JP4475487B2 - Ｈｉｖの核局在化阻害剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、抗HIV 抗感染治療活性を有し、かつHIV プレインテグレーション複合体（HIV preintegration complex）の核局在化を阻害する群の化合物類と組成物類を提供するものである。
【０００２】
従来の技術
この十年間で、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（HIV-1 ）の感染率は世界的な流行を示す比率になっている。サハラ砂漠以南のアフリカにおいてHIV-1 に感染したヒトの人数が著しく増大しているのに加え、欧州や北米でも新たな感染が著しく増大している。タイやマレーシアなどの東南アジア諸国におけるHIV-1 の出現も同様に重大事である。現在の感染率に基づいて、東南アジアは、近い将来、世界の汚染地域として、アフリカを追い越すかもしれないと推定されている。このように、HIV-1 の感染とAIDSの発生は衰えることなく続いている。保護ワクチンがないので、感染後の治療法としては、保健医療プロバイダーが利用できる治療手段しかない。
【０００３】
長期間にわたって疾状が進行しない患者（non-progressor）が確認されたので、HIV-1 の感染症を治療して、感染後に疾患が発症するのを遅らせることができるかもしれないということが強く示唆された。今日、HIV-1 の治療法の主な標的になっているのは、ウイルスの生活環にとって重要なウイルス酵素、逆転写酵素（ＲＴ）およびプロテアーゼである。これら各酵素の阻害剤は、患者内のウイルス量を減らすのに成功して CD4+ T リンパ球サブセットを増大したので、HIV 感染症を治療するのに使用される市販の薬物になっている。
【０００４】
これらのエンドポイント（end point ）はともに、治療後の病状が有望であろうと予想されることと十分な関連があることが分かっている。各種の方式で、ＲＴ阻害剤とプロテアーゼ阻害剤をともに利用する多剤治療法によって、血液中を循環するウイルスが検出可能なレベル未満まで低下したことは重要である。これらの臨床試験結果は、HIV-1 の感染とAIDSの持続療法を実現できることを示した。
【０００５】
しかし、適用される抗ウイルス剤に対し耐性のウイルス分離株の出現と、一クラスの阻害剤類内の複数薬剤に対する交差耐性の出現が予想されるので、多剤療法の利用は制限される。これらの予想結果は、新規な薬剤の開発を続け、かつウイルス酵素以外の新規の標的の確認を続ける必要があることを強く示した。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルス１型などのレンチウイルス類は、一次マクロファージ類（Gendelman ら、J.Virol., 58巻67〜74頁1986年；Gartner ら、Science 、233 巻215 〜219 頁1986年）、一次血液樹状細胞（Langhoffら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、88巻998 〜8002頁1991年）および表皮のランゲルハンス細胞（Ramazzottiら、Immunology、85巻94〜98頁1995年）などの一時的に分化する非***細胞（non-dividing terminally differentiated cell ）に感染する。
【０００７】
この感染は、ウイルスゲノムが組み込まれているHIV-1 のプレインテグレーション複合体（preintegration complex）(PIC）の、非***細胞の核膜を横切って行われる能動輸入（active importation）によって促進される（Bukrinsky ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、89巻6580〜6584頁1992年；Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年；およびvon Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年）。
【０００８】
その上に、HIV-1 は、核膜の溶解が起こるＭ期の前およびそのＭ期を含む細胞周期のすべてのステップにおいて、活性化された一次Ｔ細胞に増殖性感染を行うことができる。したがって、能動核輸入が行われれば、細胞***は不要になるので、HIV-1 は、レトロウイルスの通常の標的である増殖性細胞（Lewis ら、EMBO J., 11 巻3053〜3058頁1992年）のみならず非増殖性細胞にも感染することができる（Roe ら、EMBO J., 12 巻2099〜2108頁1993年；およびLewis とEmerman, J.Virol., 68 巻510 〜516 頁1994年）。
【０００９】
PIC は、ウイルスのゲノムRNA に加えて、ｇａｇ由来のマトリックス抗原タンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、逆転写酵素（ＲＴ）インテグラーゼ（ＩＮ）およびウイルスタンパク質“r"（vpr ）で構成されている。新生cDNAの逆転写と産生は、核移行の前に、感染した標的細胞の細胞質内のPIC と関連して完了する。HIV-1 のPIC がカリオフェリン（Karyophe rin）と会合し、この細胞タンパク質が能動核輸入に関与しているということが最近報告された（Gallayら、J.Virol., 70巻1027〜1032頁1996年；およびPopov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）（Adam, Trends Biol., ５巻189 〜191 頁1995年に概説されている）。
【００１０】
カリオフェリンαは、標的タンパク質に、これらタンパク質の核局在化配列（NLS ）を通じて結合するが、カリオフェリンβは、カリオフェリンα−標的タンパク質複合体の核膜孔構造体へのドッキングを仲介する（Raduら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、92巻1769〜1773頁1995年；Moroianuら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、92巻2008〜2011頁1995年；Goerlichら、Nature (London) 、377 巻246 〜248 頁1995年；AdamとGerace, Cell、66巻837 〜847 頁1991年；GoerlichとMattaj, Science 、271 頁1513〜1518頁1996年；およびHurt.Cell 、84巻509 〜515 頁1996年）。
【００１１】
HIV-1 のマトリックス抗原タンパク質は、一つの確定された（K26KKYK)NLS と一つの推定の（K110SKKK) NLS を含有し、PIC 内の主存カリオフィリン構造体（Karyophilic structure ）である（Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年；von Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年；Gallayら、J.Virol., 70巻1027〜1032頁1996年；およびBukrinsky ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、90巻6125〜6129頁1993年）。
【００１２】
前記二種のMA NLSのいずれかと結合して含有する合成ペプチドは、両者ともに、Ｂ細胞およびＴ細胞の溶解物中に存在するカリオフェリンαを識別した（Nadlerら、J.Biol.Chem., 272 巻4310〜4315頁1997年）。MAのKKKYK NLS の突然変異は、単独でまたはVpr の欠失と組み合わせて、HIV-1 PIC の核輸入を減らし、成長阻害Ｔ細胞培養物（Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年）および CD4+ HeLa細胞の培養物（Emerman ら、Nature (London) 、365 巻107 〜108 頁1994年）のみならずマクロファージの初代培養物（von Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年；Heizinger ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻7311〜7315頁1992年）への感染を阻害した。
【００１３】
また、KKKYK NLS 内の一つのアミノ酸が置換された場合も、HIV-1 PIC の、生体外での酵母カリオフェリンαとの結合が低下したので（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）、PIC のカリオフェリンαとの結合すなわち核輸入と、非***細胞内でのウイルスの複製との関連を示している。
【００１４】
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、抗HIV 抗感染治療活性を有し、かつHIV プレインテグレーション複合体の核局在化を阻害する化合物類と医薬組成物類を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明は、下記式Ｉ：
【００１５】
【化３】
【００１６】
〔式中、Ａは、独立して、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルであり；Ｙは−Ｓ−Ａであり（Ａは独立して上記定義のとおりである）；そしてＺおよびＸは、独立してＨ，−（ＣＨ2)n −ＮＨ2 （ｎは０〜６の整数である）、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルまたはＣ1-6 アルコキシである〕で表される化合物を提供するものである。好ましくは、Ａはメチルであり、Ｘは−ＮＨ2 であり、そしてＺはＨもしくはアミノである。本発明はさらに、医薬として許容できる担体中に、式Ｉで表される化合物を含有してなる医薬組成物を提供するものである。
【００１７】
本発明は、さらに、
（ａ）塩化アセチルを短鎖アルコールに溶解した溶液を準備し；
（ｂ）上記溶液に、置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンおよび３，５−ジアシルアニリンを添加して、混合物をつくり；
（ｃ）上記混合物を還流して、上記アニリン誘導体を、上記ピリミジン誘導体の６位に結合させ；次いで
（ｄ）得られた混合物を乾燥して、式Ｉで表される固体の最終生成物を得る；
工程を含んでなる、式Ｉで表される化合物の合成方法を提供するものである。好ましくは、上記置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンは４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジンであり、そして上記３，５−ジアシルアニリンは３，５−ジアセチルアニリンである。
【００１８】
発明の実施の形態
本発明は、下記式Ｉ：
【化４】
【００１９】
〔式中、Ａは独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルであり；Ｙは−Ｓ−Ａであり（Ａは独立して上記定義のとおりである）；そしてＺおよびＸは独立してＨ，−（ＣＨ2)n −ＮＨ2 （ｎは０〜６の整数である）、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルまたはＣ1-6 アルコキシである〕で表される化合物を提供するものである。好ましくは、Ａはメチルであり、Ｘは−ＮＨ2 でありそしてＺはＨもしくはアミノである。本発明は、さらに、医薬として許容できる担体中に、式Ｉで表される化合物を含有してなる医薬組成物を提供するものである。
【００２０】
本発明は、さらに、
（ａ）塩化アセチルを短鎖アルコールに溶解した溶液を準備し；
（ｂ）上記溶液に、置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンおよび３，５−ジアシルアニリンを添加して、混合物をつくり；
（ｃ）上記混合物を還流して、上記アニリン誘導体を、上記ピリミジン誘導体の６位に結合させ；次いで
（ｄ）得られた混合物を乾燥して、式Ｉで表される固体の最終生成物を得る；
ステップを含んでなる、式Ｉで表される化合物の合成方法を提供するものである。好ましくは、上記置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンは４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジンであり、そして上記３，５−ジアシルアニリンは３，５−ジアセチルアニリンである。
【００２１】
本発明は、不可欠の硫黄含有置換基（式Ｉにおける“Ｙ”を参照）をつくることによって、HIV の感染を阻止するのに有効な小さな有機分子の構造を改良するものである。この置換基の存在は、他のHIV 阻害剤には開示も示唆もされていないが、細胞への吸収が改良された特性を有する化合物を提供し、その結果、他のHIV プレインテグレーション複合体阻害剤の構造には開示も示唆もされていない改良された効力を提供する。
【００２２】
本発明の化合物は、末梢血単核細胞（PBMC）培養物が感染した際の、受容体依存性の核内への輸入を阻害するのに有効であった。化合物のcni-h0294 は、MA NLS中の隣接するリシン残基と部分シツフ塩基を形成することによって、HIV-1 PIC （プレインテグレーション複合体）と相互作用を行うと考えられ（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年；Dubrovsky ら、Molec.Med., １巻217 〜230 頁1995年）、その置換されたピリミジン部分に陽電荷を有し、これはこの化合物の細胞の生物学的利用率と経口吸収特性を制限する働きをする。
【００２３】
cni-h0294 が、HIV PIC と酵母カリオフェリンαの会合を妨害すること（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）およびマクロファージの初代培養物が、マクロファージ親和性分離株（macrophage tropic isolate ）のHIV ADA （IC50＝10nM〜50nM）に感染するのを有効に阻害すること（Dubrovsky ら、Molec.Med., １巻217 〜230 頁1995年）はすでに報告されている。
【００２４】
治療剤は、PIC 阻害剤として有効であるためには、細胞内で作用しなければならないことに留意すべきである。したがって、効力は、細胞の生物学的利用率に比例する。さらに、長期間にわたってHIV 感染症を治療するのに好ましい投与経路は、患者の服薬遵守を高めるために経口の経路である。したがって、HIV 抗感染化合物は、経口で投与されかつ経口による生物学的利用率が高いことが大いに要望されている。
【００２５】
化合物の合成
代表的な化合物である２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン（化合物５３）を合成した。化合物５３を合成するのに２種類の方法がある。第一の方法は、塩化アセチル（0.8ml 、11mmol）を、無水アルコール６０mlに添加することによって開始される。その混合物を１５分間撹拌して、塩酸エタノール（hydrochloric ethanol）溶液を生成させる。次に、1.75g(10mmol）の４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジン（Aldrich ）と３，５−ジアセチルアニリン（１．８ｇ、１０mmol）を続けて添加した。
【００２６】
その反応混合物を２４hr還流し、最終的に褐色に変色させた。エタノールを蒸発させて乾固し、次いで20mlのCHCl3 を残留物（灰色の固体）に添加して分離した。前記灰色の固体を濾過し、乾燥して1.7gの粗生成物を得た。TLC （薄層クロマトグラフィー）による分析結果は、未反応の出発材料がCHCl3 層中に残っていることを示した。約0.5gの粗生成物をメタノールで再結晶して、分析の結果純品の試料 370mg（収率39.8％）を得た。
【００２７】
製品化合物５３の第二の製造法がある。具体的に述べると、４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジン（１mmol）と３，５−ジアセチルアニリン（1.1mmol ）を５mlのH2O 中に含有する混合物に、HCl(90μl ）を添加した。得られた反応混合物を、90〜100 ℃で１hr加熱し次に氷浴中で冷却した。1N KOH 2mlを添加して、前記酸を中和した。得られた混合物を１０分間撹拌したところ、沈澱が生成し、その沈澱を濾別して、285mg の乾燥した淡褐色の粗生成物（収率90％）を得た。TLC 分析（MeOH：CH2Cl2＝10:0.6）の結果は、純品生成物の一つのスポットだけを示した。メトキシエタノール溶液から再結晶して、分析した結果純品の生成物267mg （収率84.5％）を得た。再結晶生成物を減圧乾燥（78℃）させて融点が264.8 ℃〜268.6 ℃の生成物を得た。
【００２８】
化合物５３の分析規格は、分子量が316.4 でC15H16N4O2S である。さらに、1HNMR (DMSO-d6、270MHz）はδ2.46（s, 3H, SMe），2.6 (s, 6H, 2COCH3），5.52（s, 1H, C3-H ），6.52（brs, 2H, NH2），8.01（s, 1H, Ar-H ），8.45（s, 2H, Ar-H ），9.41（s, 1H, NH ）である。さらに、最終生成物を分析して、元素分析の実測値と元素分析の計算値を比較した結果は次のとおりであった。
計算値：C56.94 H5.10 N17.17 S10.14
実測値：C56.84 H4.99 N17.55 S10.18
【００２９】
803mg (5mmol）の２−メチルメルカプト−４−クロロピリミジンと８８６mg（５mmol）の３，５−ジアセチルアニリンを、２０mlの水中で混合することによって、例示化合物６２〔２−メチルメルカプト−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕を合成した。次に、０．４２mlの濃塩酸を添加した。この反応混合物を、90〜100 ℃で４hr加熱し、次に氷浴中で冷却した。冷却された混合物に５mlの1N KOHを添加して、前記HCl 由来の酸性pHを中和した。得られた混合物を、氷浴中で１０分間撹拌して、沈澱を生成させた。
【００３０】
その沈澱を濾別して、乾燥した淡褐色の粗生成物1.44ｇを得た。メタノール：CH2 Cl2 (1：25) の薄層クロマトグラフィー（TLC ）の分析結果は、１スポットだけを示した。その粗沈澱をメトキシエタノールから再結晶して、減圧乾燥し、1.42ｇの純品の２−メチルメルカプト−４−（３′，５′ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン（化合物６２）を、全収率９４％で得た。NMR 分析の結果、分子量が301.38の式C15H15N3O2S が確認された。
計算値：C59.78 H5.02 N13.94 S10.64
実測値：C59.32 H4.80 N13.81 S10.34
【００３１】
医薬配合物
本発明の医薬複合体または本発明の医薬混合物は、それ自体（複合体または混合物）によって、またはその複合体もしくは混合物が適切な担体および賦形剤と混合されてなる医薬組成物によって、患者に投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、静脈内注射もしくは注入、腹腔内注射、皮下注射または筋肉内注射などによって、非経口投与を行うことができる。
【００３２】
本発明の化合物または医薬組成物は、担体と賦形剤を用いて適当に配合して、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などをつくり、経口または直腸を通じて投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、例えば皮膚パッチによって局所に投与して、有効薬剤の一定の全身レベルを達成することができる。本発明の化合物または組成物を配合して、皮膚もしくは粘膜の表面に局所塗布するのに適切な、局所用クリーム剤、皮膚もしくは粘膜用のパッチ、液剤またはゲル剤をつくることができる。本発明の化合物または医薬組成物は、HIV 感染症の局所治療もしくは全身治療を行うため、気道に、吸入器で投与することができる。
【００３３】
本発明で使用するのに適切な本発明の化合物または医薬組成物の投与量を、当業技術者は、本明細書の開示に基づいて決定することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の化合物または医薬組成物の有効投与量（投与経路および有効薬物の薬物動態によって決まる）および配合物の特定の投与経路（すなわち、経口、非経口、局所または吸入の経路）に適した医薬担体および賦形剤を含有している。有効化合物は、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠の製造・乳化、カプセルへの充填、包括または凍結乾燥によって、医薬配合物に混合される。非経口投与用の本発明の配合物としては、有効複合体の水溶液または水溶性の形態の混合物がある。
【００３４】
さらに、有効化合物の懸濁剤も、油状注射懸濁液として製造できる。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームがある。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの物質を含有していてもよい。この懸濁液は、安定剤、または本発明の複合体または混合物の可溶性を高めて一層高濃度の溶液を得ることができる薬剤を、任意に含有していてもよい。
【００３５】
経口投与用医薬配合物は、有効化合物を、固体の賦形剤、例えば糖類（例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース製剤（例えば澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゼラチン、ガム類またはポリビニルピロリドンと混合することによって得ることができる。その上に、崩壊剤を添加してもよく、そして安定剤を添加してもよい。
【００３６】
実施例
実施例１
この実施例は、本発明の化合物類の治療に役立つ効用を示す、HIV 感染症の治療の予想モデルの生体外実験をいくつか例示する。Schumandtmanesallaら（Virology 1997 年）が述べているようにして単離し精製したマクロファージに、HIV-1 を、ｐ２４コンテント（10ng p24／106 細胞）によって調節した感染多重度で感染させた。
【００３７】
化合物（図１は化合物５３および図２は化合物６２を示す）を各種の濃度で添加した。さらに、陽性対照の化合物２（図１では“CNI-H294”と呼称し、図２では“cni-h0294 ”と呼称している）を指定濃度で添加した。２hrインキュベートしてウイルスを吸着させた後、過剰のウイルスを洗い流し、次いでマクロファージを指定の期間インキュベートした後、分析した。ＲＴすなわち逆転写酵素の活性を７日後〜１１日後に、標準法で測定した。
【００３８】
図１は、Ｈ９細胞培養によって抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物５３の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた必要な硫黄基を欠いている、構造が類似の化合物（“化合物２”と比較したグラフを示す。上記検定法は、感染したマクロファージ培養物の上澄み液の逆転写酵素活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、HIV 感染症を治療する効力と直接関連づけることができる。これらのデータは、本発明の化合物５３が、構造の類似している化合物２より効力が高いことを示している。
【００３９】
図２は、マクロファージ培養で抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物６２の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組みこまれた必要な硫黄基を欠いている、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較したグラフを示す。この検定法は、感染したＨ９細胞の培養物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、HIV 感染症を治療する効力に直接関連づけることができる。これらのデータは、本発明の化合物６２が有効な抗HIV 抗感染剤であったことを示している。
【００４０】
実施例２
この実施例は、抗CD3 モノクローナル抗体および抗CD28モノクローナル抗体で活性化された、急性感染PBMC培養物中で、化合物６２がHIV-1 ウイルスの複製を阻害したことを例示する（図３）。末梢血単核細胞を、未感染個体から単離し、次いでSmithgall ら、J.Immunol., 156 巻2324〜2330頁1996年に記載された方法にしたがって、CD8 特異的モノクローナル抗体を使用して、 CD8+ T リンパ球を枯渇させた。
【００４１】
簡単に述べると、この方法は、抗体が結合した細胞を補体によって溶解する代わりに、磁気ビーズで分離する方法を使用している。残っているPBMC画分を、１０％熱不活性化ヒト血清を補充したRPMI培地内に、2 ×106 細胞1200μl で懸濁させた。細胞は、各種の濃度の化合物６２の存在下、抗CD3mAb（1 μg/ml）および抗CD28mAb(1 μg/ml）によって活性化した。この形態の細胞活性化は、細胞集団中の CD3+ T リンパ球を特異的に標的にしている。
【００４２】
細胞は、ウイルスの接種物を添加する前に、２〜３時間、抗体および試験化合物で前処理した。この実験で使用したウイルスのHIV-1 M1は、患者由来の分離株であり、約5TCID50 の感染多重度（MOI ）で使用した。２時間インキュベートしてウイルスを吸着させた後、前記細胞を洗浄して前記ウイルス接種物を除き、次に、抗CD3mAbと抗CD28mAb および各種濃度の化合物６２（投与量−応答の関連を示すため）を補充した培地200ml 中に再び懸濁させた。次に、細胞を、1.5 ×105 細胞／ウェルで、４〜６回ずつ反復して、Ｕ形底ウェル９６個付き培養プレートに入れた。p24 産生量を終点として使用し、ウイルス産生量を、感染してから６〜１０日後に測定した。上記ｐ２４抗原捕獲検定法は製造業者の指示にしたがって実施した。
【００４３】
図３に示したデータは、化合物62（“CNI-H6297 ”）の濃度が0,0.01μM および1.0 μM の場合の投与量−応答の関係を、ウイルス濃度の尺度としてp24 を用いて示している。
また、化合物６２は、HIV-1 に感染した個体由来のPBMCが、生体外で、抗CD3mAbによって活性化されると、そのPBMC内でウイルスが複製するのを阻害した。血清学的に陽性の個体由来のPBCMを集めて、先に述べたようにして CD8+ T リンパ球を涸渇させた。
【００４４】
細胞を、培地中に懸濁させ次いで抗CD3mAb（1 μg/ml）で活性化した。６〜１０日後に、培地上澄み液のｐ２４のレベルを測定し、処理された培地を、未処理培地と比較することによって、ウイルス産生量を測定した。図４は、HIV 抗感染特性の上記予測検定法の上記実験条件下での、化合物62（“CNI-H6297 ”）の投与−応答の関係を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マクロファージ培養物の抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物５３〔２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕の抗ＨＩＶ治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた規定の硫黄基を欠いていることによって本発明の化合物５３と異なっている、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較するグラフを示す。この検定法は、感染したマクロファージ培養 物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、本発明の化合物５３が、構造が類似している化合物２より効力が高かったことを示している。
【図２】 図２は、マクロファージ培養物の抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物６２〔２−メチルメルカプト−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた規定の硫黄基を欠いていることによって本発明の化合物６２と異なる、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較するグラフを示す。この検定法は、感染したマクロファージ培養物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、本発明の化合物６２が、有効な抗HIV 抗感染剤であったことを示している。
【図３】 図３は、HIV-1 ウイルスに感染させて（またＣＤ３モノクローナル抗体と抗CD28モノクローナル抗体で）活性化した末梢血単核細胞（PBMC）培養物を、異なる濃度の化合物62（μM ）で処理した場合の化合物６２の治療効力のさらなる分析結果を示す。この検定法は、p24 をウイルスの複製の指標として測定するので、HIV 感染症を治療する効力に直接関連づけることができる。これらのデータは、化合物６２の抗ウイルス効力を、投与量−応答の関係で示す。
【図４】 図４は、HIV-1 に感染した個体由来のPBMCを、抗CD3mAbで、生体外にて活性化した場合のPBMC内でのウイルスの複製も、化合物６２が阻害したことを示す。血清学的に陽性の個体からPBMCを収集し、上記のようにして CD8+ T リンパ球を涸渇させた。細胞を、培地中に懸濁させ次いで抗CD3mAb（1 μg/ml）で活性化した。６〜１０日後に、培養物の上澄み液のp24 のレベルを測定して、処理済培養物を未処理培養物と比較することによって、ウイルス産生量を測定した。図４は、HIV 抗感染特性の上記予測検定法の上記実験条件下での化合物62（“cni-h6297 ”）の投与量−応答の関係を示す。
発明の属する技術分野
本発明は、抗HIV 抗感染治療活性を有し、かつHIV プレインテグレーション複合体（HIV preintegration complex）の核局在化を阻害する群の化合物類と組成物類を提供するものである。
【０００２】
従来の技術
この十年間で、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（HIV-1 ）の感染率は世界的な流行を示す比率になっている。サハラ砂漠以南のアフリカにおいてHIV-1 に感染したヒトの人数が著しく増大しているのに加え、欧州や北米でも新たな感染が著しく増大している。タイやマレーシアなどの東南アジア諸国におけるHIV-1 の出現も同様に重大事である。現在の感染率に基づいて、東南アジアは、近い将来、世界の汚染地域として、アフリカを追い越すかもしれないと推定されている。このように、HIV-1 の感染とAIDSの発生は衰えることなく続いている。保護ワクチンがないので、感染後の治療法としては、保健医療プロバイダーが利用できる治療手段しかない。
【０００３】
長期間にわたって疾状が進行しない患者（non-progressor）が確認されたので、HIV-1 の感染症を治療して、感染後に疾患が発症するのを遅らせることができるかもしれないということが強く示唆された。今日、HIV-1 の治療法の主な標的になっているのは、ウイルスの生活環にとって重要なウイルス酵素、逆転写酵素（ＲＴ）およびプロテアーゼである。これら各酵素の阻害剤は、患者内のウイルス量を減らすのに成功して CD4+ T リンパ球サブセットを増大したので、HIV 感染症を治療するのに使用される市販の薬物になっている。
【０００４】
これらのエンドポイント（end point ）はともに、治療後の病状が有望であろうと予想されることと十分な関連があることが分かっている。各種の方式で、ＲＴ阻害剤とプロテアーゼ阻害剤をともに利用する多剤治療法によって、血液中を循環するウイルスが検出可能なレベル未満まで低下したことは重要である。これらの臨床試験結果は、HIV-1 の感染とAIDSの持続療法を実現できることを示した。
【０００５】
しかし、適用される抗ウイルス剤に対し耐性のウイルス分離株の出現と、一クラスの阻害剤類内の複数薬剤に対する交差耐性の出現が予想されるので、多剤療法の利用は制限される。これらの予想結果は、新規な薬剤の開発を続け、かつウイルス酵素以外の新規の標的の確認を続ける必要があることを強く示した。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルス１型などのレンチウイルス類は、一次マクロファージ類（Gendelman ら、J.Virol., 58巻67〜74頁1986年；Gartner ら、Science 、233 巻215 〜219 頁1986年）、一次血液樹状細胞（Langhoffら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、88巻998 〜8002頁1991年）および表皮のランゲルハンス細胞（Ramazzottiら、Immunology、85巻94〜98頁1995年）などの一時的に分化する非***細胞（non-dividing terminally differentiated cell ）に感染する。
【０００７】
この感染は、ウイルスゲノムが組み込まれているHIV-1 のプレインテグレーション複合体（preintegration complex）(PIC）の、非***細胞の核膜を横切って行われる能動輸入（active importation）によって促進される（Bukrinsky ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、89巻6580〜6584頁1992年；Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年；およびvon Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年）。
【０００８】
その上に、HIV-1 は、核膜の溶解が起こるＭ期の前およびそのＭ期を含む細胞周期のすべてのステップにおいて、活性化された一次Ｔ細胞に増殖性感染を行うことができる。したがって、能動核輸入が行われれば、細胞***は不要になるので、HIV-1 は、レトロウイルスの通常の標的である増殖性細胞（Lewis ら、EMBO J., 11 巻3053〜3058頁1992年）のみならず非増殖性細胞にも感染することができる（Roe ら、EMBO J., 12 巻2099〜2108頁1993年；およびLewis とEmerman, J.Virol., 68 巻510 〜516 頁1994年）。
【０００９】
PIC は、ウイルスのゲノムRNA に加えて、ｇａｇ由来のマトリックス抗原タンパク質（ＭＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、逆転写酵素（ＲＴ）インテグラーゼ（ＩＮ）およびウイルスタンパク質“r"（vpr ）で構成されている。新生cDNAの逆転写と産生は、核移行の前に、感染した標的細胞の細胞質内のPIC と関連して完了する。HIV-1 のPIC がカリオフェリン（Karyophe rin）と会合し、この細胞タンパク質が能動核輸入に関与しているということが最近報告された（Gallayら、J.Virol., 70巻1027〜1032頁1996年；およびPopov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）（Adam, Trends Biol., ５巻189 〜191 頁1995年に概説されている）。
【００１０】
カリオフェリンαは、標的タンパク質に、これらタンパク質の核局在化配列（NLS ）を通じて結合するが、カリオフェリンβは、カリオフェリンα−標的タンパク質複合体の核膜孔構造体へのドッキングを仲介する（Raduら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、92巻1769〜1773頁1995年；Moroianuら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、92巻2008〜2011頁1995年；Goerlichら、Nature (London) 、377 巻246 〜248 頁1995年；AdamとGerace, Cell、66巻837 〜847 頁1991年；GoerlichとMattaj, Science 、271 頁1513〜1518頁1996年；およびHurt.Cell 、84巻509 〜515 頁1996年）。
【００１１】
HIV-1 のマトリックス抗原タンパク質は、一つの確定された（K26KKYK)NLS と一つの推定の（K110SKKK) NLS を含有し、PIC 内の主存カリオフィリン構造体（Karyophilic structure ）である（Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年；von Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年；Gallayら、J.Virol., 70巻1027〜1032頁1996年；およびBukrinsky ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、90巻6125〜6129頁1993年）。
【００１２】
前記二種のMA NLSのいずれかと結合して含有する合成ペプチドは、両者ともに、Ｂ細胞およびＴ細胞の溶解物中に存在するカリオフェリンαを識別した（Nadlerら、J.Biol.Chem., 272 巻4310〜4315頁1997年）。MAのKKKYK NLS の突然変異は、単独でまたはVpr の欠失と組み合わせて、HIV-1 PIC の核輸入を減らし、成長阻害Ｔ細胞培養物（Bukrinsky ら、Nature、365 巻666 〜669 頁1993年）および CD4+ HeLa細胞の培養物（Emerman ら、Nature (London) 、365 巻107 〜108 頁1994年）のみならずマクロファージの初代培養物（von Schwedler ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻6992〜6996頁1994年；Heizinger ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、91巻7311〜7315頁1992年）への感染を阻害した。
【００１３】
また、KKKYK NLS 内の一つのアミノ酸が置換された場合も、HIV-1 PIC の、生体外での酵母カリオフェリンαとの結合が低下したので（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）、PIC のカリオフェリンαとの結合すなわち核輸入と、非***細胞内でのウイルスの複製との関連を示している。
【００１４】
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、抗HIV 抗感染治療活性を有し、かつHIV プレインテグレーション複合体の核局在化を阻害する化合物類と医薬組成物類を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明は、下記式Ｉ：
【００１５】
【化３】
〔式中、Ａは、独立して、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルであり；Ｙは−Ｓ−Ａであり（Ａは独立して上記定義のとおりである）；そしてＺおよびＸは、独立してＨ，−（ＣＨ2)n −ＮＨ2 （ｎは０〜６の整数である）、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルまたはＣ1-6 アルコキシである〕で表される化合物を提供するものである。好ましくは、Ａはメチルであり、Ｘは−ＮＨ2 であり、そしてＺはＨもしくはアミノである。本発明はさらに、医薬として許容できる担体中に、式Ｉで表される化合物を含有してなる医薬組成物を提供するものである。
【００１７】
本発明は、さらに、
（ａ）塩化アセチルを短鎖アルコールに溶解した溶液を準備し；
（ｂ）上記溶液に、置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンおよび３，５−ジアシルアニリンを添加して、混合物をつくり；
（ｃ）上記混合物を還流して、上記アニリン誘導体を、上記ピリミジン誘導体の６位に結合させ；次いで
（ｄ）得られた混合物を乾燥して、式Ｉで表される固体の最終生成物を得る；
工程を含んでなる、式Ｉで表される化合物の合成方法を提供するものである。好ましくは、上記置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンは４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジンであり、そして上記３，５−ジアシルアニリンは３，５−ジアセチルアニリンである。
【００１８】
発明の実施の形態
本発明は、下記式Ｉ：
【化４】
〔式中、Ａは独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、または直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルであり；Ｙは−Ｓ−Ａであり（Ａは独立して上記定義のとおりである）；そしてＺおよびＸは独立してＨ，−（ＣＨ2)n −ＮＨ2 （ｎは０〜６の整数である）、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1-6 アルキル、直鎖もしくは分枝鎖のＣ2-6 アルケニルまたはＣ1-6 アルコキシである〕で表される化合物を提供するものである。好ましくは、Ａはメチルであり、Ｘは−ＮＨ2 でありそしてＺはＨもしくはアミノである。本発明は、さらに、医薬として許容できる担体中に、式Ｉで表される化合物を含有してなる医薬組成物を提供するものである。
【００２０】
本発明は、さらに、
（ａ）塩化アセチルを短鎖アルコールに溶解した溶液を準備し；
（ｂ）上記溶液に、置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンおよび３，５−ジアシルアニリンを添加して、混合物をつくり；
（ｃ）上記混合物を還流して、上記アニリン誘導体を、上記ピリミジン誘導体の６位に結合させ；次いで
（ｄ）得られた混合物を乾燥して、式Ｉで表される固体の最終生成物を得る；
ステップを含んでなる、式Ｉで表される化合物の合成方法を提供するものである。好ましくは、上記置換された６−ハロゲン−メチルメルカプトピリミジンは４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジンであり、そして上記３，５−ジアシルアニリンは３，５−ジアセチルアニリンである。
【００２１】
本発明は、不可欠の硫黄含有置換基（式Ｉにおける“Ｙ”を参照）をつくることによって、HIV の感染を阻止するのに有効な小さな有機分子の構造を改良するものである。この置換基の存在は、他のHIV 阻害剤には開示も示唆もされていないが、細胞への吸収が改良された特性を有する化合物を提供し、その結果、他のHIV プレインテグレーション複合体阻害剤の構造には開示も示唆もされていない改良された効力を提供する。
【００２２】
本発明の化合物は、末梢血単核細胞（PBMC）培養物が感染した際の、受容体依存性の核内への輸入を阻害するのに有効であった。化合物のcni-h0294 は、MA NLS中の隣接するリシン残基と部分シツフ塩基を形成することによって、HIV-1 PIC （プレインテグレーション複合体）と相互作用を行うと考えられ（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年；Dubrovsky ら、Molec.Med., １巻217 〜230 頁1995年）、その置換されたピリミジン部分に陽電荷を有し、これはこの化合物の細胞の生物学的利用率と経口吸収特性を制限する働きをする。
【００２３】
cni-h0294 が、HIV PIC と酵母カリオフェリンαの会合を妨害すること（Popov ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 、93巻11859 〜11864 頁1996年）およびマクロファージの初代培養物が、マクロファージ親和性分離株（macrophage tropic isolate ）のHIV ADA （IC50＝10nM〜50nM）に感染するのを有効に阻害すること（Dubrovsky ら、Molec.Med., １巻217 〜230 頁1995年）はすでに報告されている。
【００２４】
治療剤は、PIC 阻害剤として有効であるためには、細胞内で作用しなければならないことに留意すべきである。したがって、効力は、細胞の生物学的利用率に比例する。さらに、長期間にわたってHIV 感染症を治療するのに好ましい投与経路は、患者の服薬遵守を高めるために経口の経路である。したがって、HIV 抗感染化合物は、経口で投与されかつ経口による生物学的利用率が高いことが大いに要望されている。
【００２５】
化合物の合成
代表的な化合物である２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン（化合物５３）を合成した。化合物５３を合成するのに２種類の方法がある。第一の方法は、塩化アセチル（0.8ml 、11mmol）を、無水アルコール６０mlに添加することによって開始される。その混合物を１５分間撹拌して、塩酸エタノール（hydrochloric ethanol）溶液を生成させる。次に、1.75g(10mmol）の４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジン（Aldrich ）と３，５−ジアセチルアニリン（１．８ｇ、１０mmol）を続けて添加した。
【００２６】
その反応混合物を２４hr還流し、最終的に褐色に変色させた。エタノールを蒸発させて乾固し、次いで20mlのCHCl3 を残留物（灰色の固体）に添加して分離した。前記灰色の固体を濾過し、乾燥して1.7gの粗生成物を得た。TLC （薄層クロマトグラフィー）による分析結果は、未反応の出発材料がCHCl3 層中に残っていることを示した。約0.5gの粗生成物をメタノールで再結晶して、分析の結果純品の試料 370mg（収率39.8％）を得た。
【００２７】
製品化合物５３の第二の製造法がある。具体的に述べると、４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジン（１mmol）と３，５−ジアセチルアニリン（1.1mmol ）を５mlのH2O 中に含有する混合物に、HCl(90μl ）を添加した。得られた反応混合物を、90〜100 ℃で１hr加熱し次に氷浴中で冷却した。1N KOH 2mlを添加して、前記酸を中和した。得られた混合物を１０分間撹拌したところ、沈澱が生成し、その沈澱を濾別して、285mg の乾燥した淡褐色の粗生成物（収率90％）を得た。TLC 分析（MeOH：CH2Cl2＝10:0.6）の結果は、純品生成物の一つのスポットだけを示した。メトキシエタノール溶液から再結晶して、分析した結果純品の生成物267mg （収率84.5％）を得た。再結晶生成物を減圧乾燥（78℃）させて融点が264.8 ℃〜268.6 ℃の生成物を得た。
【００２８】
化合物５３の分析規格は、分子量が316.4 でC15H16N4O2S である。さらに、1HNMR (DMSO-d6、270MHz）はδ2.46（s, 3H, SMe），2.6 (s, 6H, 2COCH3），5.52（s, 1H, C3-H ），6.52（brs, 2H, NH2），8.01（s, 1H, Ar-H ），8.45（s, 2H, Ar-H ），9.41（s, 1H, NH ）である。さらに、最終生成物を分析して、元素分析の実測値と元素分析の計算値を比較した結果は次のとおりであった。
計算値：C56.94 H5.10 N17.17 S10.14
実測値：C56.84 H4.99 N17.55 S10.18
【００２９】
803mg (5mmol）の２−メチルメルカプト−４−クロロピリミジンと８８６mg（５mmol）の３，５−ジアセチルアニリンを、２０mlの水中で混合することによって、例示化合物６２〔２−メチルメルカプト−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕を合成した。次に、０．４２mlの濃塩酸を添加した。この反応混合物を、90〜100 ℃で４hr加熱し、次に氷浴中で冷却した。冷却された混合物に５mlの1N KOHを添加して、前記HCl 由来の酸性pHを中和した。得られた混合物を、氷浴中で１０分間撹拌して、沈澱を生成させた。
【００３０】
その沈澱を濾別して、乾燥した淡褐色の粗生成物1.44ｇを得た。メタノール：CH2 Cl2 (1：25) の薄層クロマトグラフィー（TLC ）の分析結果は、１スポットだけを示した。その粗沈澱をメトキシエタノールから再結晶して、減圧乾燥し、1.42ｇの純品の２−メチルメルカプト−４−（３′，５′ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン（化合物６２）を、全収率９４％で得た。NMR 分析の結果、分子量が301.38の式C15H15N3O2S が確認された。
計算値：C59.78 H5.02 N13.94 S10.64
実測値：C59.32 H4.80 N13.81 S10.34
【００３１】
医薬配合物
本発明の医薬複合体または本発明の医薬混合物は、それ自体（複合体または混合物）によって、またはその複合体もしくは混合物が適切な担体および賦形剤と混合されてなる医薬組成物によって、患者に投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、静脈内注射もしくは注入、腹腔内注射、皮下注射または筋肉内注射などによって、非経口投与を行うことができる。
【００３２】
本発明の化合物または医薬組成物は、担体と賦形剤を用いて適当に配合して、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などをつくり、経口または直腸を通じて投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、例えば皮膚パッチによって局所に投与して、有効薬剤の一定の全身レベルを達成することができる。本発明の化合物または組成物を配合して、皮膚もしくは粘膜の表面に局所塗布するのに適切な、局所用クリーム剤、皮膚もしくは粘膜用のパッチ、液剤またはゲル剤をつくることができる。本発明の化合物または医薬組成物は、HIV 感染症の局所治療もしくは全身治療を行うため、気道に、吸入器で投与することができる。
【００３３】
本発明で使用するのに適切な本発明の化合物または医薬組成物の投与量を、当業技術者は、本明細書の開示に基づいて決定することができる。本発明の医薬組成物は、本発明の化合物または医薬組成物の有効投与量（投与経路および有効薬物の薬物動態によって決まる）および配合物の特定の投与経路（すなわち、経口、非経口、局所または吸入の経路）に適した医薬担体および賦形剤を含有している。有効化合物は、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠の製造・乳化、カプセルへの充填、包括または凍結乾燥によって、医薬配合物に混合される。非経口投与用の本発明の配合物としては、有効複合体の水溶液または水溶性の形態の混合物がある。
【００３４】
さらに、有効化合物の懸濁剤も、油状注射懸濁液として製造できる。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームがある。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの物質を含有していてもよい。この懸濁液は、安定剤、または本発明の複合体または混合物の可溶性を高めて一層高濃度の溶液を得ることができる薬剤を、任意に含有していてもよい。
【００３５】
経口投与用医薬配合物は、有効化合物を、固体の賦形剤、例えば糖類（例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース製剤（例えば澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゼラチン、ガム類またはポリビニルピロリドンと混合することによって得ることができる。その上に、崩壊剤を添加してもよく、そして安定剤を添加してもよい。
【００３６】
実施例
実施例１
この実施例は、本発明の化合物類の治療に役立つ効用を示す、HIV 感染症の治療の予想モデルの生体外実験をいくつか例示する。Schumandtmanesallaら（Virology 1997 年）が述べているようにして単離し精製したマクロファージに、HIV-1 を、ｐ２４コンテント（10ng p24／106 細胞）によって調節した感染多重度で感染させた。
【００３７】
化合物（図１は化合物５３および図２は化合物６２を示す）を各種の濃度で添加した。さらに、陽性対照の化合物２（図１では“CNI-H294”と呼称し、図２では“cni-h0294 ”と呼称している）を指定濃度で添加した。２hrインキュベートしてウイルスを吸着させた後、過剰のウイルスを洗い流し、次いでマクロファージを指定の期間インキュベートした後、分析した。ＲＴすなわち逆転写酵素の活性を７日後〜１１日後に、標準法で測定した。
【００３８】
図１は、Ｈ９細胞培養によって抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物５３の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた必要な硫黄基を欠いている、構造が類似の化合物（“化合物２”と比較したグラフを示す。上記検定法は、感染したマクロファージ培養物の上澄み液の逆転写酵素活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、HIV 感染症を治療する効力と直接関連づけることができる。これらのデータは、本発明の化合物５３が、構造の類似している化合物２より効力が高いことを示している。
【００３９】
図２は、マクロファージ培養で抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物６２の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組みこまれた必要な硫黄基を欠いている、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較したグラフを示す。この検定法は、感染したＨ９細胞の培養物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、HIV 感染症を治療する効力に直接関連づけることができる。これらのデータは、本発明の化合物６２が有効な抗HIV 抗感染剤であったことを示している。
【００４０】
実施例２
この実施例は、抗CD3 モノクローナル抗体および抗CD28モノクローナル抗体で活性化された、急性感染PBMC培養物中で、化合物６２がHIV-1 ウイルスの複製を阻害したことを例示する（図３）。末梢血単核細胞を、未感染個体から単離し、次いでSmithgall ら、J.Immunol., 156 巻2324〜2330頁1996年に記載された方法にしたがって、CD8 特異的モノクローナル抗体を使用して、 CD8+ T リンパ球を枯渇させた。
【００４１】
簡単に述べると、この方法は、抗体が結合した細胞を補体によって溶解する代わりに、磁気ビーズで分離する方法を使用している。残っているPBMC画分を、１０％熱不活性化ヒト血清を補充したRPMI培地内に、2 ×106 細胞1200μl で懸濁させた。細胞は、各種の濃度の化合物６２の存在下、抗CD3mAb（1 μg/ml）および抗CD28mAb(1 μg/ml）によって活性化した。この形態の細胞活性化は、細胞集団中の CD3+ T リンパ球を特異的に標的にしている。
【００４２】
細胞は、ウイルスの接種物を添加する前に、２〜３時間、抗体および試験化合物で前処理した。この実験で使用したウイルスのHIV-1 M1は、患者由来の分離株であり、約5TCID50 の感染多重度（MOI ）で使用した。２時間インキュベートしてウイルスを吸着させた後、前記細胞を洗浄して前記ウイルス接種物を除き、次に、抗CD3mAbと抗CD28mAb および各種濃度の化合物６２（投与量−応答の関連を示すため）を補充した培地200ml 中に再び懸濁させた。次に、細胞を、1.5 ×105 細胞／ウェルで、４〜６回ずつ反復して、Ｕ形底ウェル９６個付き培養プレートに入れた。p24 産生量を終点として使用し、ウイルス産生量を、感染してから６〜１０日後に測定した。上記ｐ２４抗原捕獲検定法は製造業者の指示にしたがって実施した。
【００４３】
図３に示したデータは、化合物62（“CNI-H6297 ”）の濃度が0,0.01μM および1.0 μM の場合の投与量−応答の関係を、ウイルス濃度の尺度としてp24 を用いて示している。
また、化合物６２は、HIV-1 に感染した個体由来のPBMCが、生体外で、抗CD3mAbによって活性化されると、そのPBMC内でウイルスが複製するのを阻害した。血清学的に陽性の個体由来のPBCMを集めて、先に述べたようにして CD8+ T リンパ球を涸渇させた。
【００４４】
細胞を、培地中に懸濁させ次いで抗CD3mAb（1 μg/ml）で活性化した。６〜１０日後に、培地上澄み液のｐ２４のレベルを測定し、処理された培地を、未処理培地と比較することによって、ウイルス産生量を測定した。図４は、HIV 抗感染特性の上記予測検定法の上記実験条件下での、化合物62（“CNI-H6297 ”）の投与−応答の関係を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マクロファージ培養物の抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物５３〔２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕の抗ＨＩＶ治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた規定の硫黄基を欠いていることによって本発明の化合物５３と異なっている、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較するグラフを示す。この検定法は、感染したマクロファージ培養 物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、本発明の化合物５３が、構造が類似している化合物２より効力が高かったことを示している。
【図２】 図２は、マクロファージ培養物の抗HIV 活性を検定する方法で、本発明の化合物６２〔２−メチルメルカプト−６−（３′，５′−ジアセチルフェニル）アミノ−ピリミジン〕の抗HIV 治療活性を、ピリミジン部分に正電荷を有しかつピリミジン部分に組み込まれた規定の硫黄基を欠いていることによって本発明の化合物６２と異なる、構造が類似の化合物（“cni-h0294 ”）と比較するグラフを示す。この検定法は、感染したマクロファージ培養物の上澄み液の逆転写酵素の活性を、ウイルス産生量の尺度として測定する。これらのデータは、本発明の化合物６２が、有効な抗HIV 抗感染剤であったことを示している。
【図３】 図３は、HIV-1 ウイルスに感染させて（またＣＤ３モノクローナル抗体と抗CD28モノクローナル抗体で）活性化した末梢血単核細胞（PBMC）培養物を、異なる濃度の化合物62（μM ）で処理した場合の化合物６２の治療効力のさらなる分析結果を示す。この検定法は、p24 をウイルスの複製の指標として測定するので、HIV 感染症を治療する効力に直接関連づけることができる。これらのデータは、化合物６２の抗ウイルス効力を、投与量−応答の関係で示す。
【図４】 図４は、HIV-1 に感染した個体由来のPBMCを、抗CD3mAbで、生体外にて活性化した場合のPBMC内でのウイルスの複製も、化合物６２が阻害したことを示す。血清学的に陽性の個体からPBMCを収集し、上記のようにして CD8+ T リンパ球を涸渇させた。細胞を、培地中に懸濁させ次いで抗CD3mAb（1 μg/ml）で活性化した。６〜１０日後に、培養物の上澄み液のp24 のレベルを測定して、処理済培養物を未処理培養物と比較することによって、ウイルス産生量を測定した。図４は、HIV 抗感染特性の上記予測検定法の上記実験条件下での化合物62（“cni-h6297 ”）の投与量−応答の関係を示す。
Claims (11)
- 下記式Ｉ：
で表される化合物。 - Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがＨである請求項１に記載の化合物。
- Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがアミノである請求項１に記載の化合物。
- 医薬として許容可能な担体中に、請求項１に記載の化合物を含有する医薬組成物。
- Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがＨである請求項４に記載の医薬組成物。
- Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがアミノである請求項４に記載の医薬組成物。
- 請求項１に記載の式Ｉで表される化合物の合成方法において、
（ａ）塩化アセチルを短鎖アルコールに溶解した溶液を準備し；
（ｂ）上記溶液に、４−アミノ−６−クロロ−２−メチルメルカプトピリミジンおよび3,5−ジアシルアニリンを添加して、混合物をつくり；
（ｃ）上記混合物を還流して、上記アニリン誘導体を上記ピリミジン誘導体に結合させ；次いで
（ｄ）得られた混合物を乾燥して、式Ｉで表される固体の最終生成物を得る；
工程を含んでなる方法。 - 前記3,5−ジアシルアニリンが3,5−ジアセチルアニリンである請求項７に記載の方法。
- 下記式Ｉ：
で表される化合物を含んで成るＨＩＶ感染症治療剤。 - Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがＨである請求項９に記載の治療剤。
- Ａがメチルであり、Ｘが−ＮＨ2 であり、そしてＺがアミノである請求項９に記載の治療剤。
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