JP4488579B2 - Method for producing monoclonal antibody - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体を製造する方法、特には細胞からの該モノクローナル抗体の分泌量を増大させる方法、並びに該方法により製造される細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の生体は、生体の恒常的維持にとって有害であり種々の疾患の発症または増悪の原因（病原）となる種々の抗原（例えば、外来性抗原（ウイルス、細菌毒素及び化学物質等）あるいは自己抗原（例えば、自己反応性リンパ球；腫瘍細胞；過剰の生体内因子（サイトカイン、ホルモン若しくは成長因子等）など）を特異的に捕捉し生体から排除する防御システムである体液性免疫を有している。
この体液性免疫においては、いわゆる抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）が主役を演じている。
【０００３】
抗体（免疫グロブリン）は、２本の長いポリペプチド鎖（免疫グロブリン重鎖；IgH鎖）と２本の短いポリペプチド鎖（免疫グロブリン軽鎖；IgL鎖）との４本ののポリペプチド鎖により構成されるＹ型の基本構造を有する。このＹ型構造は、ジスルフィド結合により架橋した２本のIgH鎖の各々にIgL鎖が１つずつジスルフィド結合により結合して構成される。
【０００４】
この抗体の生体にとって有害な抗原（病因）の捕捉・排除という機能から、早くから抗体の医薬品として利用された。初期の抗体医薬は、いわゆる抗血清と呼ばれるものであり、特定の抗原（例えば、細菌毒素やヘビ毒など）に対する様々なタイプの抗体が混在する血清自体（即ちポリクローナル抗体）である。しかしながら、この抗血清の取得方法は、血清からの回収による方法に限られていることからその供給は必然的に限りがあった。また、様々なタイプの抗体が混在するこの抗血清から特定の抗原特異性を有する単一のタイプの抗体分子、即ちモノクローナル抗体を単離することにおいても多大な困難性を有していた。
【０００５】
これらの問題は、1975年のケーラー及びミルシュタインらによるいわゆるハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製の成功（Nature, Vol.256, p.495-497,1975）により解決へと導かれた。
この方法は、即ち、抗原により免疫感作された非ヒト哺乳動物から採取した特定のタイプのモノクローナル抗体を産生する細胞（脾臓細胞等のＢ細胞）をミエローマ細胞と細胞融合させ不死化させることにより不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）を得、該ハイブリドーマを培養することにより細胞培養液中から該モノクローナル抗体を精製、取得を可能にするものであった。この方法のみでは、所望のモノクローナル抗体の大量製造が必ずしも達成されないものの、所望のモノクローナル抗体を所望の折に取得できるという点では画期的技術であった。この技術により、モノクローナル抗体の抗体医薬としての利用への道が開かれた。
【０００６】
モノクローナル抗体は、上述のような抗血清（ポリクロナール抗体）に比べ、その抗原特異性や安定性などにおいて特段に優れること、並びに疾患の発症あるいは増悪に関与する抗原（例えば、ウイルスや細菌毒素等の外来性抗原；サイトカイン、ホルモン若しくは成長因子等の種々の生体内因子；並びに受容体、細胞接着分子及びシグナル伝達分子などの細胞表面分子など）に特異的に結合することにより、該抗原の生物活性を調節（活性阻害、活性増強、シグナル伝達阻害、リガンドに代わるシグナル伝達、あるいは細胞間接着の阻害など）することができることから、これまでに種々の疾患の予防及び治療のための極めて有用な医薬品として用いられている。
【０００７】
一方、上述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産生量は、必ずしも高いものとは言えず、該ハイブリドーマを培養して、その細胞培養液中から該モノクローナル抗体を精製、単離する方法のみでは、該モノクローナル抗体の大量製造に困難性を伴うものであった。従って、医薬品として極めて有用なモノクローナル抗体を、十分に且つ安価に供給するために、ハイブリドーマからより多くの量のモノクローナル抗体を製造する方法が検討されている。
【０００８】
例えば、ヒト抗体産生ハイブリドーマをインターロイキン−２を添加した培地で培養することにより抗体の産生量が増大する旨の報告がされている（Cellular immunology, Vol.115, p.325-333, 1988)）。
また、遺伝子工学技術を用いた試みとして、オチ（Ochi）等らは、下記のような報告をしている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.80, p.6351, 1983）。
ハプテン（TNP；2,4,6-trinitrophenyl）特異的なマウスIgMモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマSp6からクローニングした該抗TNPモノクローナル抗体のIgH鎖及びIgL（κ）鎖各々をコードするIgH鎖遺伝子（μ）とIgL鎖遺伝子（κ）を、該抗TNPモノクローナル抗体とは異なる未知の抗原に対するIgGモノクローナル抗体を産生するプラズマ細胞腫X63Ag8に導入して得た組換え細胞が、該IgG抗体とともに該抗TNP抗体を産生する。また、該ハイブリドーマSp6に由来する変異株であり、該TNP抗体の軽鎖であるκ鎖のみを分泌し重鎖を発現せず結果として該抗TNP抗体を分泌しない細胞株に、該抗TNP抗体の重鎖をコードするIgH遺伝子を導入して得た組換え細胞が、該抗TNP抗体を産生する。
しかしながら、このオチらの実験の結果では、上記各々の組換え細胞により産生される抗TNP抗体の量は、該ハイブリドーマSp6からサブクローニングされたハイブリドーマSp603が産生する抗TNP抗体の量の10乃至25％程度であり、目的のモノクローナル抗体の分泌量を上げることには失敗している。
【０００９】
一般に、ハイブリドーマや抗体遺伝子を組み込んだ宿主細胞によりモノクローナル抗体を大量に生産させる手段として、培養液当たりの細胞数を増加させる方法と、細胞当たりの物質生産を向上させる方法が検討されている。
培養液当たりの細胞数を増加させることは好ましい方法であるが、細胞数の増加が必ずしも抗体の高生産につながるとは限らず、むしろ抗体生産性の高い単一の細胞株を選別、単離し、該単一の細胞株を培養することが重要である。この抗体生産性の高い細胞株（ハイブリドーマや組換え細胞など）の選別、単離には多大の労力を有すものの、所望のモノクローナル抗体の生産性を上げる目的においては、極めて重要なファクターである。
【００１０】
一方、遺伝子組換え細胞を用いた所望の蛋白質の製造においては、該組換え細胞に導入された該所望の蛋白をコードする遺伝子の発現効率を高めるため、該組換え細胞に該所望の蛋白をコードする遺伝子とともにジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子やグルタミン酸合成酵素（GS）遺伝子を導入し、該所望の蛋白の遺伝子のコピー数を増幅することにより、該所望の蛋白の産生量を増大される方法が利用されている（国際特許出願公開WO81/02426号、及び同WO87/04462号など）。
DHFR遺伝子を例に挙げれば、これらの方法は、即ち、所望の蛋白をコードする遺伝子の近傍にDHFR遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換した後、該宿主細胞を薬剤（例えば、メソトレキセイト（MTX）、ホスフィノトリシン、メチオニンスルホキシミン等）の存在下で培養して薬剤耐性株を選択する。
得られた薬剤耐性株では、導入されたdhfr遺伝子のコピー数が増大（遺伝子増幅）すると同時に、その近傍に隣接する遺伝子も遺伝子増幅される。所望の蛋白をコードする遺伝子のコピー数を増幅される結果、該所望の蛋白を産生量の増大が期待される。
【００１１】
抗原により免疫感作させた哺乳動物から単離したモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を不死化して得られる不死化Ｂ細胞（例えば、前述の該Ｂ細胞とミエローマ細胞との融合により得られるハイブリドーマ）においては、再配列された免疫グロブリン遺伝子（IgH遺伝子）及び再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子（IgL遺伝子）はともにゲノム中に組み込まれている。
上述の遺伝子増幅遺伝子により該IgH遺伝子及びIgL遺伝子を増幅するためには、該各々の遺伝子のゲノム上における存在位置を同定し、且つ各々の遺伝子の近傍に該遺伝子増幅遺伝子を挿入する必要がある。
しかしながら、この方法は理論的には可能性を有するが、多大な時間と労力を有する上、該不死化Ｂ細胞のゲノム上の所望の位置に正確に該遺伝子増幅遺伝子をターゲティングすることは現実には不可能である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、より簡便な操作で確実に、抗体産生細胞、特に不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）によるモノクローナル抗体の産生効率を増大させることを目的とする。即ち、これまで困難とされてきた該不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）によるモノクローナル抗体発現効率を増大することができる新規な方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体生産においては、免疫グロブリン軽鎖遺伝子（IgL鎖遺伝子）の発現に比べ、免疫グロブリン重鎖遺伝子（IgH鎖遺伝子）の発現がしばしば不安定であり、場合によっては抗体分子の分泌が停止すること着目し、抗体分子の分泌量は、IgH鎖遺伝子の発現量に依存するものと発想した。
【００１４】
本発明者らは、この発想に基づき、IgH鎖遺伝子の発現を改善（増強）することにより抗体分子の分泌量を増大させる方法に関しで鋭意研究を行った結果、特定のモノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）に、該ハイブリドーマからクローニングした該モノクローナル抗体の重鎖ポリペプチドをコードする再配列された内在性IgH遺伝子と同一の塩基配列を有するIgHコーディングcDNAを導入して得た組換えハイブリドーマにおいては、該モノクローナル抗体の分泌量が有意に増大すること、また、該ハイブリドーマに該IgHコーディングcDNAとともにDHFR遺伝子などの遺伝子増幅遺伝子を導入することによっても、該モノクローナル抗体の産生量が増大することを見出し本発明を完成するに到った。
【００１５】
本発明の方法を用いれば、モノクローナル抗体産生細胞による該モノクローナルの産生量を有意に増大することができる。即ち、本発明のモノクローナル抗体の製造方法並びに該方法により製造される細胞は、医薬品として有用なモノクローナル抗体の製造において極めて有用である。
即ち、本発明は下記のとおりの方法及び細胞である。
【００１６】
（１） モノクローナル抗体の製造方法であって、下記工程：
（ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡを導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞を得る工程；及び
（ｂ）該形質転換細胞を培養し、細胞培養液中に分泌された該モノクローナル抗体を取得する工程、
からなることを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
（２） 該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子と同一の塩基配列を有する遺伝子であることを特徴とする前記(1)に記載の製造方法。
（３） 該細胞が、哺乳動物のＢ細胞に由来する不死化Ｂ細胞であることを特徴とする前記(1)または前記(2)に記載の製造方法。
（４） 該不死化Ｂ細胞が、該Ｂ細胞をミエローマ細胞または組換えミエローマ細胞と融合することにより得られる融合細胞であることを特徴とする前記(3)に記載の製造方法。
（５） 該哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記(3)または前記(4)に記載の製造方法。
（６） 該哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする前記(3)または前記(4)に記載の製造方法。
（７） 該哺乳動物が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記(3)または前記(4)に記載の製造方法。
（８） 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子であることを特徴とする前記(1)乃至前記(4)、前記(6)または前記(7)のいずれかに記載の製造方法。
（９） 該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子であることを特徴とする前記(1)乃至前記(4)、前記(6)または前記(7)のいずれかに記載の製造方法。
（10） 該モノクローナル抗体が、非ヒト哺乳動物のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記(1)乃至前記(5)のいずれかに記載の製造方法。
（11） 該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記(1)乃至前記(4)、前記(6)または前記(7)のいずれかに記載の製造方法。
（12） 該外来性ＤＮＡが、さらに遺伝子増幅遺伝子を含むことを特徴とする前記(1)乃至前記(11)のいずれかに記載の製造方法。
（13） 該遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子であることを特徴とする前記(12)に記載の製造方法。
（14） 前記(1)乃至前記(13)のいずれかの方法により製造される形質転換細胞。
【００１７】
以下、本発明で用いる語句の意味及び本発明の具体的態様を明らかにすることにより本発明をさらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明において「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなどの哺乳動物を意味し、さらに後述する「ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」も包含する。
本発明において「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を意味し、具体的には、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなどの哺乳動物を意味し、さらに後述する「ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」も包含する。
【００１９】
本発明において「抗原」とは、上記に哺乳動物の生体における免疫担当細胞が、非自己と認識する任意の物質を意味し、該生体にとって外来である外来性抗原及び該生体が自己抗体を産生し得る該生体の任意の内因性物質を包含する。
該外来性抗原としては、例えば、種々のウイルス、細菌、細菌毒素及び化学物質が挙げられ、また、該生体が、特定の哺乳動物である場合には、該生体と異なる個体あるいは異なる動物種に由来する任意の物質（例えば、組織、細胞、蛋白質、それらの断片、体液など）が包含される。
内因性物質としては、場合によっては該生体中で過剰に産生される種々のサイトカイン、成長因子、ホルモン、細胞表面分子（例えば、受容体、チャンネル分子、シグナル伝達分子など）、自己反応性リンパ球などが挙げられる。
【００２０】
本発明において「モノクローナル抗体」とは、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体である。
該「モノクローナル抗体」は、前記の抗原を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、後述する遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト型モノクローナル抗体（ヒト型抗体；CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含する。
また、ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）またはＩｇＭである。
【００２１】
本発明における「モノクローナル抗体を分泌する細胞」とは、再配列（rearranged）された内在性（endogenous）免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌する任意の細胞である。
好ましくは、下記に詳述される任意の「モノクローナル産生不死化Ｂ細胞」であり、より好ましくはモノクローナル抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞などと細胞融合して得られるハイブリドーマである。
【００２２】
本発明における「モノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞」とは、上述の哺乳動物の生体が抗原により免疫感作されることにより該生体中に生ずる該抗原に対するモノクローナル抗体を産生するＢ細胞、並びに該Ｂ細胞を所望の方法によって不死化することにより製造される不死化Ｂ細胞を意味する。
この「モノクローナル抗体産生Ｂ細胞」及び「モノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞」は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。
即ち、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシあるいは後述のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物のような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する。
免疫は、該哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。
通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、さらに必要に応じ、モノクローナル抗体産生細胞の採取の前日または前々日にも免疫を行う。
【００２３】
前述の如く免疫感作された哺乳動物から常法に従って、脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓から、抗体産生細胞であるＢ細胞を回収する。
この抗体産生Ｂ細胞を、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)及びそれに準じる修飾方法に従って、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させて不死化してハイブリドーマとすることにより抗体産生不死化Ｂ細胞を得る。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、NSO、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0、BW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
【００２４】
上述のようにして作製されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（モノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞）のスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばRIAやELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００２５】
本発明における「ヒト抗体」あるいは「ヒト免疫グロブリン」とは、前述した免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域（V_H）及びＨ鎖の定常領域（C_H）並びにＬ鎖の可変領域（V_L）及びＬ鎖の定常領域（C_L）を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。
ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; 表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 及び特表平6-500233号公報）に記載の方法に従って作製することができる。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）の工程からなる。
（ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡを導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞を得る工程。
（ｂ）該形質転換細胞を培養し、細胞培養液中に分泌された該モノクローナル抗体を取得する工程。
【００２７】
ここで「免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子」とは、前述したモノクローナル抗体を産生する細胞（好ましくは、抗体産生Ｂ細胞、抗体産生不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマなど））が有する内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子によりコードされる免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子（好ましくはcDNA）であり、該cDNAは、既知の細胞工学技術及び遺伝子組換え技術を用いて常法に従って下記のようにして調製することができる。
【００２８】
（１）所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、市販の試薬（例えば、FastTrack2.0kit(INVITROGEN製）など）を用いて常法に従ってPolyA⁺RNAの抽出、精製する。具体的には、例えば、下記のとおりである。
凍結して保存しておいたハイブリドーマを、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、市販の細胞溶解試薬（例えば、POLYTRONなど）により細胞を破壊し、可溶化する。該可溶化物を適切な温度（例えば、約45℃）でインキュベーションした後、Oligo(dT) celluloseを加え適切な時間（例えば、約1時間）緩やかに振盪する。
次いで、Oligo(dT) celluloseを洗浄後、PolyA⁺RNA をEllution Bufferで溶出させる。溶出したPolyA⁺RNAをエタノール沈殿させ、適切量のTris-EDTA緩衝液に溶解する。得られたPolyA⁺RNAの濃度を、適切な波長（例えば、260nm）での吸光度を測定することにより決定する。
【００２９】
（２）得られたPolyA⁺RNAを鋳型とし、市販の試薬（例えば、Marathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH製）など）を用いてRACE-PCR法により常法によりcDNAを合成する（「遺伝子増幅PCR法・基礎と新しい展開」、1992年第２刷、共立出版株式会社発行、p.13-15）。具体的には下記のとおりである、
適切量の精製PolyA⁺RNA（例えば約1乃至5μg）を鋳型として、1st strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成する。該ｃDNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミノアルコール並びにクロロホルムを用いて抽出に供する。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、アダプターDNAに連結する。得られたDNA反応物を適切な濃度に希釈（例えば、1/250）したものを鋳型とし、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に設計したプライマー及び該アダプターＤＮＡの塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、常法によりPCRを行う。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分画し、cDNAを回収する。
【００３０】
（３）得られた該モノクローナル抗体の重鎖の全長あるいは一部のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を市販の試薬（例えば、Dye Terminator Cycle Sequence Kit（PE-Applied Biosystems製）、及びPRISM377 DNA Sequencer（PE-Applied Biosystems製））を用いて決定する。
（４）該モノクローナル抗体の重鎖の一部のアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を基に、PCRにより該重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列の全長をコードするcDNAが可能なように一対のプライマーDNAを合成し、該一対のプライマーを用いて、前記の精製PolyA⁺RNAを鋳型として前記と同様にPCRを行し、該重鎖ポリペプチドの全長をコードするcDNAを得る。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、上記で詳述した「免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子」を、該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞（好ましくは該遺伝子の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ自体、即ち、上述のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞あるいは不死化Ｂ細胞と同義）に、常法に従って遺伝子工学技術を用いて導入し、該遺伝子により形質転換された形質転換細胞を選別、単離し、該形質転換細胞を培養することにより細胞培養液中から該モノクローナル抗体を精製、取得することからなる。
【００３２】
該細胞への該遺伝子（例えば、cDNA）の導入は、該遺伝子を常法に従って該遺伝子が宿主細胞中で発現可能なようにプラスミドベクター組み込み発現ベクターを作製し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより行う。
プラスミドにcDNAを組み込む方法としては、例えばManiatisらの方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989）に記載の方法などが挙げられる。
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.1.74, 1989）に記載の塩化カルシウム法または塩化 カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３３】
本発明で使用されるベクターとしては、宿主細胞（好ましくは真核細胞）内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される。
具体的には、プラスミドとしては例えば、pLS407、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19、pSH19、pSH15、pUB110、pTP5、pC194、pcD2、pBSV、CMD、pSV2、さらにpMAL C2、pEF-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Research）、第１８巻、第５３２２頁、１９９０年等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等などが例示される。
また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例示される。
【００３４】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、並びに上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子、終止コドンを含んでいることが好ましい。
またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子をコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
さらに、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子を含んでいてもよい。
【００３５】
哺乳動物細胞等の真核細胞で上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ニワトリ由来のβアクチンプロモーター、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ニワトリ由来のβアクチンプロモーター、SV40由来のプロモーター、SV40、レトロウイルスのプロモーターである。しかしながら、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法であり、好ましいエンハンサーとしてはCMVエンハンサーが挙げられる。
細菌中で上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、AAGGなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示される。
酵母中で上述の所望の免疫グロブリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
【００３６】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【００３７】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149等があげられる。
【００３８】
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
上述の発現ベクターの作製は、上述のプロモーター、開始コドン、上述のIgH鎖をコードする遺伝子及び／またはターミネーター領域などを連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。
【００３９】
上述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞、即ち形質転換細胞の選別は、該発現ベクターに所望の選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子など）を挿入しておき、該形質転換細胞を、該薬剤の存在下で培養することにより可能である。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
【００４０】
上述の本発明のモノクローナル抗体の製造方法には、上記発現ベクターに挿入された上述した所望のモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、遺伝子増幅遺伝子を挿入しておくことにより、該重鎖ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増幅させることにより、該形質転換細胞による所望のモノクローナル抗体の産生効率をさらに増大させる態様も本発明の態様として包含する。
【００４１】
本発明において使用され得る遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素（GS）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。好ましくは、DHFR遺伝子またはGS遺伝子である。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体の製造方法において、上記で詳述した「免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子」により形質転換される細胞（宿主細胞）は、即ち、「該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞」であれば、いかなる細胞でも良いが、特に好ましくは該遺伝子の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ自体（即ち、上述のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞あるいは不死化Ｂ細胞と同義）である。
【００４３】
当該ハイブリドーマ以外の宿主細胞の例としては、当該所望のモノクローナル抗体を産生する限り、天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞などのいずれをも包含する。
当該所望のモノクローナル抗体を産生する細胞であれば、当該細胞の起源が、例えば、大腸菌（DH5α、TB1、HB101等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞（PC12,PC12h)、ハムスター由来細胞（BHK及びCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびHepG2等）などのいずれであっても良い。
【００４４】
上述した該所望の免疫グロブリンの重鎖をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法（Virology, Vol.52, p.456, 1973）に従って、細菌（E.coli、Bacillus subtilis 等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979）やコンピテント法（J. Mol. Biol., Vol.56, p.209, 1971）によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978）やリチウム法（J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）によって、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法（Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）によってそれぞれ形質転換することができる。
【００４５】
上述した本発明のモノクローナル抗体の製造方法における「形質転換細胞」であって、上述の所望の免疫グロブリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換された形質転換細胞の培養は常法によって下記のように行うことができる。当該培養により、細胞培養液中から所望モノクローナル抗体を得ることができる。
【００４６】
該所望の免疫グロブリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換される細胞が、該遺伝子の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ自体（上述のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞あるいは不死化Ｂ細胞と同義）であり、即ち、得られる形質転換細胞が、組換えハイブリドーマである場合には、通常のハイブリドーマの一般的な培養方法と同様にして行うことができる。
【００４７】
具体的には、該組換えハイブリドーマを、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００４８】
基本培地としては、例えば、Ham'F12培地、MCDB153培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
【００４９】
該組換えハイブリドーマからのモノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００５０】
一方、該所望の免疫グロブリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換される細胞が、上述した組換え蛋白の製造において一般的に使用される例えば、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞である場合には、組換え蛋白の製造における一般的な培養方法と同様にして行うことができる。
【００５１】
即ち、該形質転換細胞を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、該形質転換細胞から本発明の所望のモノクローナル抗体が大量に生産されるように適宜選択される。
【００５２】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、pHが５〜８である培地である。
宿主がE. coliの場合、好ましい培地としてLB培地、M9培地（Millerら、 Exp. Mol. Genet、Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常14〜43℃、約３〜24時間行うことができる。
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常30〜40℃、約16〜96時間行うことができる。
【００５３】
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培（Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙げられ、pHは５〜８であることが望ましい。培養は通常約20〜35℃で約14〜144時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, Vol.122, p.501, 1952）、 DMEM培地（Virology, Vol.8, p.396, 1959）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967）、199培地（proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950）等を用いることができる。培地のpHは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約30〜40℃で約15〜72時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's 培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、そのpHは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約20〜40℃で15〜100時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
本発明における所望のモノクローナル抗体は、そのようにして培養された形質転換細胞の培養上清中から上述したモノクローナル抗体の一般的な精製方法により得ることができる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を以って本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００５５】
実施例１ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
既報に記載されるヒトIL-8に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを以下の試験において用いた（Nature genetics Vol.15, p.146-156, 1997、及び国際特許出願公開WO96/33735号公報）。
なお、該ハイブリドーマは、下記のように製造された。
マウスの重鎖及び軽鎖の各々の内在性遺伝子座を不活性化し、且つヒト免疫グロブリンの重鎖（Cμ及びCγ₂）及び軽鎖（κ）の各々遺伝子座を含むDNAをマウスの内在性ゲノムに組み込むことにより作製したヒトIgG₂/κモノクローナル抗体を産生する既報のトランスジェニックマウスを被免疫動物として用いた(Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; 表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 及び特表平6-500233号公報）。
【００５６】
該ヒトIgG₂/κ抗体産生トランスジェニックマウス（8乃至10週齢）に、組換えヒトIL-8（25μg）を完全フロインドアジュバントとともに腹腔内投与して初回免疫した。初回免疫から2週間毎に、該IL-8を不完全フロインドアジュバントとともに追加免疫（3回）し、以下の細胞融合の4日前に最終免疫した。
最終免疫の後、該被免疫マウスの脾臓及びリンパ節を採取してリンパ球（抗体産生Ｂリンパ球を含む）を回収した。該抗体産生リンパ球を、常法に従って、いずれの自己抗体をも産生しないマウスミエローマ細胞（NSO-bsl2細胞株）と細胞融合した。細胞融合により得られるハイブリドーマを常法に従ってHAT選択法により選別した。
得られたハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体のヒトIL-8に対する反応性の有無を、常法に従ってELISAにより測定し、抗ヒトIL-8ヒトモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマを得た。各々のハイブリドーマは凍結保存された。
【００５７】
実施例２ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマからの内在性IgH遺伝子の単離
上記のようにして調製した抗ヒトIL-8ヒトIgG₂/κモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（クローン：K2.2.1）の凍結細胞を、細胞溶解緩衝液（Lysis Buffer）に溶解し、POLYTRONにより細胞を破壊し、可溶化させた。
次いで、該細胞可溶化物から、市販のRNA抽出キット（FastTrack2.0kit(INVITROGEN製））を用いてPolyA⁺RNAを抽出、精製した。
該細胞可溶化物を45℃でインキュベーションした後、Oligo(dT) celluloseを加え約1時間緩やかに振盪した。次いで、Oligo(dT) celluloseを洗浄後、PolyA⁺RNA をEllution Bufferで溶出させた。溶出したPolyA⁺RNAをエタノール沈殿させ、Tris-EDTA緩衝液に溶解した。得られたPolyA⁺RNAの濃度を、260nmの波長での吸光度を測定することにより決定した。
【００５８】
得られたPolyA⁺RNAを鋳型とし、市販のMarathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH製）を用いたRACE-PCR法により常法によりcDNAを合成した（「遺伝子増幅PCR法・基礎と新しい展開」、1992年第２刷、共立出版株式会社発行、p.13-15）。即ち、該ハイブリドーマから精製したPolyA⁺RNA（1乃至5μg）を鋳型として、1st strand cDNA及び2nd strand cDNAを順次合成した。該ｃDNAを、フェノール／クロロホルム／イソアミノアルコール並びにクロロホルムを用いて各々1回ずつ抽出に供した。次いで、cDNAをエタノール沈殿させ、該キットに付属のアダプターDNAに連結させた。
得られたDNA反応物の希釈物を鋳型とし、合成プライマーを用いて常法により5'RACE-PCRを行い内在性免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの一部をコードするcDNAを調製した。該PCRには免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に設計したプライマーHG2-3-437（配列番号３）及び該アダプターDNAの塩基配列を基に設計したプライマーを用いた。
【００５９】
PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分画し、DNAを回収した。得られたcDNAの塩基配列の決定を、市販のDyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit（PE-Applied Biosystems製）及びPRISM377 DNA Sequencer（PE-Applied Biosystems製）を用いて行った。なお、本配列決定のためのSequencing Primerは、前述のPCRにおいて使用したプライマーを使用した。
決定した該免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドの一部をコードするcDNAの塩基配列（翻訳開始点の付近の塩基配列を含む）を基に、一対のプライマーVH4-21（配列番号４）及びCG2-1（配列番号５）を合成した。この一対のプライマーを用いて、上述と同様にしてさらにPCRを行った。得られたPCR産物から上述と同様にして得たcDNAの塩基配列を上述と同様にして決定し、該ハイブリドーマK2.2.1が産生する抗ヒトIL-8ヒトモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチド（IgH）の全長をコードするcDNAを得た（塩基配列：配列番号１、及びアミノ酸配列配列番号２）。
【００６０】
実施例３ ハイブリドーマK2.2.1へのIgH cDNAの導入、及び組換えハイブリドーマによるモノクローナル抗体の製造
前記で得たハイブリドーマK2.2.1が分泌する抗ヒトIL-8ヒトモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチド（IgH）の全長をコードするcDNA（配列番号１）を、常法に従ってDNAリガーゼを用いて、CMVエンハンサー／ニワトリBアクチンプロモーター及びDHFR遺伝子を保持するプラスミドpLS407のEcoRI制限酵素部位に挿入、連結し、発現ベクターpDH502を作製した（図１）。
該DHFR遺伝子は、マーカー遺伝子であると同時に遺伝子増幅遺伝子であり、該遺伝子の存在により該発現ベクターによる形質転換細胞の選別は、該細胞をメソトレキセイト（MTX）存在下で培養することにより可能となる。
該IgH遺伝子発現ベクターpDH502を、エレクトロポレーションによりハイブリドーマK2.2.1に導入した。次いで、該ハイブリドーマを、選択培地（IMDM (JRH BIOSCUENCE)；10%FBS及び300mM MTXを含有）中で培養し、生育した約100個の形質転換体（組換えハイブリドーマ）を選別、取得した。該選別した各々の組換えハイブリドーマを、96ウェルマイクロプレート中で培養した。
【００６１】
各ウェル中で培養されている各々の形質転換体（組換えハイブリドーマ）の培養上清中に産生されるヒトモノクローナル抗体（IgG₂）の量を常法に従って、サンドイッチELISAにより測定した。なお、固相抗体（一次抗体）として抗ヒトIgG(Fc)（Organon Teknika製）を、検出抗体（二次抗体）として西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した抗ヒトIgκ抗体（PROTOS IMMUNORESEARCH製）を用いた。また、対照標準品としてヒトIgG/κ（The Binding Site）を用いた。
結果を図２に示す。
その結果、親株ハイブリドーマであるK2.2.1のほとんどのクローンのモノクローナル抗体の産生量が極めて低い値であるのに対し、組換えハイブリドーマのほとんどのクローンにおいて、有意なモノクローナル抗体の産生量の増大が認められた。
また、該組換えハイブリドーマのいくつかのクローンのモノクローナル抗体の産生量を表１に示す。
【００６２】
【表１】

【００６３】
次に、組換えハイブリドーマクローンの中で、特に高濃度のモノクローナル抗体の産生を示したクローン（クローンNo.12、15、41、89）を、限界希釈法によりサブクローニングしてサブクローンド（sub-cloned）組換えハイブリドーマを得た（クローンNo.12-6、15-4、15-12、41-2、及び89-5）。各々のsub-cloned組換えハイブリドーマのモノクローナル抗体の産生量を、上述と同様のELISAにより測定した。結果を表２（上段）に示す。
【００６４】
【表２】

【００６５】
その結果、各々のsub-cloned組換えハイブリドーマのモノクローナル抗体の産生量は、親組換えハイブリドーマのそれに比べ有意に高い値であった。例えば、親組換えハイブリドーマ（No.15）の抗体産生量は、約37.3μg/mlであったのに対し、該親株からサブクローニングした組換えハイブリドーマ（No.15-4）の抗体産生量は、約95.3μg/mlに増大した。
【００６６】
実施例４ 遺伝子増幅を施した組換えハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造
DHFR遺伝子によるIgH遺伝子の増幅のモノクローナル抗体の産生効率上昇に対する効果の有無を検討した。
前記で作製したsub-cloned組換えハイブリドーマ（クローンNo.12-6、15-4、15-12、41-2、及び89-5）の各々を、１、２または５μMのメトトレキセート（MTX）を含む栄養培地中でさらに培養してMTX耐性細胞株を選択、取得した。
各々のsub-cloned組換えハイブリドーマから、下記MTX耐性細胞株を取得した。
＜クローンNo.12-6＞ クローンNo.12-5μ-96-8
＜クローンNo.15-4＞ クローンNo.15-1μ-82-1
＜クローンNo.15-12＞ クローンNo.15-1μ-87-4
＜クローンNo.41-2＞ クローンNo.41-2μ-75-4
＜クローンNo.89-5＞ クローンNo.89-2μ-2-5、及び89-2μ-33-12
各々のMTX耐性組換えハイブリドーマクローンのモノクローナル抗体の産生量を、前記と同様のサンドイッチELISAにより測定した。結果を前記表２（下段）に示した。
その結果、MTX選択した各々の組換えハイブリドーマの１細胞数当りのモノクローナル抗体の産生効率は、MTX選択する前（DHFRによる遺伝子増幅前）のそれに比べ低いものの、IgH遺伝子で形質転換する前の野生型親ハイブリドーマK2.2.1のモノクローナル抗体の産生量が極めて低い（図２）ことを考慮すると、該MTX選択した組換えハイブリドーマのモノクローナル抗体の産生効率は、該野生型親ハイブリドーマのそれに比べ有意に増大していた。
【００６７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の方法を用いれば、医薬品として有用なモノクローナル抗体の製造において、モノクローナル抗体産生細胞によるモノクローナル抗体の産生量を簡便に有意に増大させることが可能となる。
特に、モノクローナル抗体の製造において一般的に用いられるモノクローナル抗体産生不死化Ｂ細胞（ハイブリドーマ）のモノクローナル抗体の産生効率が、内在性IgH遺伝子の発現の不安定さまたは低発現性に依存して低い場合には、本発明の方法を用いることにより該親ハイブリドーマのモノクローナル抗体の分泌量を有意に増大させることが可能である。
従って、本発明のモノクローナル抗体の製造方法及び該方法により得られるモノクローナル抗体産生形質転換細胞（組換え細胞）は、抗体医薬品の製造において極めて有用な手段である。
【００６８】
【配列表】

【００６９】
「配列表フリーテキスト」
配列番号：３
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列HG2-3-437。
配列番号：４
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列VH4-21。
配列番号：５
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列CG2-1。
【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】発現ベクターpDH502の構造及び制限酵素地図を模式的に示す図。
【図２】組換えハイブリドーマによる抗ヒトIL-8モノクローナル抗体の産生量を示す図。縦軸は、モノクローナル抗体の産生量を示し、横軸はマイクロプレート中の各ウェルの各組換えハイブリドーマクローンの種類を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody, particularly to a method for increasing the secretion amount of the monoclonal antibody from cells, and a cell produced by the method.
[0002]
[Prior art]
Mammalian living organisms have various antigens (for example, foreign antigens (viruses, bacterial toxins, chemical substances, etc.) or self that are harmful to the constant maintenance of the organism and cause the onset or exacerbation of various diseases (pathogens). Has humoral immunity that is a defense system that specifically captures and excludes antigens (eg, autoreactive lymphocytes; tumor cells; excess in vivo factors (cytokines, hormones, growth factors, etc.)) Yes.
In this humoral immunity, so-called antibodies (also called immunoglobulins) play a leading role.
[0003]
An antibody (immunoglobulin) consists of four polypeptide chains, two long polypeptide chains (immunoglobulin heavy chain; IgH chain) and two short polypeptide chains (immunoglobulin light chain; IgL chain). It has a Y-shaped basic structure. This Y-type structure is composed of two IgH chains crosslinked by disulfide bonds, one IgL chain bonded by a disulfide bond.
[0004]
Because of the function of capturing and eliminating antigens (pathogenesis) harmful to the living body of this antibody, it has been used as an antibody pharmaceutical from an early stage. The initial antibody drug is a so-called antiserum, which is a serum itself (ie, a polyclonal antibody) in which various types of antibodies against a specific antigen (for example, bacterial toxin, snake venom, etc.) are mixed. However, since the method for obtaining this antiserum is limited to the method by recovery from serum, its supply is necessarily limited. Also, it has been very difficult to isolate a single type of antibody molecule having a specific antigen specificity, ie, a monoclonal antibody, from this antiserum mixed with various types of antibodies.
[0005]
These problems were led to a solution in 1975 by the successful production of monoclonal antibodies by so-called hybridomas by Kohler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, p.495-497, 1975).
In this method, cells that produce a specific type of monoclonal antibody collected from a non-human mammal immunized with an antigen (B cells such as spleen cells) are fused with myeloma cells and immortalized. By immortalizing B cells (hybridoma) and culturing the hybridoma, the monoclonal antibody can be purified and obtained from the cell culture medium. Although this method alone does not necessarily achieve mass production of a desired monoclonal antibody, it is an epoch-making technique in that a desired monoclonal antibody can be obtained whenever desired. This technology paved the way for the use of monoclonal antibodies as antibody drugs.
[0006]
Monoclonal antibodies are particularly superior in antigen specificity and stability as compared to the antisera (polyclonal antibodies) as described above, and antigens involved in the onset or exacerbation of diseases (for example, viruses and bacterial toxins). By binding specifically to foreign antigens; various in vivo factors such as cytokines, hormones or growth factors; and cell surface molecules such as receptors, cell adhesion molecules and signal transduction molecules). Can be regulated (activity inhibition, activity enhancement, signal transduction inhibition, signal transduction instead of ligand, or cell-cell adhesion inhibition, etc.), so far a very useful pharmaceutical for the prevention and treatment of various diseases It is used as.
[0007]
On the other hand, the production amount of the monoclonal antibody by the hybridoma is not necessarily high, and the monoclonal antibody can be obtained only by a method of culturing the hybridoma and purifying and isolating the monoclonal antibody from the cell culture medium. Was associated with difficulty in mass production. Therefore, in order to supply monoclonal antibodies extremely useful as pharmaceuticals sufficiently and inexpensively, methods for producing a larger amount of monoclonal antibodies from hybridomas have been studied.
[0008]
For example, it has been reported that the amount of antibody production is increased by culturing a human antibody-producing hybridoma in a medium supplemented with interleukin-2 (Cellular immunology, Vol. 115, p. 325-333, 1988). ).
As an attempt using genetic engineering technology, Ochi et al. Reported the following (Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 80, p.6351, 1983).
An IgH chain gene (μ) encoding each of the IgH chain and IgL (κ) chain of the anti-TNP monoclonal antibody cloned from the hybridoma Sp6 producing a mouse IgM monoclonal antibody specific for hapten (TNP; 2,4,6-trinitrophenyl) ) And IgL chain gene (κ) are introduced into a plasmacytoma X63Ag8 that produces an IgG monoclonal antibody against an unknown antigen different from the anti-TNP monoclonal antibody. Produces antibodies. In addition, the anti-TNP antibody is a mutant derived from the hybridoma Sp6, which secretes only the κ chain, which is the light chain of the TNP antibody, does not express a heavy chain and consequently does not secrete the anti-TNP antibody. Recombinant cells obtained by introducing an IgH gene encoding the heavy chain of this produce the anti-TNP antibody.
However, in the results of these experiments, the amount of anti-TNP antibody produced by each of the above recombinant cells was 10 to 25% of the amount of anti-TNP antibody produced by hybridoma Sp603 subcloned from the hybridoma Sp6. However, it has failed to increase the secretion amount of the target monoclonal antibody.
[0009]
In general, methods for increasing the number of cells per culture and methods for improving substance production per cell have been studied as means for producing large amounts of monoclonal antibodies using host cells incorporating a hybridoma or antibody gene.
Increasing the number of cells per culture is a preferred method, but increasing the number of cells does not necessarily lead to high antibody production, but rather selecting and isolating a single cell line with high antibody productivity. It is important to culture the single cell line. Although selection and isolation of cell lines with high antibody productivity (such as hybridomas and recombinant cells) has a great deal of effort, it is an extremely important factor for the purpose of increasing the productivity of the desired monoclonal antibody. .
[0010]
On the other hand, in the production of a desired protein using a recombinant cell, the desired protein is introduced into the recombinant cell in order to increase the expression efficiency of the gene encoding the desired protein introduced into the recombinant cell. A method for increasing the production amount of the desired protein by introducing a dihydrofolate reductase (DHFR) gene or a glutamate synthase (GS) gene together with the gene to be encoded and amplifying the copy number of the gene of the desired protein (International Patent Application Publication Nos. WO81 / 02426, WO87 / 04462, etc.).
Taking the DHFR gene as an example, in these methods, an expression vector in which a DHFR gene is inserted in the vicinity of a gene encoding a desired protein is constructed, and a host cell is transformed with the expression vector. Cells are cultured in the presence of a drug (eg, methotrexate (MTX), phosphinotricin, methionine sulfoximine, etc.) to select a drug resistant strain.
In the obtained drug-resistant strain, the copy number of the introduced dhfr gene increases (gene amplification), and at the same time, the adjacent gene is also amplified. As a result of amplifying the copy number of the gene encoding the desired protein, an increase in the production amount of the desired protein is expected.
[0011]
In an immortalized B cell obtained by immortalizing a monoclonal antibody-producing B cell isolated from a mammal immunized with an antigen (for example, a hybridoma obtained by fusion of the aforementioned B cell and myeloma cell), Both the rearranged immunoglobulin gene (IgH gene) and the rearranged immunoglobulin light chain gene (IgL gene) are integrated in the genome.
In order to amplify the IgH gene and IgL gene by the gene amplification gene described above, it is necessary to identify the location of each gene in the genome and to insert the gene amplification gene in the vicinity of each gene. .
However, this method is theoretically feasible, but it takes a lot of time and effort, and it is actually possible to target the gene-amplified gene accurately to a desired position on the genome of the immortalized B cell. Is impossible.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to reliably increase the production efficiency of monoclonal antibodies by antibody-producing cells, particularly immortalized B cells (hybridomas), with a simpler operation. That is, it aims at providing the novel method which can increase the monoclonal antibody expression efficiency by this immortalized B cell (hybridoma) made difficult until now.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
In the production of monoclonal antibodies by hybridomas, the present inventors often expressed the immunoglobulin heavy chain gene (IgH chain gene) more unstablely than the expression of the immunoglobulin light chain gene (IgL chain gene). Focused on the fact that the secretion of antibody molecules ceases, the idea that the amount of antibody molecule secretion depends on the expression level of the IgH chain gene.
[0014]
Based on this idea, the present inventors conducted extensive research on a method for increasing the secretion amount of an antibody molecule by improving (enhancing) the expression of an IgH chain gene. As a result, immortality that produces a specific monoclonal antibody Recombination obtained by introducing an IgH-encoding cDNA having the same base sequence as the rearranged endogenous IgH gene encoding the heavy chain polypeptide of the monoclonal antibody cloned from the hybridoma into a transformed B cell (hybridoma) In a hybridoma, the amount of the monoclonal antibody secreted increases significantly, and the amount of the monoclonal antibody produced also increases by introducing a gene amplification gene such as a DHFR gene into the hybridoma together with the IgH-coding cDNA. As a result, the present invention has been completed.
[0015]
If the method of this invention is used, the production amount of this monoclonal by a monoclonal antibody production cell can be increased significantly. That is, the method for producing a monoclonal antibody of the present invention and the cells produced by the method are extremely useful for producing a monoclonal antibody useful as a pharmaceutical product.
That is, this invention is the method and cell as follows.
[0016]
(1) A method for producing a monoclonal antibody, comprising the following steps:
(A) an immunoglobulin heavy chain polypeptide having a rearranged endogenous immunoglobulin heavy chain gene and a rearranged endogenous immunoglobulin light chain gene, and the endogenous heavy chain polypeptide derived from the endogenous immunoglobulin heavy chain gene; A foreign DNA comprising a gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide in a cell that secretes a monoclonal antibody comprising the immunoglobulin light chain polypeptide derived from the sex immunoglobulin light chain gene And obtaining a transformed cell transformed with the exogenous DNA; and
(B) culturing the transformed cell and obtaining the monoclonal antibody secreted into the cell culture medium;
A method for producing a monoclonal antibody, comprising:
(2) The gene encoding the amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide is a gene having the same base sequence as the endogenous immunoglobulin heavy chain gene (1) ) Production method.
(3) The production method according to (1) or (2) above, wherein the cell is an immortalized B cell derived from a mammalian B cell.
(4) The production method according to (3) above, wherein the immortalized B cell is a fused cell obtained by fusing the B cell with a myeloma cell or a recombinant myeloma cell.
(5) The production method according to (3) or (4) above, wherein the mammal is a non-human mammal.
(6) The production method according to (3) or (4) above, wherein the mammal is a human.
(7) The production method according to (3) or (4) above, wherein the mammal is a transgenic non-human mammal having an ability to produce a human antibody.
(8) The endogenous immunoglobulin heavy chain gene is a human immunoglobulin heavy chain gene, (1) to (4), (6) or (7) above, Manufacturing method.
(9) The endogenous immunoglobulin light chain gene is a human immunoglobulin light chain gene, (1) to (4), (6) or (7) above, Manufacturing method.
(10) The production method according to any one of (1) to (5) above, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody of a non-human mammal.
(11) The production method according to any one of (1) to (4), (6), or (7) above, wherein the monoclonal antibody is a human monoclonal antibody.
(12) The production method according to any one of (1) to (11), wherein the exogenous DNA further contains a gene amplification gene.
(13) The production method according to (12), wherein the gene amplification gene is a dihydrofolate reductase (DHFR) gene.
(14) A transformed cell produced by the method according to any one of (1) to (13).
[0017]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by clarifying the meanings of the terms used in the present invention and specific embodiments of the present invention.
[0018]
In the present invention, the term “mammal” means mammals such as humans, cows, sheep, pigs, goats, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, and mice, and further described below “has the ability to produce human antibodies. Also included are “transgenic non-human mammals”.
In the present invention, “non-human mammal” means mammals other than human, specifically, mammals such as cows, sheep, pigs, goats, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, and mice. Furthermore, “transgenic non-human mammal having the ability to produce human antibodies” described later is also included.
[0019]
In the present invention, the term “antigen” means any substance that the immunocompetent cells in the mammal's living body recognize as non-self, and the foreign antigen that is foreign to the living body and the living body produces autoantibodies. Any endogenous substance of the organism that can be included.
Examples of the foreign antigens include various viruses, bacteria, bacterial toxins, and chemical substances. When the living body is a specific mammal, the foreign antigen may be an individual different from the living body or a different animal species. Any derived material (eg, tissue, cells, proteins, fragments thereof, body fluids, etc.) is included.
Endogenous substances include various cytokines, growth factors, hormones, cell surface molecules (for example, receptors, channel molecules, signal transduction molecules, etc.), self-reactive lymphocytes that are sometimes produced in excess in the living body. Etc.
[0020]
In the present invention, the “monoclonal antibody” is any monoclonal antibody having reactivity with the aforementioned antigen.
The “monoclonal antibody” is a natural antibody obtained by immunizing a mammal such as a mouse, rat, hamster, guinea pig or rabbit with the antigen, and a chimeric monoclonal antibody which can be produced using a gene recombination technique described later. (Chimeric antibodies) and human monoclonal antibodies (human antibodies; CDR-grafted antibodies), and human monoclonal antibodies (human antibodies) that can be produced using human antibody-producing transgenic animals and the like are also included.
Also included are monoclonal antibodies having any isotype such as IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD or IgE. IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) or IgM is preferable.
[0021]
The “cell that secretes a monoclonal antibody” in the present invention has a rearranged endogenous immunoglobulin heavy chain gene and a rearranged endogenous immunoglobulin light chain gene. Any cell that secretes a monoclonal antibody comprising an immunoglobulin heavy chain polypeptide derived from an immunoglobulin heavy chain gene and an immunoglobulin light chain polypeptide derived from the endogenous immunoglobulin light chain gene.
Preferred is any “monoclonal immortalized B cell” described in detail below, and more preferred is a hybridoma obtained by cell fusion of a monoclonal antibody-producing B cell with a myeloma cell or the like.
[0022]
The “monoclonal antibody-producing immortalized B cell” in the present invention refers to a B cell that produces a monoclonal antibody against the antigen generated in the living body of the mammal by immunization with the antigen, and the B cell. It means an immortalized B cell produced by immortalizing a cell by a desired method.
These “monoclonal antibody-producing B cells” and “monoclonal antibody-producing immortalized B cells” can be produced by an existing general production method.
That is, for example, the antigen is optionally combined with Freund's Adjuvant, mammals, preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, pigs, goats, horses, cows, or humans described below. A transgenic non-human mammal engineered to produce antibodies from other animals, such as antibody-producing transgenic non-human mammals is immunized.
Immunization is carried out by injecting or transplanting the mammal subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a food pad or intraperitoneally, or transplanted once or several times.
Usually, immunization is carried out 1 to 4 times about every 1 to 14 days from the initial immunization, and further immunization is performed on the day before or two days before the collection of monoclonal antibody-producing cells as necessary.
[0023]
B cells, which are antibody-producing cells, are recovered from the immunized mammal as described above from the spleen, lymph nodes, bone marrow, tonsils, etc., preferably from the spleen, according to a conventional method.
This antibody-producing B cell is preferably treated with mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, human or the like according to the method of Köhler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, p.495-497, 1975) and the modification method according thereto. An antibody-producing immortalized B cell is obtained by cell fusion with a myeloma cell having no autoantibody-producing ability derived from a mammal, more preferably a mouse, rat or human, and immortalizing it into a hybridoma.
Examples of myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.653 (653; ATCC No. CRL1580), P3 / NSI / 1-Ag4-1 (NS-1), NSO, P3 / X63 -Ag8.U1 (P3U1), SP2 / 0-Ag14 (Sp2 / 0, Sp2), PAI, F0, BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag.2.3., Human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1- 2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used.
[0024]
For screening of hybridomas producing monoclonal antibodies (monoclonal antibody-producing immortalized B cells) prepared as described above, the hybridomas are cultured in, for example, a microtiter plate, The reactivity to the immunizing antigen used in the aforementioned mouse immunization can be measured, for example, by measuring by an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
[0025]
“Human antibody” or “human immunoglobulin” in the present invention means the variable region of the heavy chain (V _H ) And the heavy chain constant region (C _H ) And the variable region of the L chain (V _L ) And the light chain constant region (C _L All regions including) are immunoglobulins derived from genes encoding human immunoglobulins. In other words, it means an antibody in which the heavy chain is derived from a human immunoglobulin heavy chain gene and the light chain is derived from a human immunoglobulin light chain gene.
The human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal prepared by incorporating at least a human immunoglobulin gene into a non-human mammal locus such as a mouse with an antigen according to a conventional method. The monoclonal antibody can be produced in the same manner as the production method of the monoclonal antibody.
For example, transgenic mice producing human antibodies have been reported (Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Table No. 4-504365). Publication: International Application Publication No. WO94 / 25585; Nikkei Science, June, 40 to 50, 1995; Nature, Vol. 368, p.856-859, 1994; It can be produced according to the method described in the publication.
[0026]
The method for producing a monoclonal antibody of the present invention comprises the following steps (a) and (b).
(A) an immunoglobulin heavy chain polypeptide having a rearranged endogenous immunoglobulin heavy chain gene and a rearranged endogenous immunoglobulin light chain gene, and the endogenous heavy chain polypeptide derived from the endogenous immunoglobulin heavy chain gene; A foreign DNA comprising a gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide in a cell that secretes a monoclonal antibody comprising the immunoglobulin light chain polypeptide derived from the sex immunoglobulin light chain gene And obtaining a transformed cell transformed with the exogenous DNA.
(B) A step of culturing the transformed cell to obtain the monoclonal antibody secreted into the cell culture medium.
[0027]
Here, the “gene encoding the same amino acid sequence as that of the immunoglobulin heavy chain polypeptide” means a cell producing the above-described monoclonal antibody (preferably an antibody-producing B cell, an antibody-producing immortalized B cell (hybridoma). And the like)) which encodes the same amino acid sequence as that of the immunoglobulin heavy chain polypeptide encoded by the endogenous immunoglobulin heavy chain gene (preferably cDNA). It can be prepared as follows according to a conventional method using a technique and a gene recombination technique.
[0028]
(1) From a hybridoma producing a desired monoclonal antibody, a commercially available reagent (for example, FastTrack 2.0 kit (manufactured by INVITROGEN) etc.) is used in accordance with a conventional method. ⁺ Extract and purify RNA. Specifically, for example, it is as follows.
The frozen and stored hybridoma is dissolved in a cell lysis buffer (Lysis Buffer), and the cells are disrupted and solubilized with a commercially available cell lysis reagent (eg, POLYTRON). After incubating the lysate at an appropriate temperature (eg, about 45 ° C.), Oligo (dT) cellulose is added and gently shaken for an appropriate time (eg, about 1 hour).
Next, after washing Oligo (dT) cellulose, PolyA ⁺ Elute RNA with Ellution Buffer. Eluted PolyA ⁺ RNA is ethanol precipitated and dissolved in an appropriate amount of Tris-EDTA buffer. Obtained PolyA ⁺ The concentration of RNA is determined by measuring absorbance at an appropriate wavelength (eg, 260 nm).
[0029]
(2) Obtained PolyA ⁺ Using RNA as a template, a commercially available reagent (eg, Marathon cDNA Amplification Kit (manufactured by CLONTECH), etc.) is used to synthesize cDNA by a conventional method using the RACE-PCR method. Second edition of the year, published by Kyoritsu Publishing Co., p. Specifically:
Appropriate amount of purified PolyA ⁺ Using RNA (for example, about 1 to 5 μg) as a template, 1st strand cDNA and 2nd strand cDNA are sequentially synthesized. The cDNA is subjected to extraction using phenol / chloroform / isoaminoalcohol and chloroform. The cDNA is then ethanol precipitated and ligated to adapter DNA. Designed based on the base sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of the monoclonal antibody produced by the hybridoma, using the resulting DNA reaction product diluted to an appropriate concentration (eg 1/250) as a template PCR is performed by a conventional method using the designed primer and a primer designed based on the base sequence of the adapter DNA. The obtained PCR product is fractionated by agarose gel electrophoresis, and cDNA is recovered.
[0030]
(3) The obtained cDNA base sequence encoding the full-length or part of the amino acid sequence of the heavy chain of the monoclonal antibody is obtained by using commercially available reagents (for example, Dye Terminator Cycle Sequence Kit (manufactured by PE-Applied Biosystems)) and PRISM377 DNA. Determine using a Sequencer (PE-Applied Biosystems).
(4) A pair of primers based on the base sequence of the cDNA encoding the partial amino acid sequence of the heavy chain of the monoclonal antibody so that a cDNA encoding the full length of the amino acid sequence of the heavy chain polypeptide can be obtained by PCR. DNA is synthesized and the purified PolyA is synthesized using the pair of primers. ⁺ PCR is performed in the same manner as described above using RNA as a template to obtain cDNA encoding the full length of the heavy chain polypeptide.
[0031]
The method for producing a monoclonal antibody of the present invention secretes a monoclonal antibody comprising the immunoglobulin heavy chain polypeptide, which is described in detail above, “a gene encoding the same amino acid sequence as that of the immunoglobulin heavy chain polypeptide”. Introduced into a cell (preferably a monoclonal antibody-producing hybridoma itself as a source in the preparation of the gene, that is, synonymous with the above-described monoclonal antibody-producing B cell or immortalized B cell) using genetic engineering techniques according to a conventional method, The method comprises selecting and isolating a transformed cell transformed with the gene, purifying and obtaining the monoclonal antibody from the cell culture medium by culturing the transformed cell.
[0032]
For introduction of the gene (eg, cDNA) into the cell, an expression vector incorporating the plasmid vector is prepared so that the gene can be expressed in the host cell according to a conventional method, and the host cell is transformed with the expression vector. This is done by converting.
Examples of the method for incorporating cDNA into a plasmid include the method described in Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989).
As a method for introducing a plasmid into a host, a calcium chloride method, a calcium chloride / rubidium chloride method, or an electroporation method described in (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.1.74, 1989). Etc.
[0033]
The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be retained and replicated in a host cell (preferably a eukaryotic cell), and includes a plasmid vector and a phage vector.
Specifically, plasmids include, for example, pLS407, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19, pSH19, pSH15, pUB110, pTP5, pC194, pcD2, pBSV, CMD, pSV2, and further pMAL C2, pEF-BOS (nucleic Nucleic Acid Research, Vol. 18, Page 5322, 1990, etc.) or pME18S (Experimental Medicine Separate Volume “Gene Engineering Handbook”, 1992, etc.) etc. are exemplified.
Examples of the phage include bacteriophages such as λ phage, and animal and insect viruses (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retrovirus, vaccinia virus, and nuclear polyhedrosis virus.
[0034]
When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector generally has at least a promoter-operator region, a start codon, and a gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain), a stop codon, a terminator region, and a replicable. Consists of units.
When yeast, animal cells, or insect cells are used as the host, the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain), and a stop codon.
In addition, DNA encoding a signal peptide, enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of a gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain), splicing junction, polyadenyl May contain a recombination site, a selectable marker region or a replicable unit.
Further, it may contain a gene amplification gene that is usually used depending on the purpose.
[0035]
Examples of a promoter for expressing a gene encoding the above-described desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) in eukaryotic cells such as mammalian cells include, for example, chicken-derived β-actin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus Promoters, heat shock promoters, and the like. Preferred are a β-actin promoter derived from chicken, a promoter derived from SV40, SV40, and a retrovirus promoter. However, it is not particularly limited to these.
In addition, the use of an enhancer is an effective method for expression, and a preferred enhancer includes a CMV enhancer.
The promoter-operator region for expressing the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) in bacteria contains the promoter, the operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (eg, AAGG). It is a waste. For example, when the host is Escherichia, preferred examples include those containing Trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, tac promoter and the like.
Examples of promoters for expressing the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) in yeast include the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter. When the host is a Bacillus genus Include SL01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like.
[0036]
A suitable initiation codon is exemplified by methionine codon (ATG).
Examples of stop codons include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA). As the terminator region, a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
[0037]
A replicable unit refers to a DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a DNA fragment prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included. Suitable plasmids include plasmid pBR322 or an artificial modification thereof (DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme) in E. coli, yeast 2μ plasmid or yeast chromosomal DNA in yeast, Examples of mammalian cells include plasmid pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmid pSV2neo ATCC 37149, and the like.
[0038]
As the enhancer sequence, polyadenylation site and splicing junction site, those commonly used by those skilled in the art such as those derived from SV40 can be used.
The above-described expression vector can be prepared by linking the above promoter, initiation codon, the above-mentioned IgH chain-encoding gene and / or terminator region to appropriate replicable units in a continuous and circular manner. . At this time, if desired, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, other restriction enzyme cleavage sites, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
[0039]
Selection of a host cell transformed with the above expression vector, that is, a transformed cell, is carried out by inserting a desired selection marker (for example, drug resistance gene) into the expression vector, It is possible by culturing in the presence of
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples thereof include antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin.
[0040]
In the above-described method for producing a monoclonal antibody of the present invention, a gene amplification gene is inserted together with a gene encoding the above-described desired monoclonal antibody heavy chain polypeptide inserted into the expression vector, thereby allowing the An embodiment in which the production efficiency of a desired monoclonal antibody by the transformed cell is further increased by amplifying the copy number of the gene encoding the chain polypeptide is also included as an embodiment of the present invention.
[0041]
Examples of gene amplification genes that can be used in the present invention include dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase (GS) gene, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, hygromycin-B-phospho. Examples include transferase genes and aspartate transcarbamylase genes. Preferably, it is a DHFR gene or a GS gene.
[0042]
In the method for producing a monoclonal antibody of the present invention, a cell (host cell) transformed with the “gene encoding the same amino acid sequence as the immunoglobulin heavy chain polypeptide” described in detail above, Any cell may be used as long as it is a “cell that secretes a monoclonal antibody comprising the immunoglobulin heavy chain polypeptide”, but particularly preferably the monoclonal antibody-producing hybridoma used as a source in preparation of the gene itself (ie, the aforementioned monoclonal antibody production). B cells or immortalized B cells).
[0043]
Examples of host cells other than the hybridoma include various cells such as natural cells or artificially established recombinant cells as long as the desired monoclonal antibody is produced (for example, bacteria (Escherichia, Bacillus). , Yeast (Saccharomyces spp., Pichia spp., Etc.), animal cells or insect cells.
If the cell produces the desired monoclonal antibody, the origin of the cell is, for example, E. coli (DH5α, TB1, HB101, etc.), mouse-derived cell (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3 Etc.), rat-derived cells (PC12, PC12h), hamster-derived cells (BHK, CHO, etc.), monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, diploid fibroblasts) Cell, myeloma cell, HepG2, etc.).
[0044]
Introduction (transformation (transfection)) of the above-described expression vector into which the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain has been inserted (transformation (transfection)) can be carried out using a conventionally known method.
For example, in the case of animal cells, for example, according to Graham's method (Virology, Vol. 52, p. 456, 1973), in the case of bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), for example, the method of Cohen et al. (Proc. Natl). Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972), protoplast method (Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979) and competent method (J. Mol. Biol. , Vol. 56, p. 209, 1971), Saccharomyces cerevisiae, for example, the method of Hinnnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 75, p. 1927, 1978) or the lithium method ( J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983), and in the case of insect cells, for example, by the method of Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983). Can be transformed.
[0045]
The “transformed cell” in the above-described method for producing a monoclonal antibody of the present invention, wherein the transformed cell transformed with the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain is cultured in the following manner. Can be done. By the culture, a desired monoclonal antibody can be obtained from the cell culture medium.
[0046]
The cell transformed with the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain is the monoclonal antibody-producing hybridoma itself (synonymous with the above-mentioned monoclonal antibody-producing B cell or immortalized B cell) used as a source in the preparation of the gene. Yes, that is, when the resulting transformed cell is a recombinant hybridoma, it can be performed in the same manner as a general culture method of a normal hybridoma.
[0047]
Specifically, the recombinant hybridoma is obtained in vitro or in vivo in a mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or the like, preferably a mouse or rat, more preferably a mouse ascites, and the culture supernatant obtained. Or by isolation from ascites of mammals.
When cultivating in vitro, in order to grow, maintain and preserve the hybridoma according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the research and the culture method, etc., to produce a monoclonal antibody in the culture supernatant It is possible to carry out using any nutrient medium that is derived from a known nutrient medium or a known basic medium as used in the above.
[0048]
Examples of the basic medium include a low calcium medium such as Ham'F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium, and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium. The basic medium can contain, for example, serum, hormones, cytokines and / or various inorganic or organic substances depending on the purpose.
[0049]
Isolation and purification of the monoclonal antibody from the recombinant hybridoma can be carried out by using the above-mentioned culture supernatant or ascites, saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation method, caproic acid method, caprylic acid method, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.) , By subjecting to an affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
[0050]
On the other hand, when the cell transformed with the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain is a host cell such as a CHO cell generally used in the production of the above-described recombinant protein, It can be performed in the same manner as a general culture method in the production of a recombinant protein.
[0051]
That is, it can be produced by culturing the transformed cell in a nutrient medium.
The nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant). Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose. Examples of the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, large extract, and the like. Examples include soybean cake, potato extract and the like. In addition, other nutrients (for example, inorganic salts (for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (for example, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.)) may be included as desired. .
Culturing is performed by methods known in the art. The culture conditions such as temperature, medium pH and culture time are appropriately selected so that the desired monoclonal antibody of the present invention is produced in large quantities from the transformed cells.
[0052]
In addition, although the specific culture medium and culture | cultivation conditions used according to a host cell below are illustrated, it is not limited to these at all.
When the host is a bacterium, actinomycetes, yeast or filamentous fungus, for example, a liquid medium containing the above nutrient source is suitable. Preferably, the medium has a pH of 5-8.
When the host is E. coli, preferred media include LB medium, M9 medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) and the like. In such a case, the culture can be performed usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and stirring as necessary.
When the host is a Bacillus genus, the treatment can be performed usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
[0053]
When the host is yeast, examples of the medium include Burkholder's minimum culture (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980), and the pH is 5-8. desirable. The culture is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
When the host is an animal cell, for example, a MEM medium (Science, Vol. 122, p. 501, 1952) containing about 5 to 20% fetal bovine serum, a DMEM medium (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), RPMI1640 medium (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199 medium (proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) Etc. can be used. The pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours.
When the host is an insect cell, for example, Grace's medium containing fetal bovine serum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985) can be mentioned, and its pH is about 5-8. Is preferred. The culture is usually performed at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and aeration and agitation can be performed as necessary.
The desired monoclonal antibody in the present invention can be obtained from the culture supernatant of the transformed cells thus cultured by the above-described general purification method for monoclonal antibodies.
[0054]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to only the modes described in the examples.
[0055]
Example 1 Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Hybridoma
The hybridoma producing a human monoclonal antibody against human IL-8 described in the previous report was used in the following tests (Nature genetics Vol.15, p.146-156, 1997, and International Patent Application Publication No. WO96 / 33735). .
The hybridoma was produced as follows.
Inactivate the endogenous loci of each of the mouse heavy and light chains, and human immunoglobulin heavy chains (Cμ and Cγ ₂ ) And light chain (κ) loci prepared by integrating DNA containing each loci into the endogenous genome of the mouse ₂ Previously-known transgenic mice producing κ / κ monoclonal antibodies were used as immunized animals (Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Table H4-504365 Publication; International Application Publication No. WO94 / 25585 Publication; Nikkei Science, June, 40 to 50, 1995; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; Table No. 6-500233).
[0056]
The human IgG ₂ Recombinant human IL-8 (25 μg) was intraperitoneally administered together with complete Freund's adjuvant to transgenic mice (8 to 10 weeks old) / κ antibody-producing mice for the first immunization. Every 2 weeks after the initial immunization, the IL-8 was boosted with incomplete Freund's adjuvant (3 times), and the final immunization was performed 4 days before the following cell fusion.
After the final immunization, the spleen and lymph nodes of the immunized mouse were collected and lymphocytes (including antibody-producing B lymphocytes) were collected. The antibody-producing lymphocytes were cell-fused with mouse myeloma cells (NSO-bsl2 cell line) that did not produce any autoantibodies according to a conventional method. Hybridomas obtained by cell fusion were selected by the HAT selection method according to a conventional method.
The presence or absence of reactivity of the human monoclonal antibody produced by the obtained hybridoma to human IL-8 was measured by ELISA according to a conventional method to obtain a plurality of hybridomas producing anti-human IL-8 human monoclonal antibody. Each hybridoma was stored frozen.
[0057]
Example 2 Isolation of endogenous IgH gene from monoclonal antibody-producing hybridoma
Anti-human IL-8 human IgG prepared as described above ₂ The frozen cells of the / κ monoclonal antibody-producing hybridoma (clone: K2.2.1) were dissolved in a cell lysis buffer (Lysis Buffer), and the cells were disrupted with POLYTRON and solubilized.
Next, from the cell lysate, PolyA using a commercially available RNA extraction kit (FastTrack 2.0 kit (manufactured by INVITROGEN)) ⁺ RNA was extracted and purified.
After the cell lysate was incubated at 45 ° C., Oligo (dT) cellulose was added and gently shaken for about 1 hour. Next, after washing Oligo (dT) cellulose, PolyA ⁺ RNA was eluted with Ellution Buffer. Eluted PolyA ⁺ RNA was ethanol precipitated and dissolved in Tris-EDTA buffer. Obtained PolyA ⁺ The concentration of RNA was determined by measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm.
[0058]
Obtained PolyA ⁺ Using RNA as a template, cDNA was synthesized by the RACE-PCR method using a commercially available Marathon cDNA Amplification Kit (manufactured by CLONTECH) ("Gene Amplification PCR Method: Fundamentals and New Developments", 1992, 2nd edition, Kyoritsu) Publishing Co., Ltd., p.13-15). That is, PolyA purified from the hybridoma ⁺ 1st strand cDNA and 2nd strand cDNA were sequentially synthesized using RNA (1 to 5 μg) as a template. The cDNA was subjected to extraction once each using phenol / chloroform / isoamino alcohol and chloroform. The cDNA was then ethanol precipitated and ligated to the adapter DNA that came with the kit.
Using the obtained dilution of the DNA reaction product as a template, 5′RACE-PCR was performed by a conventional method using a synthetic primer to prepare cDNA encoding a part of the endogenous immunoglobulin heavy chain polypeptide. In the PCR, a primer HG2-3-437 (SEQ ID NO: 3) designed based on the base sequence encoding the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain constant region and a primer designed based on the base sequence of the adapter DNA were used. .
[0059]
PCR products were fractionated by agarose gel electrophoresis, and DNA was recovered. The nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined using a commercially available DyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit (manufactured by PE-Applied Biosystems) and PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by PE-Applied Biosystems). In addition, the sequencing primer for this sequencing used the primer used in the above-mentioned PCR.
Based on the determined base sequence of cDNA encoding a part of the heavy chain polypeptide of the immunoglobulin (including the base sequence near the translation start point), a pair of primers VH4-21 (SEQ ID NO: 4) and CG2- 1 (SEQ ID NO: 5) was synthesized. Using this pair of primers, PCR was further performed in the same manner as described above. The base sequence of cDNA obtained from the obtained PCR product in the same manner as described above was determined in the same manner as described above, and the heavy chain polypeptide (IgH) of the anti-human IL-8 human monoclonal antibody produced by the hybridoma K2.2.1 CDNA encoding the full length of was obtained (base sequence: SEQ ID NO: 1 and amino acid sequence SEQ ID NO: 2).
[0060]
Example 3 Introduction of IgH cDNA into hybridoma K2.2.1 and production of monoclonal antibody by recombinant hybridoma
A cDNA (SEQ ID NO: 1) encoding the full length of the heavy chain polypeptide (IgH) of the anti-human IL-8 human monoclonal antibody secreted by the hybridoma K2.2.1 obtained above is converted into a CMV using DNA ligase according to a conventional method. The expression vector pDH502 was prepared by inserting and ligating into the EcoRI restriction enzyme site of the plasmid pLS407 carrying the enhancer / chicken B actin promoter and DHFR gene (FIG. 1).
The DHFR gene is a marker gene as well as a gene amplification gene, and the presence of the gene enables selection of transformed cells by the expression vector by culturing the cells in the presence of methotrexate (MTX). .
The IgH gene expression vector pDH502 was introduced into the hybridoma K2.2.1 by electroporation. Subsequently, the hybridoma was cultured in a selective medium (IMDM (JRH BIOSCUENCE); containing 10% FBS and 300 mM MTX), and about 100 transformants (recombinant hybridoma) grown were selected and obtained. Each selected recombinant hybridoma was cultured in a 96-well microplate.
[0061]
Human monoclonal antibody (IgG) produced in the culture supernatant of each transformant (recombinant hybridoma) cultured in each well ₂ ) Was measured by sandwich ELISA according to a conventional method. Anti-human IgG (Fc) (manufactured by Organon Teknika) as a solid phase antibody (primary antibody) and anti-human Igκ antibody (manufactured by PROTOS IMMUNORESEARCH) labeled with horseradish peroxidase (HRP) as a detection antibody (secondary antibody) Using. In addition, human IgG / κ (The Binding Site) was used as a reference standard.
The results are shown in FIG.
As a result, the production of monoclonal antibodies in most clones of the parental hybridoma K2.2.1 was extremely low, whereas a significant increase in the production of monoclonal antibodies was observed in most of the recombinant hybridoma clones. It was.
Further, Table 1 shows the production amounts of monoclonal antibodies of several clones of the recombinant hybridoma.
[0062]
[Table 1]

[0063]
Next, among the recombinant hybridoma clones, clones (clone Nos. 12, 15, 41, 89) that produced particularly high concentrations of monoclonal antibodies were subcloned by the limiting dilution method and subcloned (sub- cloned) Recombinant hybridomas were obtained (clone Nos. 12-6, 15-4, 15-12, 41-2, and 89-5). The amount of monoclonal antibody produced by each sub-cloned recombinant hybridoma was measured by the same ELISA as described above. The results are shown in Table 2 (upper).
[0064]
[Table 2]

[0065]
As a result, the amount of monoclonal antibody produced by each sub-cloned recombinant hybridoma was significantly higher than that of the parent recombinant hybridoma. For example, the antibody production amount of the parent recombinant hybridoma (No. 15) was about 37.3 μg / ml, whereas the antibody production amount of the recombinant hybridoma (No. 15-4) subcloned from the parent strain was Increased to about 95.3 μg / ml.
[0066]
Example 4 Production of monoclonal antibody from recombinant hybridoma subjected to gene amplification
The effect of amplification of IgH gene by DHFR gene on the increase of monoclonal antibody production efficiency was examined.
Each of the sub-cloned recombinant hybridomas (clone Nos. 12-6, 15-4, 15-12, 41-2, and 89-5) prepared above was treated with 1, 2, or 5 μM methotrexate (MTX). Further culturing was carried out in a nutrient medium containing MTX-resistant cell lines, which were selected and obtained.
The following MTX resistant cell lines were obtained from each sub-cloned recombinant hybridoma.
<Clone No. 12-6> Clone No. 12-5μ-96-8
<Clone No. 15-4> Clone No. 15-1μ-82-1
<Clone No. 15-12> Clone No. 15-1μ-87-4
<Clone No. 41-2> Clone No. 41-2μ-75-4
<Clone No. 89-5> Clone No. 89-2μ-2-5 and 89-2μ-33-12
The amount of monoclonal antibody produced by each MTX-resistant recombinant hybridoma clone was measured by the same sandwich ELISA as described above. The results are shown in Table 2 (lower).
As a result, the production efficiency of monoclonal antibody per cell of each recombinant hybridoma selected by MTX was lower than that before MTX selection (before gene amplification by DHFR), but it was wild before transformation with IgH gene. Considering that the production amount of the monoclonal antibody of type parent hybridoma K2.2.1 is extremely low (FIG. 2), the production efficiency of the monoclonal antibody of the recombinant hybridoma selected by MTX is significantly increased compared to that of the wild type parent hybridoma. Was.
[0067]
【The invention's effect】
As described above, by using the method of the present invention, it is possible to easily and significantly increase the amount of monoclonal antibody produced by monoclonal antibody-producing cells in the production of a monoclonal antibody useful as a pharmaceutical product.
In particular, when the monoclonal antibody production efficiency of monoclonal antibody-producing immortalized B cells (hybridoma) commonly used in the production of monoclonal antibodies is low depending on the unstable expression or low expression of endogenous IgH gene In addition, it is possible to significantly increase the secretion amount of the monoclonal antibody of the parent hybridoma by using the method of the present invention.
Therefore, the monoclonal antibody production method of the present invention and the monoclonal antibody-producing transformed cells (recombinant cells) obtained by the method are extremely useful means in the production of antibody pharmaceuticals.
[0068]
[Sequence Listing]

[0069]
"Sequence Listing Free Text"
SEQ ID NO: 3
Other information: Description of artificial sequence: Artificially synthesized primer sequence HG2-3-437.
SEQ ID NO: 4
Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence VH4-21 synthesized artificially.
SEQ ID NO: 5
Other information: Description of artificial sequence: Artificially synthesized primer sequence CG2-1.
[0070]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure and restriction enzyme map of an expression vector pDH502.
FIG. 2 is a graph showing the amount of anti-human IL-8 monoclonal antibody produced by a recombinant hybridoma. The vertical axis represents the amount of monoclonal antibody produced, and the horizontal axis represents the type of each recombinant hybridoma clone in each well in the microplate.

Claims (14)

モノクローナル抗体の製造方法であって、下記工程：
（ａ）再配列された内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を有し、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞に、該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性ＤＮＡを導入し、該外来性ＤＮＡにより形質転換された形質転換細胞を得る工程；及び
（ｂ）該形質転換細胞を培養し、細胞培養液中に分泌された該モノクローナル抗体を取得する工程、
からなることを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。A method for producing a monoclonal antibody comprising the following steps:
(A) an immunoglobulin heavy chain polypeptide having a rearranged endogenous immunoglobulin heavy chain gene and a rearranged endogenous immunoglobulin light chain gene, derived from the endogenous immunoglobulin heavy chain gene, and the endogenous Exogenous DNA containing a gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide in a cell that secretes a monoclonal antibody comprising an immunoglobulin light chain polypeptide derived from the sex immunoglobulin light chain gene And obtaining a transformed cell transformed with the exogenous DNA; and (b) culturing the transformed cell and obtaining the monoclonal antibody secreted into the cell culture medium,
A method for producing a monoclonal antibody, comprising: 該免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子と同一の塩基配列を有する遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。2. The gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide is a gene having the same base sequence as the endogenous immunoglobulin heavy chain gene. Production method. 該細胞が、哺乳動物のＢ細胞に由来する不死化Ｂ細胞であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の製造方法。The method according to claim 1 or 2, wherein the cell is an immortalized B cell derived from a mammalian B cell. 該不死化Ｂ細胞が、該Ｂ細胞をミエローマ細胞または組換えミエローマ細胞と融合することにより得られる融合細胞であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。The method according to claim 3, wherein the immortalized B cell is a fused cell obtained by fusing the B cell with a myeloma cell or a recombinant myeloma cell. 該哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方法。The production method according to claim 3 or 4, wherein the mammal is a non-human mammal. 該哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方法。The production method according to claim 3 or 4, wherein the mammal is a human. 該哺乳動物が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項３または請求項４に記載の製造方法。The production method according to claim 3 or 4, wherein the mammal is a transgenic non-human mammal capable of producing a human antibody. 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至請求項４、請求項６または請求項７のいずれかに記載の製造方法。The production method according to any one of claims 1 to 4, 6, or 7, wherein the endogenous immunoglobulin heavy chain gene is a human immunoglobulin heavy chain gene. 該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至請求項４、請求項６または請求項７のいずれかに記載の製造方法。The production method according to any one of claims 1 to 4, 6, or 7, wherein the endogenous immunoglobulin light chain gene is a human immunoglobulin light chain gene. 該モノクローナル抗体が、非ヒト哺乳動物のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の製造方法。The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody of a non-human mammal. 該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１乃至請求項４、請求項６または請求項７のいずれかに記載の製造方法。The method according to any one of claims 1 to 4, 6, or 7, wherein the monoclonal antibody is a human monoclonal antibody. 該外来性ＤＮＡが、さらに遺伝子増幅遺伝子を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載の製造方法。The production method according to any one of claims 1 to 11, wherein the exogenous DNA further contains a gene amplification gene. 該遺伝子増幅遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子であることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。The method according to claim 12, wherein the gene amplification gene is a dihydrofolate reductase (DHFR) gene. 請求項１乃至請求項１３のいずれかの方法により製造される形質転換細胞。A transformed cell produced by the method according to any one of claims 1 to 13.

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