copolymer (i) containing an acid anhydride unit, but is preferably 150 to 350 ° C., more preferably 200 to 300. ° C. Moreover, when melt-kneading using a melt-extrusion apparatus, it is preferable to perform the melt-kneading under reduced pressure or the melt-kneading under nitrogen stream from a viewpoint of coloring suppression.
射出成形による本発明のバイオチップ用基板の製造方法としては、金型温度を成形樹脂の固化温度以下の温度に設定し、溶融樹脂を射出、成形する一般的な方法が使用できる。また、バイオチップ用基板に対する金型転写性をより高度にすることを目的とした場合、
(1)樹脂の金型キャビティへの充填工程中に、金型面に接する樹脂表面の固化温度を低下させつつ成形する方法、
(2)断熱層被覆金型を用いて成形する方法、
(3)射出直前に、高周波誘導加熱によって金型表面を加熱させて成形する方法、
(4)射出直前に、輻射加熱によって金型表面を加熱させて成形する方法、
(5)樹脂を振動させつつ成形する方法、
(6)金型を振動させつつ成形する方法
等を使用することもできる。
As a method for producing the biochip substrate of the present invention by injection molding, a general method in which the mold temperature is set to a temperature not higher than the solidification temperature of the molding resin and the molten resin is injected and molded can be used. In addition, when the purpose is to make the mold transferability to the biochip substrate higher,
(1) A method of molding while lowering the solidification temperature of the resin surface in contact with the mold surface during the filling process of the resin into the mold cavity,
(2) A method of molding using a heat-insulating layer-coated mold,
(3) Immediately before injection, a method of heating and molding the mold surface by high frequency induction heating,
(4) Immediately before injection, a method of heating and molding the mold surface by radiant heating,
(5) A method of molding while vibrating the resin,
(6) A method of forming a mold while vibrating it can also be used.
射出成形による本発明のバイオチップ用基板の製造方法で使用される金型は、鉄または鉄を主成分とする鋼材、アルミニウム、またはアルミニウムを主成分とする合金、亜鉛合金、ベリリウム−銅合金等の一般に合成樹脂の成形に使用されている金属金型が良好に使用できる。 The mold used in the method for producing the biochip substrate of the present invention by injection molding is iron or a steel material mainly composed of iron, aluminum, an alloy mainly composed of aluminum, a zinc alloy, a beryllium-copper alloy, or the like. The metal mold generally used for molding synthetic resins can be used satisfactorily.
射出成形による本発明のバイオチップ用基板の製造方法で使用される金型の作成方法としては、例えば、金属、プラスチック、シリコン又はガラス等の材料からの切削加工やエッチング加工、又は紫外線硬化樹脂のフォトリソグラフィ加工等の方法により、目的とする微細な溝を有する有機ポリマー製の平板の表面形状を有する母型を一つ作成し、この母型からニッケル等の電気化学的鋳造法により作成される。また、レジストパターンを形成する方法を用いて金型を作ることも可能である。金属基板にレジストパターンを形成した後、レジストのない部分を金属メッキで埋め、レジストを除去して、基板表面に微細なパターンを施した金属板を形成する。この金属板を金型にして、樹脂の加工を行うことが可能である。 As a method for producing a mold used in the method for producing a biochip substrate of the present invention by injection molding, for example, cutting or etching from a material such as metal, plastic, silicon or glass, or ultraviolet curable resin One master mold having the surface shape of a flat plate made of an organic polymer having a desired fine groove is created by a method such as photolithography processing, and the master mold is created by an electrochemical casting method such as nickel. . It is also possible to make a mold using a method of forming a resist pattern. After the resist pattern is formed on the metal substrate, the portion without the resist is filled with metal plating, and the resist is removed to form a metal plate having a fine pattern on the substrate surface. The metal plate can be used as a mold to process the resin.
さらに、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体には、本発明の目的を損なわない範囲でヒンダードフェノール系、ベンゾトリアゾール系、ベンゾフェノン系、ベンゾエート系、およびシアノアクリレート系の紫外線吸収剤および酸化防止剤、高級脂肪酸や酸エステル系および酸アミド系、さらに高級アルコールなどの滑剤および可塑剤、モンタン酸およびその塩、そのエステル、そのハーフエステル、ステアリルアルコール、ステアラミドおよびエチレンワックスなどの離型剤、亜リン酸塩、次亜リン酸塩などの着色防止剤、ハロゲン系難燃剤、リン系やシリコーン系の非ハロゲン系難燃剤、核剤、アミン系、スルホン酸系、ポリエーテル系などの帯電防止剤、顔料などの着色剤などの添加剤を任意に含有させてもよい。ただし、その添加剤保有の色が本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体に悪影響を及ぼさない範囲で添加する必要がある。 Furthermore, the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention includes hindered phenol-based, benzotriazole-based, benzophenone-based, benzoate-based, and cyanoacrylate-based ultraviolet absorbers within the range not impairing the object of the present invention. Antioxidants, higher fatty acids, acid esters and acid amides, lubricants and plasticizers such as higher alcohols, release agents such as montanic acid and salts thereof, esters thereof, half esters, stearyl alcohol, stearamide and ethylene wax , Anti-coloring agents such as phosphites and hypophosphites, halogen flame retardants, phosphorous and silicone non-halogen flame retardants, nucleating agents, amines, sulfonic acids, polyethers, etc. Additives such as colorants such as inhibitors and pigments may be optionally added. However, it is necessary to add in a range where the color of the additive does not adversely affect the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention.
これら添加剤の混合方法としては、本発明で用いる（Ａ）熱可塑性共重合体中に、これら添加剤が十分に分散する方法であれば特に制限は無いが、（Ｂ）原共重合体の製造時、（Ａ）熱可塑性共重合体製造時あるいは本発明のバイオチップ用基板製造時に混合することができるが、好ましくは（Ａ）熱可塑性共重合体製造時あるいは本発明のバイオチップ用基板製造時である。 The method for mixing these additives is not particularly limited as long as these additives are sufficiently dispersed in the (A) thermoplastic copolymer used in the present invention. It can be mixed at the time of manufacture, (A) at the time of manufacturing the thermoplastic copolymer, or at the time of manufacturing the biochip substrate of the present invention, preferably (A) at the time of manufacturing the thermoplastic copolymer or the substrate for the biochip of the present invention. At the time of manufacture.
ところで、上記のような共重合体にてバイオチップ用基板を作製する場合、ガラス、セラミック、金属などに比較し、射出成形方法やホットエンボス法などを用いることにより、微細な形状を設けた基材（バイオチップ）をより簡単に大量生産することが可能である。そこで、選択結合性物質が固定化されるバイオチップ用基板の形状について述べる。本発明の選択結合性物質が固定化されるバイオチップ用基板には凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化される。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な選択結合性物質物質が固定化されたバイオチップを提供することができる。そして、凹凸部の複数の凸部の高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいう。さらに本発明のバイオチップには、平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１が平坦部であり、かつ、２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。そして、該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、５０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一であることが好ましい。ここで、平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。具体的に高さの差が略同一とは、凹凸部凸部上面の高さと、平坦部の高さとの差が１００μｍより小さいことをいう。 By the way, when producing a biochip substrate with the copolymer as described above, a substrate having a fine shape is formed by using an injection molding method, a hot embossing method, or the like as compared with glass, ceramic, metal, or the like. It is possible to mass-produce materials (biochips) more easily. Therefore, the shape of the biochip substrate on which the selective binding substance is immobilized will be described. The biochip substrate for selective binding substance of the present invention are immobilized has uneven portion, selectivity adapted substance protrusion upper surface Ru immobilized. By adopting such a structure, at the time of detection, a non-specifically adsorbed specimen is not detected as described later, so that the selective binding substance substance with low noise and consequently better S / N is obtained. Can be provided. And about the height of the some convex part of an uneven | corrugated | grooved part, it is preferable that the height of the upper surface of a convex part is substantially the same. Here, when the height is substantially the same, a selective binding substance is immobilized on the surface of a convex part having a slightly different height, and this is reacted with a fluorescently labeled analyte, and then scanned with a scanner. The height at which the difference in signal level strength does not matter. Specifically, “the heights are substantially the same” means that the difference in height is less than 100 μm. Furthermore, the biochip of the present invention is preferably provided with a flat portion. Specific examples are shown in FIGS. 1 is a flat portion, and a selective binding substance (for example, nucleic acid) is immobilized on the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion indicated by 2. And it is preferable that the upper surface of the convex part of this uneven | corrugated | grooved part is substantially flat. Here, the fact that the upper surface of the convex portion is substantially flat means that there is no unevenness of 50 μm or more. Furthermore, it is preferable that the height of the upper surface of the convex part of the uneven part and the height of the flat part are substantially the same. Here, the heights of the flat portion and the uneven portion are substantially the same height when the signal level is not lowered when scanned by the scanner. Specifically, the difference in height is substantially the same, which means that the difference between the height of the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion and the height of the flat portion is smaller than 100 μm.
すなわち、一般にマイクロアレイは、蛍光標識化された検体と基材に固定化された選択結合性物質とを反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。この集光された光をマイクロアレイの表面に照射して、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、この条件のまま、対物レンズもしくは、マイクロアレイ自体を走査することによりマイクロアレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっている。 That is, in general, a microarray generally reacts a fluorescently labeled specimen with a selective binding substance immobilized on a substrate and reads fluorescence with a device called a scanner. The scanner condenses the laser light by narrowing down the laser light as excitation light with an objective lens. The condensed light is irradiated on the surface of the microarray, and the laser beam is focused on the surface of the microarray. Under this condition, the fluorescence generated from the microarray is read by scanning the objective lens or the microarray itself.
このような、スキャナーを用いて本発明の凸部上面に選択結合性物質を固定化したバイオチップ（基材）をスキャンすると、凹凸部の凹部に非特異的に吸着した検体ＤＮＡの蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果を発揮する。この理由は、凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部ではレーザー光がデフォーカスされるからである。逆に言えば、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。なぜなら、凸部上面の高さにこれ以上のばらつきがあると、スキャナーの焦点深度の関係で正確な蛍光強度を測定できないことが起こりうるからである。 When a biochip (base material) having a selective binding substance immobilized on the upper surface of the convex portion of the present invention is scanned using such a scanner, the fluorescence (noise) of the sample DNA adsorbed nonspecifically to the concave portion of the concave and convex portion is scanned. ) Is difficult to detect. This is because the laser beam is focused on the upper surface of the convex portion, so that the laser beam is defocused in the concave portion. In other words, the difference between the height of the upper surface of the highest convex portion and the height of the upper surface of the lowest convex portion among the plurality of convex portions to which the selective binding substance is immobilized is preferably 50 μm or less. This is because if there is more variation in the height of the upper surface of the convex portion, it may happen that accurate fluorescence intensity cannot be measured due to the depth of focus of the scanner.
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であれば良いが、３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。 The difference between the height of the upper surface of the highest convex portion and the height of the upper surface of the lowest convex portion among the plurality of convex portions to which the selective binding substance is immobilized may be 50 μm or less, but 30 μm or less. It is more preferable that the height is the same. In addition, the same height as used in this application shall also include the error by the dispersion | variation which generate | occur | produces by production etc.
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうのであって、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。 The plurality of convex portions on which the selective binding substance is immobilized means a portion on which the selective binding substance (for example, nucleic acid) necessary as data is immobilized, and is simply a dummy selective binding substance. The part where is fixed is excluded.
また、一般にスキャナーの焦点を調整する方法は、以下の通りである。すなわち、スキャナーがマイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、マイクロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、図３に示すように、治具にマイクロアレイを突き当て、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、その条件のまま、マイクロアレイ全体をスキャンする。したがって、本発明の担体には、特に凹凸部と平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図１、図２に示す。１１が平坦部であり、かつ、１２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。このようにしておけば、選択結合性物質が固定化された基材をスキャンする場合は、いったん平坦部の上面で励起光の焦点を合わせたり、平坦部を治具に突き当てることが可能である。すなわち、スキャナーの焦点合わせが容易になる。このようにして、平坦部で励起光の焦点を合わせるので、選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、平坦であり、かつ、凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。
In general, the method of adjusting the focus of the scanner is as follows. That is, when the scanner focuses the excitation light on the surface of the microarray, the excitation light is focused at the corner of the microarray, or as shown in FIG. Fit to microarray surface. Then, the entire microarray is scanned under the conditions. Therefore, the carrier of the present invention is particularly preferably provided with an uneven portion and a flat portion. Specific examples are shown in FIGS.
凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍより大きいと、以下のような問題点が生じることがある。すなわち、励起光の焦点は平坦部の上面で調整されているので、凸部の上面の高さが異なると、凸部上面での励起光の焦点がぼやけてしまい、最悪の場合、選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く検出されないことが起こりうる。同様なことは、凸部上面と高さが同じ平坦部が設けられていない場合でも起こりうる。 If the difference between the height of the upper surface of the convex part and the height of the flat part is larger than 50 μm, the following problems may occur. That is, since the focal point of the excitation light is adjusted on the upper surface of the flat part, if the height of the upper surface of the convex part is different, the focal point of the excitation light on the upper surface of the convex part is blurred. It may happen that no fluorescence due to the reaction between the substance and the analyte is detected. The same thing can occur even when a flat portion having the same height as the upper surface of the convex portion is not provided.
また、凸部の上面が平坦でない場合、凸部上面での励起光の焦点の大きさにばらつきが起き、結果的に１つの凸部上面内で検出された蛍光の強さにむらが発生する。こうなると、後の解析が困難となる。本願の場合は、上記のような問題は起きず、良好なシグナル（蛍光）を得ることが可能である。 In addition, when the upper surface of the convex portion is not flat, the focal spot size of the excitation light on the upper surface of the convex portion varies, and as a result, the intensity of fluorescence detected in one upper surface of the convex portion varies. . If this happens, later analysis becomes difficult. In the case of the present application, the above problem does not occur, and a good signal (fluorescence) can be obtained.
なお、凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、５０μｍ以下であればよいが、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。 The difference between the height of the upper surface of the convex portion and the height of the flat portion may be 50 μm or less, more preferably 30 μm or less, and the height of the upper surface of the convex portion and the height of the flat portion are the same. It is still preferable if it exists. In addition, the same height as used in this application shall also include the error by the dispersion | variation which generate | occur | produces by production etc.
また本発明では、平面上の基材に選択結合性物質を点着するのではなく、凹凸部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。したがって、凸部上面以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、凸部上面以外の部分では、励起光の焦点がぼやけてるため、望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光を検出することがない。このため、ノイズが小さくなり、結果的にＳ／Ｎが良くなるという効果を発揮する。 Further, in the present invention, the selective binding substance is immobilized only on the upper surface of the convex part of the concavo-convex part, instead of spotting the selective binding substance on the substrate on the plane. Therefore, even if the specimen sample is non-specifically adsorbed on a portion other than the top surface of the convex portion, the focus of the excitation light is blurred on the portion other than the top surface of the convex portion. No fluorescence is detected. For this reason, the noise is reduced, and as a result, the S / N ratio is improved.
また、凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。このようにすることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。 Moreover, it is preferable that the area of the upper surface of a convex part is substantially the same. By doing in this way, the area of the part by which various selective binding substances are immobilized can be made the same, which is advantageous for later analysis. Here, the area of the upper part of the convex part is substantially the same means that the value obtained by dividing the largest upper surface area in the convex part by the smallest upper surface area is 1.2 or less.
凸部の上面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、４ｍｍ２以下、１０μｍ２以上が好ましい。 The area of the upper surface of the convex portion is not particularly limited, but is preferably 4 mm 2 or less and 10 μm 2 or more from the viewpoint that the amount of the selective binding substance can be reduced and handling is easy.
凹凸部における凸部の高さとしては、０．０１ｍｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが１ｍｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。 The height of the convex portion in the concavo-convex portion is preferably 0.01 mm or more and 1 mm or less. If the height of the convex portion is lower than this, a non-specifically adsorbed specimen sample other than the spot may be detected, resulting in a poor S / N. Further, when the height of the convex portion is 1 mm or more, there may be a problem that the convex portion is easily broken and damaged.
また、少なくとも凸部の側面に導電性材料が設けられていることが好ましい。こうすると、例えば、対抗電極を設け、対抗電極とこの導電性材料の間に電流、電圧を印加することにより核酸の場合であるとハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。導電性材料がコートされる好ましい領域としては、凹部の全部、凸部の側面全部である。その例を図４に示す。 Moreover, it is preferable that the conductive material is provided at least on the side surface of the convex portion. In this case, for example, in the case of nucleic acid, hybridization can be accelerated by providing a counter electrode and applying a current and voltage between the counter electrode and the conductive material. Preferred regions to be coated with the conductive material are all the concave portions and all the side surfaces of the convex portions. An example is shown in FIG.
印加する電圧の範囲としては、電流が流れる場合は、０．０１Ｖ以上、２Ｖ以下の範囲が好ましい。特に好ましい範囲は、０．１Ｖ以上、１．５Ｖ以下である。これより、大きい電圧を印加すると水が電気分解をおこし、表面の選択結合性物質に悪影響を及ぼす場合がある。導電性材料の材質としては特に限定されないが、炭素、マグネシウム、アルミ、シリコン、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、錫、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、白金、金、ステンレスやこれらの混合物や導電性ポリマーが挙げられる。この中でも、白金、金、チタンが特に好ましく用いられる。これらの導電性材料の膜の作製方法としては、蒸着、スパッタ、ＣＶＤ、メッキなどが挙げられる。 As a range of the voltage to be applied, a range of 0.01 V or more and 2 V or less is preferable when a current flows. A particularly preferable range is 0.1 V or more and 1.5 V or less. From this, when a large voltage is applied, water causes electrolysis, which may adversely affect the surface selective binding substance. The material of the conductive material is not particularly limited, but carbon, magnesium, aluminum, silicon, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, tin, zirconium, niobium, molybdenum, palladium, silver, hafnium, Examples include tantalum, tungsten, platinum, gold, stainless steel, mixtures thereof, and conductive polymers. Among these, platinum, gold, and titanium are particularly preferably used. Examples of a method for forming these conductive material films include vapor deposition, sputtering, CVD, and plating.
上記のように凸部に導電性材料をコートした場合は、凸部の上面以外はさらに絶縁材料の層を設けることが好ましい。絶縁材料の層があると、電流を流した場合凸部の上面にのみ被検体を引き寄せることが可能である。絶縁材料の材料としては、金属の酸化物（例えば、Ａｌ−Ｏ、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＶＯ、ＳｎＯ、Ｃｒ−Ｏ、Ｚｎ−Ｏ、ＧｅＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2、Ｎｂ−Ｏ、Ｙ2Ｏ3など）、窒化物（Ａｌ−Ｎ、Ｓｉ3Ｎ4、ＴｉＮ、Ｔａ−Ｎ、Ｇｅ−Ｎ、Ｚｒ−Ｎ、ＮｂＮなど）、硫化物（ＺｎＳ、ＰｂＳ、ＳｎＳ、ＣｕＳ）、絶縁性のポリマーが挙げられる。 When the conductive material is coated on the convex portion as described above, it is preferable to further provide a layer of an insulating material other than the upper surface of the convex portion. When there is a layer of insulating material, it is possible to draw the subject only on the upper surface of the convex portion when a current is passed. Examples of the insulating material include metal oxides (for example, Al—O, SiO 2 , TiO 2 , VO, SnO, Cr—O, Zn—O, GeO 2 , Ta 2 O 5 , ZrO 2 , Nb—O). , Y etc. 2 O 3), nitride (Al-N, Si 3 N 4, TiN, Ta-N, Ge-N, Zr-N, NbN , etc.), sulfides (ZnS, PbS, SnS, CuS), An insulating polymer may be mentioned.
このように作製されたバイオチップ用基板は、基板表面に酸無水物単位を有するので、特別な処理を施すことなく、基板表面にアミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を共有結合により容易に固定化することが可能となる。また、酸やアルカリで軽く加水分解分解を行うと、カルボキシル基を生成でき、アミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を共有結合により容易に固定化することが可能である。本発明においては、酸無水物またはカルボキシル基とアミノ基または水酸基の結合反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤を用いることもできる。これら縮合剤の中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易であり、選択結合性物質と担体表面の酸無水物またはカルボキシル基との縮合反応には特に好ましく用いられる。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、酸無水物が表面に生成された担体を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面を活性化しておいても良い。 Since the biochip substrate thus prepared has an acid anhydride unit on the substrate surface, a selective binding substance having an amino group or a hydroxyl group on the substrate surface can be easily bonded by covalent bonding without any special treatment. It can be fixed. Further, when lightly hydrolyzing with an acid or alkali, a carboxyl group can be generated, and a selective binding substance having an amino group or a hydroxyl group can be easily immobilized by a covalent bond. In the present invention, various condensing agents such as dicyclohexylcarbodiimide and N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate are used in order to promote the bonding reaction between an acid anhydride or carboxyl group and an amino group or hydroxyl group. It can also be used. Among these condensing agents, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) is less toxic and relatively easy to remove from the reaction system. It is particularly preferably used for the condensation reaction with an acid anhydride or a carboxyl group. These condensing agents such as EDC may be used by mixing with a solution of a selective binding substance, or by immersing a carrier in which an acid anhydride is formed on the surface in an EDC solution in advance to activate the surface. You can leave it.
このような縮合剤を用い、基板表面の酸無水物またはカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により基板表面と選択結合性物質が固定化されることになり、基板表面の酸無水物またはカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により基板表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を基板に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。 When such a condensing agent is used to react an acid anhydride or carboxyl group on the substrate surface with an amino group of the selective binding substance, the substrate surface and the selective binding substance are immobilized by an amide bond. Thus, when the acid anhydride or carboxyl group on the substrate surface is reacted with the hydroxyl group of the selective binding substance, the substrate surface and the selective binding substance are fixed by an ester bond. The temperature at which the sample containing the selective binding substance is allowed to act on the substrate is preferably 5 ° C to 95 ° C, more preferably 15 ° C to 65 ° C. The treatment time is usually 5 minutes to 24 hours, preferably 1 hour or longer.
上述した簡便な方法により、基板表面に選択結合性物質を固定化することにより、非特異的な検体の吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性物質を固定化できる。 By immobilizing a selective binding substance on the substrate surface by the simple method described above, nonspecific analyte adsorption is suppressed, and the selective binding substance is fixed firmly and densely by covalent bonding. Can be
上述の方法により得られた選択結合性物質固定化基板は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。 The selective binding substance-immobilized substrate obtained by the above-described method can be appropriately treated after fixing the selective binding substance. For example, the fixed selective binding substance can be denatured by performing heat treatment, alkali treatment, surfactant treatment, or the like.
また、選択結合性物質固定化基板は、蛍光標識化された検体と基板に固定化された選択結合性物質とをハイブリダイゼーション反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。しかし、基板表面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。基板に黒色を呈し、またレーザー照射により発光を生じない物質を含有させて少なくとも表面を黒色にすることは、基板自身からの自家蛍光を低減させることができる点で好ましい。このような基板を用いることにより、検出の際、基板からの自家蛍光を低減できるのでよりノイズが小さく、結果的にシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が良好な選択結合性物質が固定化された基板を提供することができる。 In general, a selective binding substance-immobilized substrate undergoes a hybridization reaction between a fluorescently labeled specimen and a selective binding substance immobilized on the substrate, and reads fluorescence with a device called a scanner. The scanner condenses the laser light by narrowing down the laser light as excitation light with an objective lens. However, when autofluorescence is generated from the substrate surface, the emitted light becomes noise and may lead to a decrease in detection accuracy. It is preferable that the substrate has a black color and contains a substance that does not emit light by laser irradiation so that at least the surface is black because autofluorescence from the substrate itself can be reduced. By using such a substrate, the autofluorescence from the substrate can be reduced during detection, so that the noise is smaller, and as a result, a selective binding substance with a good signal / noise (S / N) ratio is immobilized. A substrate can be provided.
ここで、基板が黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、基板の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、基板の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。 Here, the black substrate means that the spectral reflectance of the black portion of the substrate does not have a specific spectral pattern (such as a specific peak) in the visible light (wavelength range of 400 nm to 800 nm) and is a uniformly low value. In addition, the spectral transmittance of the black portion of the substrate also has a specific spectral pattern and is uniformly low.
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２ 条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。 As the values of the spectral reflectance and the spectral transmittance, the spectral reflectance in the range of visible light (wavelength is 400 nm to 800 nm) is 7% or less, and the spectral transmittance in the same wavelength range is 2% or less. Is preferred. Note that the spectral reflectance here refers to the spectral reflectance when regular reflected light from the substrate is captured in an illumination / light-receiving optical system conforming to JIS Z 8722 Condition C.
黒色にする手段としては、基板に黒色物質を含有させることにより達成しうるが、この黒色物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。 As a means for blackening, it can be achieved by adding a black substance to the substrate. Preferred examples of the black substance include carbon black, graphite, titanium black, aniline black, Ru, Mn, Ni, Cr, Black materials such as Fe, Co and Cu oxides, carbides of Si, Ti, Ta, Zr and Cr can be used.
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、チタンブラックを好ましく含有させることができ、ポリマーに一様に分散しやすいことから特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。 These black materials can be contained alone or in combination of two or more. Among these black materials, carbon black and titanium black can be preferably contained, and carbon black can be particularly preferably used because it is easily dispersed uniformly in the polymer.
ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。なかでも「選択結合性物質」として核酸を用いる場合には、本発明のバイオチップ基板が有する特性を充分活かすことができるので特に好ましい。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、長さが２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。 Here, the “selective binding substance” means a substance that can selectively bind to a test substance directly or indirectly, and representative examples thereof include nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic properties. A compound can be mentioned. The nucleic acid may be DNA, RNA or PNA. A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Falls under the category of Examples of the protein include an antibody and an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a “selective binding substance”. As the saccharide, a polysaccharide is preferable, and various antigens can be exemplified. In addition, substances having antigenicity other than proteins and saccharides can be immobilized. The selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance or may be obtained from a living cell or the like. In particular, the use of a nucleic acid as the “selective binding substance” is particularly preferable because the characteristics of the biochip substrate of the present invention can be fully utilized. Among these nucleic acids, nucleic acids called oligonucleic acids having a length of 10 to 100 bases can be easily artificially synthesized with a synthesizer, and the amino group at the end of the nucleic acid can be easily modified. It is preferable because it can be easily fixed on the surface of the carrier. Furthermore, when the length is less than 20 bases, 20 to 100 bases are more preferable from the viewpoint of low hybridization stability. In order to maintain the stability of hybridization, the range of 40 to 100 bases is particularly preferable.
本発明の担体を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。 Examples of the test substance used in the measurement method using the carrier of the present invention include nucleic acids to be measured, for example, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes of genetic diseases, and a part thereof, and various living organisms having antigenicity. Examples include components, antibodies against pathogenic bacteria, viruses and the like, but are not limited thereto. Examples of specimens containing these test substances include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, various tissue fluids, various foods and beverages, and dilutions thereof. It is not limited to these. Moreover, the nucleic acid to be the test substance may be labeled with a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the nucleic acid as a template. In the latter case, the measurement sensitivity can be greatly improved. When a nucleic acid amplification product is used as a test substance, the amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleotide triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like. When the test substance is an antigen or antibody, the test substance antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method, or the test substance antigen or antibody may be bound to a selective binding substance. Thereafter, the carrier is washed, and a labeled antibody or antigen that reacts with the antigen or antibody with an antigen-antibody is reacted, and the label bound to the carrier can be measured.
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。 The step of causing the immobilized substance and the test substance to interact can be performed in the same manner as in the past. The reaction temperature and time are appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be hybridized, the type of antigen and / or antibody involved in the immune reaction, and in the case of nucleic acid hybridization, usually 50 ° C. to 70 ° C. In the case of an immune reaction, it is usually from room temperature to about 40 ° C. for about 1 minute to several hours.
以下、実施例により本発明の構成、効果をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（Ａ）熱可塑性共重合体の製造
（Ａ−１）：
容量が５リットルで、バッフルおよびファウドラ型撹拌翼を備えたステンレス製オートクレーブに、メタクリル酸メチル／アクリルアミド共重合体系懸濁剤（以下の方法で調製した。メタクリル酸メチル２０重量部、アクリルアミド８０重量部、過硫酸カリウム０．３重量部、イオン交換水１５００重量部を反応器中に仕込み反応器中を窒素ガスで置換しながら７０℃に保った。反応は単量体が完全に、重合体に転化するまで続け、メタクリル酸メチルとアクリルアミド共重合体の水溶液として得た。得られた水溶液を懸濁剤として使用した）０．０５部をイオン交換水１６５部に溶解した溶液を供給し、４００ｒｐｍで撹拌し、系内を窒素ガスで置換した。次に、下記混合物質を反応系を撹拌しながら添加し、７０℃に昇温した。内温が７０℃に達した時点を重合開始として、１８０分間保ち、重合を終了した。以降、通常の方法に従い、反応系の冷却、ポリマーの分離、洗浄、乾燥を行い、ビーズ状の（Ｂ−１）原共重合体を得た。この（Ｂ−１）原共重合体の重合率は９８％であった。
Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
(A) Production of thermoplastic copolymer (A-1):
A methyl methacrylate / acrylamide copolymer suspension (prepared by the following method: 20 parts by weight of methyl methacrylate, 80 parts by weight of acrylamide) was added to a stainless steel autoclave having a capacity of 5 liters and equipped with a baffle and a foudra-type stirring blade. Then, 0.3 parts by weight of potassium persulfate and 1500 parts by weight of ion-exchanged water were charged into the reactor and maintained at 70 ° C. while replacing the reactor with nitrogen gas. The resulting solution was obtained as an aqueous solution of methyl methacrylate and an acrylamide copolymer (using the obtained aqueous solution as a suspending agent), and a solution prepared by dissolving 0.05 part in 165 parts of ion-exchanged water was supplied at 400 rpm. And the inside of the system was replaced with nitrogen gas. Next, the following mixed substances were added while stirring the reaction system, and the temperature was raised to 70 ° C. The time when the internal temperature reached 70 ° C. was set as the start of polymerization, and kept for 180 minutes to complete the polymerization. Thereafter, the reaction system was cooled, the polymer was separated, washed, and dried according to the usual method to obtain a bead-like (B-1) raw copolymer. The polymerization rate of this (B-1) raw copolymer was 98%.
メタクリル酸（ＭＡＡ） ３０重量部
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ） ７０重量部
ｔ−ドデシルメルカプタン １．２重量部
２，２’−アゾビスイソブチロニトリル ０．３２重量部
このビーズ状の（Ｂ−１）原共重合体を、スクリュウ径３０ｍｍ、Ｌ／Ｄが４５．５のベント付き同方向回転２軸押出機（日本製鋼所社製 ＴＥＸ３０ＸＳＳＳＴ）のホッパー口より５ｋｇ／ｈで供給して、樹脂温度２８０℃、スクリュウ回転数１００ｒｐｍで溶融押出し、ペレット状のグルタル酸無水物単位を含有する（Ａ−１）熱可塑性共重合体を得た。この際の滞留時間（原料を供給してから、吐出口より吐出されるまでの時間）は、約７分であった。得られた（Ａ−１）熱可塑性共重合体を赤外分光光度計を用いて分析した結果、１８００ｃｍ-1及び１７６０ｃｍ-1に吸収ピークが確認され、この（Ａ−１）熱可塑性共重合体中にグルタル酸無水物単位が形成していることを確認した。また、この共重合体を重ジメチルスルホキシドに溶解させ、室温（２３℃）にて1Ｈ−ＮＭＲを測定し、共重合体組成を決定したところ、メタクリル酸メチル単位７３重量％、グルタル酸無水物単位２０重量％、メタクリル酸単位７重量％であった。また、この（Ａ−１）熱可塑性共重合体の極限粘度は０．４１ｄｌ／ｇであった。
Methacrylic acid (MAA) 30 parts by weight Methyl methacrylate (MMA) 70 parts by weight t-dodecyl mercaptan 1.2 parts by weight 2,2′-azobisisobutyronitrile 0.32 parts by weight This bead-like (B-1 ) The raw copolymer was supplied at a rate of 5 kg / h from the hopper port of a vented co-rotating twin screw extruder (TEX30XSSST manufactured by Nippon Steel) with a screw diameter of 30 mm and an L / D of 45.5. It was melt-extruded at 280 ° C. and a screw rotation speed of 100 rpm to obtain (A-1) a thermoplastic copolymer containing pellet-like glutaric anhydride units. The residence time (time from supplying the raw material to discharging from the discharge port) was about 7 minutes. The resulting (A-1) results of the thermoplastic copolymer was analyzed with an infrared spectrophotometer, absorption peaks were observed at 1800 cm -1 and 1760 cm -1, the (A-1) a thermoplastic copolycondensates It was confirmed that glutaric anhydride units were formed in the coalescence. Further, this copolymer was dissolved in deuterated dimethyl sulfoxide, and 1 H-NMR was measured at room temperature (23 ° C.) to determine the copolymer composition. As a result, 73 wt% of methyl methacrylate units, glutaric anhydride were obtained. The unit was 20% by weight and the methacrylic acid unit was 7% by weight. The intrinsic viscosity of the (A-1) thermoplastic copolymer was 0.41 dl / g.
（Ａ−２）：
上記ビーズ状の（Ｂ−１）原共重合体およびナトリウムメトキシド（原共重合体１００重量％に対し、０．１重量％となる量）を、スクリュウ径３０ｍｍ、Ｌ／Ｄが４５．５のベント付き同方向回転２軸押出機（日本製鋼所社製 ＴＥＸ３０ＸＳＳＳＴ）のホッパー口より５ｋｇ／ｈで供給して、樹脂温度２８０℃、スクリュウ回転数１００ｒｐｍで溶融押出し、ペレット状のグルタル酸無水物単位を含有する（Ａ−２）熱可塑性共重合体を得た。この際の滞留時間（原料を供給してから、吐出口より吐出されるまでの時間）は、約７分であった。得られた（Ａ−２）熱可塑性共重合体を赤外分光光度計を用いて分析した結果、１８００ｃｍ-1及び１７６０ｃｍ-1に吸収ピークが確認され、この（Ａ−２）熱可塑性共重合体中にグルタル酸無水物単位が形成していることを確認した。また、この共重合体を重ジメチルスルホキシドに溶解させ、室温（２３℃）にて1Ｈ−ＮＭＲを測定し、共重合体組成を決定したところ、メタクリル酸メチル単位７３重量％、グルタル酸無水物単位２６重量％、メタクリル酸単位１重量％であった。また、この（Ａ−２）熱可塑性共重合体の極限粘度は０．４２ｄｌ／ｇであった。
(A-2):
The bead-shaped (B-1) raw copolymer and sodium methoxide (amount of 0.1% by weight with respect to 100% by weight of the raw copolymer) were prepared using a screw diameter of 30 mm and an L / D of 45.5. Supplied at a rate of 5 kg / h from the hopper port of the same-direction rotating twin-screw extruder with a vent (TEX30XSSST, manufactured by Nippon Steel) A (A-2) thermoplastic copolymer containing units was obtained. The residence time (time from supplying the raw material to discharging from the discharge port) was about 7 minutes. The resulting (A-2) results a thermoplastic copolymer was analyzed with an infrared spectrophotometer, absorption peaks were observed at 1800 cm -1 and 1760 cm -1, the (A-2) a thermoplastic copolycondensates It was confirmed that glutaric anhydride units were formed in the coalescence. Further, this copolymer was dissolved in deuterated dimethyl sulfoxide, and 1 H-NMR was measured at room temperature (23 ° C.) to determine the copolymer composition. As a result, 73 wt% of methyl methacrylate units, glutaric anhydride were obtained. The unit was 26% by weight and the methacrylic acid unit was 1% by weight. Further, the intrinsic viscosity of this (A-2) thermoplastic copolymer was 0.42 dl / g.
（Ａ−３）：ペレット状の上記（Ａ−２）熱可塑性共重合体９０重量部に対し、カーボンブラック（三菱化学社製 ♯３０５０Ｂ、初期粒径４０ｎｍ）１０重量部を、スクリュウ径３０ｍｍ、Ｌ／Ｄが４５．５のベント付き同方向回転２軸押出機（日本製鋼所社製 ＴＥＸ３０ＸＳＳＳＴ）のホッパー口より５ｋｇ／ｈで供給して、樹脂温度２８０℃、スクリュウ回転数１００ｒｐｍで溶融押出し、黒色ペレット状の（Ａ−３）熱可塑性共重合体を得た。 (A-3): 10 parts by weight of carbon black (Mitsubishi Chemical Corporation # 3050B, initial particle size 40 nm), 90 mm by weight of the pellet-shaped (A-2) thermoplastic copolymer, 30 mm in screw diameter, L / D is supplied at a rate of 5 kg / h from the hopper port of a vented co-rotating twin screw extruder (TEX30XSSST, manufactured by Nippon Steel), and melt extruded at a resin temperature of 280 ° C. and a screw rotation speed of 100 rpm. A black pellet-shaped (A-3) thermoplastic copolymer was obtained.
（Ｃ−１）：ＰＣである帝人化成社製“パンライト”ＡＤ５５０３を使用した。 (C-1): “Panlite” AD5503 manufactured by Teijin Chemicals Ltd., which is a PC, was used.
（Ｃ−２）：ＰＭＭＡである住友化学社製“スミペックス”ＭＧを使用した。 (C-2): “SUMIPEX” MG manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd., which is PMMA, was used.
（Ｃ−３）：５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（メルトフローレート（ＭＦＲ）＝２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、ガラス転移温度１４０℃）を使用した。 (C-3): Hydrogenated ring-opening polymer of 5-methyl-2-norbornene (melt flow rate (MFR) = 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, glass transition temperature 140 ° C. )It was used.
参考例１〜３
厚さ１．２ｍｍ、直径１２７ｍｍの合成石英ガラス上に、スパッタリングによりエッチングマスクとして厚さ１５０ｎｍのＳｉ膜を作製した。この上にフォトレジスト（東京応化社製ＯＦＰＲ５０００）をスピナーで３μｍの厚みに塗布した。その後、マスクを介してＵＶ光をフォトレジストに照射した。そして現像し、露光した部分のフォトレジストを除去した。次に、現像まで行ったガラス基板を真空容器内にいれ、ＳＦ６ガスを導入しリアクティブイオンエッチングを行った。こうして、露光した部分のＳｉ膜（エッチングマスク）を除去した。続いてパーターニングされたフォトレジストとエッチングマスクの両方をマスクとして、４５％フッ酸水溶液にて室温にてエッチングした。次に酸素雰囲気下でプラズマエッチングを行い、フォトレジストを灰化してフォトレジストを除去した。さらにＳＦ６雰囲気下でリアクティブイオンエッチングを行い、エッチングマスクを除去した。このようにして、合成石英製の母基板をえた。この母基板に刻まれた溝のディメンジョンは、断面が半円状であり、もっとも幅の広い部分、すなわち溝の一番上の部分は、幅５０μｍであった。深さは２０μｍであった。
Reference Examples 1-3
On a synthetic quartz glass having a thickness of 1.2 mm and a diameter of 127 mm, a Si film having a thickness of 150 nm was formed as an etching mask by sputtering. A photoresist (OFPR5000 manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was applied to the thickness of 3 μm on this with a spinner. Thereafter, the photoresist was irradiated with UV light through a mask. Then, development was performed to remove the exposed portion of the photoresist. Next, the glass substrate that had been developed was placed in a vacuum vessel, and SF 6 gas was introduced to perform reactive ion etching. Thus, the exposed portion of the Si film (etching mask) was removed. Subsequently, etching was performed at room temperature with a 45% aqueous hydrofluoric acid solution using both the patterned photoresist and the etching mask as a mask. Next, plasma etching was performed in an oxygen atmosphere, and the photoresist was ashed to remove the photoresist. Further, reactive ion etching was performed in an SF 6 atmosphere to remove the etching mask. In this way, a mother substrate made of synthetic quartz was obtained. The dimension of the groove carved in the mother substrate was semicircular in cross section, and the widest part, that is, the uppermost part of the groove, had a width of 50 μm. The depth was 20 μm.
次にこの母基板上にスパッタリングで厚さ１００ｎｍのＮｉを作製し導通処理した。このＮｉ導電膜を電極としてＮｉを１２０分間電鋳めっきし、０．４ｍｍ厚のＮｉ板を作製した。次に、Ｎｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、（Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３）熱可塑性共重合体を、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー内に窒素を流し込みながら、シリンダー温度２７０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。 Next, Ni having a thickness of 100 nm was formed on the mother substrate by sputtering and subjected to conduction treatment. Using this Ni conductive film as an electrode, Ni was electroformed for 120 minutes to produce a 0.4 mm thick Ni plate. Next, the Ni plate was peeled from the mother substrate and lined with a metal plate. This is set in a mold having a cavity of 76 mm × 26 mm × 1 mm, and (A-1, A-2, A-3) thermoplastic copolymer is used as a Sumitomo Promat 40/25 (25 t) injection molding machine. Then, while flowing nitrogen into the cylinder, a cylinder temperature of 270 ° C. and a mold temperature of 80 ° C. were set, and a flat plate having a thickness of 1 mm was formed. In the obtained flat plate, a groove having a width of 50 μm and a depth of 20 μm was formed on the surface thereof. This molded piece was used and evaluated by the following method.
比較例１
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−１）ＰＣである帝人化成社製“パンライト”ＡＤ５５０３を、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２８０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
Comparative Example 1
The Ni plate prepared in the same manner as in Reference Examples 1 to 3 was peeled from the mother substrate and lined with a metal plate. This is set in a mold having a cavity of 76 mm × 26 mm × 1 mm, and “Panlite” AD5503 made by Teijin Chemicals Co., Ltd., which is a pellet (C-1) PC, is injected by Sumitomo Promat 40/25 (25t). A flat plate having a thickness of 1 mm was formed using a molding machine with a cylinder temperature of 280 ° C. and a mold temperature of 80 ° C. In the obtained flat plate, a groove having a width of 50 μm and a depth of 20 μm was formed on the surface thereof. This molded piece was used and evaluated by the following method.
比較例２
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−２）ＰＭＭＡである住友化学社製“スミペックス”ＭＧを、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２３０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
Comparative Example 2
The Ni plate prepared in the same manner as in Reference Examples 1 to 3 was peeled from the mother substrate and lined with a metal plate. This is set in a mold having a cavity of 76 mm × 26 mm × 1 mm, and “Sumipex” MG manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd., which is a pellet (C-2) PMMA, is produced by Sumitomo Promat 40/25 (25t) injection molding. A flat plate having a cylinder temperature of 230 ° C. and a mold temperature of 80 ° C. and having a thickness of 1 mm was formed. In the obtained flat plate, a groove having a width of 50 μm and a depth of 20 μm was formed on the surface thereof. This molded piece was used and evaluated by the following method.
比較例３
参考例１〜３と同様に作成したＮｉ板を母基板から剥離し金属板に裏打ちした。これを７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのキャビティーをもつ金型にセットし、ペレット状の（Ｃ−３）５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物を、住友プロマット４０／２５（２５ｔ）射出成形機に供し、シリンダー温度２７０℃、金型温度８０℃とし、厚さ１ｍｍの平板を成形した。得られた平板には、表面に母基板と同じ幅５０μｍ、深さ２０μｍの溝が形成されていた。この成形片を使用し、下記方法により評価した。
Comparative Example 3
The Ni plate prepared in the same manner as in Reference Examples 1 to 3 was peeled from the mother substrate and lined with a metal plate. This was set in a mold having a cavity of 76 mm × 26 mm × 1 mm, and the hydrogenated ring-opening polymer of (C-3) 5-methyl-2-norbornene in the form of pellets was used as Sumitomo Promat 40/25. (25t) Using an injection molding machine, a cylinder temperature of 270 ° C. and a mold temperature of 80 ° C. were used to mold a flat plate having a thickness of 1 mm. In the obtained flat plate, a groove having a width of 50 μm and a depth of 20 μm was formed on the surface thereof. This molded piece was used and evaluated by the following method.
（１）耐熱性
示差走査熱量計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＤＳＣ−７型）を用い、窒素雰囲気下、２０℃／ｍｉｎの昇温速度でガラス転移温度（Ｔｇ）を測定した。
(1) Heat resistance A glass transition temperature (Tg) was measured at a rate of temperature increase of 20 ° C./min in a nitrogen atmosphere using a differential scanning calorimeter (DSC-7 manufactured by Perkin Elmer).
（２）基板への核酸の固定化およびハイブリダイゼーション
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
(2) Immobilization of nucleic acid on substrate and hybridization (immobilization of probe DNA)
The DNA of SEQ ID NO: 1 (60 bases, 5 ′ terminal amination) was synthesized. This DNA is aminated at the 5 ′ end.
このＤＮＡ（乾燥状態）を、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１リットルにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のグルタル酸無水物とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）、（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）の成形片（基板）上の平坦部分（溝が形成されていない部分）に点着した。次いで、成形片を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間インキュベートした後、純水で洗浄した。 This DNA (dry state) was dissolved in pure water at a concentration of 0.27 nmol / μl to obtain a stock solution. When spotting the substrate, PBS (NaCl 8g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 2.9g, KCl 0.2g, KH 2 PO 4 0.2g dissolved in pure water and made up to 1 liter. The final concentration of the probe is adjusted to 0.027 nmol / μl by adding hydrochloric acid for adjusting pH to pH 5.5), and glutaric anhydride on the support surface is condensed with the amino group at the end of the probe DNA. Therefore, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to make the final concentration 50 mg / ml. And about 200 nl of these mixed solutions are taken out, this is (A-1), (A-2), (A-3), (C-1), (C-2), (C-3) It spotted on the flat part (part in which the groove | channel is not formed) on a shaping | molding piece (board | substrate). Next, the molded piece was placed in a sealed plastic container, incubated at 37 ° C. and 100% humidity for 20 hours, and then washed with pure water.
なお、別途（Ａ−３）成形片を作製して、この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。 In addition, when (A-3) a molded piece was separately prepared and the spectral reflectance and spectral transmittance of this black substrate were measured, the spectral reflectance was any wavelength in the visible light region (wavelength 400 nm to 800 nm). However, it was 5% or less, and the transmittance was 0.5% or less at the same wavelength range. Neither spectral reflectance nor spectral transmittance had a specific spectral pattern (such as a peak) in the visible light region, and the spectrum was uniformly flat. The spectral reflectance is the value when specularly reflected light from the base material is captured using an apparatus (manufactured by Minolta Camera, CM-2002) equipped with an illumination / light receiving optical system conforming to the condition C of JIS Z 8722. Spectral reflectance was measured.
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号５のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調製方法を以下に示す。
(Preparation of sample DNA)
As the sample DNA, DNA of SEQ ID NO: 5 (968 bases) having a base sequence capable of hybridizing with the DNA-immobilized substrate was used. The preparation method is shown below.
配列番号２と配列番号３のＤＮＡを合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３ プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号４：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。 The DNAs of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were synthesized. This was dissolved in pure water to a concentration of 100 μM. Next, pKF3 plasmid DNA (Takara Bio Inc. product number; 3100) (SEQ ID NO: 2264 bases) was prepared, and this was used as a template. The DNAs of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 were used as primers for PCR reaction ( Amplification was performed by Polymerase Chain Reaction.
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製 製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、 配列番号２の溶液を２μｌ、配列番号３の溶液を２μｌ、 テンプレート（配列番号４）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これをエタノール沈殿により精製して、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号５（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。 The conditions for PCR are as follows. Namely, ExTaq 2 μl, 10 × ExBuffer 40 μl, dNTP Mix 32 μl (the above is attached to product number RR001A manufactured by Takara Bio Inc.), SEQ ID NO: 2 solution 2 μl, SEQ ID NO 3 solution 2 μl, Template (SEQ ID NO 4 0.2 μl was added, and the volume was made up to 400 μl with pure water. These mixed solutions were divided into four microtubes, and PCR reaction was performed using a thermal cycler. This was purified by ethanol precipitation and dissolved in 40 μl of pure water. When a part of the solution after the PCR reaction was taken and confirmed by electrophoresis, it was confirmed that the base length of the amplified DNA was about 960 bases and that SEQ ID NO: 5 (968 bases) was amplified.
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液にに２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号５：（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。 Next, a 9-base random primer (manufactured by Takara Bio Inc .; product number 3802) was dissolved at a concentration of 6 mg / ml, and 2 μl was added to the DNA solution purified after the PCR reaction. This solution was heated to 100 ° C. and then rapidly cooled on ice. 5 μl of buffer attached to Klenow Fragment (Takara Bio Inc .; product number 2140AK) and 2.5 μl of dNTP mixture (dATP, dTTP, and dGTP concentrations of 2.5 mM and dCTP concentration of 400 μM, respectively) were added thereto. . Furthermore, 2 μl of Cy3-dCTP (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; product number PA53021) was added. To this solution, 10 U of Klenow Fragment was added and incubated at 37 ° C. for 20 hours to obtain sample DNA labeled with Cy3. Since the random primer was used for labeling, the length of the sample DNA varies. The longest sample DNA is SEQ ID NO: 5: (968 bases). When the sample DNA solution was taken out and confirmed by electrophoresis, the strongest band appeared in the vicinity corresponding to 960 bases, and the region corresponding to a shorter base length was thinly smeared. This was purified by ethanol precipitation and dried.
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ***ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。 This labeled sample DNA is dissolved in 1% by weight BSA (bovine serum albumin), 5 × SSC (5 × SSC is 43.8 g of NaCl and trisodium citrate hydrate is dissolved in 22.1 g of pure water. 200 ml of NaCl, 43.8 g of NaCl and 22.1 g of trisodium citrate hydrate dissolved in pure water, and 1 ml of the mess up to 1 l. The solution is expressed as 10 × SSC, and the 5-fold diluted solution is expressed as 0.2 × SSC.), 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.01 wt% salmon sperm DNA solution (each concentration is (Final concentration), dissolved in 400 μl to obtain a solution for hybridization.
（ハイブリダイゼーション）
成形片上に固定化されたプローブＤＮＡと上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブＤＮＡが固定化されている成形片にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
(Hybridization)
The probe DNA immobilized on the molded piece was hybridized with the sample DNA. Specifically, 10 μl of a hybridization solution was dropped on the molded piece on which the probe DNA prepared previously was immobilized, and a cover glass was placed thereon. In addition, the periphery of the cover glass was sealed with a paper bond so that the hybridization solution was not dried. This was placed in a plastic container and incubated at 65 ° C. and 100% humidity for 10 hours. After incubation, the cover glass was peeled off, washed and dried.
（測定）
次いで、ハイブリダイゼーションの有無を検出するために、ハイブリダイゼーション後の成形片上の蛍光を蛍光顕微鏡（オリンパス光学）により観察した。ハイブリダイゼーションを示す蛍光が観察された場合、表１中に○印を、蛍光が観察されない場合は、×印を示した。
(Measurement)
Subsequently, in order to detect the presence or absence of hybridization, the fluorescence on the molded piece after hybridization was observed with a fluorescence microscope (Olympus Optics). When fluorescence indicating hybridization was observed, a circle mark was shown in Table 1, and when no fluorescence was observed, an X mark was shown.
次いで、定量的な議論を行うために、ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記の成形片をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を６００にした状態で測定を行った。その結果、すなわち、プローブＤＮＡを固定化した部分の蛍光（シグナル）と、プローブＤＮＡを固定化した部分以外の蛍光強度（ノイズ）をあわせて表１に示す。 Next, in order to perform a quantitative discussion, the above-mentioned molded piece was set on a DNA chip scanner (Axon Instruments GenePix 4000A), with a laser output of 33% and a photomultiplier voltage setting of 600. Measurements were made. As a result, the fluorescence (signal) of the portion where the probe DNA is immobilized and the fluorescence intensity (noise) other than the portion where the probe DNA is immobilized are shown in Table 1.
また、ハイブリダイゼーションの操作後に成形片に、反りなどの変形が認められたものを×、変形が認められなかったものを○印で示した。 In addition, the molded piece in which deformation such as warpage was recognized after the hybridization operation was indicated by x, and the case in which no deformation was observed was indicated by ◯.
参考例１〜２、比較例１〜３の比較により、本発明の参考例となるバイオチップ用基板に使用される特定の共重合体は、高い耐熱性を有し、さらに基板への核酸の固定化およびハイブリダイゼーションも容易である。 By comparison between Reference Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 to 3, the specific copolymer used for the biochip substrate which is a reference example of the present invention has high heat resistance, and further nucleic acid to the substrate. Immobilization and hybridization are also easy.
また、ＰＣおよび比較例３で使用した重合体は、良好な耐熱性を有するものの、本発明のバイオチップ用基板に使用される特定の共重合体は核酸の固定化およびハイブリダイゼーションに劣り、バイオチップ用基板としては適していないことがわかる。 Although the polymer used in PC and Comparative Example 3 has good heat resistance, the specific copolymer used in the biochip substrate of the present invention is inferior in nucleic acid immobilization and hybridization, It turns out that it is not suitable as a substrate for a chip.
また、参考例３より、バイオチップ基板を黒色化することにより、スキャナーによる観察において、ノイズが大幅に減少することが分かる。 Further, it can be seen from Reference Example 3 that the noise is greatly reduced in the observation with the scanner by blackening the biochip substrate.
本参考例では、基板の平坦な部分にＤＮＡを固定化したが、本発明の参考例となるバイオチップ用基材を用い、本参考例で示した同じ方法で、平坦部分のみならず微細な溝にもＤＮＡやタンパク質を容易に固定化できる。 In this reference example , DNA was immobilized on a flat portion of a substrate. However, using a biochip base material which is a reference example of the present invention, the same method shown in this reference example was used to make not only the flat portion but also a fine portion. DNA and protein can be easily immobilized in the groove.
比較例４
参考例１のように基板が本発明の樹脂ではなく、ガラスの場合の実験を行った。
Comparative Example 4
As in Reference Example 1, an experiment was performed in which the substrate was not the resin of the present invention but glass.
スライドガラスを１０Ｎ ＮａＯＨ水溶液に１時間浸漬したあと、純水で十分に洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のスライドガラスを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスの表面にアミノ基を導入した。 The slide glass was immersed in a 10N NaOH aqueous solution for 1 hour and then thoroughly washed with pure water. Next, after APS (3-aminopropyltriethoxysilane; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was dissolved in pure water at a ratio of 2% by weight, the slide glass was immersed for 1 hour and taken out from this solution. Dried at 110 ° C. for 10 minutes. In this way, amino groups were introduced on the surface of the glass.
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラス基板を２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラス基板の表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラス表面にカルボン酸を導入した。これをＤＮＡ固定化用基板として用いた。さらに、塩基配列１のＤＮＡを参考例１と同様の手順で上記ガラス基板に固定化した。さらに定量的な議論を行うためにこれらの基板における発光強度をスキャナーにより測定した。その結果を表２に示す。表２の結果からガラス基板では蛍光が微弱であり、Ｓ／Ｎ比が劣っていることがわかる。 Subsequently, 5.5 g of succinic anhydride was dissolved in 335 ml of 1-methyl-2-pyrrolidone. 1M 50 ml sodium borate (3.09 g boric acid and sodium hydroxide for pH adjustment was added to make up to 50 ml with pure water. PH 8.0) was added to the succinic acid solution. The glass substrate was immersed in this mixed solution for 20 minutes. After soaking, it was washed with pure water and dried. In this way, the amino group on the surface of the glass substrate was reacted with succinic anhydride to introduce carboxylic acid on the glass surface. This was used as a DNA immobilization substrate. Furthermore, the DNA of base sequence 1 was immobilized on the glass substrate in the same procedure as in Reference Example 1. For further quantitative discussion, the emission intensity of these substrates was measured with a scanner. The results are shown in Table 2. From the results in Table 2, it can be seen that the glass substrate has weak fluorescence and the S / N ratio is inferior.
また、その他の市販のアミノ基が導入されたスライドガラスを用い、上記と同様なスキームでＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーションまで行った。用いたスライドガラスは、ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライド硝子 高密度アミノ基導入タイプ（松浪硝子工業（株）製；製品番号ＳＤ０００１１）とＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製；製品番号Ｓ０８１１１０）を用いた。同様に測定した結果、これらのスライドガラスを用いても、参考例１よりもＳ／Ｎ比が劣っていた。その結果を表２に示す。 In addition, using other glass slides introduced with a commercially available amino group, DNA immobilization and hybridization were performed in the same scheme as described above. The slide glass used is a coated slide glass for DNA microarray, high density amino group introduction type (Matsunami Glass Industry Co., Ltd .; product number SD00011) and MAS coated slide glass (Matsunami Glass Industry Co., Ltd .; product number S081110). Using. As a result of measurement in the same manner, even when these slide glasses were used, the S / N ratio was inferior to that of Reference Example 1. The results are shown in Table 2.
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有する（Ａ−３）からなる基板を得た。
Example 1
(Preparation of DNA immobilization carrier)
A mold for injection molding was prepared using a known method LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung), and a substrate made of (A-3) having a shape as described later was obtained by the injection molding method.
基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部分を除き表面は平坦であった。基板の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。 The shape of the substrate was 76 mm in length, 26 mm in width, and 1 mm in thickness, and the surface was flat except for the central portion of the substrate. In the center of the substrate, there is a recessed portion having a diameter of 10 mm and a depth of 0.2 mm. In this recess, 64 (8 × 8) convex portions having a diameter of 0.2 mm and a height of 0.2 mm are provided. Provided. When the height difference between the height of the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion (the average value of the heights of the 64 convex portions) and the flat portion was measured, it was 3 μm or less. Further, the height variation of the 64 convex upper surfaces (the difference in height between the highest convex upper surface and the lowest convex upper surface), and further, the average height of the convex upper surface and the flat portion The difference in height of the upper surface was measured and found to be 3 μm or less. Furthermore, the pitch (the distance from the central portion of the convex portion to the central portion of the adjacent convex portion) of the concave and convex portion was 0.6 mm.
（プローブＤＮＡの固定化）
そして、配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。このＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面の酸無水物およびカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をガラス製のキャピラリーに取り、顕微鏡下でこのプローブＤＮＡをＰＭＭＡ基板の凸部上の４箇所に点着した。次いで、この基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、その後純水で洗浄した。
(Immobilization of probe DNA)
And DNA of sequence number 1 (60 bases, 5 'terminal amination) was synthesize | combined. This DNA is aminated at the 5 ′ end. This DNA was dissolved in pure water at a concentration of 0.27 nmol / μl to obtain a stock solution. When spotting on the substrate, the final concentration of the probe is adjusted to 0.027 nmol / μl with PBS (pH 5.5), and the acid anhydride and carboxylic acid on the surface of the carrier are condensed with the amino group at the end of the probe DNA. Therefore, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to make this final concentration 50 mg / ml. Then, these mixed solutions were taken into a glass capillary, and this probe DNA was spotted at four places on the convex portion of the PMMA substrate under a microscope. Next, the substrate was placed in a sealed plastic container, incubated at 37 ° C. and 100% humidity for about 20 hours, and then washed with pure water.
（検体ＤＮＡの調製）
参考例１と同様に行った。
(Preparation of sample DNA)
It carried out similarly to the reference example 1.
（ハイブリダイゼーション）
前述の（検体ＤＮＡの調製）で調製したＤＮＡ溶液を１０μｌ取りだし、これに３０μｌの、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ、０．０１重量％サケ***ＤＮＡの溶液を加え、トータルで４０μｌとした（すなわち、参考例１や２と比較すると、検体の濃度は１／４であるが、トータルの検体量は参考例１や２と同じとなる）。そして、これを前述したＤＮＡが固定化された担体の凹凸部分に滴下して、注意深くカバーガラスをかぶせた。そして、カバーガラスの周りをペーパボンドでシーリングして、ハイブリダイゼーション溶液が乾かないようにした。すなわち、検体ＤＮＡの分子量を参考例１や比較例１と同じにした。これをプラスチック容器に入れて、湿度１００％、温度６５℃の状態で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離して、洗浄・乾燥した。
(Hybridization)
Take 10 μl of the DNA solution prepared in the above (Preparation of sample DNA), and add 30 μl of 1 wt% BSA, 5 × SSC, 0.1 wt% SDS, 0.01 wt% salmon sperm DNA solution to this. The total sample volume was 40 μl (that is, the sample concentration was 1/4 compared with Reference Examples 1 and 2, but the total sample amount was the same as Reference Examples 1 and 2). And this was dripped at the uneven | corrugated | grooved part of the support | carrier with which DNA mentioned above was fix | immobilized, and the cover glass was carefully covered. Then, the periphery of the cover glass was sealed with paper bond to prevent the hybridization solution from drying. That is, the molecular weight of the sample DNA was the same as in Reference Example 1 and Comparative Example 1. This was placed in a plastic container and incubated for 10 hours at a humidity of 100% and a temperature of 65 ° C. After incubation, the cover glass was peeled off, washed and dried.
（測定）
参考例１と同じ条件にて、スキャナーにより蛍光測定を行った。その結果を表３に示す。
(Measurement)
Fluorescence measurement was performed with a scanner under the same conditions as in Reference Example 1. The results are shown in Table 3.
これから、蛍光強度については参考例３とほぼ同一であるが、ノイズについては参考例３よりもさらに低下した。すなわち、よりＳ／Ｎ比が向上した。 From this, the fluorescence intensity is almost the same as that of Reference Example 3, but the noise is further lowered than that of Reference Example 3. That is, the S / N ratio was further improved.
実施例２
次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。実施例１で用いた射出成形品の凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面（基準となる凸部）よりも、３０μｍ低い凸部（４箇所）がある基材（基材ア）、他の凸部上面よりも、５０μｍ低い凸部（４箇所）がある基材（基材イ）をそれぞれ作製した。なお、これら基材の低い部分以外の凸部（基準となる凸部）上面の高さと、平坦部分の高さの差は３μｍ以下であった。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調製を行った。ついで、基準となる凸部上面に４箇所、低い凸部上面に４箇所にプローブＤＮＡ溶液の点着を実施例１と同様に行った。さらに、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーションの操作、測定を実施例１と同様に行った。基準となる凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズ、高さが低い凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズを表４に示す。
Example 2
Next, an experiment was performed for the case where the height of the convex portion varied. The convex part of the injection molded product used in Example 1 was shaved with wrapping paper, and a difference was provided in the height of the upper surface of the convex part. That is, a base material (base material a) having 30 μm lower convex portions (four locations) than the other convex upper surfaces (reference convex portions), and 50 μm lower convex portions (four locations) than the other convex upper surfaces. ) Were prepared, respectively. In addition, the difference of the height of the convex part (protrusion part used as a reference | standard) other than the low part of these base materials and the height of a flat part was 3 micrometers or less. In the same manner as in Example 1 , a probe DNA to be spotted was prepared. Next, in the same manner as in Example 1 , the probe DNA solution was spotted at four locations on the upper surface of the reference convex portion and at four locations on the lower convex surface. Furthermore, DNA preparation for hybridization, hybridization operation, and measurement were performed in the same manner as in Example 1 . Table 4 shows the average value of the fluorescence intensity on the upper surface of the convex part and the noise around it, and the average value of the fluorescent intensity on the upper surface of the convex part with a low height and the noise around it.
このように、凸部の高さにばらつき（５０μｍ以下）があっても、比較例と比べると十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
実施例３
さらに、凸部上面と平坦部の差がある場合について検討した。実施例１で用いた射出成形品の平坦部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と凸部上面の高さの差が３０μｍ（基材ウ）、５０μｍ（基材エ）の２種類の基材を作製した。すなわち、基材ウは凸部の高さが平坦部の高さより３０μｍ高いことになる。実施例１と同様に、点着するプローブＤＮＡの調製、凸部上面へのプローブＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーションの操作を行い、実施例１と同様に測定を行った。その結果を表５に示す。
Thus, it can be seen that a sufficiently large S / N is obtained compared to the comparative example even if the height of the convex portion varies (50 μm or less).
Example 3
Furthermore, the case where there was a difference between the upper surface of the convex part and the flat part was examined. The flat part of the injection-molded product used in Example 1 is shaved with wrapping paper, and the difference in height between the flat part upper surface and the convex part upper surface is 30 μm (base material c) and 50 μm (base material d). Was made. That is, in the base material u, the height of the convex portion is 30 μm higher than the height of the flat portion. In the same manner as in Example 1 , preparation of spotted probe DNA, spotting of the probe DNA solution on the upper surface of the convex portion, preparation of hybridization DNA, and hybridization were performed, and measurement was performed in the same manner as in Example 1. It was. The results are shown in Table 5.
このように、平坦部上面と凸部上面との高さに差（５０μｍ以下）があっても、比較例と比較するれば十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。 Thus, it can be seen that even when there is a difference in height between the upper surface of the flat part and the upper surface of the convex part (50 μm or less), a sufficiently large S / N is obtained as compared with the comparative example.
１１ 平坦部
１２ 凹凸部
１３ マイクロアレイ
１４ 対物レンズ
１５ 励起光
１６ マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
２１ 凸部上面
２２ 導電性膜
２３ 絶縁膜
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