JP4471837B2 - 食料品及び食品加工工場においてリステリアモノサイトゲネスを制御するための病原性ファージ - Google Patents
食料品及び食品加工工場においてリステリアモノサイトゲネスを制御するための病原性ファージ Download PDFInfo
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Description
「溶原性」とは、ファージ株がそのDNAを細菌標的内に注入するとファージDNAが「プロファージ」として宿主細胞のDNA内に組み込まれ、かなりの期間の間そこに組み込まれたまま保たれることができることをいう。プロファージは宿主細胞がストレス下に置かれた場合にのみ切り出される(かつ複製及び溶解を開始する)ので、その結果起こる細菌溶解は予測不可能であり容易に制御することができず、これが、溶原性ファージが工業用途にあまり役立たない理由である。溶原性ファージは望ましくない危険な遺伝子を細菌標的に送達する可能性があり、そのDNAはこれをも組み込むということを含めた他の理由によっても、溶原性ファージは工業的除染目的に不適切である。対照的に、細菌標的内に組み込まれるために分子機構が必要ないという前提で、細菌標的を直接溶解するファージクラスがある。このようなファージは細菌標的に対して「病原性」又は「溶解性」であるといわれる。リステリアモノサイトゲネスに対する病原性ファージは、本発明者のうちの1人によって最近発見された。
(i)主成分(例えば乳)の低温殺菌及び製品の熱処理[これは、多くの場合に再汚染が起こり、多くの製品には最終(殺リステリア性)熱処理を施すことができないので、多くの場合成功しない]、
(ii)消毒剤、酵素、抗生物質などの物理化学的作用物質の適用[これは、経験により十分に細菌数を減少させないことが示されている]、及び、
(iii)機械的にバイオフィルムを壊す試み[これは、細菌の残渣を十分に残すので、その後に食料品が汚染される]
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、食品及び環境中のリステリアを選択的に制御することが示されている酵素リステリオリシンと組み合わせることができる(DE4326617C1及びEP95932002.9)。
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、(i)安息香酸やBHTなどの様々な種類の保存料、及び、(ii)第四級アンモニウム化合物などのファージが適合性を有する様々な消毒剤等の既知の表面消毒剤と組み合わせることができる。
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、バンコマイシン、ナイシン、ダノフロキサシン及びネオマイシンを含む既知の抗微生物剤(抗生物質及び化学療法剤を含む)と組み合わせて使用することができる。
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、バイオフィルム(例えば食品加工装置中に見つかるバイオフィルム)を壊すことを補助するために酵素と組み合わせて使用することができる。このような酵素は当分野で知られており、多糖類デポリメラーゼ酵素及びプロテアーゼが含まれる。
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、食品加工装置を処理するために使用する場合に既知の界面活性剤と組み合わせることができる。界面活性剤は、ファージが様々な表面上に適切に分布されるように表面を湿らすこと、並びにリステリアがファージに接近可能になるように汚物を溶解及び除去することに役立つ。適切な界面活性剤には、Tween80、20及び81並びにドバノールが含まれる。
本発明のファージ、エンドリシン及び/又はエンドリシンを含む宿主細菌は、リステリアモノサイトゲネスに特異的なファージ及び/又は食品加工装置及び食料製品を汚染することで知られている他の細菌に特異的なファージと組み合わせることができる。このような細菌には、大腸菌、並びにサルモネラ属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、クロストリジウム属、及びシュードモナス属由来の細菌種が含まれる。
液体培地中のリステリアモノサイトゲネスの根絶:
ステップ1.103CFUのリステリアモノサイトゲネスを液体培地中に混ぜる。
ステップ2.5×108PFUのファージP100を液体培地中に混ぜる。
ステップ3.対照として、ファージP100を懸濁させた緩衝液を液体培地の一定分量中に混ぜる。
ステップ4.様々な時間間隔で細菌のコロニー計数を行う。
結果を図1に示す。
実験室スケールのチーズモデルで、P100として知られる抗リステリアモノサイトゲネスファージ株を用いて誘発実験を行った。この実験では、確立された商業的チーズ製造工程に特徴的な表面熟成品質(味、質感などの)を達成するためのテクニカルフローラを組み込んだ。本実験で使用した株Cとして知られているリステリアモノサイトゲネス(「Lm」)の株は、特定のチーズ製造工場の一般的な汚染物質である。
チーズにおける誘発実験
・実験は、ブラインから直接取ったチーズで行った(pH未調整)。
・210μL又は1mLのインキュベーション混合物を64cm2のチーズ表面に蒔くことによって、t=0にLm株C、テクニカルフローラ、及びファージP100をチーズに適用した。t=0は「CMD+1」(チーズ製造日+1)と同じである。次いで、1mLの溶液で処理したチーズの表面を乾燥させるために層流キャビネット内で乾燥させた。インキュベーション混合物は以下から構成されていた:
・テクニカルフローラ:
・108CFU/mLのデバリオマイセスハンセニイ(Debaryomyces hansenii)NIZO F937及びNIZO F1200(酵母菌)
・108CFU/mLのブレビバクテリウムリネンズ(Brevibacterium linens)NIZO B1204(レッドスメアチーズに典型的な細菌)
・7cfu/cm2の濃度に相当するLmC(対数増殖培地からpfzで希釈した)
・1×107pfu/cm2又は5×105PFU/cm2に相当する濃度のファージP100(MPOS緩衝液中)
正確な処理の組合せには表1を参照されたい。
・チーズを毎日、P100を含む210μL又は1000μLの洗浄溶液で、CMD+6、CMD+10、及びCMD+13に1mL/70cm2で処理した(処理の組合せ4及び5)。
・110g/LのNaCl
・108CFU/mLのブレビバクテリウムリネンズNIZO B1204
・1 107PFU/cm2又は5 105PFU/cm2に相当する濃度のファージP100(MOPS緩衝液中)
・PD+63までチーズを6℃で保存した。
・定量:70cm2の試料をチーズから切り出し、選択的培地で分析した。
・定性/定量分析は、チーズ上のリステリアの増殖レベルにも依存する。細胞数が>102個である場合は、濃縮は行わなかった。細胞数がそれより低い場合は、梱包の前にも濃縮を行った。
・pH及びテクニカルフローラのさらなる分析。
・CMD+6の1つのチーズでは、ファージを適用する前及び後にファージ力価を決定した。
酵母及びブレビバクテリウムがチーズ上で良好に増殖しており、チーズ表面が中和されていたのでチーズの熟成は良好であった。
リステリアモノサイトゲネスCはこのモデルにおいてチーズ表面上で良好に増殖し、陰性対照で105〜107CFU/cm2のレベルであった。(陰性対照:ファージを適用せず)(図2)。
CMD=チーズ製造日
PD=梱包日
大腸菌JM109(pHPLxxx)由来のエンドリシンのアッセイ、過剰発現及び精製
プレートアッセイ
1.活性試験用にリステリアモノサイトゲネスアッセイ株を調製する。1000mlの終夜培養物をトリプトースブロス又はトリプチケースソイブロス中で増殖させ、遠心分離し、細胞をSM緩衝液、pH8.0(Sambrook他、1989参照)(又はPBS)で1回洗浄し、20mlのSM緩衝液(又はPBS)中に再懸濁させる(約50倍の濃度)。
2.−20℃又は80℃で、1ml量で保存する。
3.大腸菌JM109(pHPLxxx)をLB−寒天(100μg/mlのアンピシリンを含む)に画線又はプレートし、終夜インキュベートする。
4.コロニーが十分な大きさになった後、1mMのIPTGを添加したLB−Ampプレートで複製プレートを調製する(NC−フィルターを用いる)。小さなコロニーが目に見えるまで5〜7時間インキュベートする。
5.プレートの表面を(逆さまで)クロロホルムを浸した濾紙に5分間曝露させる。
6.コロニーに素早く0.5mlの50倍濃縮のリステリアモノサイトゲネス培養物を添加した3〜4mlの融解軟寒天(SM緩衝液中に0.4%、約45℃)をかぶせる(かぶせる層は薄く、均等でかなり濁っているべきである)。
7.コロニーの周辺に透明な溶解領域が見えるまで室温で60分間(最大終夜)インキュベートする。これには、5分間から5時間までの時間がかかり得る(これは重要なアッセイである。これは必ず起こらなければならない。そうでなければ、株又は活性試験手順に問題がある可能性がある)。
8.JM109(pHPLxxx)の終夜培養物を、100μg/mlのAmpを含むLBブロス中、30〜35℃のインキュベーションで調製する。
9.翌朝、250mlの予熱したブロスに10mlのO/N培養物を接種し、0.5〜0.6のOD600まで増殖させる。
10.1mMのIPTGを導入し、増殖速度が停止し始めるまでさらに3〜4時間インキュベートする。
11.遠心分離によって細胞を回収し、ペレット(又は複数のペレット)を培養物250mlあたり5mlのPBS(pH8.0)0.05%Tween20、又は下流のNi−NTA精製が必要な場合は緩衝液A(以下参照)に再懸濁させる。細胞を−20℃で凍結させる。
12.細胞を解凍する。フレンチプレスによって細胞抽出物を調製し、遠心分離し(>30000×g、30分間)、上清を濾過する(0.2μmフィルター、好ましくはPESから作製されたもの)。抽出物を含む酵素を氷上(数時間)又は20℃で保存する(注記:超音波処理も使用することができるが、一般にフレンチプレスによって得た収率の方がはるかに良い)。
13.新しく増殖させた中期から対数期の終わりにある細胞、又はステップ1(上記)の事前に冷凍したリステリアモノサイトゲネス細胞を使用する。PBS緩衝液、pH8.0、0.05%TritonX100(ODを約1.0〜1.5に調整)に再懸濁させる。ハーフマイクロプラスチック製キュベット(1ml)を使用し、900μlの細胞を加え、少なくとも室温、好ましくは30〜37℃まで予熱し、50〜100mlの酵素を加える。濁度は5分間以内に0.5以下まで下がるはずである。
この粗抽出物を、リステリア細胞の溶解並びに染色体DNA、プラスミド、タンパク質及び酵素の放出に使用することができる。しかし、これは大量の大腸菌タンパク質、核酸(DNA、RNA)断片、ATP、及び汚染性pHPLベクターを含む。これが望ましくない場合は、酵素をIMACによって精製する(以下参照)。
14.粗抽出物をNi−NTA樹脂で分画する。ステップ8〜11に要約した手順は液体クロマトグラフィー(FPLC又は類似のもの、ステップ15参照)用であり、強く勧められる。しかし、小規模の精製では、これをより単純なバッチ型手順で行うこともできる。最初の培養物体積250mlあたり約3mlの樹脂(NiNTAアガロース)を使用する。樹脂をタンパク質に曝した後、低速遠心分離(500×g未満)によって洗浄ステップを(バッチで)を実施する。最後の洗浄の後、樹脂を収集して小さい使い捨てのプラスチック製カラム(BioRad及び他社から入手可能)内に1〜2mlの一定分量に分け、15mlの円錐型又は丸底型のチューブに入れる。溶出緩衝液(約1ml)(100%B)を加え、5分間静置し、遠心して液体を回収する。溶出を1〜2回繰り返す。続いてステップ19を行う。
15.FPLC精製。十分な量の緩衝液A(50mMのリン酸緩衝液、pH8.0、500mMのNaCl、5mMのイミダゾール)及び緩衝液B(Aと同様だが250mMのイミダゾール)を調製する。緩衝液AとBとでのイミダゾール勾配を用いる。抽出物(最大40ml=2リットル(8×250ml)の培養物からの抽出物)をNi−NTAカラム(25ml体積)に載せ、低流速(0.75〜1.0ml/分)を用いる。必要な場合は、Qiagen社の手引きに概要が示されている手順によって、各酵素を精製する前にNi−NTA樹脂(Ni−NTA Superflow)を再生する。新しい又は再生したカラムは、少なくとも5回使用することができる。
16.5倍カラム体積の100%緩衝液Aで洗浄する(流速2〜3ml/分)
17.(280nmでの)基底読取値が安定するまで、3〜5倍カラム体積の12%緩衝液B(総濃度約35mMのイミダゾール)で洗浄する。このステップにより、最も汚染するタンパク質が除去される(イミダゾール自体が280nmでの値を増加させることに注意されたい)。
18.酵素画分を250mMのイミダゾール(100%緩衝液B)で溶出させる。ピークを手動で回収することが最良である(ピークの右肩に関しては、早めに止めること−イミダゾール自体の吸光がより高いことにごまかされないこと)。氷上で保存する。この酵素は高濃度の塩及びイミダゾールの存在下で寒冷沈殿する傾向があるので、新しく溶出させた画分を凍結しないこと。
19.溶出させたすべての画分を、測光活性アッセイによって確認する(上記参照)。
20.遠心フィルターユニット(PES膜、分子量カットオフ10kDa)による活性画分の濃度及び緩衝液の交換(高濃度塩及びイミダゾールの除去)。溶解緩衝液(PBS、pH8.0、0.05%TritonX100、0.05%Tween20)で膜を前処理する。溶解緩衝液で2回洗浄する。膜にタンパク質が詰まった場合は、新しいフィルターユニットへ移す。0.2μmのシリンジフィルターを用いてフィルター滅菌する(PES膜を使用すること−セルロースでは酵素の多くを保持してしまう)。あるいは、緩衝液の交換は、濃縮タンパク質溶液の透析によって行うことができる(PBS又はTris緩衝液、0.05%Tween20)。本発明者らは、透析を長引かせた場合にHPL118が凝集する傾向を有することを見出した(HPL511やHPL500は凝集しない)。
21.SDS−PAGEによって画分を確認し、タンパク質の精製度(90%を超える純度であるべきである)及びタンパク質の濃度(通常2〜4mg/mlの範囲内)を推定する。調製物の純度が十分でない場合は、カラム(ステップ10)を15%緩衝液Bで洗浄することを試みて、HPLタンパク質を150mMのイミダゾール(60%緩衝液B)、又は200mMのイミダゾール(80%緩衝液B)で溶出させる。又は、最初のタンパク質調製物全体をカラムに「再載」し(再載前に少なくとも10倍に希釈する、もしくはイミダゾールを除去するために透析する)、pH勾配などの条件を変えて第2の精製ステップを行うこともできる。ゲル濾過によってもタンパク質の純度がさらに上昇する。しかし、これはもちろんすべての標準用途に必要なわけではない。
22.濃縮した酵素溶液を最終含量30〜50%のグリセロールに調整し、50〜500μlの一定分量に分け、−25℃で保存する。これらの条件下では、酵素は数ヶ月間安定である。−80℃で凍結した場合、時々失活が生じた。
リステリアモノサイトゲネス細菌を開始培地と共に表面熟成チーズの表面上に加えた場合、十分な用量のファージP100を表面に適用することによって細菌が完全に根絶し、これは濃縮による調査によって確認された(濃縮法を用いた検出限界:チーズ表面60cm2あたり1CFUのリステリア)。ファージで処理した(高濃度又は低濃度、1回の適用又は複数回の適用)すべてのチーズで、P100で処理した後のリステリア力価は対照よりも低かった。リステリアは、ファージを(複数回の代わりに)1回しか適用しなかった場合、又は、低濃度で適用した場合にのみ発生した。ファージはチーズ上で数日間活性が保たれている。
Claims (32)
- American Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4383として寄託されているファージP100を、食料製品又は食品加工装置に、リステリアの量を減少させるのに十分な量で適用することを含む、食品製品中、食品加工装置上、又は食品保存容器上におけるリステリア汚染を制御する方法。
- P100をAmerican Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4608として寄託されているファージA511と組み合わせて適用する請求項1に記載の方法。
- 溶解性ファージをリステリオリシン、表面消毒剤、抗生物質、界面活性剤、酵素、及びリステリアモノサイトゲネス以外の細菌汚染物質に特異的なファージからなる群から選択される少なくとも1種の作用物質と組み合わせて適用する、請求項1に記載の方法。
- 食料製品が酪農製品である請求項1に記載の方法。
- 食料製品が低温殺菌していない食料製品である請求項1に記載の方法。
- 食料製品が肉製品である請求項1に記載の方法。
- 肉製品がすぐに食べられる肉製品である請求項6に記載の方法。
- 食料製品が魚製品である請求項1に記載の方法。
- 食品保存容器がサラダバーであり、食料製品がサラダである、請求項1に記載の方法。
- 食品加工装置が乳を送管するチューブ、チーズを加工するための高濃度塩のタンク、チーズの表面上に適用する培養物の容器、製品を乾燥させて保存処理するための1組の棚、及び床排水からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 液体又は半固体の食料製品と混合することによって前記溶解性ファージを適用する、請求項1に記載の方法。
- 溶解性ファージを液体と混合して食料製品、食品加工装置及び食品保存容器からなる群から選択される表面上に噴霧する、請求項1に記載の方法。
- 溶解性ファージをリステリオリシン、表面消毒剤、抗生物質、界面活性剤、酵素、及びリステリアモノサイトゲネス以外の細菌汚染物質に特異的なファージからなる群から選択される作用物質と組み合わせて食品加工装置に適用する、請求項12に記載の方法。
- 溶解性ファージを凍結乾燥させるか又はガラス化によって凍結保存し、乾燥形態で食料製品、食品加工装置及び食品容器に適用する、請求項1に記載の方法。
- American Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4383として寄託されているファージP100及び担体を含む組成物。
- American Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4608として寄託されているファージA511をさらに含む、請求項15に記載の組成物。
- リステリオリシン、表面消毒剤、抗生物質、界面活性剤、酵素、及び、リステリアモノサイトゲネス以外の細菌汚染物質に特異的なファージからなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項15に記載の組成物。
- 担体が製薬上許容される担体である請求項15に記載の組成物。
- リステリアモノサイトゲネスの減少又は排除に適した量の、American
Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4383として寄託されているファージP100を投与することを含む、リステリアモノサイトゲネスに感染した動物(ヒトを除く)を処置する方法。 - ファージA511を投与することをさらに含む請求項19に記載の方法。
- American Type Culture CollectionにATCC特許寄託指定番号PTA−4383として寄託されているファージP100。
- リステリアモノサイトゲネスを含むことが疑われる試料を請求項21に記載のP100と共にインキュベートすること、及び、リステリアモノサイトゲネスの存在の指標として、P100によって引き起こされた前記試料の変化を検出することを含む、リステリアモノサイトゲネスの存在を検出する方法であって、
前記試料の変化がP100による溶解又は検出可能な標識もしくはシグナルによるものであり、
遺伝子構築物は、試料とインキュベートする前に組換えによってP100のゲノムに挿入され、前記遺伝子構築物の発現によりリステリアモノサイトゲネスの存在下で検出可能なシグナルが生じる、リステリアモノサイトゲネスの存在を検出する方法。 - 遺伝子構築体が生物発光性タンパク質をコードしている請求項22に記載の方法。
- 生物発光性タンパク質がルシフェラーゼ及び蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- ルシフェラーゼが細菌又は昆虫由来である請求項24に記載の方法。
- 蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質又はその変異体である請求項24に記載の方法。
- リステリアモノサイトゲネスを固体支持体上に固定し、前記固体支持体における前記試料の変化を検出することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 抗リステリア抗体を用いてリステリアモノサイトゲネスを固定する請求項27に記載の方法。
- 固体支持体が試験片である請求項28に記載の方法。
- 試料を食料製品、食品加工装置又は食品保存容器から得る請求項22に記載の方法。
- リステリアモノサイトゲネスの検出を確認するシグナルを提供する又は発生させるためにP100内に遺伝子構築体を組換えによって挿入する、請求項22に記載の方法。
- 遺伝子構築体がルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードしている遺伝子からなる群から選択される請求項31に記載の方法。
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