JP4486257B2 - 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 - Google Patents
自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4486257B2 JP4486257B2 JP2000577627A JP2000577627A JP4486257B2 JP 4486257 B2 JP4486257 B2 JP 4486257B2 JP 2000577627 A JP2000577627 A JP 2000577627A JP 2000577627 A JP2000577627 A JP 2000577627A JP 4486257 B2 JP4486257 B2 JP 4486257B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ccr5
- tolerogen
- vlp
- cells
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 110
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 66
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 113
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 72
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 72
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 39
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 32
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 30
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 20
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 20
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 18
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 13
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 13
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 12
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 87
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 82
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 68
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 67
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 62
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 54
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 38
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 34
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 33
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 25
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 25
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 25
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 21
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 21
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 21
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 11
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 101100495162 Mus musculus Ccr5 gene Proteins 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 102000048160 human CCR5 Human genes 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 9
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 8
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 8
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 8
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 8
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 8
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 102000045341 human CCL5 Human genes 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 8
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 6
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 5
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 5
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 5
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 5
- 101000648740 Mus musculus Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108700011778 CCR5 Proteins 0.000 description 3
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 3
- 241000709701 Human poliovirus 1 Species 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 3
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 3
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108700031454 Bovine papillomavirus L1 Proteins 0.000 description 2
- 108700031455 Bovine papillomavirus L2 Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710169873 Capsid protein G8P Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710156564 Major tail protein Gp23 Proteins 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical class [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OC(Cl)=O FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 101710192393 Attachment protein G3P Proteins 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000701814 Bovine papillomavirus type 2 Species 0.000 description 1
- 241000701812 Bovine papillomavirus type 4 Species 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000723655 Cowpea mosaic virus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 101100438883 Homo sapiens CCR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101000897431 Macaca mulatta C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241001631648 Polyomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- VULFYOXOVPJBLV-UHFFFAOYSA-N carbonochloridic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical class OC(Cl)=O.ON1C(=O)CCC1=O VULFYOXOVPJBLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 208000010729 leg swelling Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 108010046144 polymerized flagellin Proteins 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 125000004035 thiopropyl group Chemical group [H]SC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22023—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、B細胞免疫反応をインビボで刺激するための組成物および方法に関するものである。キメラのまたは複合体のウイルス様粒子を含む新規な生物学的手段、治療、および予防、ならびに人間の疾病の研究、治療、および防止のための、前記のものの使用方法が提供される。
【0002】
[発明の背景]
人間の疾病の様々な段階で宿主免疫防御が効果を示していることは、充分確立されている。例えばウイルス感染中には、過去の免疫に反応して刺激された抗体が、感受性標的細胞の付着および浸透の前に、侵入してくるウイルスを中和することができる。この細胞が感染し始め、ウイルス関連抗原をその表面に展示すると、細胞性免疫反応もまた活性化され得る。この後者の場合、細胞毒性T細胞は、感染した細胞を殺し、それにより感染の進行を制限することができる。これらの液性および細胞性免疫反応は一般に、DNAまたはRNAゲノムおよびタンパク質キャプシドまたは膜エンベロープより成る外殻を有するウイルスを包含する、多岐にわたるウイルスによる感染に対して開始される。
【0003】
動物が、自分自身の組織の構成成分に対して同様に反応することなく殆どの外来抗原に対して激しい免疫反応を開始し得るという事実は、BurnetおよびFenner(The Production of Antibodies、Macmillan Co.、メルボルン(1949))に、免疫系は自己と非自己とを識別する何らかのメカニズムを発達させてきたに違いないということを示唆した。自己寛容の状態は、疑いなく、免疫系が通常暴露される中心抗原のために存在する(Siskind,G.、Fundamental Immunology、W.E.Paul編、Raven Press、ニューヨーク、Ch.20(1984))。「中心抗原」とは、免疫系の細胞に通常暴露される自己抗原であり、一方「末梢抗原」とは、例えば物理的疎隔によって、通常、免疫系の細胞との接触から隔てられている自己抗原である。例えば眼、脳および精巣のある構成成分に対する反応を免疫系が開始できないのは、自己寛容ではなく、これらの組織が宿主の免疫系から隔絶していることに起因する。事実、自己免疫反応は、これらの末梢組織抗原を免疫監視機構から分離して維持している物理的「障壁」が無防備となる時に起こり得る。驚くべき事に脊椎動物のゲノムは自己抗原に対する抗体を産生するのに必要な情報を全て所有しており、数多くの自己抗原に対して自然に産生される抗体を常套的に検出することができる。しかしながらこれらの抗体は力価が低く、アビディティが低く、そしてIgMクラスのものである。
【0004】
幾人かの研究者は、自己寛容は、誕生時前後に、成熟前に起こる事象である、自己と非自己成分との識別を免疫系が「学習する」こと、を含んでいると考えている。例えば胎児の発達中にリンパ系が自己抗原に暴露されることは、自己抗原に対する寛容を発達させる上で重要な相であると推測されている。別のモデルによれば、自己抗原に特異的な細胞表面レセプターを発現するリンパ球は、排除され、活性化不能とされ、またはその抗原に対して「寛容化」される。
【0005】
「B細胞寛容」という語は、免疫系が抗原(例えば自己抗原)の存在に対して効果的に反応しない状態、より詳細には、免疫系のB細胞が抗原に対する反応を開始できない状態の描写にしばしば使用される。したがって、B細胞に正常に暴露されても高力価の抗体反応を誘導できない抗原、またはB細胞による正常な無反応に関係している抗原(例えば自己抗原)は、免疫系がその存在を「寛容している」ため、「寛容原」と称する。明らかに、自己抗原は寛容原であるが、外来抗原もまた、B細胞がその抗原に充分反応できない場合には寛容原となり得る。幾人かの研究者は、例えば慢性ウイルス感染(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)の担体である母親から生まれた新生児におけるウイルスの存続)は、免疫系がウイルス抗原に対して寛容化されたために起こると考えている(Takashima等、Immunology、75:398(1992))。寛容原は必ずしも分子全体である必要はなく、或る分子の免疫上重要な領域である可能性のある、一部分(例えばタンパク質のペプチドフラグメント)であってよい。研究者等は様々な技術によって動物における寛容の誘導に成功しているが、寛容原に対する抗体を産生させる方法についての本発明者等の理解は、新生児期に関するものである。
【0006】
[発明の概要]
本発明者等は、通常自然に産生される力価または常套的ワクチン接種後の力価よりも、寛容原(自己抗原および外来抗原)に対する抗体の力価を増大させる組成物および方法を発見した。幾つかの態様では、規則正しく集合したサブユニットを有する、または寛容原の少なくとも1個のB細胞エピトープ(ここで寛容原は、規則的、反復的なアレイで提示される)に結合したキャプシドタンパク質を有する支持体またはキャプソマー構造体を使用して、B細胞寛容の破壊(break)は行われる。本発明の幾つかの態様では、寛容原およびウイルスキャプシドタンパク質は、異なる生物、ウイルス、または感染体から誘導される。支持体は、ビーズ、脂質膜、またはタンパク質ポリマーとすることができる。キャプソマー構造体は、二十面体のまたはらせんの対称性を有することができる。しかしながら望ましい組成物では、キャプソマー構造体は、自己集合して「ウイルス様粒子」またはVLPと呼ばれる機能的な構造体を形成する、ウイルスキャプシドタンパク質で構成されている。
【0007】
幾つかの態様においては、このウイルスキャプシドタンパク質はハイブリッド分子であるか、またはその他の点で修飾されている。したがって、幾つかの態様は「キメラウイルス様粒子(VLP)」であり、別の態様は「複合体ウイルス様粒子(VLP)」である[ここで「キメラVLP」は、遺伝子工学(例えば寛容原/キャプシドタンパク質融合物の作成)によってウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)に結合した寛容原を有し、そして「複合体VLP」は、キャプシドタンパク質または寛容原またはその両者の化学的、物理的またはその他の修飾によってウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)に結合した寛容原を有する(例えばビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/アビジン、その他のリガンド/レセプターアレイ)]。したがって、本発明の態様は、サブユニットの規則的な集合を有する支持体と、寛容原を与える免疫原を形成するように前記支持体に結合した寛容原の少なくとも1個のB細胞エピトープとを含む組成物[ここで、この寛容原を与える免疫原は、前記寛容原を規則的、反復的なアレイに提示する]を包含する。本発明に係る別の組成物は、キャプシドタンパク質の対称的な集合体を有するキャプソマー構造体と、ウイルス様粒子(VLP)を与える寛容原を形成するよう前記キャプソマー構造体に結合した寛容原の少なくとも1個のB細胞エピトープとを含む[ここで、寛容原を提示するVLPは、寛容原を規則的、反復的なアレイに提示する]。本発明に係る別の態様は、免疫系の細胞に結合したこれらの組成物の一つを含む単離された複合体に関するものである。さらに、これらの組成物を含む医薬は本発明の態様である。
【0008】
寛容原に対する抗体を産生させる方法もまた本発明の一部である。一つの方法では、寛容原に対する抗体を必要とする対象を特定し、そしてその対象に、寛容原に対する抗体を産生させるように、上記の組成物のうちの一つを十分量供給することによって、寛容原に対する抗体を産生させる。別のアプローチは、自己抗体を産生する物質の特定を含む。したがって、上記の組成物のうちの一つを対象に提供し、その対象から抗体を単離し、工程(b)で単離された寛容原に結合する抗体の力価を決定し、そして高力価の抗体を産生する能力によって当該物質を特定する。さらに、寛容原に対するモノクローナル抗体を産生する方法もまた本発明の範囲内にある。このアプローチによっては、上記組成物のうち一つを対象に提供し、この対象から、B細胞とのハイブリドーマを作成する。別の方法は、対象において低力価の抗体反応を生成する抗原を選択し、この抗原を修飾VLPに結合させて複合体VLPを形成させ[ここで、この複合体VLPは、抗原を規則的、反復的なアレイに提示する]、そしてこの複合体VLPを対象に提供し、それにより高力価の抗体を産生させるという工程を含む、通常免疫原性の化合物に対する抗体の産生を増強する方法を包含する。
[発明の詳細な説明]
【0009】
本明細書に記載の発明は、自己抗原および外来抗原を包含する「寛容原」に対する抗体の力価を、日常的に自然に生成する、または常套的ワクチン接種法の後の力価よりも増加させる組成物および方法に関するものである。「低力価抗体反応」とは、生理学的に有効なインビボ免疫反応を開始する抗体を不充分な量で産生するB細胞反応を意味し、一方「高力価抗体反応」とは、生理学的に有効なインビボ免疫反応を開始する充分量の抗体を指す。「低力価抗体反応」および「高力価抗体反応」という語はさらに、産生される抗体の濃度およびアビディティに従って定義される。即ち、ある抗原が「低力価抗体反応」を生むか「高力価抗体反応」を生むかは、ELISA検定において抗原がもはや検出され得ない抗体含有血清の希釈度に依存するものである[ここで、典型的には、標的抗原200ngが1:1000希釈の二次抗体と共に使用される]。したがって、「低力価抗体反応」は、典型的には上記のELISAの条件の下で約1:10000希釈未満であり、そして「高力価抗体反応」は、典型的には1:10000希釈に等しいかまたはこれより大きい。「寛容原」という語は、本明細書全体を通して使用され、完全なB細胞の非反応性、または、その抗原が抗原の正常なインビボ活性に実質的な影響を及ぼさない低力価の抗体反応のみを誘導するという点で限定されたB細胞の反応性、を伴っている自己抗原または外来抗原(ペプチド、核酸、炭水化物、または脂質)を指す。
【0010】
幾つかの態様では、B細胞寛容の破壊は、規則正しく集合したサブユニットを有する、または寛容原の少なくとも1個のB細胞エピトープ(ここで寛容原は、規則的、反復的アレイに提示されている)に結合したキャプシドタンパク質を有する支持体またはキャプソマー構造体を使用して行われる。本発明の幾つかの態様では、寛容原およびウイルスキャプシドタンパク質は、異なる生物、ウイルス、または感染体から誘導される。支持体は、ビーズ、脂質膜、またはタンパク質ポリマーとすることができる。キャプソマー構造体は、二十面体またはらせん対称性を有することができる。しかしながら好ましい組成物では、キャプソマー構造体は、自己集合して機能的な構造体を形成する、ウイルスキャプシドタンパク質で構成されている。このようなウイルスキャプシド集合体を「ウイルス様粒子」またはVLPと称する。
【0011】
幾つかの態様においては、このウイルスキャプシドタンパク質はハイブリッド分子であるか、またはその他の点で修飾されている。「ウイルス様粒子」または「キャプソマー構造体」という語はしばしば、ウイルスゲノムを包含しない、キャプシドタンパク質の自己集合的な規則的なアレイを含む機能的な構造体を指すのに使用される。この点において、幾つかの態様は「キメラウイルス様粒子(VLP)」であり、別の態様は「ウイルス様粒子(VLP)」である。「キメラVLP」という語は、寛容原が、遺伝子工学(例えば寛容原/キャプシドタンパク質融合物の作成)によってウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)に結合しているVLPを指す。したがって、寛容原/キャプシドタンパク質融合物は、ウイルス外殻タンパク質が寛容原のB細胞エピトープ由来のアミノ酸配列とキメラを作っていることから、しばしば「ハイブリッド外殻タンパク質」と呼ばれる。本明細書中で使用する命名法によれば、ハイブリッド外殻タンパク質は、そのウイルス外殻タンパク質の名称およびウイルス外殻タンパク質に関連して示される寛容原の由来によって特定される。「複合体VLP」という語は、キャプシドタンパク質または寛容原またはその両者の化学的、物理的またはその他の修飾によって寛容原がウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)に結合しているVLP(例えばビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/アビジン、その他のリガンド/レセプターアレイ)を呼称するのに使用する。
【0012】
ハイブリッド外殻タンパク質は、例えば寛容原のアミノ酸配列をウイルス外殻タンパク質のアミノ酸配列中に挿入することによって、または、ウイルス外殻タンパク質のアミノ酸配列を寛容原のアミノ酸配列に置換することによって、その一次構造体内部に寛容原のアミノ酸配列を取り込むことができる。キメラ形成の部位は多くの場合、VLPの外表面および自己集合に関与するウイルス外殻タンパク質の領域に依存する。この部位は例えばウイルス中和(neutralizing)エピトープの部位に対応し得る。ハイブリッド外殻タンパク質は、本発明のある態様では単一外殻タンパク質、別の態様ではキャプソマー(五量体に配置された5個の外殻タンパク質)、または好ましい態様では、粒子構造体として配置された多キャプシドタンパク質より成るVLPの形態をとり得ることが理解されるべきである。
【0013】
VLPのキャプソマー構造体を含むウイルスキャプシドタンパク質は多くの異なるタイプのウイルス由来であってよいが、望ましい態様は、二十面体構造体(例えばT=7)を有するウイルス、およびその天然供給源の宿主が哺乳動物であるウイルス、およびパピローマウイルス亜科、ポリオーマウイルス亜科、またはパルボウイルス科のファミリーより選ばれるウイルス中に見出されるタンパク質を有する。好ましい組成物は、多数のパピローマウイルス複合体または修飾されたL1タンパク質を含むキャプシド集合体を有する。
【0014】
本明細書に開示されるキメラのおよび複合体のVLP技術を使用することにより、幾つかのアプローチを使用して寛容原を支持体に結合させ、数多くの新規な組成物を作り出すことができる。殆どの態様では、その組成物は、1個以上の寛容原分子が支持体に結合している点で「多量体の」支持体である。しかしながら幾つかの態様においては、その組成物の寛容原部分が、一列に融合された同じ寛容原ドメインを多数含んでいるという点で「多量体化された」支持体が提供される。さらに、多量体化された寛容原を有する多量体組成物もまた本発明の態様である。別の態様では、その組成物は、1個以上のタイプの寛容原が提示されているという点で「複合物」支持体である。当業者は、複合物支持体は多量体であってよく、そして多量体化された寛容原を含んでいてよいということをも理解できるであろう。好ましくは、多量体組成物、多量体化された組成物、および複合物組成物ならびにそれらの組み合わせは、細胞への免疫系の発現を最適化するような方法で支持体に寛容原を結合させる。例えばこの態様は、寛容原を、規則的な、間隔の狭い、反復的なアレイに提示する。さらに、幾つかの態様は、支持体およびウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)の間、または寛容原およびウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)の間、またはその両方で作り替えられ、その結果、立体障害を減らし、最適な免疫反応を促進するリンカーを包含する。したがって、幾つかの組成物は、リンカーによってその支持体に結合しているウイルスキャプシドタンパク質(またはその相同体)または寛容原またはその両者を有する。
【0015】
多くの異なる寛容原を、ペプチド、核酸、炭水化物、および脂質を包含する支持体に結合させることができる。幾つかの態様においては寛容原は自己抗原である。例えば、寛容原は、リガンド、例えば新生物形成性細胞の表面上のタンパク質、または成長因子、例えば血管新生に関連するタンパク質、またはウイルスレセプター、例えばケモカインレセプターCCR5、およびサイトカイン、例えばTNF−αであってよい。これらの「全長」寛容原のフラグメントもまた幾つかの態様にとって望ましい。即ち、幾つかの態様においては、寛容原は分子全体(例えば全長)であってよいが、大抵は、寛容原は全長分子の一部またはフラグメントのみを含む(例えば部分長)。望ましい寛容原は、全長分子のうち少なくとも5ないし500、有利なものとして5ないし200、そして好ましくは5ないし50の連続するアミノ酸を含んでいる。好ましくは、寛容原およびウイルスキャプシドタンパク質は、異なる生物、ウイルス、または感染体から誘導される。別の態様は、免疫系の細胞(例えばB細胞、T細胞、または樹状細胞)に結合させた上記組成物のうち一つを含む、単離された複合体、および上記の組成物のうち一つを含む医薬を包含する。
【0016】
本発明に係る組成物、単離された複合体、および医薬は、B細胞寛容の研究、自己抗体を産生する物質の同定、および人間の疾病、例えばウイルス感染、慢性炎症、および癌の治療および予防のための、生物学的手段、治療薬、および予防薬として使用される。例えば一つの態様において、自己抗体を産生する物質を同定する方法が提供される。このアプローチでは、本発明に係る組成物を対象に供給し、次にこの対象から抗体を単離し、そして、単離されたこの抗体がその組成物により提示された寛容原と相互作用するかどうかの決定を行う。その後、単離された抗体が寛容原と相互作用する能力によってB細胞寛容を破壊するものとして、免疫原を同定する。別の態様では、寛容原に対する抗体を産生する方法が提供されるが、この場合、寛容原に対する抗体を必要とする対象を特定し、次いで治療上有益な量の本発明に係る組成物を供給する。加えて、HIV感染、慢性ウイルス感染、癌および炎症の治療および防止の方法が提供され、これは、本発明に係る組成物を含む医薬を提供する工程を含むものである。例えば、乳癌および慢性関節リウマチは、それぞれErbB−2およびTNF−αに対する抗体の産生を誘導することにより治療することができる(Maini,R.N.等、Imm.Reviews、144:195−223(1995);Baselga,J.等、J.Clin.Oncol.、14:737−44(1996))。さらに、本発明に係るキメラおよび複合体VLP上のエピトープに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が、態様である。
【0017】
本発明者等の発見の証拠は、下に述べる二つの群の実験で提供される。第一の例示的説明では、マウスケモカインレセプター(mCCR5)中心抗原に対するB細胞寛容を、mCCR5寛容原を有するキメラVLPでマウスを免疫することによって解除した。これらの実験では、マウスケモカインレセプターCCR5の細胞外ループを表すペプチドを、常套的クローニング技術により牛パピローマウイルスL1外殻タンパク質(BPV−1)の中和エピトープ中に組み入れた。L1は、たとえアジュバントが無くても高レベルの中和抗体を誘導するウイルス様粒子(VLP)へと自己集合する固有能力を持っている(Kirnbauer,R.等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、89:12180−12184(1992);Greenstone,H.L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:1800−1805(1998))。CCR5レセプターは、メモリーT細胞およびマクロファージを包含する数多くの細胞型および組織で発現される(Zhang,L.等、J.Virol.、72:5035−5045(1998))。「L1−CCR5」と呼ばれる組み換えにより生成されたキメラタンパク質は、キャプソマーの規則的なアレイを有する粒子構造体(以後、ウイルス様粒子またはVLPと称する)へと自己集合し、これが免疫原として使用された。CCR5はHIVのM親和性株のための共同レセプターであることが知られており、そしてヒトCCR5に対するモノクローナル抗体はインビボでヒト細胞のHIV感染をブロックするということを当業者は理解できるであろう。
【0018】
下記に詳述するように、L1−CCR5免疫原を投与されたマウスは、天然由来のマウスCCR5に結合し、ランテス(RANTES)リガンドの結合を阻害し、そしてヒト−マウスCCR5キメラを発現する指標セルラインのHIV−1感染をブロックする、自己抗体を産生した。本発明者はさらに、マウスにおけるこの治療プロトコルの長期的な影響は最小限であることを示す。さらに、本発明者等は、CCR5に対する自己抗体が霊長類で産生できることを立証した。これらの実験は、免疫系と同時に起こった細胞表面自己抗原に対するB細胞寛容を破壊することができることの証拠を提供するものである。これらの新規な組成物は医薬に配合することができ、HIV感染を治療および/または防止するために使用できる。
【0019】
第2群の実験において、本発明者等は、腫瘍壊死因子α(TNF−α)のフラグメントを含む複合体VLPを対象に接種することにより、TNF−αに対する自己抗体の産生を誘導できることの証拠を提供する。この免疫原は、ストレプトアビジン/TNF−α融合タンパク質(SA−TNF−α)をビオチニル化(biotinylated)L1−VLPに結合させることにより作り出した。SA−TNF−α VLP複合体を接種したマウスは、TNF−α感受性セルライン(L929細胞)に及ぼすTNF−αの影響を中和する自己抗体を産生した。これらの新規な組成物は医薬に配合することができ、慢性炎症性疾患および、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、癌、多発性硬化症、糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、および喘息を包含する(但しこれらに限定される訳ではない)TNF−αの過剰な放出に関連するその他の疾患、の治療および/または防止に使用することができる。下記の内容およびそれに続く実施例において、本発明者等はこれら二つの群の実験例をより詳細に述べる。
【0020】
免疫寛容を破壊しHIV感染を阻害するキメラVLP
自己抗原に対する自己抗体を誘導できるか否かを研究している間に、本発明者等は、ウイルス粒子の規則的な表面に類似する状況にその抗原を置くことによってB細胞寛容が解除され得ることを発見した。最初の実験で、本発明者等はマウスケモカインレセプターmCCR5を牛パピローマウイルスL1外殻タンパク質の主要な免疫部位に挿入した。この組み換えタンパク質は「L1−CCR5」と呼ばれ、CCR5エピトープをコードしているアミノ酸を多数含む自己集合性キメラL1タンパク質である。パピローマウイルスは高度に特異的な免疫原であるため、これが選択された。各々の脊椎動物種を、各群が幾つかのパピローマウイルスの型を含んでいる、別個の群のパピローマウイルスに感染させた。あるパピローマウイルスの型のビリオンに対する中和抗体は、通常、別の型に対する免疫を付与しない。
【0021】
パピローマウイルスは、多岐にわたる動物種の上皮において複製し、良性の上皮および繊維上皮性腫瘍または疣贅の形成を引き起こす、エンベロープを持たないウイルスの例である。パピローマウイルス粒子は直径が約55nmであり、ヌクレオヒストン核に入ったおよそ8kbの二本鎖DNAゲノムを包んでいる(Baker等、Biophys J.、60:1445(1991))。キャプシドは、ウイルスによりコードされている二つのタンパク質、L1およびL2で構成され、これらはSDS−PAGEゲル上でそれぞれおよそ55kDaおよび75kDaに移動する(Mose Larson等、J.Virol.、61:3596(1987))。主たるL1キャプシドタンパク質は、T−7二十面体対称性と関連する72の五量体に配置されている。ビリオン当たりおよそ12個のL2キャプシドタンパク質がある(Baker等、Biophys J.、60:1445(1991))。
【0022】
L1タンパク質は自己集合(会合)する能力を持っており、その結果、様々な組み換え発現系においてL1タンパク質を所定のパピローマウイルスから発現させることによって、大量のウイルス様粒子(VLP)を生成することができる(Kirnbauer等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:12180(1992)(BPV−1、バキュロウイルス発現系);Hagensee等、J.Virol.、67:315(1993)(HPV−1、ワクシニアウイルス発現系);Kirnbauer等、J.Virol.、67:6929(1993)(HPV−16、バキュロウイルス発現系);Rose等、J.Virol.、67:1936(1993)(HPV−11、バキュロウイルス発現系);Sasagawa等、Virol.、206:126(1995)(HPV−16、酵母発現系);Nardinelli−Haefliger等、Infection and Immunity、65:3328(1997)(HPV−16、細菌発現系))。集合に必要である訳ではないが、細胞でL1と同時発現させる(L1/L2 VLP)際にはL2をVLP中に組み入れる。
【0023】
変性させたL1タンパク質ではなく天然由来のビリオンまたはL1 VLPでウサギを免疫すると、高力価の中和血清抗体が誘導される(Christensen等、J.Virol、64:3151(1990);Kirnbauer等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:12180(1992);Pilacinski等、Bio/Technology、2:356(1984);Segre等、Am.J.Vet.Res.、16:517(1955))。天然粒子に対して産生されたポリクローナルおよびモノクローナル中和抗体は、コンホメーションの上で依存性のエピトープを認識する(Christensen等、Virus Res.、28:195(1993);Christensen等、Virology、181:572(1991))。パピローマウイルス抗原に対する液性免疫反応の性質は充分確立されているが、L1 VLPの規則的な結合構造を活用して免疫系に対する寛容原を、強力な免疫反応を推進し、ひいてはB細胞寛容を破壊するようなやり方で提示できるとは、誰も認識または予想していなかった。
【0024】
キメラL1−CCR5粒子の生成は、L1が粒子を形成する能力を損なわないような、L1の領域へのCCR5ペプチドの挿入を必要とした(実施例1を参照)。殆どのL1アミノ酸の正確な構造的位置および機能は知られていないものの、キャプシドの集合に影響を及ぼすことなしに様々なヒトパピローマウイルスの中和エピトープを損なうアミノ酸変化が、L1の3個の非接触的領域にマッピングされている(Ludmerer,S.W.、Benincasa,D.およびMark III,G.E.、J.Virol.、70:4791−4794(1996);Ludmerer,S.W.等、J.Virol.、71:3834−3839(1997);Roden,R.B.等、J.Virol.、71:6247−6252(1997))。これらの部位のアミノ酸がキャプシドの表面にありそうであったため、BPV−1 L1中の類似の部位をペプチド挿入の標的とした。よって、BPV−1 L1アミノ酸の130−136、275−285、または344−350位のL1配列を、C57BI/6(B6)マウス由来のマウスCCR5(mCCR5)の第一ECループに対応する16アミノ酸のペプチドをコードしていると予想される配列に置換した、3個のL1−CCR5キメラを組み立てた。これらのキメラはそれぞれL1−CCR5キメラ1、2、および3と命名された。
【0025】
L1−CCR5キメラを含む組み換えバキュロウイルスを作成し、得られたL1−CCR5粒子を勾配遠沈によって精製した(Kirnbauer,R.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:12180−12184(1992))。このキメラL1−CCR5分子がVLP、キャプソマー、またはその他の粒子形に集合されるか否かを決定するため、Superose 6ゲル濾過クロマトグラフィーを3個のL1−CCR5キメラの調製物について実施した(実施例2を参照)。L1 CCR5キメラ1の調製物のみが、集合した粒子構造を示す画分に溶出した。故に、以後の分析はこのキメラに限定した。電子顕微鏡によるキメラ1粒子の調査は、野生型L1 VLPより小さな(およそ28nm:55nm)多くの粒子を示した。形態学的には、このL1−CCR5キメラ粒子はポリオーマウイルス12ICOSA殻(T−1粒子)に似ており、このICOSA殻は、ポリオーマウイルスの主たる外殻タンパク質VP1の12の五量体キャプソマーの規則的アレイで構成され、高イオン強度においてVP1キャプソマーのインビトロ再集合の際に生成され得る(Salunke,D.、Caspar,D.L.D.およびGarcea,R.L.、Biophysical Journal、56:887−900(1989))。このL1−CCR5粒子と類似の大きさの小粒子は、野生型BPV−1 L1 VLP調製物の少量成分としてしばしば見出される。
【0026】
CCR5キメラ粒子が抗CCR5抗体を誘導できるかどうかを調べるため、C57B1/6マウス(挿入配列と同一のCCR5配列をコードしている系統)を、L1−CCR5粒子、変性されたL1−CCR5タンパク質、または野生型VLPでワクチン接種した(実施例3を参照)。これらのマウスからの血清を、CCR5ペプチドおよび野生型VLPに対する反応性についてELISAによって試験した(図1A)。野生型VLPを接種した対照マウス由来の血清は抗CCR5 ELISA反応性を有していなかったが、L1−CCR5粒子の接種は、抗CCR5 ELISAの高力価を有する血清を誘導した。これらの力価は、フロイントアジュバントと組み合わせて接種した3匹の動物では3x103ないし3x104の範囲であり、アジュバント無しで接種した2匹の動物では3x103と測定された。対照的に、アジュバントと組み合わせて変性L1−CCR5粒子を接種したマウスでは、CCR5ペプチド特異的抗体は検出されなかった。変性された材料は高い力価の抗L1抗体を導いたことから、変性L1−CCR5粒子の反応性の欠如はCCR5ペプチドに限定されていた(図1B)。
【0027】
これらの結果は、L1−CCR5粒子がCCR5ペプチドに対する抗体を導き出すという事の証拠を提供したが、これらの抗体が、膜関連mCCR5の一部としての天然由来のコンホメーションのこのペプチドを認識していない可能性が存在した。この可能性を排除するため、細胞上のmCCR5に結合する抗CCR5抗体の能力をフローサイトメトリー(FACS)分析により試験する実験を実施した(実施例4を参照)。一次マウスT細胞およびマクロファージ上に発現されるmCCR5に対するL1−CCR5粒子血清の結合は、これらの細胞に対する高レベルの非特異的マウスIgG結合のため、評価できなかった。これに代わり、B6マウス由来のクローニングされたmCCR5をトランスフェクションによりHeLa−MAGI細胞で一時的に発現させ、精製したマウスIgGの結合を、ベクターによりトランスフェクトした細胞と比較して測定した(図2A−2G)。この検定により、L1−CCR5で免疫したマウス由来のIgGはmCCR5でトランスフェクトした細胞と特異的に結合し(図2A)、一方、野生型BPV VLP血清由来の精製IgGとは(図2B)、またはヒト(h)CCR5の第2ECループに結合するモノクローナル抗体(mAB182)とは(図2C)、有意な結合が無かった。抗体の特異性についての対照として、マウスに、スカシガイヘモシアニン(KLH)と結合させたmCCR5ペプチドを接種した。これらのマウスは抗CCR5ペプチド抗体反応を生成し、牛血清アルブミン(BSA)と結合させたCCR5ペプチドに対して105のELISA力価であったが、これらのマウスの血清から精製されたIgGは、mCCR5発現細胞と結合しなかった(図2D)。したがって、L1−CCR5により誘導された抗体は、KLHと結合したペプチドにより誘導された抗体とは対照的に、これらが天然mCCR5と結合するという点で、真の自己抗体として機能する。
【0028】
この抗体が天然のmCCR5と結合する能力を調べるためのもう一つのアプローチとして、本発明者等は、L1−CCR5血清が、mCCR5で一時的にトランスフェクトさせたHeLa−MAGI細胞との結合についてmCCR5のケモカインリガンドと競合できるかどうかを調べた(図3)(実施例5を参照)。マウスケモカインMIP−1α、MIP−1β、およびランテス(RANTES)はmCCR5のリガンドである。さらに、MIP−1βおよびRANTESのヒト相同体はmCCR5と結合することができる(Meyer,A.等、J.Biol.Chem.、271:14445−14451(1996);Nibbs,R.J.B.等、J.Biol.Chem.、272:12495−12504(1997))。この競合検定では、市販品を入手できるヨウ素化ヒトRANTESを使用した。1:30希釈のL1−CCR5血清が、1:30希釈の野生型L1 VLP血清を用いた37%置換と比較して、およそ66%のヨウ素化ヒトRANTESに取って代わった(100倍過剰のコールドRANTESを用いて観察される置換に類似する)。1:75および1:150希釈のL1−CCR5血清はそれぞれ25%および17%のヨウ素化RANTESに取って代わり、一方、これらの希釈での対照血清を使用した場合は有意な置換は観察されなかった。先の研究は、MIP−1α、MIP−1β、およびRANTESはhCCR5の第2ECループに結合することを示した。何故ならこれらの結合はこのループに対するモノクローナル抗体によってブロックされたがhCCR5のアミノ末端に対する抗体によってはブロックされなかったためである(Wu,L等、J.Exp.Med.、186:1373−1381(1997))。これらの実験結果は、これら二つの部位の間に位置するmCCR5の第一ECループと結合する抗体は、恐らくはこのループが第2ECループの近位にあるため、RANTESの結合を部分的にブロックできることの証拠を提供している。
【0029】
L1−CCR5により誘導された抗体がM親和性HIV−1感染をブロックする能力もまた試験した(実施例6を参照)。HIV−1エンベロープとhCCR5との相互作用は複雑であり、系統依存性であると思われ、恐らくはCCR5の幾つかのEC領域を含んでいる。とりわけモノクローナル抗体研究はhCCR5の第2ECループおよびNH2末端領域を巻き込み、そしてキメラレセプターの研究は、hCCR5の第一および第三ECループもまた、HIV−1との相互作用に貢献していることを示した(Wu,L.等、J.Exp.Med.、186:1373−1381(1997);Rucker,J.等、Cell、87:437−446(1996);Atchison,R.E.等、Science、274:1924−1926(1996);Alkhatib,G.等、J.Biol.Chem.、272:19771−19776(1997);Picard,L.等、J.Virol.、71:5003−5011(1997);Ross,T.M.、Bieniasz,P.D.およびCullen,B.R.、J.Virol.、72:1918−1924(1998))。mCCR5はHIV−1共同レセプターとしては機能しないが、hCCR5のバックグラウンドにmCCR5の第一ECループ(B6マウス配列)を持っているヒト−マウスキメラレセプター(HMHH)は、ヒトセルラインで発現される時、共同レセプターの活性(低い効率ではあるが)を有している(Kuhmann,S.E.等、J.Virol.、71:8642−8656(1997))。本発明者等はこのキメラレセプターを使用して、L1−CCR5血清がM親和性HIV−1感染をブロックできるかどうかを試験した。L1−CCR5血清から精製されたIgGがHMHHと結合することを確認するため、HMHHで一時的にトランスフェクトさせたHeLa−MAGI細胞上でFACS分析を実施した。L1−CCR5マウス由来のIgG、およびヒトCCR5の第2ECループと結合する正の対照モノクローナル抗体では正の結合が得られ、一方、野生型L1 VLPマウス由来のIgGはHMHHと結合しなかった(図2E−2G)。
【0030】
これらの結果に基づき、L1−CCR5マウス由来の血清を、HIV−1のM親和性BaL株の感染を阻害する能力について、単一複製サイクル検定で、MAGIインディケーターセルラインを用いて試験した(Kimpton,J.およびEmerman,M.、J.Virol.、66:2232−2239(1992))。HMHHで一時的にトランスフェクトしたインディケーター細胞をL1−CCR5血清の存在下にHIV−1 BaLに感染させた時、1:15、1:30、および1:75の希釈はそれぞれ感染性の65%、50%、および45%中和を示した(図4)。同じ希釈において、野生型L1 VLPマウス由来の対照血清は幾らかの非特異的中和を示したが、これは1:15希釈で25%、1:30および1:75で15%に過ぎなかった。比較のために、正の対照として使用した、hCCR5結合モノクローナル抗体(mAB182)(1μg/μLの始発濃度)希釈液存在下でHIV−1 BaLに感染させたインディケーター細胞は、同様の中和曲線を示した(図5)。L1−CCR5血清はさらにT細胞親和性単離物HIV−1 LAIに対する中和活性について試験したが、予想通りこの単離物に対してはバックグラウンドレベルを超える中和を示すことはなかった。
【0031】
自己抗体の誘導についての一つの懸念は、このような方法が、ことによると天然CCR5タンパク質からの制御不能の抗原刺激を包含する、免疫された動物にとって有害な長期的帰結を有するのではないかということである。しかしながら、L1−CCR5粒子接種後6ヶ月間にわたり監視された3匹のマウスでは、この期間全体で2ないし8倍のCCR5特異的抗体力価の低下を認め、この減少は、L1特異的抗体の力価の減少にほぼ対応するものであった。動物のうち2匹は抗CCR5抗体力価に2倍の低下を、そして抗L1抗体力価に3倍の低下を示した。三匹目の動物は抗CCR5力価に8倍の低下を、そして抗L1抗体力価に10倍の低下を示した。これらの結果は、天然由来のCCR5への連続的暴露が連続的なB細胞誘導を導くわけではないという事の証拠を示しており、これは恐らく、細胞のタンパク質が免疫系により無視される状況にあり続け、そしてそれ以上に、抗CCR5反応がL1−CCR5粒子上のCCR5ペプチドへの暴露に専ら依存しているためであろう。免疫されたマウスは対照マウスと同じ体重を維持し、最終ブースティングの6ヶ月後に実施されたこのマウスのうち2匹の剖検は、視認できる病理学的変化を示さなかった。
【0032】
人間においてCCR5は専らメモリーT細胞(CD3+、CD4+、CD26hi)上に発現される。加えて、胸腺、脾臓およびリンパ節のマクロファージの1ないし10%がCCR5を発現する(Zhang,L.等、J.Virol.、72:5035−5045(1998))。脾臓、胸腺、および末梢血由来のマウス単核細胞のFACS分析は、CCR5を発現する脾臓または末梢血マクロファージおよびT細胞サブセットに、対照マウスと比較した時の低下がないことを示した。したがって、本発明者等の分析によれば、L1−CCR5粒子で免疫されたマウスは、この観察期間で視認できる病理学的変化を受けなかった。
【0033】
人間のB細胞寛容を破壊するための、そして特にHIV感染の治療および防止のための、キメラVLPの使用の有益性を支持するさらなる証拠が、マカークCCR5ポリペプチドに対する自己抗体を産生させる霊長類の研究から得られた(実施例7を参照)。これらの実験においては、マカークL1−CCR5融合タンパク質をコードしている組換え発現構造体が作成された。本発明者等は、対抗するヒト/マカークCCR5ペプチド(これらは同じである)を、マウスの実験で使用したのと同一のL1主要キャプシドタンパク質中の位置にクローニングした。次に、キャプシド粒子の自己集合性を評価した。マウスL1−CCR5についての先の実験と比較する時、キメラマカークL1−CCR5での粒子形成は効率の悪いものであった。それにも拘わらず、本発明者等はブタオザルの免疫に充分な粒子を精製することができた。Titer Maxアジュバントの存在下にこの調製物で3回ワクチン接種した5匹の動物中4匹は、ELISA検定で測定したところ明らかにCCR5特異的抗体を産生した(図5)。本発明者等は、VLP表面に外来ペプチドを展示し、かつ、より自己集合に適合したCCR5ペプチドの挿入のための別の部位を発見することにより、ヒト/マカークCCR5に対する自己抗体を産生するためのより良いVLPに基づく免疫原を生成することができると信ずるものである。さらに、下記のように本発明者等は、ヒト/マカークCCR5寛容原を有する複合体VLPは、より良い免疫反応を誘導するであろうと考えている。
【0034】
第一群の実験の結果は、中心抗原mCCR5のEC部分由来のペプチドをパピローマウイルス粒子の規則的な配列中に組み込み、その後これらの粒子を免疫すると、レセプターに結合しリガンドおよびHIV−1結合をブロックする自己抗体を誘導することができるということを立証している。mCCR5に対する自己抗体は、L1特異的抗体の減少と同様の速度で時間と共に減少するが、これは、内因性細胞表面CCR5によるB細胞刺激が誘導されなかったことを示唆するものである。
【0035】
L1−CCR5粒子により誘導された抗自己抗体は、細胞表面に発現されたmCCR5と効率的に結合するが、これは、これらが真の自己抗体として機能していることを示している。対照的に、KLHと結合させたCCR5ペプチドにより誘導された抗体は、天然mCCR5と結合できなかった。結合している自己抗体は単にこの特定のアミノ酸配列を認識している訳ではなく、その天然由来のコンホメーションの寛容原アレイを認識しているようである。しかも、L1−CCR5で免疫したマウス由来のIgGはCCR5リガンドの結合をブロックし、そのマウスCCR5ペプチドを含むキメラCCR5タンパク質を介してHIV−1感染を阻害するが、この事はさらに、これらの自己抗体の特異性および本発明の態様の治療的有用性を証明するものである。これらの検定で観察された阻害は、矛盾のないものであり、再現性があり、特異的であり、そしてヒトCCR5の第2ECループに対する対照モノクローナル抗体に類似するものである。
【0036】
mCCR5の第一ECループを最初の研究用に選択した。何故ならこれによって、B細胞寛容の破壊に対する本発明者等のアプローチを試験し、そして対象の身体がHIV−1感染を阻害することを誘導する新規な方法を提供することが同時に可能になるためである。不活性CCR5アレルについてヘテロ接合であるHIV−1に感染した人間は、たとえCCR5発現の部分的な縮小が臨床上有意な効果を有し得るにせよ、AIDSへの進行を遅らせる(Liu,R.等、Cell、86:367−77(1996);Samson,M.等、Nature(London)、382:722−5(1996);Winkler,C.等、Science、279:389−93(1998))。本発明者等の結果はまた、抗原が適当な免疫原において提示されたならば、霊長類はCCR5に特異的な抗体を産生する能力を有することを証明している。
【0037】
本発明者等は、初回の接種から6ヶ月間の経過観察を行ったマウスにおいて、自己抗体の誘導による有害な影響が無いことを観察した。自己反応性T細胞についての試験は実施していないが、本発明者等はCCR5に対するT細胞寛容を破壊するとは予想しなかった。中心自己抗原を認識するT細胞は、免疫系の発達過程で強力に選択される。恐らくは、抗CCR5 IgGを産生するための免疫グロブリンクラスの変換に必要なT細胞の援助は、連鎖したウイルスタンパク質に対するものなのであろう。逆に、大人の動物においては、RAG再活性化およびB細胞レセプター遺伝子の末梢編集の結果、新たな特異性を有する抗体が絶えず産生される(Han,S.等、Science、278:301−5(1998);Papavasiliou,F.等、Science、278:298−301(1998);Hertz,M.等、Nature、394:292−5(1998))。
【0038】
免疫寛容を破壊しTNF−α活性を阻害する複合体VLP
B細胞寛容を破壊する本発明者等の第二のアプローチは、前もって生成したVLPの外表面に寛容原を付けることによって組み立てられた、複合体VLPの使用を含むものである。いったん集合されると、VLPおよびキャプソマー構造体はかなり安定であり、大きなまたは小さな寛容原の付加は容易に達成できる。自己集合の不安定性のため寛容原の大きさが通常小さいキメラVLPアプローチとは対照的に、複合体VLPのアプローチは、大きな寛容原をVLPに集合することを可能にし、この事が、より多くの抗体エピトープを提供し、ひいてはより多様な自己抗体の組を提供することとなる。この計画は、主たるキャプシドタンパク質中への配列の遺伝的挿入よりも多様な配列や大きさのポリペプチドにも適用することができるであろう。
【0039】
複合体VLPを使用した第一の実験では、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって寛容原TNF−αをVLPに結合させた。L1 VLPは、露出したリジン残基をビオチニル化するスルホ−NHS−ビオチン(Pierce)を用いてしっかりとビオチン化されることが示された。飽和条件の下では、このビオチニル化VLPは、L1分子1個当たりおよそ3個のストレプトアビジン四量体の比率でストレプトアビジンに結合した。この結果は、ストレプトアビジン/寛容原融合タンパク質が、稠密な、規則正しい、そしてきっちりと圧縮された配列のエピトープとして免疫系に与えることができるという証拠を提供する。
【0040】
したがって、本発明者等はE.coliにおいて、マウスTNF−αの20アミノ酸長フラグメントに連結したストレプトアビジン核を含む融合タンパク質を作成した(SA−TNF−αと称する)。この融合タンパク質を不溶性封入体として精製し、グアニジン−HCl中に可溶化し、そして生理緩衝液中への透析によって再折り畳みを行った。次いでこの再折り畳みされた融合タンパク質を、上記のように製造したビオチニル化L1 VLPと結合させ、SA−TNF−α/VLP免疫原を作り上げた。SA−TNF−α融合タンパク質は高い占有性でビオチニル化VLPに結合した(図6)。次に、SA−TNF−α/VLP免疫原をマウスに注射して自己抗体反応を誘起した。複合体VLPをマウスに2回注射すると(3x5g)、天然のマウスTNF−αに結合する高力価(ELISAによる)の抗体が誘導された(第1表を参照)。対照的に、SA−TNF−αのみまたはVLPのみによる免疫は、確実なまたは高い自己抗体反応を誘起できなかった(第2および3表を参照)。3回目のSA−TNF−α/VLPの注射後には、TNF−α抗体の力価は全てのマウスで105に達した。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
【表3】
【0044】
これらの結果は、SA−TNF−α/VLP免疫原がB細胞寛容を効果的に破壊することを確立した。複合体VLPがB細胞寛容を効果的に破壊するというさらなる証拠が、TNF−α細胞毒性検定から得られた。これらの実験において、SA−TNF−α/VLP免疫原がインディケーターセルライン(L929細胞)のTNF−α仲介アポトーシスを防止する能力が決定された。ストレプトアビジン結合VLP(対照)またはSA−TNF−α/VLPのいずれかを接種したマウスから得られた血清をTNF−αと共にインキュベートし、血清処理されたまたは血清処理されていないTNF−α試料を培養中の細胞に添加した。血清がTNF−α活性を中和する能力を、生存細胞のパーセンテージの増加によって測定した。SA−TNF−α/VLP(5%溶液)を接種したマウス由来の血清は、生存細胞についてバックグラウンドレベルを3倍増加させた(図7)。マウスTNF−α融合タンパク質での有望な結果を得て、本発明者等はマカークCCR5の4個の細胞外ドメインの各々について同様のストレプトアビジン融合タンパク質を作成した。全ての4つの融合タンパク質はE.coliの封入体から作成し精製した。4つのうち3つを、それらがビオチニル化VLPと強固に結合するよう再折り畳みすることができた。
【0045】
上記の論考および以下の実施例に示すように、寛容原に対応するペプチド配列は、集合されたキメラまたは複合体ウイルスキャプソマーの高度に機能的な配列の状況で提示される時、天然タンパク質に対するB細胞寛容を排除することができる。本明細書に記載の方法を用いてB細胞寛容を排除する能力は、数多くの適用を有している。例えば、この技術を使用してマウス抗自己モノクローナル抗体を作成することができる。さらに、このアプローチは、実験的動物モデルの正常または疾病プロセスにおけるその機能を調べるために可溶性タンパク質の活性を調節する手段として有効である。その上、自己抗体の誘導は、例えばそれぞれErbB−2およびTNF−αに対する抗体による乳癌および慢性関節リウマチの治療において、人間の疾病のためのモノクローナル抗体療法に代わる有効な代替療法を提供する(Maini等、Immunol.Rev.、144:195(1995);Baselga等、J.Clin.Oncol.、14:737(1996))。以下の議論は本発明の態様に関するさらなる特徴を記載するものである。
【0046】
支持体およびキャプソマー構造体
ウイルス様粒子またはキャプソマー構造体は免疫系に自己ペプチドを到達させて自己抗体の産生を刺激するための好ましい系を表すが、本発明者等はさらに、本発明が、寛容原を、規則的な間隔の密な反復的アレイに提示することのできる、別の構造的集合体を包含することをも意図している。これらの支持体は、サブユニットの規則的な集まりであって、寛容原の少なくとも1個のB細胞エピトープを規則的な反復的アレイで支持体に結合させることができる。好ましくはこの支持体およびキャプソマー構造体は、抗原を、約10−500オングストローム、有利な間隔として約50−300オングストローム、そして好ましくは約100オングストロームの間隔で提示することができる。即ち、提示された抗原分子間の間隔は、10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160,160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 , 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322 , 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422 , 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500オングストロームに等しく、またはこれより大きくすることができる。修飾されたT依存性2型抗原(TI−2)は、この点でVLPと同様に挙動し得る。これらは、肺炎球菌多糖類、サルモネラポリマー化フラゲリン、デキストランおよびハプテン複合体フィコール(ポリスクロース)を包含する。
【0047】
本明細書に示した例示的説明ではパピローマウイルスのウイルス様粒子を使用してきたが、自己抗体の産生の刺激における使用のためには、他のパピローマウイルスのおよびパピローマウイルス以外のウイルス様粒子もまた企図される。感染性ウイルスもまた考えられる。弱毒化したまたは生得的に非病原性のウイルスを同様のやり方で修飾し、自己抗体の産生に使用することができる。本発明に関連する使用のために特に企図されるキメラVLPの例は、Intervirology、39:1(1996)に記載のものであり、これは参照により本明細書に援用される。自己抗体の産生を刺激する際の使用のために企図されるキメラVLPには、BPV−1、HPV−1、HPV−6、HPV−11、HPV16、HPV−18、HPV−33、HPV−45、CRPV、およびCOPVがある。さらに企図されるものは、B19パルボウイルス、B型肝炎ウイルスコア粒子、B型肝炎表面抗原粒子、HIV gag粒子、タバコモザイクウイルス、カウピーモザイクウイルス、酵母Ty粒子、およびRNAファージである。SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス、ロタウイルス、およびノルウォークウイルスのためのウイルス様粒子が作成されており、キメラVLPを作成することができる。特に、当業者は、BPV−1、BPV−2、BPV−4、CRPV、DPV、EPV、HPV−1、HPV−5、HPV−6、HPV−8、HPV−11、HPV−16、HPV−18、HPV−31、HPV−33およびRhPVを包含する多くのパピローマウイルスの全ゲノムの完全なヌクレオチド配列を既に決定している。ところが、本発明の実施形態のキャプソマー構造体を組み立てるために使用される好ましいキャプシドタンパク質は、天然の哺乳動物宿主を有する二十面体ウイルス(群)由来のタンパク質を含んでいる。したがって、本明細書に記載の方法に関連して使用できる多くの異なった主たるおよび重要性の低い少量の外殻タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列は、既に既知である。
【0048】
主たるおよび/または重要性の低い外殻タンパク質を含むVLPは、本明細書に開示する方法に従って免疫原性組成物を製造するために使用できるという事が理解されるべきである。特にパピローマウイルスL2の希少な外殻タンパク質の場合、L2キメラは、挿入された抗原を表面に露出させることができるという事を理解すべきである。標的抗原は外面にある。本発明者等がパピローマウイルスE7抗体の産生に使用したL2/E7融合物は、VLPに組み込まれた時に、BPV L2の最初の110アミノ酸がHPV16 E7ポリペプチド配列全体に融合している(Lowy等、米国特許第5618536号。これは参照により本明細書の援用される)。この例においては、E7配列を、かつてウイルス中和エピトープに対応することが示されたL2の部位に融合させた(Roden等、J.Virol.、68:7570(1994))。下記の開示では、寛容原を本発明に係る規則的集合体に結合させる、幾つかのアプローチを提供する。
【0049】
寛容原を提示する支持体またはキャプソマー構造体を作成するためのアプローチ
上記に論じたように、一般に、寛容原をウイルス様粒子の構造体中に組み込むために二つの異なるアプローチを使用することができる。一つのアプローチでは、最初に、ウイルス外殻タンパク質配列および関心の持たれる自己ペプチド配列の両者を含むアミノ酸配列をコードしている遺伝的構造物を作成する。得られる構造物は、ハイブリッド外殻タンパク質が自己集合してキャプソマー構造体またはVLPを形成した後には、自己ペプチドを外表面上に提示する単一のキメラポリペプチドをコードしている。第二のアプローチによれば、VLPの外表面上に提示された自己ペプチドを、前もって作成したVLPを含む多数のサブユニットタンパク質に、直接的または間接的に連結させる。例えば、野生型パピローマウイルスL1タンパク質は、第二の結合剤に対する結合定数が107−1010、104−108、1010−1012、または1012−1016の範囲である第一の結合剤に結合させた組換え外殻タンパク質であってよい。第二の結合剤は自己ペプチドへの結合に適合させることができる。本発明の特に好ましい態様では、ビオチニル化された野生型VLPを最初に生成させる。これは、前もって作成したVLPをビオチニル化することにより達成できる。次に、このビオチニル化VLPをアビジンまたはストレプトアビジンに連結した自己ポリペプチドと結合して、自己ペプチドが提示されている表面を有する複合体を形成させる。このようにして、多コピーの自己ペプチドをVLPに間接的に結合させ、その結果、自己ペプチドが外殻タンパク質のペプチドバックボーン中に統合されないようにする。したがって、ハイブリッド外殻タンパク質ポリペプチド配列の重要部分として、または例えばビオチン結合を介して間接的に、自己ペプチドに連結したハイブリッド外殻タンパク質を含む組成物は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【0050】
本発明の実施形態により、十分な親和性、B細胞寛容の破壊、または疾患状態(例えば、ウイルス感染、腫瘍形成、または炎症)の阻害を達成するような形態または方法で寛容原が得られることが望ましい。天然の寛容原(すなわち、分散した分子が存在するので、少数のエピトープを保有する寛容原)は所望の応答を達成するために十分であり得る一方で、合成寛容原または多量体免疫原(例えば、多数の分子の寛容原を示す、すなわち、多数の同一のエピトープを有するVLP)は、しばしばより高い免疫応答を誘発し得る。用語「多量体(multimeric)」は、支持体またはキャプソマー構造体の1つを超える同一の分子の存在をいうことに留意するべきである。例えば、CCR5またはそのフラグメントのいくつかの同一の分子は、VLP上に提示される。用語「多量体」は、用語「多重結合化(multimerized)」と区別されるべきであり、これは、ハイブリッド分子に結合した支持体またはキャプソマー構造体をいい、各ハイブリッド分子は、一列に結合した寛容原またはその個々のエピトープの多数のコピーを含む。例えば、それぞれの多重結合化寛容原は、分散型のリンカー(例えば、λファージリンカー)を含むか含まない無作為に反復したCCR5の20アミノ酸長のフラグメントを含み、多数の多量体寛容原は支持体またはキャプソマー構造体に結合して多重結合/多量体免疫原を形成することができる。
【0051】
B細胞寛容を有効に破壊する多量体免疫原(合成または天然)を、支持体またはキャプソマー構造体への寛容原の結合によって得ることができる。この目的に適切な支持体には、ポリアクリルアミドビーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒子、炭水化物集合体(例えば、オリゴ糖ベースのビーズまたは集合体)、脂質集合体(例えば、脂質膜)、タンパク質集合体またはポリマー(例えば、ポリ−L−リジンまたはポリ−D−、L−アラニン)、またはサブユニットの組織化した均整のとれた集合体を有する当該分野で公知の他の支持体が含まれるが、これらに限定されない。また、寛容原が水酸基、カルボキシ基またはアミノ基および担体の反応基を介して共有結合している無機担体(例えば、シリカゲル、ゼオライト、珪藻土またはアミノ化ガラス)を、いくつかの実施形態で使用することができる。
【0052】
いくつかの実施形態では、寛容原を、寛容原に結合している2つの化学反応種、リガンド/レセプター相互作用、またはペプチドとの間の結合であり得るリンカーを介して支持体またはキャプソマー構造体に結合して支持体またはキャプソマー構造体への結合を可能にするか、あるいは、免疫系の細胞との寛容原の会合の自由度を高めることを可能にする。いくつかの実施形態では、例えば、支持体またはキャプソマー構造体は、疎水性非共有結合性相互作用による寛容原の一部と相互作用する疎水性表面を有する。いくつかの場合、支持体の疎水性表面は、プラスチックまたは疎水基が結合された任意の他のポリマー(ポリスチレン、ポリエチレン、またはポリビニルなど)などのポリマーである。
【0053】
さらに、寛容原は、タンパク質およびオリゴ糖/多糖(例えば、セルロース、デンプン、グリコーゲン、キトサン、またはアミノ化セファロース)を含む支持体またはキャプソマー構造体に共有結合することができる。これら後者の実施形態では、共有結合させるために寛容原上の反応基(ヒドロキシ基またはアミノ基)を使用して支持体またはキャプソマー構造体の反応基に結合させる。実施形態はまた、寛容原と相互作用する荷電表面を有する支持体を含み得る。さらなる実施形態は、寛容原を結合させるために化学的に活性化する他の反応基を有する支持体を含む。例えば、臭化シアン活性化基質、エポキシ活性化基質、チオおよびチオプロピルゲル、ニトロフェニルクロロギ酸エステル、およびN−ヒドロキシスクシンイミドクロロギ酸エステル結合、またはオキシランアクリル支持体を使用する。(Sigma)。
【0054】
他の実施形態では、ビオチンのアビジン様分子(例えば、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン)との相互作用を利用する。以前に示されているように、VLPをビオチン化し、寛容原/ストレプトアビジン融合タンパク質に容易に結合させることができる。キャプシドタンパク質へのより多くのリジンまたはシステインの挿入により、より多くのビオチン化が行われ、それにより、より多くの寛容原をVLPの表面に付加することができる。さらに、寛容原の密度および高度に組織化された反復配列を有するVLPを確立するために、部位特異的変異誘発技術の使用により、リジンまたはシステイン分子を計画的に挿入することができる。当業者が即座に認識するように、その逆(すなわち、ストレプトアビジン/キャプソマータンパク質融合およびビオチン化寛容原の使用)も行うことが出る。別の実施形態では、可動性を促進し、存在し得る任意の立体障害を克服するために、適切な長さのλリンカーを寛容原と支持体またはキャプソマー構造体との間に挿入する。最適な免疫応答を可能にする適切な長さのリンカーの同定を、本明細書中に記載の種々のアッセイにおける種々リンカーを用いた寛容原のスクリーニングによって行うことができる。
【0055】
1つを超える型の寛容原を有する複合支持体もまた、実施形態である。「複合支持体」は、2つまたはそれ以上の異なる寛容原を結合または固定するために使用される高分子構造であり得る。複合支持体はまた、上記で詳述のように、反応基を介して形成された疎水性相互作用および共有結合の使用によって構築される。さらに、いくつかの実施形態では、分子の可動性をより高く促進するために、かつ、立体障害を克服するために、寛容原と支持体との間に適切な長さのλリンカーなどのリンカーを挿入する。最適な免疫応答を可能にする適切な長さのリンカーの同定を、本発明の開示に詳述のアッセイにおける種々のリンカーを用いた寛容原のスクリーニングによって行うことができる。
【0056】
本発明の他の実施形態では、それぞれ「多重結合多量体支持体」および「多重結合複合支持体」を作製するために、上記で考察した多量体および複合支持体を、多重結合寛容原に結合している。例えば、多重結合寛容原の実施形態は、分子生物学の従来の技術の使用によって結合させた寛容原をコードする2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を有する発現構築物の作製によって得られる。発現した融合タンパク質は、多重結合因子の1つの実施形態であり、それを支持体に結合させる。多くのこのような多重結合因子を有する支持体を、多重結合多量体支持体という。寛容原の多重結合形態は、免疫応答を誘導する、ひいてはB細胞寛容を破壊するより良好な能力を有する因子を得る能力のための多くの適用に有利であり得る。多重結合因子を作製するタンパク質ドメインの間のリンカーまたはスペーサー(可動性λリンカー)の組込みはまた、いくつかの実施形態に有利であり得る。例えば、タンパク質と結合ドメインとの間の適切な長さのλリンカーの挿入により、分子の可動性の増加を促進し、ドメインの間の立体障害を克服する。同様に、多重結合化寛容原と支持体との間へのリンカーの挿入により、可動性の増加を促進し、支持体またはキャプソマー構造体に存在する立体障害を減少させる。最適な免疫応答を可能にするリンカーの適切な長さの同定を、本開示に詳述のアッセイにおける種々のリンカーを用いた寛容原のスクリーニングによって行うことができる。同様の様式で、リンカーを含むか含まない複合多重結合化多量体支持体を、支持体への1つを超える異なる多重結合化寛容原の結合によって構築することができる。
【0057】
特に、自己免疫応答が望ましい自己抗原の挿入用の好ましいウイルス様粒子上の部位は、ウイルス中和エピトープである。これは、典型的には、ウイルス中和エピトープはウイルスの表面上に配置され、抗体結合に利用することができるためである。これらの特徴は、キメラウイルス様粒子の構造的背景における免疫系に対する自己抗原の提示に望ましい。乳頭腫ウイルス中和エピトープの同定法は、Ludmerer et al., J.Virol., 70、4791、1997、Ludmerer et al.、J.Virol.、71、3834、1997、およびRodenet al.、J.Virol.、71、6247、1997に記載されている。一般に、ウイルス中和エピトープの同定法は、好ましくは2つの密接に関連したL1タンパク質の1つと結合するモノクローナル抗体を使用し、その間の特異的なアミノ酸の相違を再類別する組換え体を系統的に作製する。あるいは、関連ウイルス(例えば、乳頭腫ウイルス)のL1タンパク質をコードするポリペプチド配列を整列させて、最も長さの変化するセグメントを同定することができる。これらの高度に変化する位置は、おそらく、キャプシドタンパク質の外部または内部ループであろう。外部ループは、自己免疫応答と考えられる自己抗原のポリペプチド配列の置換の候補である。したがって、日常的な実験室での手順によって容易に同定することができるウイルス中和エピトープは、本発明のVLPまたはキャプソマー構造体における自己ペプチドの配置に好ましい部位である。例えば、BPV−1上のウイルス中和エピトープ部位は、自己ペプチドの配置用の対応するVLP上の好ましい部位であろう。以下の節では、本発明の態様で使用することができる寛容原のサイズの考察を提供する。
【0058】
支持体またはキャプソマー構造体に対する寛容原のサイズ
一般に、ウイルス外殻タンパク質構造に組込まれるか、支持体またはキャプソマー構造体に結合する抗原を示すアミノ酸の数は、抗原の特徴であり抗体の抗原結合部位に適合し得るエピトープに対応するのに十分な大きさでなければならない。一般に、抗原結合部位への結合には5〜6アミノ酸の直鎖配列で十分であると認められており、少なくとも5アミノ酸の自己抗原を免疫原構造体に組み込むことが好ましい。しかし、より多数のアミノ酸の使用もまた良好な結果を得ることができることが理解される。本明細書中に示した実施例では、16アミノ酸のマウスCCR5タンパク質をL1主要外殻タンパク質構造体へ組み込むことによりにより良好な結果が得られた。寛容原を示すより長いポリペプチド配列もまた、抗自己免疫反応の誘導用の免疫原として使用されるウイルス外殻構造体への取り込みが意図される。したがって、免疫原ウイルス様粒子は、少なくとも5アミノ酸長の自己ポリペプチド配列を組み込むが、寛容原の長さは200アミノ酸長を超え、かつ全長タンパク質を含み得ることが好ましい。望ましい範囲は、5〜200アミノ酸である。すなわち、寛容原は、5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160,160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,アミノ酸長またはそれ以上であり得る。
【0059】
ビオチン化VLPは、実質的に16アミノ酸長を超えるペプチドと複合化し、免疫系に提示され得ることが意図される。全長タンパク質を示すポリペプチド配列を小さなハイブリッド外殻タンパク質構造体に組み込むこともできる。本発明者らは、以下に本発明の実施形態として示すことができる広範な種々の寛容原を記載する。
【0060】
多数の型の寛容原を支持体またはキャプソマー構造体に提示することができる多数の寛容原 広範な種々の寛容原を用いて、本発明を実施することができる。好ましい実施形態では、寛容原は自己抗原である。好ましい自己抗原には、自己抗原を標的する抗体が有効な治療薬であると認められている抗原がふくまれる。一般には、自己抗原は、VLPに結合した自己抗原を含む組成物で免疫化される生物の自己抗原に一致する。したがって、ヒトの免疫化用に、ヒト自己ペプチド(ヒトCCR5ケモカインレセプターなど)を、VLP構造体に組み込むことができる。この方法では、ヒトは自己抗体を産生することができる。使用することができ自己抗原の特定の例は、TNF−αおよびCTLA−4などの中枢自己抗原である。
【0061】
TNF−αは、多数のヒト疾患(慢性関節リウマチ(RA)の原理となる溶解性エフェクターとして最も注目すべきである)に関連している(Maini et al.、Imm.Reviews、144、195、1995)。慢性関節リウマチは、世界人口の約1%が罹患していると考えられている複数の関節の慢性で痛みを伴う疾患である。RAの症状は、薬物療法は無効である。これにより、症状よりもむしろ疾患のエフェクターを標的する別の治療ストラテジーの開発が望まれている。抗TNF−αモノクローナル抗体治療により、ヒト臨床試験においてRAの客観的および主観的指標を劇的に改善した(Feldman et al.、Annu.Rev.Immunol.、14、397、1996)。不運にも、この利点は一時的であることが証明されており、この効果の喪失はモノクローナル抗体に対する抗体の発生に相関していた。TNF−αが比較的低濃度の血清で生物学的に活性である小さな可溶性タンパク質である事実とあわせて、これらの知見により、TNF−αはワクチンを含む自己抗体用の魅力的な標的となった。さらに、この概念を試験するためのTNF−α媒介RA用の良好なマウスモデルが存在する(Thorbecke et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、7375、1992)。
【0062】
CTLA−4は、T細胞のB7が媒介する同時刺激の重要なレギュレーターであると考えられるT細胞の膜結合レセプターである(Thompson et al.、Immunity、7、445、1997)。同時刺激は、有効なCD8+T細胞が媒介する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の発生に重要である。通常、CTLA−4がB7固定後に正または負のシグナルを伝達するように作用するかどうかは現在未解決である(Zheng et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、6284、1998)。しかし、CTLA−4に対する抗体は、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍抗原に対する反応において、CTLの産生を明確に強化する。したがって、CTLA−4に対する自己抗体誘導用のワクチンを使用して、腫瘍のみまたは腫瘍抗原特異的ワクチンとの組み合わせに対する免疫応答を増強することができる(Leach et al.、Science、271、1734、1996)。特に、一過性自己免疫疾患の症状は、従来の治療に不応性の広範な散在性または手術不可能な癌被検者の受容可能な副作用であり得る。
【0063】
他の意図される寛容原には、慢性的にヒトに感染するウイルス(C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、HIVが含まれるが、これらに限定されない)由来のウイルス抗原、ケモカインおよび新形成および血管形成に関連する分子が含まれる。本明細書中に記載の技術の使用によって、当業者は、ビオチン化VLP上に種々の異なる寛容原(核酸、ペプチド、脂質、および炭水化物を含む)を提示させることができる。例えば、最初にビオチン化核酸をストレプトアビジンに結合させて、次に、核酸/ストレプトアビジン複合体をビオチン化VLPに結合させるサンドイッチアプローチを使用することができる。同様に、従来の化学的性質を使用して、脂質を、ビオチン、ストレプトアビジン、およびビオチン化VLPに結合させることができる。
【0064】
ビオチン化VLPの試験中に、B細胞の小さな有機化合物の破壊能力を確立した。ビオチンは、ビタミンであり、マウスの自己寛容原である。先に記載のように、本発明者らは、ビオチン化VLPを調製し、上記のようにこの免疫原をマウスに注射した。抗ビオチン抗体の存在を、ビオチン化BSAを標的抗原として使用するELISAアッセイによって同定した。ネガティブコントロールとして、非ビオチン化BSAに対する血清反応性を同定した。3匹のマウスの血清における抗ビオチン抗体の力価は、100、100、および10であり、非ビオチン化BSAに対する反応性は検出されなかった。
【0065】
上記の組成物を、B細胞寛容の研究についてのモデル系を得ることができるがヒト疾患の治療および予防用の治療および予防用の医薬品に組込まれることが好ましい、例えば、免疫系の単離細胞に結合する生物工学的ツールとして使用することができる。以下の開示は、本発明のいくつかの治療および予防の実施形態を考察している。
【0066】
治療および予防への適用
本発明の組成物は、癌、ウイルス感染、または炎症などの疾患の予防のための予防手段または既にこれらの疾患を罹患している被験体を治療するための治療手段として被検者の治療に適切である。予防薬として本発明の薬剤で治療できるが、ほとんどの適切な被験体は、Ab結合に接近しやすい媒介物を有する疾患の危険性のある被検者である。
【0067】
本発明の薬学的に活性な化合物を、生薬の従来の方法にしたがって処理して、被検者(例えば、ヒトを含む哺乳動物)への投与用の薬剤を製造することができる。これを、修飾するか修飾することなく薬学的生成物に組み込むことができる。さらに、いくつかの経路で本発明の免疫原をとどける医薬品または治療薬の製造は、本発明の態様である。
【0068】
本発明の化合物を、従来の賦形剤(すなわち、本発明の組成物と有害に反応しない非経口、経腸(例えば、経口)、または局所投与に適切な薬学的に受容可能な有機または無機担体物質)との混合物で使用することができる。適切な薬学的に受容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物(ラクトース、アミロース、またはデンプンなど)、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。薬学的調製物を滅菌し、所望ならば、活性化合物と有害に反応しない助剤(例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色物質、香味料および/または芳香剤など)と混合することができる。
【0069】
特定の処方物の有効量および投与法は、個々の被検者および病期ならびに当業者に公知の他の因子に基づいて変化し得る。このような化合物の治療効果および毒性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順(例えば、ED50(集団の50%に治療効果のある用量)およびLD50(集団の50%致死量))によって同定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は治療指数であり、ED50/LD50比として示すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトへの投薬範囲の処方に使用する。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないか全くないED50の循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、使用した投薬形態、被検者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。
【0070】
正確な投薬量は、治療を受ける被検者を考慮して、個々の医師によって選択される。十分なレベルの活性部分を得るように、または、所望の効果を維持するように、投薬量および投与を調節する。考慮することができるさらなる因子には、被検者の疾患の重症度、年齢、および体重、食事、投与時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する寛容/応答が含まれる。
【0071】
投与経路には、経皮、非経口、胃腸、経気管支、および経肺胞が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与経路には、電気的または直接注射(中心静脈ラインへの直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下注射など)が含まれるが、これらに限定されない。胃腸投与経路には、摂取または直腸が含まれるが、これらに限定されない。経気管支および経肺胞投与経路には、口または鼻腔内のいずれかを介した吸入が含まれるが、これに限定されない。
【0072】
経皮投与に適切な組成物には、皮膚に直接塗布するか保護担体(経皮デバイス(「経皮パッチ」)など)に組込んだ薬学的に受容可能な懸濁液、オイル、クリーム、および軟膏が含まれるが、これらに限定されない。適切なクリーム、軟膏などの例を、例えば、Physician’s Desk Referenceに見出すことができる。適切な経皮デバイスの例は、例えば、1989年4月4付けで、にChinen et al.に付与された米国特許第4,818,540号(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。
【0073】
非経口投与に適切な組成物には、薬学的に受容可能な滅菌等張液が含まれるが、これに限定されない。このような溶液には、中枢静脈への注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射用の生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
経気管支および経肺胞投与に適切な組成物には、吸入用の種々の型のエアゾールが含まれるが、これに限定されない。経気管支および経肺胞投与に適切なデバイスもまた実施形態である。このようなデバイスには、噴霧器および気化器が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物の送達のために、多くの形態の現在利用可能な噴霧器および気化器を容易に適用することができる。
【0075】
胃腸投与に適切な組成物には、注射および直腸投与用の座薬用の薬学的に受容可能な粉末、丸剤、または液体が含まれるが、これらに限定されない。使用が容易であるので、胃腸投与(特に、経口)が本発明の好ましい実施形態である。
【0076】
本発明の薬学的実施形態の投与を含む、ヒト疾患のいくつかの治療および予防法を提供する。これらの態様では、本発明の組成物を、医薬品に組込み、必要な被検者に投与する。1つのアプローチによって、HIV感染または別の慢性ウイルス感染に接触する危険性のある被検者またはすでにHIV感染または別の慢性ウイルスに感染している被検者を、従来の診断アッセイによって同定し、治療または予防有効量の本発明の医薬品を被検者に投与する。類似のアプローチを使用して慢性炎症性疾患治療および/または予防をすることができる。これは、必要な被験体の同定および本発明の組成物を含む医薬品の投与である。本発明の他の方法には、高力価の中和抗体を惹起するアプローチが含まれる。したがって、薬剤(例えば、本発明の組成物)を、そのB細胞破壊能力について同定し、その後必要な被験体に投与する。さらなる実施形態には、本発明の組成物に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の作製法が含まれる。これらの新規の抗体を、医薬品に組込み、ヒト疾患の治療および予防に必要とされる被検者に投与することができる。以下の開示はこれらのアプローチをより詳細に考察している。
【0077】
キメラおよび結合VLPに対する抗体の調製
以下のキメラまたは結合VLPの構築後、これらの組成物を使用して抗体を作製することができる(実施例10を参照)。キメラまたは結合VLPを認識する抗体は、多くの用途を有し、これには、生物工学的適用、治療/予防的適用、および診断的適用が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。中和抗体(すなわち、CCR5媒介接着を阻害する抗体)は、治療に特に好ましい。
【0078】
抗体産生のために、種々の宿主(ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む)を、キメラまたは結合VLPの注射によって免疫化することができる。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを使用して免疫応答を増強することができる。このようなアジュバントには、フロイントアジュバント、ミネラルゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、および界面活性剤(例えば、リゾレシチン)、多機能性(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定されない。BCG(Bacillus Calmette−Guerin)およびCorynebacterium parvumは潜在的に有用なアジュバントである。しかし、VLPベースの免疫原もまた、さらなるアジュバントなしで寛容原に対する抗体の力価を増加させることができる。
【0079】
キメラまたは複合体VLPに対するモノクローナル抗体を、継代培養細胞株によって抗体分子が産生される任意の技術を用いて調製することができる。これらには、Koehler and Milstein,Nature、256、495〜497、1975に最初に記載のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.、Immunol.Today、4、72、1983、Cote et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.、80、2026〜2030、1983)、およびEBVハイブリドーマ技術(Cole et al.、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss Inc.、New York N.Y.、pp.77〜96、1985)(その全てが本明細書中で参考として援用される)が含まれるが、これらに限定されない。さらに、「キメラ抗体」を作製するために開発された技術(適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体のスプライシング)を使用することができる。(Morrison et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.、81、6851〜6855、1984、Neuberger et al.、Nature、312、604〜608、1984、およびTakeda et al.、Nature、314、452〜454、1985(その全てが本明細書中で参考として援用される))。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載した技術(米国特許第4,946,778号(本明細書中で参考として援用される))を、キメラまたは結合VLPに指向する一本鎖抗体の産生に適用することができる。抗体を、Orlandi et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.、86、3833〜3837、1989、およびWinter G.and Milstein C.、Nature、349、293〜299、1991(その全てが本明細書中で参考として援用される)に記載のようにリンパ球群におけるin vivo産生の誘導によって、あるいは、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングによって産生することもできる。
【0080】
キメラまたは複合体VLPの特異的結合部位を含む抗体フラグメントを作製することもできる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab’)2フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって作製することができるFabフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能にするFab発現ライブラリーを構築することができる。(Huse W.D. et al.、Science、256、1275〜1281、1989(本明細書中で参考として援用される))。
【0081】
1つのアプローチによって、以下のようにキメラまたは結合VLPに対するモノクローナル抗体を作製することができる。簡単に述べれば、マウスを、それら由来の数μgの選択タンパク質またはペプチドと数週間にわたり反復接種する。次いで、マウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞をポリエチレングリコールの存在下でマウス骨髄腫細胞と融合させ、過剰な非融合細胞を、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)での系の増殖に追って破壊する。首尾よく融合した細胞を希釈し、希釈物のアリコートを、マイクロタイタープレートのウェルにおき、培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンを、Engvall,E.、Meth.Enzymol.、70、419、1980(本明細書中で参考として援用される)に最初に記載の免疫アッセイ法(ELISAなど)およびその派生的な方法によってウェル上澄みの液中の抗体の検出によって同定する。選択したポジティブクローンを拡大し、使用するためにそのモノクローナル抗体産物を回収することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順は、Davis,L.et al.、Basic Methods in Molecular Biology Elsevier、New York、第21−2項に記載されている。
【0082】
単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を、修飾していないか、あるいは免疫原性を増強するように修飾することができる上記に由来の発現タンパク質またはペプチドでの適切な動物の免疫化によって調製することができる。有効なポリクローナル抗体は、抗原および宿主の種の両方に関連する多くの因子に影響を受ける。また、宿主動物は、接種部位および用量によって変化し、抗原の不適切な用量または過剰な用量では抗血清の力価は低い。少用量(ngレベル)の抗原の多数の皮内部位での投与が最も信頼できるようである。ウサギについての有効な免疫化プロトコールを、Vaitukaitis,J.et al.、J.Clin.Endocrinol.Metab.、33、988〜991、1971に見出すことができる。
【0083】
規則的な間隔で追加免疫を行い、例えば、既知濃度の抗原に対して寒天中の二重免疫拡散によって半定量的に同定し、その抗体力価が低下し始めたときに抗血清を回収することができる。例えば、Ouchterlony,O. et al.、第19章、Handbook of Experimental Immunology、D.Wier編、Blackwell、1973を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常、0.1〜0.2mg/mlの血清(約12M)の範囲である。抗原の抗血清の親和性を、例えば、Fisher,D.第42章、Manual of Clinical Immunology、第2版、Rose and Friedman編、Amer,Soc.For Microbiol.、Washington,D.C.、1980に記載のような競合結合曲線の作成によって同定する。いずれかのプロトコールにしたがって調製した抗体調製物は、生物学的サンプル中の抗原保有物質の濃度を同定する定量的免疫アッセイに有用であり、これはまた、半定量的または定量的に使用される。さらに、本開示を通して考察されているように、キメラまたは結合VLPを使用してヒトにおける抗体産生を誘導することができる。したがって、キメラまたは結合VLPを、別のタンパク質、担体、支持体、またはアジュバントに結合させるか、またはそれと共に投与して、強力な免疫応答を誘導する医薬品またはワクチンを作製することができる。
【0084】
以下の実施例は、キャプソマー構造体に自己会合したキメラL1−CCR5タンパク質をコードするポリヌクレオチドの調製および発現に使用した手順を記載する。以下に記載の手順には、CCR5ペプチドフラグメントをコードするアミノ酸配列を組込むためのL1をコードするポリヌクレオチドの修飾が含まれる。この例示的証明では、第1の細胞外ループのC57B1/6(B6)マウスCCR5(mCCR5)(mCCR5)由来の16個のコドンを、ウイルス中和エピトープ部位に対応する3つの領域BPV−1 L1配列の1つに個別に挿入した。これらのエピトープの位置は、種々のヒト乳頭腫ウイルスのポリペプチド配列のアラインメントによって以前に予想されている。CCR5配列を投与されたL1の3つの不連続領域は、Ludmerer et al.、J.Virol.、70、4791、1996、Ludmerer et al.、J.virol.、71、3834、1997、Roden et al.、J.Virol.、71、6247、1997に記載されている。これらの部位のアミノ酸はキャプシド表面上で発現するようであるので、BPV−1 L1中のアナログ部位をペプチド挿入用に標的した。これにより、CCR5ペプチド配列を含むキメラL1タンパク質の一部が表面に発現し、ヒト免疫系に対する有効な提示に利用することができることが確実になった。
【0085】
実施例1は、抗原粒子に自己会合したキメラL1−CCR5タンパク質の作製に使用した方法を記載する。
【0086】
【実施例】
[実施例1]
抗原粒子に自己会合することができるキメラタンパク質の構築
3つの異なるL1−CCR5キメラ(「L1−CCR5キメラ1」、「L1−CCR5キメラ2」、および「L1−CCR5キメラ3」を指す)をコードするポリヌクレオチドを、本質的にHo et al.、Gene、77、51、1989に記載の技術にしたがった重複伸長PCR変異誘発によって調製した。BPV−1 L1をコードするポリヌクレオチド(Chen et al.、Nature,299、557、1982)を、バキュロウイルスpFastBac 1発現ベクター(Gibco BRL、Gaithersberg、MD)の多クローニング部位の相補部位にEcoRI/KpnIフラグメントとしてクローン化した。各3つのキメラのBPV−1 L1配列の一部を、C57B1/6 mCCR5の第1の細胞外ループをコードする配列と置換した。mCCR5タンパク質由来のポリペプチド配列は、以下の配列を有する:His−Tyr−Ala−Asn−Glu−Trp−Val−Phe−Gly−Asn−Ile−Met−Cys−Lys−Val(配列番号1)(Boring et al.、J.Biol.Chem.、271、7551、1996)。L1−CCR5キメラ1では、L1アミノ酸130〜136をコードする配列を、mCCR5配列に置換した。L1−CCR5キメラ2では、L1アミノ酸275〜285をコードする配列を、mCCR5配列に置換した。L1−CCR5キメラ3では、L1アミノ酸344〜350をコードする配列を、mCCR5配列に置換した。最終的なクローンを、制限消化分析およびPCR増幅領域のヌクレオチド配列分析によって確認した。
【0087】
キメラL1−CCR5タンパク質または野生型BPV−1 L1をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルス貯蔵物を、製造者が記載のように、GIBCOBRLバキュロウイルス系を用いて作製した。乳頭腫様粒子を、先に記載のように組換えバキュロウイルス感染Sf9細胞から精製した。(Kirnbauer,R.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、12180〜12184、1992、Greenstone,H.L.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95、1800〜1805、1998)。粒子調製物の一般的な形態を、FPLC Superose 6ゲル濾過カラム(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)を用いた移動度アッセイによって分析した。溶出物を1mlの画分に回収した。このカラムの空隙用量は8mlである。以前に、野生型L1 VLPはカラムの画分9に主に溶出し、L1キャプソマーは、画分15に溶出され、L1モノマーは画分19〜21に溶出されることが同定されている(Okun,M.M.et al.、提出中)。カラム画分を、ウェスタンブロットによってL1の存在について分析した。
【0088】
実施例2は、キメラL1−CCR5タンパク質がキャプソマー構造体へ自己会合することを確認するために使用した方法を記載する。興味深いことに、下記のL1−CCR5粒子は、電子顕微鏡によって、野生型L1タンパク質から形成されたVLPよりいくらか小さいことが示された。
【0089】
[実施例2]
キメラキャプソマー構造体の調製
上記の3つのL1−CCR5キメラを、FPLC SUPEROSE 6ゲル濾過カラムクロマトグラフィー(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)によって単離した。各1mlのカラム画分を、変性条件下で10%ポリアクリルアミドゲルを用いたウェスタンブロッティングによってL1の存在についてアッセイした。コントロールは、野生型L1 VLPは主にカラム画分9に溶出され、L1キャプソマーは画分15に溶出され、L1モノマーは画分19〜21に溶出されたことを示した。キメラ2および3の調製物由来のL1−CCR5タンパク質は、主に画分15において検出された。これらの結果は、L1−CCR5キメラ2およびL1−CCR5キメラ3タンパク質が、高次構造体に会合できなかったことを示唆した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、次の手順でL1−CCR5キメラ1を選択した。精製粒子を、最初にカーボン被覆の格子に粒子を吸着させ、かつ1%酢酸ウラニルで染色し、次に、その格子を36,000倍のPhilips電子顕微鏡モデルEM 400RTを用いて試験することによって電子顕微鏡を用いて試験した。
【0090】
これらの手順の結果は、L1−CCR5キメラ1タンパク質が会合した粒子構造体を含むことが公知のカラム画分に溶出されたことを示した。電子顕微鏡によるキメラ1粒子の試験により、粒子は約28nmの直系を有する一方で、野生型L1 VLPは約55nmの直径を有することが明らかになった。28nmの直径は、粒子が12個のキャプソマーからなる一方で、野生型L1タンパク質から形成されるより大きな直径の構造体は、72個のキャプソマーからなることが示唆される。形態学的には、L1−CCR5キメラ1粒子は、12個の5量体キャプソマーのポリオーマウイルス主要被覆タンパク質VP1の規則的な配列からなり、高イオン強度でVP1キャプソマーのin vitro再アセンブリの際に作製することができるポリオーマウイルス12ICOSA殻(T−1粒子)に類似した(Salunke et al.、Biophys.J.、56、887、1989)。L1−CCR5粒子に類似のサイズの小粒子を、野生型BPV−1 L1 VLP調製物の微量成分として見出した。L1−CCR5粒子が野生型VLPより小さいにもかかわらず、野生型キャプソマーが欠く野生型VLPの少なくともいくつかの特徴を保有していた。特に、L1−CCR5粒子は、マウス赤血球を凝集し、粒子に結合するがキャプソマーに結合しない、BPV−1中和モノクローナル抗体(#9)に対してELISA反応性を示した。(Roden,et al.J.Virol.、68,7570、1994)
【0091】
以下の実施例は、キャプソマー構造体上に整列した配列として提示されたペプチド配列がどのようにして中枢抗原に対してさえも体液性免疫応答を刺激することができるのかを例示する。以下に示すように、L1−CCR5粒子を投与されたマウスは、mCCR5特異的抗原の産生によって応答する。有意に、この結果は、免疫化によって、内因性細胞CCR5に対する寛容に影響されずにペプチドにB細胞寛容を付与することを示した。免疫原性粒子に結合した天然のmCCR5によって誘導された抗自己抗体は、CCR5リガンドの結合を阻害し、mCCR5ペプチドを含むキメラCCR5タンパク質によってHIV−1感染が阻害される。
【0092】
実施例3は、キメラL1−CCR5粒子を抗CCR5抗体誘導用の免疫原として使用することができることを示すために使用した方法を記載する。
【0093】
[実施例3]
寛容破壊免疫応答の刺激
抗血清を調製するために、C57B1/6マウスに、免疫化プロトコールにおいて、IMJECT活性化免疫原結合キット(Pierce、Rockford、IL)を用いてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にカップリングしたmCCR5の第1の細胞外ループを示すL1−CCR5粒子、野生型BPV−1 L1 VLP、または合成CCR5ペプチドのいずれかを投与した。いくつかの場合、マウスに、1%SDSの存在下での2分間のボイルによって変性させたL1−CCR5粒子を投与した。マウスに、10μgの抗原を2週間間隔で3回皮内に摂取した。ほとんどの場合、血清サンプルを、最終追加免疫の2週間後に回収した。アジュバントを使用した場合、抗原を、最初の注射用にはフロイント完全アジュバント中で、その後の注射用にはフロイント不完全アジュバント中で調製した。血清サンプルを、BPV−1 VLPに対するIgG抗体を検出するための定量的ELISAプロトコールを用いて、CCR5ペプチドおよび野生型VLPに対する反応性について試験した。Kirnbauer et al.、J.Natl.Cancer Inst.、86、494、1994に記載の手順を用いてELISAを行った。mCCR5の第1の細胞外ループを示す合成ペプチドを調製し、担体タンパク質としてのウシ血清アルブミン(BSA)にカップリングした。抗CCR5特異性IgGを、50μlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中の300ngのBSAカップリングCCR5ペプチドの96ウェル IMMULON IIマイクロタイタープレート(Dynatech,Chantilly、VA)の各ウェルに37℃で2時間の結合することによって検出した。PBSでの3回の洗浄後、ウェルを0.5%脱脂粉乳+1%新生ウシ血清を含む50μlのPBSを用いて室温で2時間阻害した。阻害後、ウェルを、PBSで3回再洗浄した。マウス血清を、PBS+0.5%脱脂粉乳で連続希釈した。最終的なPBS洗浄物を除去後、希釈した血清サンプル(50μl)をウェルに入れた。プレートを、ゆっくりと振とうさせながら室温で2.5時間インキュベートした。5回の洗浄後、0.5%ミルク−PBSで1:10,000に希釈した50μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN)を、ウェルに添加した。プレートを、ゆっくり撹拌しながら室温で1時間インキュベートし、その後、3回洗浄した。ABTSペルオキシダーゼ基質(50μl)をプレートに添加し、室温で45分間インキュベートし、THERMO MAXマイクロプレートリーダーを用いて、405nmの光学密度(OD)を読み取った。バックグラウンドの2倍を超えるOD405値(通常、0.1を超える)を、陽性とみなした。
【0094】
図1Aに示した結果は、L1−CCR5粒子を投与したマウス由来の血清サンプルが、高い抗CCR5 ELISA力価を有することを示した。それに対して、野生型VLPを投与したコントロールマウスは、予想通りELISA反応性を示さなかった。抗CCR5力価は、フロイントアジュバントと組み合わせた免疫原を投与した3匹の動物で3×103〜3×104の範囲であり、アジュバントを含まない免疫原を投与した2匹の動物で3×103であった。アジュバントを組み合わせた変性L1−CCR5粒子を投与したマウスは、mCCR5ペプチド特異的抗体の証拠を示さなかった。図1Bに示した結果に示されるように、変性L1−CCR5粒子の反応性欠失は、変性物質が高力価の抗L1抗体を惹起したので、CCR5ペプチドに制限された。これらの所見により、成体動物は、中枢自己抗原に特異的な抗体の産生能力を維持していることが明確に示された。
【0095】
上記の結果は、L1−CCR5粒子がCCR5ペプチドに特異的な抗体を惹起することを示す一方で、抗体がその天然の形態で提示された場合、細胞関連mCCR5タンパク質も認識することを確証するためにさらなる試験を行った。抗CCR5抗体が細胞表面上に発現したmCCR5に結合することを示すために、フローサイトメトリー分析(FACS)を用いて、これを行った。
【0096】
実施例4は、L1−CCR5粒子に対して惹起した抗体が細胞表面上に発現した元のmCCR5レセプタータンパク質に結合することを示すために使用された方法を記載する。
【0097】
[実施例4]
キャプソマー構造体に導入された自己抗原に応答して刺激された自己抗体による未変成抗原の結合
【0098】
貯留したマウス血清由来の全IgGをプロテインGカラム(Pierce社)でアフィニティークロマトグラフィーにより当技術における通常の技能を有する者が熟知している手順により親和精製した。IgGを含有するカラム画分を貯留し、ついでCENTRICON−30スピンカラム(Amicon社;Beverly,MA)を用いて濃縮した。抗体結合検定を、組み換えマウスCCR5レセプターを発現するトランスフェクションされたヒト細胞を用いて行った。L1−CCR5粒子に対して生成した抗体の結合はマウス細胞の初代培養を用いた場合は容易に試験することができなかったが、その理由はこれらの細胞が高レベルのFcγレセプターを発現し、非特異的マウスIgGと相互作用したために、結合の背景レベルが高くなったからである。そこで、流動細胞光度測定法(flow cytometry)分析のために、マウスCCR5発現ベクターを一時的にHeLa−MAGI細胞にLIPOFECTAMINE PLUSトランスフェクションキット(Gibco BRL社;Gaithersberg,MD)を用いてトランスフェクションすることにより発現させた。B6マウスからクローン化されたmCCR5と、ヒトCCR5のバックグラウンドにmCCR5の第1の細胞外ループを含むヒト−マウスCCR5キメラとを含むpcDNA3由来プラスミドをKuhmannらによりJ.Virol.,71:8642(1997)に記載されているように調製した。トランスフェクション後48時間の時点で5mM EDTAの存在下で単層を静かに掻き取ることにより分離した。細胞を染色用バッファ(PBS+0.5%BSA)中で3回洗浄した。約105個の細胞を、染色用バッファ25μlにマウスIgGを1μg加えたものに再懸濁し、ついで45分間4℃でインキュベートした。細胞を染色用バッファで3回洗浄し、染色用バッファ25μlにフルオレセイン(FITC)−標識化ヤギ抗マウスIgG)(Jackson Immunoresearch社;West Grove、PA)250ngを加えたものに再懸濁し、30分間4℃でインキュベートした。細胞を染色用バッファで3回洗浄し、最終的にFACS分析用に調製するために染色用バッファ0.5mlに再懸濁した。対照として、細胞を、FITC−標識化マウス抗ヒトCCR5単クローン抗体(mAB182)(R&D Systems社;Minneapolis,MN)500ngを用いて製造者の提供した取り扱い仕様書に従って染色した。FACSCALIBURおよびCELLQUESTソフトウェア(Becton Dickinson社;San Jose,CA)を用いてFACS分析を行った。特異的結合の測定はpcDNA3ベクターをトランスフェクションした対照細胞の染色と比較して行った。
【0099】
これらの手順を行った結果から、L1−CCR5キャプソマー粒子を特異的に結合した組み換えmCCR5レセプターの投与に応答して刺激された自己抗体がトランスフェクションされたHeLa−MAGI細胞の表面に発現することが示された。図2AはL1−CCR5で免疫化されたマウス由来のIgGがmCCR5レセプターを発現したトランスフェクションされた細胞に高い親和性で特異的に結合するが、ベクター単独でトランスフェクションされた細胞には結合しないこと示している。mCCR5を発現する細胞は、野生型L1(図2B)により形成されたウイルス様粒子またはヒトCCR5の第2の細胞外ループに特異的な単クロン抗体(mAB182)(図2C)を用いた免疫化に応答して刺激された抗体を実質的に結合しないが、これは予想どおりである。抗体の特異性についての対照として、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合したmCCR5ペプチドをマウスに投与した。これらのマウスはELISA力価がBSA−結合したものに対して105である抗CCR5ペプチド抗体を産生することにより応答したが、精製IgGはmCCR5を発現する細胞に結合しなかった(図2D)。全体として、これらの結果から示されることは、L1−CCR5キャプソマー粒子を用いた免疫化に応答して生成した抗体は、KLH−CCR5ペプチドに対して生成した抗体と対照的に、細胞表面に発現された未変成のmCCR5と特異的に結合するので、真性の自己抗体として機能することである。
【0100】
L1−CCR5粒子に対して生成した抗体が未変成のmCCR5に結合する能力をさらに検査したが、これはmCCR5を発現するトランスフェクションされたHeLa−MAGI細胞に結合するための125I−標識化ヒトRANTESケモカイン(chemokine)リガンドとの競合を試験することにより行った。マウスケモカインMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESはmCCR5に対するリガンドである。加えて、MIP−1βおよびRANTESのヒト相同体はmCCR5に結合可能である(Meyerら,J.Biol.Chem.,271:14445(1996);Nibbsら,J.Biol.Chem.,272:12495(1997))。以下の実施例に示すように、mCCR5発現構築物を用いたトランスフェクションから3日後、マウス血清の希釈液の不存在下または存在下に0.5nMヨウ素化RANTESを用いて細胞をインキュベートした。
【0101】
実施例5はCCR5レセプターに対して生成した自己抗体がレセプターに対するリガンドの結合を阻害することを示すのに用いた方法を説明するものである。
【0102】
[実施例5]
レセプターに特異的自己抗体がリガンドの結合を阻害
【0103】
HeLa−MAGI細胞を一時的にmCCR5発現プラスミドでトランスフェクションしたが、その際Stratagene Cloning Systems社(La Jolla,CA)から購入したCaPO4トランスフェクションキットを使用した。トランスフェクション後2日目に105個の細胞を24穴組織培養プレートの個別のウェルに移した。次の日に細胞を冷PBS中で2回洗浄し、ついで冷結合用バッファ(25mM HEPES(pH7.2)、5mM MgCl2、1mM CaCl2、0.5%(wt/vol)BSA)150μlに再懸濁した。細胞を4時間、4℃でインキュベートしたが、これは0.5nM125I−標識化ヒトRANTES(Amersham社;Arlington Heights,IL)を用いマウス血清の種々の希釈液の不存在下または存在下に行った。小さい分子を取り除くために、結合検定を行う前に、マウス血清をMICRO BIO−SPIN CHROMATOGRAPHY−6カラム(Bio−Rad社;Hercules,CA)を用いて結合用バッファにバッファ交換した。対照として、50nMまたは500nMの非ヨウ素化ヒトRANTES(R&D Systems社)の存在下で何度か結合検定を行った。ウェルを冷結合用バッファに0.5M NaClを加えたもので4回洗浄して反応を停止した。1%SDSを0.5ml添加することにより細胞を溶解し、ついで溶解産物を計数用ガラス瓶に移した。結合した放射能をBeckman Gamma 5500Bカウンタで1分間計数した。
【0104】
これらの手順を行った結果から、L1−CCR5粒子に対して生成された自己抗体は細胞表面に発現されたCCR5と特異的に結合し、リガンドがレセプターに結合するのを阻害することが確認された。特に、図4に示すグラフ化された結果からわかるように、L1−CCR5血清の1:30希釈液は(100倍過剰の冷RANTESを用いた際に観察される置き換えと同様に)ヨウ素化されたヒトRANTESの約66%を置き換え、これに対して野生型L1 VLP血清の1:30希釈液を用いると37%が置き換えられた。L1−CCR5の1:75希釈液および1:150希釈液はそれぞれヨウ素化RANTESの25%および17%を置き換えたが、対照血清をこれらの希釈率で用いた場合は顕著な置き換えは見られなかった。最大限に結合したヨウ素化RANTESは血清の不存在下で結合検定することにより決定され、図3において水平の点線で示すように約2550cpmに相当する。ヨウ素化RANTESの非特異的結合(約1300cpm)は冷(非ヨウ素化)ヒトRANTESの1000倍過剰(500nM)において結合検定することにより決定した。図4に示すデータは1つの実験について2つのウェルの平均値を表す。従前の研究からMIP−1α、MIP−1βおよびRANTESがヒト(h)CCR5の第2の細胞外ループに結合することが示唆されたが、その理由はそれらの結合が分子のこの部分に対して単クロン抗体により阻害されるからであり、hCCR5のアミノ末端に特異的な抗体により結合を阻害される訳ではないからである(Wuら,J.Exp.Med.,186:1373(1997))。ここに述べた知見から示されるように、これら2つの部位の間に位置する、mCCR5の第1の細胞外ループに対する結合特異性を持つ抗体が都合よくRANTES結合を阻害し、さらにこれらの自己抗体のインビボ形成を刺激する方法を提供している。
【0105】
上述の自己抗体の有用性をさらに調べるために、本発明者らは前記の実施例において観察されたリガンド結合の阻害が標的細胞のウイルス感染の阻害と相関関係を有するか否かを検討した。単クロン抗体を用いた研究によりhCCR5の第2の細胞外ループおよびアミノ末端領域が、そしてキメラレセプターを用いた研究によりCCR5の第1および第3の細胞外ループもレセプターのHIV−1との相互作用に貢献していることを示唆した(Wuら,J.Exp.Med.,186:1373(1997);Ruckerら,Cell,87:437(1996);Atchisonら,Science,274:1924(1996);Alkhatibら,J.Biol.Chem.,272:19771(1997);Picardら,J.Virol.,71:5003(1997);Rossら,J.Virol.,72:1918(1998))。mCCR5はHIV−1コ−レセプターとして機能しないけれども、ヒト−マウスキメラレセプター(HMHH)は、hCCR5の背景中にmCCR5(B6マウス配列)の第1の細胞外ループを含有しており、ヒト細胞系統において発現されるとコレセプター活性を持つ(Kuhmannら,J.Virol.,71:8642(1997))。そこで、このキメラレセプターを以下の実施例で用いて抗L1−CCR5血清がM−刺激性HIV−1感染を阻害し得るか否かを試験した。
【0106】
以下の実施例で示された結果は、HIV感染の阻害に強い関連性を示しているが、その理由はCCR5発現の部分的減少でさえも臨床的に有意の効果を持ち得るからである。これが正しいのは不活性CCR5対立遺伝子について異型接合性であるHIV−1に感染した個体ではAIDSの進行が遅いからである(Liuら,Cell,86:367(1966);Samsonら,Nature、382:722(1996);Winklerら,Science、279:389(1998))。
【0107】
実施例6はL1−CCR5粒子に応答して生成した自己抗体がM−刺激性HIV−1による標的細胞の感染を阻害することを示すために用いた方法を説明するものである。手順中キメラ性マウス−ヒトCCR5レセプターが利用されたため、最初のステップは前述の抗CCR5自己抗体がキメラレセプターを認識することを確認するステップを含んだ。
【0108】
[実施例6]
抗レセプター自己抗体が標的細胞のHIV感染を阻害
【0109】
L1−CCR5血清から生成したIgGがヒト−マウスキメラレセプターと結合することを確認するために、KuhmannらがJ.Virol.,71:8642(1997)に記載したHMHH発現構築物で一時的にトランスフェクションしたHeLa−MAGI細胞でFACS分析を行った。この発現構築物を受容細胞にトランスフェクションしてから2日後にL1−CCR5 IgG、野生型L1 VLP IgGまたは陽性対照抗ヒトCCR5単クロン抗体のいずれかで染色した。図2E−2Gに示す結果からわかるように、L1−CCR5粒子だけでなく、ヒトCCR5の第2の細胞外ループに特異的な陽性対照の単クロン抗体を投与したマウス由来の血清IgGを用いて陽性の結合が得られた。しかし、予想通り、野生型L1 VLPを投与したマウス由来のIgGはHMHHと結合しなかった。
【0110】
前述の結果に基づいて、L1−CCR5マウス由来の血清をHIV−1のM−刺激性BaL株の感染を阻害する能力について試験したが、その際単一複製サイクル検定およびHeLa−MAGI指標細胞系統を用いた。HeLa−MAGI細胞は、KimptonらによりJ.Virol.,66:2232(1992)に記載されているように、市販のCaPO4トランスフェクションキット(Stratagene Cloning Systems社)を用いてキメラ性ヒト−マウスCCR5発現ベクターで一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後で、かつ感染の前日に指標細胞を24穴プレートにウェル当たり6.5×104個の細胞密度で完全DMEM培地中に播種した。若干例の感染を、MICRO BIO−SPIN CHROMATOGRAPHY−6カラム(Bio−Rad社)を用いてあらかじめPBSにバッファ交換した貯留マウス血清の存在下に行った。感染に先立って、細胞を、10μg/mlのDEAE−デキストランとともに血清の希釈液を加えた完全DMEM培地中で総体積140μlで30分間4℃でインキュベートした。インキュベーション終了後、ウイルスを各ウェルに加えて全体積を150μlとした。細胞を2時間37℃でインキュベートした後、1mlの完全DMEM培地を各ウェルに加えた。感染から3日後に細胞をX−galで染色し、感染したウェルの青い核の数を数えることにより感染用量を決定した。ウイルス侵入の阻害を、血清存在下の青い核の平均数を血清不存在下の感染中心の平均数と比較して評点した。典型的には対照(無血清)ウェルにおいて50〜75個の青色の感染中心が存在するのに十分な感染性ビリオン(virion)をそれぞれの感染において使用した。検定はすべて二重に行った。継代接種すると、トランスフェクションしたHeLa−MAGI細胞の感染効率が顕著に低下したが、これはおそらくCD4の発現が減少するためである。従って、感染はすべて最近解凍したHeLa−MAGI細胞に行った。
【0111】
これらの手順を行った結果をグラフ化して図4に示したが、これらの結果から示されるように、自己CCR5抗原に対して生成された血清抗体であり、未変成の抗原を認識することが示されかつリガンド−レセプター相互作用を阻害したものは、また標的細胞のウイルス感染をも阻害した。HMHH発現構築物で一時的にトランスフェクションし、L1−CCR5血清の1:15、1:30および1:75希釈液の存在下にHIV−1 BaLと接触した指標細胞は感染性がそれぞれ65%、50%および45%中和された。同じ希釈率で、野生型L1 VLPマウス由来の対照血清は若干の非特異的中和を示したが、1:15希釈液では25%、1:30および1:75希釈液ではそれぞれ15%のレベルであったにすぎない。陽性対照として用いたヒトCCR5(mAB182)に特異的な単クロン抗体50μg/ml存在下でHIV−1 BaLで感染した指標細胞は約50%の中和を示した。このように、上述の手順に従って生産された抗CCR5自己抗体はHIV−1による罹病性細胞の感染を効果的に阻害した。
【0112】
本発明者らは感染性ウイルスの整った表面抗原を模倣する状況におくことによって自己抗原に対するB細胞の免疫寛容を破壊する方法を示した。これを行うために、本発明者らは乳頭腫ウイルスL1 VLPの表面の優性なウイルス中和性エピトープを自己タンパク質由来のペプチド配列で置換した。詳しくは、本発明者らはウシ乳頭腫ウイルス1型(BPV−1)のL1内の中和性エピトープと想定されるエピトープ(Ludmererら,J.Virol.,70:4791(1996))にマウスケモカインレセプターCCR5の第1の外部(external)ループに相当する、長さ16アミノ酸のペプチド配列を遺伝子工学的技法により導入した。このキメラ性L1は、キメラ性L1−CCR5タンパク質に対するヒトの免疫応答を刺激するための免疫原として使用し得るキャプソマーの整った配列を有する粒子内に組み込まれた。
【0113】
キメラ性L1−CCR5タンパク質サブユニットからなるVLPで免疫されたマウスを継続的に飼育して免疫法の長期的効果を決定した。これらの効果には自己抗体産生の任意の病理学的結果が含まれる。免疫から6ヶ月経過時に免疫化マウスの体重は対照動物の体重と同じであり、外観上健康であった。最高の抗CCR5力価を示したマウスの剖検では自己免疫疾患の徴候はなんら見られなかった。ワクチンにより予防接種したしたマウスのCCR5抗体力価は当初は安定しているが、その後L1に対する応答に並行して徐々に下降した。これらの結果から示唆されるのは、細胞性CCR5はキメラ性VLPに誘導されたB細胞のCCR5ペプチドに対する応答を活性化も免疫寛容化もしないことである。
【0114】
以下の実施例は中心自己抗原に向けられた自己抗体がマウス以外の哺乳動物においてどのように刺激を受けるかについて説明するものである。下記の例示において、抗アカゲサルCCR5抗体の産生を誘導する組成物および産生方法を説明する。
【0115】
[実施例7]
アカゲサルにおける自己免疫応答の刺激
【0116】
まず、アカゲサルCCR5ポリペプチド配列の一部分を含むキメラ性L1−CCR5タンパク質をコードする組み換え発現構築物を本質的に実施例1に示す手順に従って調製した。得られた発現構築物を受容体Sf9細胞内に導入し、ここで組み換えベクターによりコードされたタンパク質が産生された。受容体細胞内で産生されたキメラ性L1−CCR5タンパク質の自己組み込み集合体を表すキャプソマー構造体をスクロース勾配およびCsCl勾配遠心分離により精製した。並行して行う手順として、野生型L1タンパク質からなる野生型VLPも対照用免疫原として用いるために調製、精製した。対照免疫原はL1−CCR5キメラに存在するアカゲサルCCR5ポリペプチド配列を含んでいない。精製した野生型VLPまたはキメラ性L1−CCR5は、アジュバントのキャプソマー構造体と組み合わせて、それぞれ対照および試験免疫原性組成物とする。これらの組成物を実施例3に記載するような標準的免疫化手順に従ってアカゲサルに別々に皮内注射する。一例において、2週間間隔で動物に免疫原性組成物を3回投与する。最初の免疫化を行う前の時点から2匹の動物から定期的に採取した血清サンプルからは、免疫化前はCCR5結合抗体の証拠は得られなかった。対照動物から採取した血清サンプルは野生型L1VLP免疫原性組成物の最終回投与後数週間経過時でもCCR5結合抗体についての証拠は得られなかった。これに対して、L1−CCR5キメラを含むキャプソマー構造体を投与した動物から採取した血清サンプルは顕著なレベルの抗CCR5抗体を含有している(図5)。これらの結果から、L1−CCR5キャプソマー構造体が所望の免疫原性を持つことおよびこの効果が抗原特異的であることが確認された。
【0117】
本発明者らは、先に、他の乳頭腫ウイルスポリペプチドをL2マイナーキャプシドタンパク質の融合物としてVLPに添加すると、これらのウイルスペプチドに対する強い細胞媒介免疫応答と挿入されたペプチドに対する特異的抗体の産生を誘起することができることを示した(Greenstoneら,Proc Natl Acad Sci USA,95:1800(1998);H.L. Greenstone Ph.D.Thesis(1998), The Johns Hopkins University, Baltimore, MD)。力価の高い抗体応答とMHC Iに限定されたCTL応答の双方の誘起がアジュバントの不存在下にVLPを少量接種することにより可能になる。上述の知見から、VLPがウイルスのエピトープに対して強い免疫応答を誘起する能力はおそらくそれらが細胞表面と相互作用する能力および反復構造の整った配列としてエピトープを提示する能力に関係しているものと考えられる。
【0118】
本発明者らはウイルスタンパク質のL2キメラを作成することに成功した。意義深いのは、融合はすべて一緒に会合(co−assembly)して粒子として効率的に回収し得る全長L1VLPにするのに適合していることである(Greenstoneら,Proc Natl Acad Sci USA,95:1800(1998))。L2タンパク質中の大きな挿入物は、42kDa全長タンパク質を表すものでさえもVLPの会合に適合している。L2がこの大きさの挿入物を受容する能力は、L2がVLPの構造体上の集合性に寄与しているのではないため、粒子の自己会合を犠牲にすることなくかなりの変更に耐えることができるという事実に帰着する。L2がVLP中で整った構造体を有することはあり得るが、その間隔はL1の間隔ほど近いものではないだろう。乳頭腫ウイルスのキャプシドにおけるL2の位置は確定されていないけれども、本発明者らはL2が20面体のキャプシドの12個の頂点に配置されていることを示す、実験に基づく証拠を得ている。これにより、L2および任意のタンパク質は約300オングストロームの反復距離でそこに挿入されることになる。
【0119】
乳頭腫ウイルスL2タンパク質は外来性ポリペプチド配列の大きな挿入物を収容することができ、なおかつウイルス様粒子に導入することができるので、L2の部位に挿入された全長自己タンパク質を有するL1/L2キメラを調製し免疫原として使用することができる。好適な実施形態では、標的ポリペプチドをBPV L2タンパク質の最初の110個のアミノ酸に融合させる。これによりキャプシド上の挿入配列はL1 VLPに組み込まれると外側になる。実際、この方法を用いてTNF−αに対する自己抗体の産生を刺激するための免疫原として使用できるキメラ性VLPを調製することができる。
【0120】
以下の2つの実施例はマウスTNF−α VLPをL2キメラおよびストレプトアビジン融合物としての両方の場合について作成方法を説明するものである。このタンパク質の既知の原子構造(Eckら,J.Biol.Chem.,264:17595(1989))に基づいて、L1キメラも機能的に中和性抗体が結合するエピトープを含むTNF−αペプチドを挿入することにより調製することができる。TNF−α VLPワクチンにより予防接種したマウス由来の血清をELISA検定においてマウスTNF−αに対する反応性について、およびインビトロにおけるL929細胞のTNF−α誘起細胞溶解の阻害について試験することができる(Takasakiら,Nature Biotech,15:1266(1997))。TNF−αポリペプチド配列を表すVLPもまたコラーゲンII型RAを有するDBA/1マウスをワクチンによる予防接種をするのに使用することができる。疾患の経過におけるこの措置の効果を標準的な脚の腫れおよび組織学的分析を用いてモニターすることができる(Thorbecke et al.,Proc Natl Acad Sci USA,89:7375(1992))。
【0121】
実施例8は免疫原として用いるキメラ性L1/L2粒子を調製するのに使用することができる方法を説明するものである。
【0122】
[実施例8]
自己抗体の産生を刺激するキメラ性L1/L2粒子
【0123】
分子クローニングの技術において通常の技能を有する者が熟知している標準的技法を用いてL2−マウスTNF−αポリペプチドキメラをコードする遺伝子構築物を調製しトランスフェクションされた細胞内でキメラタンパク質として発現した。ついでこれらのキメラタンパク質をL1ウイルス様粒子に共組み込みしてキメラ性L1/L2 VLPとした。このL1/L2 VLPを精製し、アジュバントと組み合わせ、免疫化手順に従って試験動物に投与した。対照として、L2−TNF−αキメラタンパク質および可溶性TNF−αを単独で注射した。キメラ性L1/L2 VLP製剤を投与したマウス由来の血清サンプルELISA検定で検出可能である抗TNF−α抗体を含有する。これに対して、対照動物由来の血清サンプルは抗TNF−α抗体を含有していない。この結果はキメラ性L2タンパク質を含むキメラ性L1/L2粒子が自己抗体の産生を刺激するために使用するのに有用であることを示している。
【0124】
実施例9は自己ポリペプチド配列が粒子を構成するタンパク質にビオチン結合を介して結合している免疫原性ウイルス様粒子を作製および使用する方法を説明するものである。この場合、あらかじめ形成されたVLPをビオチン化し、ついでストレプトアビジン結合自己ペプチドと接触させる。この操作が可能なのは野生型L1 VLPが一度形成されるとまったく安定しているからである。
【0125】
[実施例9]
ビオチン結合を介して自己ポリペプチドを導入するウイルス様粒子
【0126】
精製した野生型L1 VLPをスルホ−NHS−ビオチン試薬を用い、製造者の提供する取扱説明書(Pierce社)に従ってビオチン化した。ビオチン化したVLPを24%−54%スクロース直線密度勾配で分離することにより精製して遊離ビオチンを除去した。予備的実験でL1 VLPが濃密にビオチン化されていることがわかった。この観察により示されるように、各L1にビオチンを結合するためには少なくとも1個の露出したリジンが存在していた。マウスTNA−αポリペプチドをストレプトアビジン融合タンパク質としてのVLPに接合した。ストレプトアビジンは一般的に任意の選択されたポリペプチドをビオチン化したVLPに効率的に結合するのに有用である。マウスTNF−αタンパク質由来のポリペプチド配列の配列はSer−Ser−Gln−Asn−Ser−Ser−Asp−Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−Val−Ala−Asn−His−Gln−Val−Glu(配列番号:2)である。この配列をストレプトアビジン発現ベクターpTSA−18FへのC−末端融合物としてクローン化した(Sano,T.and Cantor,C.R.,Biochem.Biophy.Res.Commun.,176:571−577(1991))。発現は0.4mM IPTGで誘導後3〜6時間インキュベートしたBL21(DE3)(pLysS)バクテリアで行った。封入体からのタンパク質の精製はSano and Cantorにより記載されたように行った(Sano,T. and Cantor,C.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:142−146(1990))。このストレプトアビジン融合タンパク質をビオチン化されたVLPと3:1(重量:重量)の比率で1時間室温で反応させた。ストレプトアビジン融合物に接合した粒子を24%−54%スクロース直線密度勾配で遠心分離することにより精製した。ストレプトアビジン結合自己ポリペプチドを結合したまたは結合しないVLP5μgの製剤を試験および対照マウスにそれぞれ2週間間隔で3回注射した。最終回の注射から2週間後、自己ポリペプチドを含む組成物を投与した動物から採取した血清サンプルは抗自己ポリペプチド抗体の証拠を示した。これに対して、対照動物の血清サンプルには相当する抗体は検出されなかった。
【0127】
マウス単クロン抗体が治療剤としておよび広範囲の基礎および応用研究用の試薬として有用であることはよく確立されている知識である。しかしながら、たいていの単クロン抗体はマウスまたはラット由来であるため、現在入手可能な抗体セットは、中心抗原が表面に露出しているマウスまたはラットのエピトープをそれらの未変成の立体配座で特異的に認識するものに欠けている。この欠失によりヒトにおける研究には限界があるが、その理由は齧歯動物は哺乳動物の生物学を研究するためのモデルであり、高度に保存されてきたタンパク質のアミノ酸配列は典型的には進化を通じて保存されている重要な機能を有するからである。そこで、本明細書に開示の方法を用いて未変成の立体配座の自己抗体に対するB細胞の応答を刺激することが可能である。しかるのち、所望の結合特異性を有する単クロン抗体を産生するハイブリドーマを調製しスクリーニングすることが可能である。詳しくは、TNF−αに対する多クロン抗体を生成するのにもっとも有効なTNF−α VLPを用いてマウスTNF−αを特異的に認識し、機能的に不活性化する単クロン抗体を生成するようにすることが可能である。標準脾臓細胞/ミエローマ融合方法を用いて単クロン抗体産生細胞を創成する(Galfre et al.,Nature,266:550(1977))。
【0128】
実施例10はTNF−αに対するマウス単クロン抗体を製造するのに使用できる方法を簡単に説明するものである。
【0129】
[実施例10]
モノクローナル抗体の製造
まず、上述の方法に従って調製した表面にマウスTNF−αポリペプチドを露出したウイルス様粒子でマウスを免疫化する。ELISA検定を用いてマウス由来の血清が未変成TNF−αに特異的な抗体を含有することを確認する。これらのマウスを殺し、脾臓細胞を採取し非分泌性ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマのコレクションを作成する。これらのハイブリドーマを当技術における通常の技能を有する者が熟知している方法によりスクリーニングして、未変成TNF−αに対する結合特異性を有する抗体を分泌する細胞を同定する。ついで有効量の抗TNF−α抗体を精製する。
【0130】
[実施例11]
サブドミナントウイルス中和性エピトープに対する抗体の応答の向上
乳頭腫ウイルスL1およびL1/L2 VLPをワクチン接種すると高力価(100,000より大)であるが型にのみ特異的な中和性抗血清を生成することができる(Kimbauer,R.et al.,PNAS,89:12180−4(1992);Roden,Rら、J.Virol,70:5857−83(1996))これに対して、L2単独で、若しくはその砕片は低力価(1000より小)の中和性抗血清しか引き出さないが、それらは乳頭腫ウイルス型のうち交差中和性血清である場合がある(Roden,R.et al.,J.Viro.,68:7570−4(1994);Kawana,K.et al.,J.Virol.,73:6188−90(1999);Roden,R.et al.,Abstract Book,17th International Papillomavirus Conference,p.61(1999))。交差中和性L2抗体の力価を向上させるために、L2ペプチドをVLPの表面に密な間隔の配列にする。たとえば、HPV16 L2のアミノ酸108〜120を含むペプチドを遺伝的にストレプトアビジンのC末端に融合し、この融合タンパク質を実施例9に概略を説明したように製造する。ストレプトアビジン−L2融合タンパク質をビオチン化VLPと反応させ、接合されたVLPを実施例9に概略を説明したように精製した。ストレプトアビジン−L2接合VLPでワクチン予防接種した哺乳動物由来の抗血清を、先に説明したインビトロ中和検定法(Roden,R.et al.,J.Virol.,68:7570−4(1994);Roden,R.et al.,Abstract Book,17th International Papillomavirus Conference,p.61(1999))を用いて、乳頭腫ウイルス疑似ビリオンを交差中和する抗体について試験する。高力価の交差中和性抗体を検出する。
【0131】
本発明を実施形態および実施例を参照して説明したが、本発明の精神を逸脱することなく種々の変更を加えることができることは理解されたい。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。本明細書に文献はすべて明示的に参考して本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1Aおよび1BはELISA検定における血清抗体反応性を示す折れ線グラフである。図1Aは、BSA結合CCR5ペプチドに対するIgG抗体の反応性を示している。図1Bは、BPV−1 VLPに対するIgG抗体の反応性を示している。記号は、フロイントアジュバント存在下でのL1−CCR5粒子(□)、変性L1−CCR5粒子(◇)、またはBPV−1 VLP(△)、またはアジュバント不在下でのL1−CCR5粒子(○)を接種したマウス由来の血清を使用した結果を示す。
【図2】 図2A−2Gは、一時的にトランスフェクトしたHeLa−MAGI細胞に対する抗体結合のフローサイトメトリー分析を示すヒストグラムである。CCR5 DNAをコードしている組み立て物(太い実線)、またはバックグラウンド染色のための対照としてベクターのみ(影を付したヒストグラム)を、染色の2日前に細胞中にトランスフェクトした。(2A−2D)。マウスCCR5またはベクターDNAでトランスフェクトした細胞。(2E−2G)。ヒト/マウスCCR5キメラ(HMHH)またはベクターDNAでトランスフェクトした細胞。細胞を、L1−CCR5で免疫したマウス由来の精製IgG(2Aおよび2E)、BPV−1 VLPで免疫したマウス由来の精製IgG(2Bおよび2F)、またはKLH結合CCR5ペプチドで免疫したマウス由来の精製IgG(2D)と共にインキュベートした。対照として、細胞はヒトCCR5の第2ECループに対する蛍光標識したモノクローナル抗体で染色した(2Cおよび2F)。
【図3】 図3は、血清によるヨウ素化ヒトランテス(RANTES)の置換を示す棒グラフである。HeLa−MAGI細胞をmCCR5で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトの3日後、細胞を0.5nMヨウ素化RANTESと共にマウス血清の希釈液の不在下または存在下でインキュベートした。血清不在下での結合について検定することにより、最大結合したヨウ素化RANTESを決定したが、これはおよそ2550cpmに相当する(点線で示す)。ヨウ素化RANTESの非特異結合(およそ1300cpm)を、1000倍過剰(500nM)のコールド(非ヨウ素化)ヒトRANTES中での結合について検定することにより、決定した。データは、一つの実験からの2個のウェルの平均値を表す。この検定は、再現性を確実とするため、2回反復した。
【図4】 図4は、L1−CCR5血清、BPV−1 VLP血清、またはヒトCCR5の第2ECループに対するモノクローナル抗体(mAB182)の希釈液を用いたHIV−1 BaL感染の阻害を示す折れ線グラフである。血清は3匹の動物からプールした。感染した細胞の核が青色に染まるHIV−1のインディケーターセルラインである、HeLa−MAGI細胞を、ヒトCCR5遺伝子のバックグラウンド中にマウスCCR5の第一のECループを含んでいる、ヒト−マウスCCR5キメラ(HMHH)で一時的にトランスフェ
クトした。トランスフェクトの3日後、細胞をプールしたマウス血清の希釈液または抗体と共に、細胞を4℃で30分間インキュベートした。次いで細胞をM親和性単離物HIV−1 BaLでチャレンジした。感染の3日後、核ウェル中の青色の細胞数を数えることによって、感染した細胞を採点した。血清存在下における青色の(感染した)核の数を血清不在下における青色の核の数と比較することにより、HIV−1 BaL感染の阻害を決定した。データは、一つの実験からの2個のウェルの平均値を表す。再現性を確実とするため、この検定は少なくとも2回反復したが、同様の結果であった。(□)L1−CCR5を接種したマウス、(○)BPV−1 VLPを接種したマウスからの血清、または(△)mAB182。
【図5】 図5は、ELISA検定における霊長類血清抗体の反応性を示す折れ線グラフである。記号は、アジュバントと共にL1−CCR5粒子(□)を、またはアジュバント不在下に野生型BPV−1 VLP(◇)を接種したマカーク由来の血清を用いた結果を表している。
【図6】 図6は、ビオチニル化および非ビオチニル化VLPに対するストレプトアビジンの結合を示す折れ線グラフである。記号は、(□)野生型ストレプトアビジン(SA)と複合体ビオチニル化VLP、(○)SA−TNF−αと複合体ビオチニル化VLP、(■)野生型SAと複合体非ビオチニル化VLP、および(●)SA−TNF−αと複合体非ビオチニル化VLPを表す。
【図7】 図7は、TNF−α細胞毒性検定の結果を示す棒グラフである。ビオチニル化VLPと結合させたストレプトアビジン−TNF−α融合タンパク質(SA−TNF−α)を接種したマウス由来の血清を、TNF−αの存在下でTNF−α感受性細胞セルライン(L929)と共にインキュベートした。ビオチニル化VLPと結合させたストレプトアビジンを接種したマウス由来の血清を対照として使用した。細胞の能力。SA−TNF−αを接種したマウス(例えば5%濃度)由来の血清は、バックグラウンドレベルと比較した時、生存細胞の数において3倍の増加を示した。
【配列表】
Claims (10)
- 乳頭腫ウイルスL1キャプシドタンパク質の対称的な集合を含むキャプソマー構造体と、
前記キャプソマー構造体に結合して、寛容原を提示するウイルス様粒子(VLP)を形成するように、腫瘍壊死因子α(TNF−α)及びCCR5から選択される寛容原の少なくとも1種類のB細胞エピトープを含む組成物であって、
前記寛容原を提示するVLPは、前記寛容原を規則的、反復的なアレイとして表示することを特徴とする、寛容原に対する免疫応答を刺激するための組成物。 - 前記キャプソマー構造体は20面体であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記寛容原は前記支持体にリンカーにより結合されていることを特徴とする請求項1または2に記載の組成物。
- 前記リンカーはビオチンを含むことを特徴とする請求項3に記載の組成物。
- 免疫系の細胞に結合した請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物を含む単離された複合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物を含む製薬。
- HIV感染を阻害するための請求項6に記載の製薬。
- 炎症を抑制するための請求項6に記載の製薬。
- 慢性ウイルス性疾患を治療するための請求項6に記載の製薬。
- 寛容原に対するモノクローナル抗体を生成する方法であって、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物を与えられた対象からのB細胞を用いてハイブリドーマを作成するステップを含むことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10513298P | 1998-10-21 | 1998-10-21 | |
US60/105,132 | 1998-10-21 | ||
PCT/US1999/024548 WO2000023955A1 (en) | 1998-10-21 | 1999-10-20 | Virus-like particles for the induction of autoantibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002528393A JP2002528393A (ja) | 2002-09-03 |
JP2002528393A5 JP2002528393A5 (ja) | 2006-12-28 |
JP4486257B2 true JP4486257B2 (ja) | 2010-06-23 |
Family
ID=22304219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000577627A Expired - Lifetime JP4486257B2 (ja) | 1998-10-21 | 1999-10-20 | 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6719978B2 (ja) |
EP (1) | EP1123114B1 (ja) |
JP (1) | JP4486257B2 (ja) |
AT (1) | ATE314095T1 (ja) |
AU (1) | AU770802B2 (ja) |
CA (1) | CA2347411C (ja) |
DE (1) | DE69929232T2 (ja) |
ES (1) | ES2258869T3 (ja) |
WO (1) | WO2000023955A1 (ja) |
Families Citing this family (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5437951A (en) | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
JP4486257B2 (ja) * | 1998-10-21 | 2010-06-23 | アメリカ合衆国 | 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 |
DK1135162T3 (da) * | 1998-11-30 | 2009-01-19 | Cytos Biotechnology Ag | Ordnet molekylær præsentation af allergener, fremstillingsfremgangsmåde samt anvendelse |
AU2007202761B2 (en) * | 2001-01-19 | 2010-01-21 | Kuros Biosciences Ag | Molecular antigen array |
US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
US7094409B2 (en) * | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
FR2828404B1 (fr) * | 2001-08-10 | 2005-07-15 | Neovacs | Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal |
DE60234375D1 (de) * | 2001-09-14 | 2009-12-24 | Cytos Biotechnology Ag | VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG |
US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
EP1432443B1 (en) * | 2001-10-05 | 2009-01-21 | Cytos Biotechnology AG | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
BR0213117A (pt) | 2001-10-05 | 2004-09-21 | Cytos Biotechnology Ag | Conjugados peptìdeo angiotensina-veìculo e seus usos |
NZ532515A (en) * | 2001-11-07 | 2005-10-28 | Cytos Biotechnology Ag | Compositions comprising a RANKL peptide attached to a core or virus-like particle for treatment of bone disease and immunization |
AU2002363382B2 (en) * | 2001-11-07 | 2007-07-19 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays presenting IL-5, IL-3 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases |
JP4533626B2 (ja) * | 2001-11-07 | 2010-09-01 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイ |
MXPA04003900A (es) * | 2001-11-07 | 2004-07-08 | Cytos Biotechnology Ag | Disposiciones de antigenos para el tratamiento de enfermedades oseas. |
US20030219459A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-11-27 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
US7285289B2 (en) | 2002-04-12 | 2007-10-23 | Nagy Jon O | Nanoparticle vaccines |
US9045727B2 (en) * | 2002-05-17 | 2015-06-02 | Emory University | Virus-like particles, methods of preparation, and immunogenic compositions |
US20060088909A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-04-27 | Compans Richard W | Virus-like particles, methods of preparation, and immunogenic compositions |
EP1545625B1 (en) * | 2002-06-07 | 2011-08-24 | Kentucky Bioprocessing, LLC | Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform |
CN1668637B (zh) | 2002-07-17 | 2010-05-26 | 希托斯生物技术股份公司 | 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列 |
AU2003250106B2 (en) | 2002-07-18 | 2009-11-26 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
SI1524994T1 (sl) | 2002-07-19 | 2011-08-31 | Cytos Biotechnology Ag | Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe |
EP1549140A4 (en) * | 2002-09-03 | 2009-04-29 | Kentucky Bioproc Llc | PRODUCTION OF PEPTIDES IN PLANTS IN THE FORM OF HYBRID VIRAL HULL PROTEINS |
US20060210588A1 (en) * | 2003-03-26 | 2006-09-21 | Cytos Biotechnology Ag | Hiv-peptide-carrier-conjugates |
EP1606398A1 (en) | 2003-03-26 | 2005-12-21 | Cytos Biotechnology AG | Melan-a peptide analogue-virus-like-particle conjugates |
US7537767B2 (en) | 2003-03-26 | 2009-05-26 | Cytis Biotechnology Ag | Melan-A- carrier conjugates |
WO2005005614A2 (en) * | 2003-07-03 | 2005-01-20 | Pecos Labs, Inc. | Combined b-cell and t-cell epitopes on vlp for improved vaccines |
WO2005068639A2 (en) * | 2004-01-20 | 2005-07-28 | Cytos Biotechnology Ag | Particle-induced ghrelin immune response |
WO2005091753A2 (en) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Large Scale Biology Corporation | Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform |
WO2005117963A1 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Cytos Biotechnology Ag | Medical uses of carrier conjugates of non-human tnf-peptides |
WO2005117983A2 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-15 | Cytos Biotechnology Ag | Carrier conjugates of tnf-peptides |
DE102004036913A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-02-09 | Responsif Gmbh | Verwendung von Pentameren zur Herstellung eines Medikaments |
EP1812051A2 (en) | 2004-10-05 | 2007-08-01 | Cytos Biotechnology AG | Vlp-antigen conjugates and their uses as vaccines |
CN101119749A (zh) | 2004-10-25 | 2008-02-06 | 赛托斯生物技术公司 | 肠抑胃肽(gip)抗原阵列及其用途 |
GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
EP1868642B1 (en) * | 2005-03-18 | 2013-05-08 | Cytos Biotechnology AG | Cat allergen fusion proteins and uses thereof |
LT5414B (lt) * | 2005-04-13 | 2007-04-25 | Biotechnologijos Institutas | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu |
EP1896068A1 (en) * | 2005-06-14 | 2008-03-12 | Cytos Biotechnology AG | Antigen conjugates and uses thereof |
ES2310062B1 (es) * | 2005-07-15 | 2009-11-13 | Bionostra, S.L. | Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
EP1934335A4 (en) * | 2005-09-08 | 2010-05-05 | Large Scale Biology Corp | MODIFIED TOBACCO MOSAIC VIRUS PARTICLES AS MEDIA FOR THE DISPOSAL OF PROTEIN ANTIGENS FOR VACCINE APPLICATIONS |
US20110027220A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-03 | Cytos Biotechnology Ag | Interleukin-1 Conjugates and Uses Thereof |
JP5484732B2 (ja) | 2005-12-14 | 2014-05-07 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | 過敏症の治療のための免疫賦活性核酸パッケージ粒子 |
ES2427994T3 (es) | 2006-06-12 | 2013-11-05 | Cytos Biotechnology Ag | Procesos para empaquetar oligonucleótidos en partículas de tipo viral de bacteriófagos de ARN |
EP2125854B1 (en) | 2006-12-12 | 2016-10-26 | Kuros Biosciences AG | Oligonucleotides containing high concentrations of guanine monomers |
EP2012122A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-07 | Medigene AG | Mutated parvovirus structural proteins as vaccines |
WO2008145400A2 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Medigene Ag | Mutated structural protein of a parvovirus |
WO2009009430A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Diagnosing and protecting horses against papillomavirus |
EP2062592A1 (en) * | 2007-11-20 | 2009-05-27 | BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND letztvertreten durch das Robert Koch-Institut vertreten durch seinen Präsidenten | System for delivery into a XCR1 positive cell and uses thereof |
JP5209800B2 (ja) | 2008-12-09 | 2013-06-12 | ファイザー バクシーンズ エルエルシー | IgECH3ペプチドワクチン |
NZ618391A (en) | 2009-07-30 | 2015-07-31 | Pfizer Vaccines Llc | Antigenic tau peptides and uses thereof |
PT2473605T (pt) | 2009-09-03 | 2018-05-28 | Pfizer Vaccines Llc | Vacina pcsk9 |
WO2011033493A1 (en) | 2009-09-21 | 2011-03-24 | Conservatoire National des Arts et Métiers | Carrier conjugates of il-23-peptides and their induced antibodies |
EP2575868A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
EP2755677B1 (en) * | 2011-09-15 | 2020-11-04 | Medigene AG | Anti-her2 vaccine based upon aav derived multimeric structures |
EP2948469A4 (en) | 2013-01-23 | 2016-11-02 | Univ Leland Stanford Junior | STABILIZED HEPATITIS B CORE POLYPEPTIDE |
WO2015017280A1 (en) | 2013-07-28 | 2015-02-05 | Qantu Therapeutics, Inc. | Vaccine formulations that induce a th2 immune response |
EP3104877B1 (en) | 2014-02-11 | 2020-01-22 | The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Pcsk9 vaccine and methods of using the same |
EP3368068B1 (en) | 2015-10-30 | 2020-11-18 | University of Copenhagen | Virus like particle with efficient epitope display |
MX2022004825A (es) | 2019-10-23 | 2022-10-10 | Regeneron Pharma | Agonistas sintéticos del receptor similar a rig i. |
WO2022140655A1 (en) * | 2020-12-23 | 2022-06-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Single-molecule electronic multiplex nanopore immunoassays for biomarker detection |
WO2023235410A2 (en) * | 2022-06-01 | 2023-12-07 | The Regents Of The University Of California | Multivalent display of apoai peptide on nanoparticles against atherosclerosis |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5143726A (en) | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
GB8903313D0 (en) | 1989-02-14 | 1989-04-05 | Wellcome Found | Conjugates |
US5714374A (en) * | 1990-09-12 | 1998-02-03 | Rutgers University | Chimeric rhinoviruses |
GB9114003D0 (en) | 1991-06-28 | 1991-08-14 | Mastico Robert A | Chimaeric protein |
JPH0519914A (ja) * | 1991-07-17 | 1993-01-29 | Sharp Corp | 半導体装置の内部降圧回路 |
KR940008286B1 (ko) * | 1991-08-19 | 1994-09-09 | 삼성전자 주식회사 | 내부전원발생회로 |
CH684782A5 (de) | 1992-01-27 | 1994-12-30 | Rolf M Zinkernagel C O Inst Fu | Antigen zur Auslösung von CD8+ Zellimmunantworten. |
KR950008453B1 (ko) * | 1992-03-31 | 1995-07-31 | 삼성전자주식회사 | 내부전원전압 발생회로 |
US5618536A (en) | 1992-09-03 | 1997-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric papillomavirus-like particles |
US5437951A (en) | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
CA2145063A1 (en) | 1992-09-22 | 1994-03-31 | Cambridge Genetics Limited | Recombinant viruses displaying a nonviral polypeptide on their external surface |
DK96493D0 (da) | 1993-08-26 | 1993-08-26 | Mouritsen Og Elsner Aps | Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden |
US5721485A (en) * | 1996-01-04 | 1998-02-24 | Ibm Corporation | High performance on-chip voltage regulator designs |
AU2678097A (en) | 1996-04-16 | 1997-11-07 | Immusol Incorporated | Targeted viral vectors |
KR100224669B1 (ko) * | 1996-12-10 | 1999-10-15 | 윤종용 | 내부 전원 전압 발생기 회로 |
US6171591B1 (en) * | 1997-12-08 | 2001-01-09 | Pentamer Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant nodavirus compositions and methods |
JPH11231954A (ja) * | 1998-02-16 | 1999-08-27 | Mitsubishi Electric Corp | 内部電源電圧発生回路 |
DE19827457C1 (de) | 1998-06-19 | 2000-03-02 | Medigene Ag | Strukturprotein von AAV, seine Herstellung und Verwendung |
EP0994403B1 (en) * | 1998-10-15 | 2003-05-21 | Lucent Technologies Inc. | Current mirror |
JP4486257B2 (ja) | 1998-10-21 | 2010-06-23 | アメリカ合衆国 | 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 |
DK1135162T3 (da) | 1998-11-30 | 2009-01-19 | Cytos Biotechnology Ag | Ordnet molekylær præsentation af allergener, fremstillingsfremgangsmåde samt anvendelse |
US6373754B1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-04-16 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Semiconductor memory device having stable internal supply voltage driver |
US20060210687A1 (en) * | 2002-11-06 | 2006-09-21 | Fiberstar, Inc. | Enhanced crackers, chips, wafers and unleavened using highly refined cellulose fiber ingredients |
-
1999
- 1999-10-20 JP JP2000577627A patent/JP4486257B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-20 WO PCT/US1999/024548 patent/WO2000023955A1/en active IP Right Grant
- 1999-10-20 DE DE69929232T patent/DE69929232T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-20 EP EP99970772A patent/EP1123114B1/en not_active Revoked
- 1999-10-20 CA CA2347411A patent/CA2347411C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-20 AU AU12143/00A patent/AU770802B2/en not_active Expired
- 1999-10-20 ES ES99970772T patent/ES2258869T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-20 AT AT99970772T patent/ATE314095T1/de not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-13 US US09/835,124 patent/US6719978B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-24 US US10/253,443 patent/US20030072753A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-06-14 US US10/867,119 patent/US7371572B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-05-01 US US11/415,611 patent/US7479280B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-03-18 US US12/050,892 patent/US7875450B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7479280B2 (en) | 2009-01-20 |
CA2347411A1 (en) | 2000-04-27 |
CA2347411C (en) | 2012-04-03 |
DE69929232T2 (de) | 2006-08-31 |
US20020081295A1 (en) | 2002-06-27 |
US7371572B2 (en) | 2008-05-13 |
US6719978B2 (en) | 2004-04-13 |
WO2000023955A1 (en) | 2000-04-27 |
AU1214300A (en) | 2000-05-08 |
US20080175853A1 (en) | 2008-07-24 |
EP1123114B1 (en) | 2005-12-28 |
JP2002528393A (ja) | 2002-09-03 |
AU770802B2 (en) | 2004-03-04 |
DE69929232D1 (de) | 2006-02-02 |
US7875450B2 (en) | 2011-01-25 |
US20030072753A1 (en) | 2003-04-17 |
US20060210587A1 (en) | 2006-09-21 |
EP1123114A1 (en) | 2001-08-16 |
WO2000023955A8 (en) | 2000-06-22 |
ES2258869T3 (es) | 2006-09-01 |
US20040228798A1 (en) | 2004-11-18 |
ATE314095T1 (de) | 2006-01-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4486257B2 (ja) | 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子 | |
ES2213754T3 (es) | Particulas quimericas de tipo papilomavirus. | |
JP2002528393A5 (ja) | ||
CZ20001244A3 (en) | Vaccine containing capsomeres of human papillomavirus, treatment method and prevention of HPV infections | |
US7691386B2 (en) | Chimeric papillomavirus-like particles | |
EP1637166A2 (en) | Virus-like particles for the induction of autoantibodies | |
AU717647B2 (en) | Chimeric papillomavirus-like particles | |
AU717932B2 (en) | Chimeric papillomavirus-like particles | |
CA2201601C (en) | Chimeric papillomavirus-like particles | |
Greenstone | Chimeric papillomavirus virus-like particles: A biochemical and immunological characterization |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061017 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061017 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090915 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091215 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100302 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100326 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4486257 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130402 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130402 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140402 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |