JP4467792B2 - ｈＣＧアッセイにより対象において妊娠の見込みを予測する方法。 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、引用によりその全部を本明細書の一部とみなす１９９９年２月３日出願の米国出願番号０９／０１７，９７６の一部継続出願である。
【０００２】
ここに開示された発明は、国立衛生研究所補助金番号ＮＩＥＨＳ ＥＳ−０７５８９およびＨＤ１５４５４の下の米国政府支援にてなされた。
【０００３】
【発明の背景】
本出願を通じて、著者および日付によって種々の刊行物が引用される。これらの刊行物についての十分な引用は、請求の範囲の直前で明細書の終わりにアルファベット順に見いだすことができる。技術の水準をより十分に記載するために、その全部のこれらの刊行物の開示は引用して本明細書の一部とみなす。
【０００４】
初期妊娠喪失（ＥＰＬ）は広くわたった、しかし大いに診断されていない問題である。ＥＰＬについて適切に診断し、その治療を開発するためには、ＥＰＬの発生の率を検出し測定することができるのが必須である。これは疫学的研究において非常に重要であり、そのうちいくらかは環境においてまたは個人の使用により職場での公知のまたは疑われる生殖トキシンへの暴露に関連する。これらの初期妊娠喪失は、しばしば、婦人または医師によって認識されておらず着床および予測される月経の間の時点において子宮中のｈＣＧの測定によってのみ検出される。ランドマーク的疫学研究はＥＰＬの発生率が妊娠を試みる健康な婦人において２２％であることを確立した（Ｗｉｌｃｏｘ，Ａ．Ｊ．ら，１９８８）。この調査は存在するユニークなベータサブユニットカルボキシ末端ペプチドを持つ無傷のｈＣＧ分子のみを検出する非常に感度の良い（０．０１ｎｇ／ｍｌ ｈＣＧ）アッセイを使用した。
【０００５】
遺伝的異常性、免疫学的機能不全、未治療感染または他の未知の生理学的問題を含めたＥＰＬおよび臨床的自然発生流産についての複数のありそうな原因がある。加えて、喪失は、その標的、黄体において適切な応答を誘導するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の不全によって引き起こされ得る。これは不適切なホルモン能力に由来し得る。特に残基４４−４９の間の分子のループ２領域におけるベータサブユニットの「ニッキング」はｈＣＧの生物能力を減少させることができる。該分子のこの領域における切断されたペプチド結合は、低下した生物能力およびヘテロダイマーホルモンに対して向けられたモノクローナル抗体による低下した免疫化学認識を呈する（Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．ら，１９９１ａ；Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．ら，１９９１ｂ，Ｐｕｉｓｉｅｕｘ，Ａ．ら，１９９０；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｒ．ら，１９８８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｒ．Ｔ．ら，１９８９）。ｈＣＧのニック入り形態は恐らくはＥＰＬの状況においてより優先的であり、少なくとも部分的には初期妊娠喪失の原因であると調べられた。生憎と、実質的な濃度のニック入りｈＣＧが妊娠、喪失または成功した妊娠の間に生成されることを主張する報告の多くは、アッセイの特異性に関して誤った仮定のため正確ではない。炭水化物修飾ｈＣＧは減少したまたは増強した生物能力いずれかを呈することができる。もしｈＣＧがかなり低下したシアル酸含有量を有し、その炭水化物鎖がガラクトースで終わるならば、かかる変化した糖蛋白質に対する肝臓受容体によって多くのｈＣＧが除去されるであろうことが知られている（Ｂｒａｕｎ、Ｊ．Ｒ．ら、１９９６；Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｔ．およびＧ．Ａｓｈｗｅｌｌ，１９９６）。アシアロｈＣＧの循環寿命は低下し、そのイン・ビボでの能力はそれにより低い。また、他の炭水化物の変化は循環寿命を変化させる；硫酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンで終わる糖蛋白質は特異的肝臓受容体によって抽出され、低下した循環寿命を有する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ、Ｊ．Ｕ．，１９９４，Ｆｉｅｔｅ，Ｄ．ら、１９９１）。
【０００６】
少なくとも２つの因子がｈＣＧの増大した能力に影響する。まず、より大きなストークス半径が、７００００の有効サイズを超える蛋白質を一般には非常にゆっくりと除去する腎臓糸球体を通じてのクリアランスを減少させることが知られている。尿から単離されたｈＣＧの有効サイズは丁度このボーダーラインの減少したクリアランスサイズである。一般に、過剰な糖含有量は糖蛋白質の水和半径をより大きくする。ｈＣＧベーターＣＯＯＨ−末端ペプチドをｈＦＳＨまたはｈＬＨに負荷することによって、その循環寿命は多いに増加したことが示されている（Ｆａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．ら、１９９２；Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．，１９９０）。この負荷は、単純に余分なポリペプチドサイズよりもむしろそのペプチドの炭水化物含有量にほとんどよるものと考えられた。第２に、蛋白質の増大した負の荷電は低下した腎臓クリアランスのためその循環時間を延長させるであろう（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ，Ｃ．１９９２，Ｑｕａｄｒｉ，Ｋ．Ｈ．ら、１９９４；Ｍａａｃｋ，Ｔ．ら、１９８５）。この増大した負の荷電は、ｈＬＨにおよびｈＣＧの下垂体形態に存在する硫酸塩を含めた、過剰のシアル酸または他の負の気によるものであり得る（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９９６ｂ）。受容体においてシグナル変換に影響する変化はｈＣＧの生物能力にも影響し得る。脱グリコシル化ｈＣＧはかなり減少した受容体能力を有することが知られている（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｎ．ら、１９９２；Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．Ｒ．，およびＬ．Ｇ．，Ｊｉａｎｇ，１９９２；Ｂｒｏｗｎｅ，Ｅ．Ｓ．ら、１９９０；Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．Ｒ．，１９８９；Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．Ｒ．ら、１９８８）。また、ｈＣＧの炭水化物還元形態はシグナル変換を減少させた（Ａｍａｎｏ，Ｊ．ら、１９９０、Ｂａｈｌ，Ｏ．ら、１９９５；Ｍｏｙｌｅ，Ｗ．Ｒ．，１９７５）。
【０００７】
本発明によると、ＥＰＬまたは再発自然発生流産はニック入りｈＣＧのごとき低下した能力を有する異常ｈＣＧ形態によるものではない。その代わり、本発明は、成功した見込みの妊娠において、婦人は通常は非常に初期の妊娠で非常に高度に優れたｈＣＧの形態を生じ；ｈＣＧの標準尿参照調製物は妊娠の後期に生産されたホルモンのより優れない形態であるという証拠を提供する。増大した能力は、増大した受容体親和性またはシグナル変換または前記の全てに対する循環半減期からの因子の組合せによって引き起こされ得る。ｈＣＧは妊娠の非常に初期には低いので、栄養膜細胞マスが増加するにつれて生産レベル上昇するまで、その機能を行うためにモラーベースのｈＣＧのより優れた形態を見いだすのは論理的である。本発明は、ｈＣＧの高度に優れた初期妊娠関連分子イソ形態を認識するここに記載された抗体Ｂ１５２を含めた分子および免疫学的ツールおよび方法を記載する。健康な妊娠の全体にわたってのＢ１５２ ｈＣＧイソ形態についての血液および尿プロフィールの測定は、成功した妊娠におけるイソ形態のパターンを描くことができる。これらのイソ形態は免疫アッセイ単独によって測定することができ、複雑な等電点電気泳動実験または他の分離技術を実行する必要性をなくする。加えて、ここに記載する方法は非常に多数の試料に適用可能である。
【０００８】
【発明の概要】
本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下で、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体と接触させ；（ｂ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定し；次いで、（ｃ）工程（ｂ）で測定した試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を、一時的にマッチした正常妊娠対象で測定した量と比較することを含み、ここに、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の相対的不存在が対象についての妊娠の陰性の見込みを示すことを特徴とする、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定することによって対象において妊娠の見込みを予測する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、（ａ）抗体と固体マトリックスとの結合を可能とする条件下、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する捕獲抗体と固体マトリックスとを接触させ；（ｂ）試料中に存在する抗原と捕獲抗体との結合を可能とする条件下で、結合マトリックスを試料と接触させ；（ｃ）結合したマトリックスおよび試料を分離し；（ｄ）抗体および試料中の抗原の結合を可能とする条件下で、分離された結合マトリックスと、ｈＣＧと特異的に結合する検出抗体とを接触させ；（ｅ）結合マトリックス上の結合抗体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定し；次いで、（ｆ）工程（ｅ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と、一時的にマッチした正常妊娠対象につき測定した量とを比較することを含み、ここに、一時的にマッチした妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量が、陽性の見込みを示し、非妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量が対象についての妊娠の陰性の見込みを示すことを特徴とする、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定することによって対象において妊娠の見込みを予測する方法を提供する。
【００１０】
加えて、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体と接触させ；次いで、（ｂ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定することを特徴とする試料中の初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、（ａ）初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体；（ｂ）抗体がそれに結合する固体マトリックス；および（ｃ）抗体および試料の間の複合体の形成を可能とする試薬を含むことを特徴とする、試料中の初期妊娠関連ｈＣＧの量を測定するための診断キットを提供する。
【００１２】
加えて、本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピンの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体とを接触させ；（ｂ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ニック入りｈＣＧに特異的に結合する第２の抗体とを接触させ；（ｃ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定し；および（ｄ）工程（ｂ）で測定した試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と、工程（ｃ）で測定した試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量とを比較することを含み、ここに、工程（ｂ）で検出された初期妊娠関連分子イソ形態の陽性検出および工程（ｃ）で検出されたｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の相対的不存在が試料中の非栄養膜悪性疾患の存在を示すことを特徴とする試料中の非栄養膜悪性疾患を検出する方法を提供する。
【００１４】
最後に、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体を接触させ；（ｂ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ニック入りｈＣＧに特異的に結合する第２の抗体とを接触させ；（ｃ）形成された複合体の量を測定し、それにより、第１の抗体との結合による試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態、および第２の抗体との結合による試料中のｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態の量を測定し；（ｄ）対象におけるｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対するｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の比率を決定し；次いで、（ｅ）経時的に、工程（ｃ）で測定した試料においてｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対してｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の比率を比較することを含み、ここに、工程（ｃ）で測定した試料においてｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対するｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の継続的に高い比率が対象において妊娠栄養膜病の存在を示すことを特徴とする、対象からのサンプルにおいて妊娠栄養膜病を検出する方法を提供する。
【００１５】
【発明の詳細な記述】
（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体を接触させ；（ｂ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定し；次いで、（ｃ）工程（ｂ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と、（ｉ）一時的にマッチした正常妊娠対象で測定した量または（ｉｉ）非妊娠対象で測定した量とを比較することを含み、ここに、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の相対的不存在が対象についての妊娠の陰性の見込みを示すことを特徴とする、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定することによって対象において妊娠見込みを予測する方法。本発明の実施形態において、抗体はＢ１５２である。本発明のもう１つの実施形態は、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態である。
【００１６】
Ｂ１５２モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、特許手続きの目的とする微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定下、１９９８年２月３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド州２０８５２、米国。該ハイブリドーマにはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７が与えられた。
【００１７】
本発明の１つの実施形態によると、工程（ａ）はさらに、抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下で該抗体と実質的に交差反応することなくｈＣＧに特異的に結合する第２の抗体を含む。本発明の実施形態において、第２の検出抗体はＢ２０７である。本発明のもう１つの実施形態において、工程（ａ）はさらに、抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下で該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ニック入りｈＣＧに特異的に結合する第２のアッセイ抗体Ｂ１０９を含む。本発明の実施形態において、検出抗体はＢ１０８である。本発明の実施形態において、工程（ｃ）はＢ１５２−Ｂ２０７アッセイについての工程（ｂ）で測定したｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を、Ｂ１０９−Ｂ１０８アッセイについての工程（ｂ）で測定した量と比較することを含み、ここに、第２の抗体に対する該抗体で測定された量の高い比率は、対象についての妊娠の陽性の見込みを示し、低い比率は対象についての妊娠の陰性の見込みを示す。
【００１８】
本発明のさらにもう１つの実施形態において、工程（ｃ）は工程（ｂ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を一時的にマッチした正常妊娠対象につき測定された量を比較することを含み、ここに、一時的にマッチした妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量は、陽性の見込みを示し、非妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量に同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量は対象についての妊娠の陰性の見込みを示す。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）抗体および対象からのｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する捕獲抗体とを接触させ；（ｂ）捕獲抗体およびｈＣＧイソ形態の間の複合体への結合を可能とする条件下、工程（ｂ）で形成されたいずれかの複合体を標識された検出抗体と接触させ；（ｃ）該複合体に結合した標識検出抗体の量を測定して、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を決定し；次いで、工程（ｂ）で測定した試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を正常妊娠対象につき測定した量と比較することを含み、ここに、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の相対的不存在が対象についての妊娠の陰性の見込みを示すことを特徴とする女性対象における否定的妊娠の見込みの確率を予測する方法を提供する。
【００２０】
本発明の実施形態によると、試料は尿試料または血液試料である。本発明の１つの実施形態において、試料は少なくとも１日から採取した凝集体試料である。もう１つの実施形態において、試料は少なくとも２連続日において採取することができ、さらなる実施形態において、試料は３日以内に採取する。本発明の実施形態において、試料はスポット尿試料、最初の朝の***尿試料、または少なくとも２連続日での最初の朝の***尿試料の凝集体試料である。本発明の１つの実施形態において、抗体は検出可能なマーカーで標識する。本発明の実施形態において、検出可能なマーカーは放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズまたはビオチンである。好ましい実施形態において、放射性同位体はＩ１２５である。
【００２１】
本発明は、さらに、（ａ）抗体と固体マトリックスとの結合とを可能にする条件下、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する捕獲抗体と固体マトリックスとを接触させ；（ｂ）試料中に存在する抗原と捕獲抗体との結合を可能とする条件下、結合マトリックスと試料とを接触させ；（ｃ）結合マトリックスおよび試料を分離し；（ｄ）抗体および試料中の抗原の結合を可能とする条件下、分離された結合マトリックスと、ｈＣＧに特異的に結合する検出抗体を接触させ；（ｅ）結合マトリックス上の結合抗体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を決定し；次いで、（ｆ）工程（ｅ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と、一時的にマッチした正常妊娠対象で測定された量を比較することを含み、ここに、一時的にマッチした妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量が陽性の見込みを示し、非妊娠試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と同様の試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量が対象につき妊娠の陰性の見込みを示すことを特徴とする、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定することによって対象において妊娠の見込みを予測する方法を提供する。
【００２２】
本発明の実施形態は、さらに、（ａ）マトリックスから試料を除去し；次いで、（ｂ）結合マトリックスを適当な緩衝液で洗浄することを含む。本発明の１つの実施形態において、捕獲抗体はＢ１５２である。本発明の１つの実施形態において、検出抗体はＢ２０７である。本発明の実施形態において、工程（ａ）は、さらに、抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下で該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ミックドｈＣＧに特異的に結合する第２捕獲抗体を含む。本発明の実施形態によると、第２捕獲抗体はＢ１０９であって、第２検出抗体はＢ１０８である。本発明の実施形態において、工程（ｄ）は、さらに、抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下で該抗体と実質的に交差反応することなくｈＣＧに特異的に結合する第２検出抗体を含む。本発明の実施形態において、工程（ｆ）は該抗体についての工程（ｅ）で測定されたｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と第２抗体につき工程（ｂ）で測定された量とを比較することを含み、ここに、第２抗体に対する該抗体で測定された量の高い比率は対象についての妊娠の陽性の見込みを示し、低い比率は対象についての妊娠の陰性の見込みを示す。
【００２３】
本発明の実施形態によると、試料は尿試料または血液試料である。本発明の１つの実施形態において、試料は少なくとも２連続日から採取した凝集体試料である。本発明の実施形態において、試料はスポット尿試料、最初の朝の***尿試料、または少なくとも２連続日についての最初の朝の***尿試料の凝集体試料である。本発明の１つの実施形態において、抗体は検出可能マーカーで標識される。本発明の実施形態において、検出可能マーカーは放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズまたはビオチンである。好ましい実施形態において、放射性同位体はＩ１２５である。
【００２４】
加えて、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体とを接触させ；次いで、（ｂ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を決定することを特徴とする試料中の初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する方法を提供する。
【００２５】
本発明の実施形態によると、該抗体は炭水化物基を含むｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の領域に特異的に結合する。本発明の１つの実施形態において、該抗体はハイブリドーマ細胞系によって生産される。本発明の１つの実施形態において、抗体はＢ１５２である。
【００２６】
さらに、本発明は、（ａ）初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体；（ｂ）それに抗体が結合する固体マトリックス；および（ｃ）抗体および試料の間の複合体の形成を可能とする試薬を含むことを特徴とする試料中の初期妊娠関連ｈＣＧの量を測定するための診断キットを提供する。本発明の実施形態において、抗体はＢ１０９またはＢ１５２である。本発明の実施形態は、さらに、対象試料、正常妊娠試料、非妊娠試料、または男性試料を含む。また、該キットはＢ２０７またはＢ１０８のごとき検出抗体を含有することができる。
【００２７】
本発明の実施形態によると、試料は尿試料または血液試料である。本発明の１つの実施形態において、試料は少なくとも１日から採集された凝集体試料であるか、あるいは２または３連続日からのものである。本発明の実施形態において、試料はスポット尿試料、最初の朝の***尿試料、または少なくとも１日での最初の朝の***尿試料の凝集体試料であるか、あるいは２または３連続日についてのものである。本発明の１つの実施形態において、抗体は検出可能マーカーで標識される。本発明の実施形態において、検出可能マーカーは放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズまたはビオチンである。好ましい実施形態において、放射性同位体はＩ１２５である。
【００２８】
加えて、本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピンの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体を提供する。
【００２９】
本発明の実施形態において、該抗体は、炭水化物基を含むヒト絨毛性ゴナドトロピンの初期妊娠関連分子イソ形態の領域に特異的に結合する。本発明の１つの実施形態によると、モノクローナル抗体はＢ１５２である。本発明の実施形態において、モノクローナル抗体Ｂ１５２を生産することができるハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７）が提供される。本発明のもう１つの実施形態はＢ１５２モノクローナル抗体によって認識されるｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態である。
【００３０】
さらに、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体とを接触させ；（ｂ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ニック入りｈＣＧに特異的に結合する第２抗体と接触させ；（ｃ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を決定し；次いで、（ｄ）工程（ｂ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量と、工程（ｃ）で測定された試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量とを比較することを含み、ここに、工程（ｂ）で検出された初期妊娠関連分子イソ形態の陽性検出および工程（ｃ）で検出されたｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の相対的不存在が試料中の非栄養膜悪性疾患の存在を示すことを特徴とする、試料中の非栄養膜悪性疾患を検出する方法を提供する。
【００３１】
本発明の実施形態によると、抗体はＢ１５２またはＢ１０９である。本発明の実施形態において、検出抗体はＢ１５２アッセイではＢ２０７であって、Ｂ１０９アッセイではＢ１０８である。本発明の実施形態において、非栄養膜悪性疾患は卵巣悪性疾患または前立腺悪性疾患である。
【００３２】
本発明の実施形態によると、試料は尿試料または血液試料である。本発明の１つの実施形態において、試料は少なくとも２連続日から採取した凝集体試料である。本発明の実施形態において、試料はスポット尿試料、最初の朝の***尿試料、または少なくとも２連続日についての最初の朝の***尿試料の凝集体試料である。本発明の１つの実施形態においては、抗体を検出可能なマーカーで標識する。本発明の実施形態において、検出可能なマーカーは放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズまたはビオチンである。好ましい実施形態において、放射性同位体はＩ１２５である。
【００３３】
最後に、本発明は、（ａ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態と特異的に結合する抗体とを接触させ；（ｂ）抗体およびｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の間の複合体の形成を可能とする条件下、試料と、該抗体と実質的に交差反応することなく無傷非ニック入りｈＣＧと特異的に結合する第２抗体と接触させ；（ｃ）形成された複合体の量を測定し、それにより、第１抗体との結合による試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態、および第２抗体との結合による試料中のｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態の量を決定し；（ｄ）対象においてｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対しｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の比率を決定し；次いで、（ｅ）経時的に、工程（ｃ）で測定された試料においてｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対するｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の比率を比較することを含み、ここに、工程（ｃ）で測定された試料においてｈＣＧの後期妊娠関連分子イソ形態に対するｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の連続する高い比率が対象における妊娠栄養膜病を示すことを特徴とする、対象からの試料において妊娠栄養膜病を検出する方法を提供する。
【００３４】
本発明の実施形態において、抗体はＢ１５２またはＢ１０９である。本発明のもう１つの実施形態において、検出抗体はＢ１０９アッセイではＢ１０８であり、Ｂ１５２アッセイではＢ２０７である。本発明の実施形態において、妊娠栄養膜病は絨毛癌または胞状奇胎である。
【００３５】
本発明の実施形態によると、試料は尿試料または血液試料である。本発明の１つの実施形態において、試料は少なくとも２連続日から採取した凝集体試料である。本発明の実施形態において、試料はスポット尿試料、最初の朝の***尿試料、または少なくとも２連続日での最初の朝の***尿試料である。本発明の１つの実施形態において、検出抗体Ｂ２０７またはＢ１０８は検出可能なマーカーで標識する。本発明の実施形態において、検出可能マーカーは放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズ、またはビオチンである。好ましい実施形態において、放射性同位体はＩ１２５である。
【００３６】
後記するごとく、ｈＣＧの予期せぬイソ形態は正常な初期妊娠の間に形成される。イン・ビトロバイオアッセイを用いると、これらのイソ形態はシグナル変換につき増強された能力を有するようである。これらのイソ形態は新規な本明細書中に記載する感度の良いイムノアッセイを用いて測定することができる。これは、初期妊娠喪失の１つの原因が成功した妊娠によって生じたより高い能力のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態を生じさせるのに失敗することである妊娠見込みを予測することを助けることができる。これは医師が失敗する妊娠を維持するのに介入するのを可能とする。必要なｈＣＧイソ形態の性質の同定は、妊娠を維持するのに適当な試薬を提供するであろう。
【００３７】
後記するｈＣＧのニック入り形態の測定のための新しい抗体は、生物活性を大いに減少させたｈＣＧの形態が少なくとも部分的には低下した生物活性による初期妊娠喪失（ＥＰＬ）に寄与するという仮定に基づいて開発された。ＥＰＬ患者で出現するｈＣＧが低下した生物学的活性を呈するという証拠が発見された。しかしながら、低下した生物活性の原因はＥＰＬ患者におけるニック入りｈＣＧの存在ではないと判断された。その代わり、妊娠を順方向妊娠を担う患者は増強された生物活性を持つｈＣＧのイソ形態を生じると仮定される。本発明は、血液および尿の臨床的試料中に直接的に存在する初期妊娠ｈＣＧのこの予期せぬおよび従前には特徴づけされていないイソ形態を測定するためのユニークな免疫化学アッセイを記載する。絨毛癌患者から単離されたｈＣＧのニック入り形態に対して反応して生じた抗体の１つはｈＣＧのニック入り形態に特異的ではないが、ｈＣＧの炭水化物変異体の中では区別されるように見えた。Ｂ１５２と命名されたこの抗体は絨毛癌患者からのｈＣＧ形態に優先的に結合するようである。妊娠間でのｈＣＧイソ形態の研究において、妊娠の最初の４週間におけるＢ１５２は、従前に記載されたＢ１０９ベースのアッセイによって例示される通常のヘテロダイマーｈＣＧアッセイにより測定された標準ｈＣＧイソ形態と比較してかなり多量のｈＣＧのイソ形態を測定したというユニークで予期せぬ観察が成された。事実、初期妊娠（***後第９、１０、１１日）において、Ｂ１５２はもう１つのモノクローナル抗体Ｂ１０９が測定したよりも２０倍多いｈＣＧを測定した。妊娠の後期において、Ｂ１５２イソ形態は減少し、Ｂ１０９によって測定された標準イソ形態よりも第３トリメスター妊娠尿が低い。さらに驚くべき観察は、非常に初期の妊娠において、高いＢ１５２／Ｂ１０９比率が成功した妊娠見込みに相関し、他方、低い比率は妊娠喪失に相関するということである。妊娠の間にここに記載したｈＣＧの潜在的に見逃されたイソ形態が成功した妊娠見込みの予測指標であり得るのでこの発見は重要である。かかるアッセイは広い医療的適用を有し、もしアッセイが妊娠が困難を来したようであることを示せば、妊娠の非常に初期に介入する機会を臨床家に提供する。
【００３８】
絨毛癌患者から単離されたｈＣＧのニック入り形態に対して生成されたがニック入りイソ形態については特異的ではないＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７が付されたハイブリドーマ細胞によって生産されたＢ１５２と命名された抗体は、ｈＣＧの炭水化物変異体の中で区別することができる。Ｂ１５２は、妊娠の最初の４週間以内では、従前に記載されたＢ１０９ベースのアッセイによって例示される通常のヘテロダイマーｈＣＧアッセイによって測定されたｈＣＧ標準イソ形態よりも多量ににて測定されるｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態につき特異的である。妊娠の後期においては、Ｂ１５２イソ形態は減少し、Ｂ１０９によって測定された標準イソ形態よりも第３トリメスター妊娠尿が低い。
【００３９】
以下の実験セクションにおいて本発明を説明する。これらのセクションは本発明の理解を助けるために記載するが、後記する請求の範囲に記載された発明を断じて限定する意図のものではなく、またそう解釈されるべきものではない。
【００４０】
【実験の詳細】
実施例１： 初期妊娠および初期妊娠喪失におけるｈＣＧの分子イソ形態
の分析
＜序論＞
正常な集団または推定生殖トキシン（Ｈａｋｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９５；Ｌａｓｌｅｙ，Ｂ．Ｌ．ら，１９９５）への暴露の結果として危険な集団いずれかにおいて、初期妊娠喪失（ＥＰＬ）の発生のほとんどすべての調査は、ヘテロダイマー非ニック入りｈＣＧのためのアッセイまたはさらにｈＣＧの遊離ベータサブユニットおよびベータコア断片を含む組合せアッセイを用いる。ＥＰＬでの測定に含まれるｈＣＧの形態についての１つの関心は、前記したニッキング現象に関して強調された。ニック入りｈＣＧ分子はほとんどのＥＰＬ研究で使用された抗体によっては測定されないので、ＥＰＬの発生率は尿分子におけるニッキングの程度に比例した尿によっておそらくは過小評価される。かなりな重要性のもう１つの関心は、月経周期の卵巣周囲サージにおける尿での「ｈＣＧ様」免疫反応性の性質の測定であった（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｊ．ら、１９９５）。最近の報告は、下垂体で生産されたｈＣＧの硫酸化形態の存在を確認しており、その構造を記載している（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９９６ｂ）。男性および妊娠していない女性の双方において、ｈＣＧの脈動的分泌がある（Ｏｄｅｌｌ，Ｗ．Ｄ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．，１９８９およびＯｄｅｌｌ，Ｗ．Ｄ．、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．，１９８７）。***時にピークとなり、恐らくは黄体相に終始送られる、下垂体起源の硫酸化ｈＣＧの非妊娠関連形態の存在は、ＥＰＬの正確な見積りに潜在的に干渉し得た。
【００４１】
妊娠の非常に初期の血液および尿中のｈＣＧの認識されないイソ形態は妊娠後期に生産されるｈＣＧの形態よりもイン・ビボで優れているであろう。かかる形態の不存在は初期妊娠喪失の１つの原因であろう。感度が良く特異的なイムノアッセイ系をデザインし、ｈＣＧのユニークな初期妊娠関連分子イソ形態（ＥＰＭＩ）を測定するようにした。炭水化物組成により異なるようであるこれらのイソ形態は成功した妊娠見込みを予測する。これらのｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態が存在しないかまたは低濃度で存在する場合、妊娠は非常に初期に失われ、「化学」妊娠としてのみ観察され得る。これらのｈＣＧイソ形態は、それからモノクローナル抗体Ｂ１５２を生産するのに使用される免疫源が後記するごとく誘導されるいく人かの絨毛癌患者で生産されたｈＣＧの形態に似ているであろう。該イソ形態は、ニッキングまたは無傷ペプチド鎖の点ではなく炭水化物含有量においては栄養膜病からのものに似ている。本発明は、Ｂ１０９エピトープに対するＢ１５２エピトープのモル比率が成功した妊娠または喪失を予測することを記載する。妊娠患者のこれらのカテゴリー：（ａ）正常妊娠婦人、（ｂ）再発流産を経験する婦人（ｃ）胚着床を受ける婦人を分析した。
【００４２】
再発自然発生流産の履歴を有する婦人の血液および尿に存在するｈＣＧイソ形態および胚着床を受ける婦人の同様の分析を測定することができる。健康な集団における合わせたＥＰＬおよび自然発生流産率は３８％である。３連続再発自然発生流産を経験する対象はもう１つの流産を維持する３２％の危険性を有する（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．，１９９０）。試験管内受精ＩＶＦ妊娠において、喪失率は非ドナー***で７０％であり、ドナー***を用いる場合５０％である。陽性の見込みを持つ妊娠から陰性の見込みを持つ妊娠を予想することは、ＥＰＭＩ ｈＣＧイソ形態の濃度の差異に基づき得る（患者におけるＢ１５２／Ｂ１０９比率における差異として）。加えて、妊娠栄養膜病（ＧＴＤ）からの検体を用いてＧＴＤおよび正常妊娠の間を区別することができる。
【００４３】
＜結果＞
ｈＬＨ／ｈＣＧについてのイン・ビトロバイオアッセイ
機能的ヒトＬＨ／ＣＧ受容体を発現するＣＨＯ細胞を使用してｈＣＧバイオアッセイを構築した。図１はこのアッセイによって測定したニック入りおよび非ニック入りｈＣＧの間の生物学的活性におけるイン・ビトロ差異を示す。この系は下垂体および胎盤ｈＣＧの活性を評価するのに用いられてきた（Ｂｉｒｋｔｎ，Ｓ．ら、１９９６ｂ）。ｈＣＧの調製物を、第２の組換えバイオアッセイ系におけるｈＣＧのニック入りおよび非ニック入り分子イソ形態につきテストした（Ｈｏ，Ｈ−Ｈ．ら、１９９７）。同様の結果が両方の系で得られた。
【００４４】
ＥＰＬ値と比較した正常妊娠値
図２はニック入りｈＣＧが初期妊娠またはＥＰＬいずれかの重要なモラー構成要素ではないことを示した。データは、生物学的活性がニック入りｈＣＧには相関しないが、代わりに、Ｂ１５２モノクローナル抗体によって認識されたｈＣＧの形態−−ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態（ＥＰＭＩ ｈＣＧ）に帰せられることを示した。初期正常妊娠と比較してＥＰＬに関連する減少したｈＣＧ生物活性があることが確立されている（Ｈｏ，Ｈ−Ｈ．ら、１９９７）。かくして、減少したｈＣＧ生物学的活性はｈＣＧの従来認識されていないイソ形態−ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の結果としてのＥＰＬでの因子である。
【００４５】
ｈＣＧ尿分析
ｈＣＧおよびｈＬＨの代謝産物を種々の状態で調べた（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９９６ａ）。１つの実験は３１％妊娠喪失を示し（Ｚｉｎａｍａｎ、ＭＪ．ら、１９９６）、他方、もう１つの実験はｈＣＧアッセイに基づく初期妊娠喪失の１７．４％の率を示した（Ｅｌｌｉｓｈ，Ｎ．Ｊ．ら、１９９６）。ｈＣＧおよびｈＣＧベータコアが着床がなくても子宮から循環に容易に移ることができるのは知られている（Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，１９９７）。ＥＰＬサイクル、正常妊娠サイクルおよび非妊娠サイクルにおけるｈＣＧ尿分析の分子スペクトルが評価されている。調査のデザインおよび人口学は記載されている（Ｅｌｌｉｓｈ，Ｎ．Ｊ．ら、１９９６）。
【００４６】
略言すると、***から計算して第９、１０、１１日対応するサイクル当たり３尿検体を収集し、無傷非ニック入りｈＣＧ、ｈＣＧ遊離ベータサブユニット、およびｈＣＧベータコア断片を同時に検出するスクリーニングアッセイ（「ＣＯＭＢＯ」）で分析した。これらの分析物の各々、ならびにニック入りｈＣＧおよびモノクローナル形態Ｂ１５２によって検出された無傷ｈＣＧの形態（ＥＰＭＩ ｈＣＧ）についての個々の測定をこれらの検体で行った。加えて、黄体相ｈＬＨ尿分析の濃度はｈＣＧアッセイにおける交差反応のため関心事であるので、正常妊娠サイクルおよび非妊娠サイクルに
おいて無傷ｈＬＨ、ｈＬＨ遊離ベータサブユニットおよびｈＬＨベータコア断片のレベルを測定した。表Ｉは使用したイムノメトリックアッセイの特徴をまとめる。
【００４７】
【表１】

【００４８】
ａ−（もし示さなければ）ｈＬＨ、遊離ベータｈＬＨ、ｈＬＨベータコア断片、ｈＣＧ、遊離ベータｈＣＧ、ｈＣＧベータコア断片；
ｂ−（もし示さなければ）（ａ）と同一＋ニック入りｈＣＧおよびニック入り遊離ベータｈＣＧ（妊娠）。
【００４９】
該結果は、ニック入りｈＣＧがＥＰＬまたは初期正常妊娠いずれかにおいて尿ｈＣＧ免疫反応の優位なモル分率を構成しないことを示す。加えて、妊娠およびＥＰＬ双方において幾人かの対象ではｈＣＧ遊離ベータサブユニットの実質的排出がある。さらに、ＥＰＬおよび正常妊娠サイクルは測定された分析物の全てを可変的に発現する。発現の発生率およびレベルは共にＥＰＬおよび正常妊娠の間で異なるが、いずれかの状態に特有のｈＣＧ関連分析物はない。しかしながら、対照集団（非妊娠サイクル）および正常妊娠群においてｈＬＨ関連分析物の間に明瞭な差異があった。非妊娠サイクルの実質的に全てはｈＬＨ遊離ベータサブユニットおよびｈＬＨベータコア断片を発現し、他方、妊娠サイクルの１／３のみが検出可能なレベルのいずれかの分析物を有した。無傷ｈＬＨは両方の群においてｈＬＨプロフィールの重要でない構成要素であることが判明した。
【００５０】
これらの発見は、ＥＰＬの検出においてｈＣＧベータコア断片を測定する必要性、およびｈＣＧベータコアアッセイが、ＥＰＬ測定が行われる黄体相のその部分に存在することが示されたベータコアｈＬＨと交差反応しないことを確認する必要性の双方を示す。該データは図２にまとめる。
【００５１】
群間のｈＣＧ分析物値の広い移動によりより有用な分析を生じるようにモル分率へ分析物値を変換した後に統計的解析を行った。モル分率データは、判別分析によっておよびＬＭＰを取り込む混合効果モデルによって評価した。判別分析は（平均から２倍標準偏差よりも大きな値と定義される）「孤立値」を除去しておよび除去することなく行った。両アプローチは同様の結果を生じた。
【００５２】
偏りを最小化するための交差有効化方法に基づく二次判別分析は正常妊娠対象の９１％およびＥＰＬ対象の８０％を正しく分類した。
【００５３】
ＬＭＰは無傷ｈＣＧアッセイにおいて有意な時間または群（ＥＰＬ−対−正常）効果が見いだせなかったので、分析物のモル分率および時間の間の相互作用につきテストする混合効果分析を行った。ｈＣＧアッセイの遊離ベータサブユニットにおいて、有意な群効果があるが時間の傾向はない。ｈＣＧベータコア断片測定およびＢ１５２測定の双方において、ホルモンレベルおよびＬＭＰからの時間傾向はＥＰＬおよび妊娠群の間で有意に異なった。この研究はいくつかの重要な知見を生じた。初期妊娠およびＥＰＬ双方において、ＥＰＬが終点測定である疫学的実験でいずれのｈＣＧ分析物を測定するかの論争を解決する分析物のスペクトルをそれは規定した。より重要には、それは、分析物のパターンおよび初期正常妊娠およびＥＰＬの間のその出現の経時双方において優位な差異があることを最初に示した。この観察は、治療介入を可能とする時点における尿ｈＣＧ測定による困難妊娠の非常に初期の予測を容易とする。
【００５４】
２つのＩＲＭＡ（Ｂ１５２−Ｂ２０７およびＢ１０９−Ｂ１０８）におけるｈＣＧの異なる形態の免疫反応性
ｈＣＧの３つの異なる形態（尿ｈＣＧ、下垂体ｈＣＧおよび絨毛癌ｈＣＧ Ｃ５）の相対的結合は２つのｈＣＧアッセイで特徴づけられた（図３）。尿非ニック入りｈＣＧおよび下垂体ｈＣＧは２つのＩＲＭＡＳによってほとんど同等によく認識され、他方、Ｃ５認識はかなり異なる。Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイはＣ５に対してより感度が良く、これは予測されるべきものである。なぜならば、Ｂ１５２抗体はＣ５に対するより高い親和性を基礎として開発され、選択されるからである。尿非ニック入りｈＣＧはプールされた正常妊娠ｈＣＧのＣＲ１２７調製物から精製される。逆に、Ｃ５はＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイによってより低い親和性にて認識され、これは後期妊娠のｈＣＧイソ形態に対する主要な特異性を有する。
【００５５】
本発明者らは、妊娠を通じて血清または尿中のｈＣＧイソ形態の変化を直接的にプロフィールする方法を開発した。ｈＣＧについての２つのＩＲＭＡを使用し、各々は異なるｈＣＧエピトープに対するモノクローナル抗体に基づく。Ｂ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイは、ヘテロダイマー−非依存性エピトープに対する通常に使用される無傷ｈＣＧアッセイである。新しいアッセイＢ１５２−Ｂ２０７^＊はｈＣＧカルボキシ末端ペプチドの炭水化物部分に対して最も感受性であるようである。同一の標準非ニック入りｈＣＧを両方のアッセイで用いた。Ｂ１０９アッセイはｈＣＧのニック入り形態とあまり反応しないが、Ｂ１５２アッセイはホルモンのニック入りおよび非ニック入り形態の間を識別しないので非ニック入りｈＣＧを使用した。Ｂ１５２アッセイはＢ１０９アッセイによって測定されたイソ形態よりも妊娠初期に出現するｈＣＧイソ形態をかなり増大した感度でもって検出した（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、１９９８）。この報告で記載された新しいイムノメトリックアッセイ系の開発に先立ち、非常に初期の妊娠ないし中期妊娠のｈＣＧイソ形態の変化を容易に識別することはできなかった。これらの変化を調べるための唯一の利用可能な手法は各患者の検体の等電点電気泳動、続いての各泳動された画分のイムノアッセイであった（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９３；Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、１９９０）。ＩＥＦパターンは、シアル酸が末端糖にある炭水化物基のマルチアンテナ構造で変化する荷電糖であるシアル酸の不均一性を反映する。本発明者らは測定すべきイソ形態エピトープの正確な性質を未だ知らないが、炭水化物区別のための証拠は、Ｂ１５２モノクローナル抗体およびＪＡＲ絨毛癌細胞系で見いだされるｈＣＧイソ形態との抗体の反応性を開発するのに用いた免疫原Ｃ５の超グリコシル化構造に基づく。Ｃ５ ｈＣＧを絨毛癌患者から単離し、その蛋白質および炭水化物含有量および構造に関して決定的に特徴付けられている（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９７）。Ｃ５（および他の絨毛癌対象からのｈＣＧ）は、主として、増大した数のニック入り部位の存在によって、および正常妊娠のｈＣＧに対する増大したグリコシル化によって蛋白質部位が異なる。正常妊娠のｈＣＧとの比較において、絨毛癌由来ｈＣＧはベータサブユニットにおいてＮ−結合ビアンテナオリゴ糖の増大したフコジル化を有する。加えて、調製物Ｃ５におけるＯ−結合オリゴ糖（絨毛癌を有する１人の患者から生じたｈＣＧの形態）は、ベータサブユニットのＣＯＯＨ−末端領域に１００％四糖コアを有する。正常中期妊娠ｈＣＧはこの構造の１０−２０％を有するにすぎない（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９７）。これらの観察、それに加えて、ＪＡＲ絨毛癌細胞系によって合成されたｈＣＧが初期妊娠で観察されたものと同様のＢ１５２／Ｂ１０９イソ形態比を供するという本発明者自身の判断は、非常に初期の妊娠において、発生する栄養膜が絨毛癌で生じたものに似たｈＣＧのイソ形態を分泌するという結論に導く。
【００５６】
また、本発明者らは、下垂体ｈＣＧの認識をテストした。というのは、そのＮ−Ａｓｎ炭水化物は、シアル酸および硫酸塩基を共に有するｈＬＨのものに対するかなりの類似性を担う、胎盤ｈＣＧのものとは幾分異なるからである（Ｂｉｒｋｅｎら、１９９６）。下垂体ｈＣＧのｂ ＣＯＨ−末端部分の炭水化物構造は未だ知られていない。Ｂ１５２は下垂体および胎盤ｈＣＧの間のいずれの実質的差異も認識しないので（図３）、Ｎ−Ａｓｎ認識における差異は同様ではない。ＣＯＯＨ−末端炭水化物の点では、下垂体および胎盤ｈＣＧ（中期−妊娠イソ形態）は同様であるように見え、Ｃ５抗原上のＯ−結合炭水化物はＢ１５２のエピトープの一部であると推定される。
【００５７】
実施例２： Ｂ１５２／Ｂ１０９比は妊娠の見込みを予測する。
【００５８】
妊娠を通じて尿試料中で測定されたＢ１５２／Ｂ１０９比
１０３の正常妊娠尿試料（最後の月経期間後５−３９週−ＬＭＰ）におけるｈＣＧイソ形態の相対的濃度は２つのイムノメトリックアッセイ（Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊およびＢ１０９−Ｂ１０８^＊）によって測定された。同一妊娠年齢においてさえの異なる試料中のｈＣＧ濃度の広い範囲のため、およびアッセイのいずれも存在するｈＣＧイソ形態の２（またはそれ以上）ファミリーに全く特異的でないので、本発明者らは、観察された２つのイソ形態群の比率としてのデータを提示することが、妊娠が進行するにつれてのイソ形態含有量の変化をより明らかに示すことを見いだす。この計算された比率は図４に示される。妊娠の５ないし８週において、Ｂ１５２／Ｂ１０９イソ形態の比率は６．２および１．３の間の範囲であり、これは初期妊娠におけるＢ１５２イソ形態の優位性を示す。１０ないし１２週の間に、該比率は１ないし０．２の範囲であり、これはｈＣＧイソ形態含有量の逆転が妊娠が進行するにつれて起こりつつあることを示す。１５ないし１８週の期間において０．５４−０．０８の範囲であり、２９週において変曲点に到達する、比率のこの現象が継続する。その時点において、該比率はほぼ０．０６の値に到達し、しかる後、該比率は妊娠期間の３７−３９．５週における０．２−０．０７の範囲までの上昇を示した。統計的解析は、二次および三次多項回帰モデルに対数変換比率データを適合させることを含む。三次項は有意ではない（尤度比率ｃ２（１）＝１．３２、Ｐ＝０．２５）、二次モデルを用いた（ｒ２＝０．７９３）。ｌｏｇ Ｂ１５２／Ｂ１０９比率は、このモデルに基づくと、ＬＭＰ＝２９週に変曲点に到達した。
【００５９】
Ｂ１５２／Ｂ２０７^＊値は、後期妊娠ｈＣＧ等量の点でＢ１５２イソ形態の測定を反映するが、絶対的量は反映しない。Ｂ１５２アッセイにおける「絶体」濃度測定は等モルベースのＢ１０９アッセイの結果と比較することはできないことを強調しなければならない。というのは、超グリコシル化イソ形態の能力は、標準、すなわち正常な後期第一トリメスター妊娠ｈＣＧと比較してＢ１５２アッセイではかなり高いからである。このイソ形態の現実のモラー値は該アッセイで記録されたものよりも１０倍低いオーダーである。この理由で、本発明者らは、２つの分析物の絶体的モラー量を分析することは選択せず、２つの測定の比率のみを選択した。
【００６０】
正常な妊娠においてさえ、得られたｈＣＧ値は使用された免疫学的試薬の特徴に従って広く変化する（ＣｏｌｅおよびＫａｒｄａｎａ，１９９２；Ｃｏｌｅら，１９９３）。本発明者らは、この報告に記載した２つのアッセイはこのスペクトルの対向端においてｈＣＧイソ形態を主として検出し、各々は主として初期ないし後期ｈＣＧ分子形態の連続において密接に関連した分子のサブセットを仮定する。
【００６１】
本発明者らは、この抗体立体配置における親和性のその低下にもかかわらず、Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイでの標準として正常妊娠ｈＣＧの使用を保持した。この理由は（１人の患者の尿から単離された）Ｃ５の限定されかつ更新できない供給および異なる標準を用いる調査に由来するデータの多様性を含む。この選択の結果は、初期妊娠ｈＣＧイソ形態が正常妊娠のそれよりも顕著に増加した免疫能力を有し、よって、そのモラー量は本アッセイでは過剰評価されるということである。本発明者らは、２つのアッセイ（Ｂ１５２およびＢ１０９）のモラー結果の比率を使用することによる本発明者らの利点に対する親和性のこの差異を使用する。いずかのアッセイは、正常な妊娠で起こるｈＣＧ値の広い移動によるこの変化を単独では曖昧なものとする。
【００６２】
他の者は妊娠を通じてのｈＣＧイソ形態の漸次の変化を記載している。Ｓｋａｒｕｌｉｓらは、無傷ｈＣＧおよびまたその遊離ベータサブユニットのフコース含有量が妊娠が進行するにつれて増加したことを見いだした（Ｓｋａｒｕｌｉｓら、１９９２）。妊娠を通じての循環ｈＣＧの等電点電気泳動パターンを調査するＤｉａｚ−Ｃｕｅｔｏらは、初期妊娠において、ｈＣＧイソ形態の８０％を超えて酸性であることを見いだした。この画分は第３トリメスターの後期には半分未満（４７％）まで減少した（Ｄｉａｚ−Ｃｕｅｔｏら、１９９６）。対照的に、ＷｉｄｅおよびＨｏｂｓｏｎは、初期妊娠のｈＣＧが、正常妊娠のｈＣＧよりもその大きな生物学的活性により「絨毛癌−様」であることを見いだした（ＷｉｄｅおよびＨｏｂｓｏｎ、１９８７）。Ｆｅｉｎらは、ゲル濾過を使用する研究において、第１トリメスターｈＣＧは第３トリメスターのそれよりも大きなサイズであると判断した。エキソグリコシダーゼでの処理はサイズの差異を排除し、これは第１トリメスターｈＣＧがより高度にグリコシル化されていることを示す（Ｆｅｉｎら、１９８３）。
【００６３】
ＪＡＲ細胞からのｈＣＧと比較した妊娠の第１および第３トリメスターにおけるマッチした血清／尿試料におけるＢ１５２／Ｂ１０９比
血清におけるＢ１５２／Ｂ１０９比率はマッチした尿試料で見いだされたものと類似であり、妊娠が進行するにつれて同様の変化を受ける（図５）。ＪＡＲ細胞（絨毛癌由来細胞系）からの細胞上澄みにおけるＢ１５２／Ｂ１０９比は初期妊娠のものと同様であった。
【００６４】
血清および尿ｈＣＧ濃度のＢ１５２／Ｂ１０９比は、正常妊娠の第３トリメスターと比較して第１トリメスターで有意に高い（表２）。血清および尿ｈＣＧ濃度比ならびに初期（５−６週）および後期（３６−３９週）妊娠におけるｌｏｇ変換比の間の有意差はペアードｔ−検定によって評価した（表３）。第１および第３トリメスターの双方において、尿Ｂ１５２／Ｂ１０９比は血清比よりも有意に高く、２つのイソ形態の相対的濃度にもかかわらず、Ｂ１５２−認識イソ形態の尿への優先的クリアランスがあることを示す。
【００６５】
【表２】

【００６６】
【表３】

【００６７】
ＩＶＦ患者からの尿試料におけるＢ１５２／Ｂ１０９比
ＩＶＦ患者（胚導入−ＥＴ後１−４週）からの尿試料において、天然妊娠で観察されたものと同様に、Ｂ１５２／Ｂ１０９比は再度２−８の間であって、妊娠が進行するにつれて減少した（図６）。見込み変数に関する妊娠持続の効果は直線または二次関数によって最良に表すことができる。二次オーダー週を含めたＡＮＯＶＡモデルを一般的方程式：見込み＝（ＥＴ後の時間）＋（診断の効果）に適合させた。適当なＡＮＯＶＡモデルを決定した後、最小二乗平均（ＥＴ効果後に週につき調整）を正常妊娠、異所性妊娠および自然発生流産集団の間で比較した（表４）。Ｂ１０９−Ｂ１０８^＊およびＢ１５２−Ｂ２０７^＊測定ｈＣＧ形態双方のｌｏｇ変換値は、異所性妊娠および自然発生流産双方を正常妊娠から区別した（Ｐ＝０．０００１）。ｌｏｇ変換値の比率は流産を正常妊娠から区別した（Ｐ＝０．０００１）。しかしながら、Ｂ１５２／Ｂ１０９もその比率のｌｏｇも妊娠障害を正常妊娠から区別しなかった。かなりの数の自然発生流産および異所性妊娠がＩＶＦ妊娠で起こる。本発明者らは、正常対照と比較してこれらの２つのカテゴリーいずれかの間のイソ形態の比率の差異を見いださず、これは低い統計学的力である。しかしながら、正常妊娠および自然発生流産におけるＢ１５２ｈＣＧイソ形態レベルの間で有意な差異は見いだされた。これは、初期妊娠喪失における本発明者らの従前の知見を支持し、ここに、Ｂ１５２イソ形態の減少したまたは存在しないレベルは初期妊娠喪失を特徴付けた（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ，１９９８）。
【００６８】
【表４】

【００６９】
ａ−二次多項係数（またはパラメーター）でのＡＮＣＯＶＡモデル
ｂ−一次（直線）係数のみでのＡＮＣＯＶＡモデル；
ｃ−異なるＡＮＯＶＡモデルの２つのＲ２と異なる数の係数との比較が意味のあるものとなるように、調整したＲ２はＡＮＣＯＶＡモデルに対する係数のＲ２調整数である；
ｄ−「対の差異」は（週ＥＴの調整効果後の）見込み変数の最小二乗平均を比較するｔ−検定に基づく；
ｅ−Ｆ−検定での自由度は（ｔｆ１、ｄｆ２）は（２、８２）は直線係数のみでのモデルおよび（２、８１、８２、）直線および二次係数についてのモデルである。
【００７０】
栄養膜病試料のｈＣＧ分析
栄養膜病血清（１７試料）および尿（２８試料）は治療後患者から入手し、よって、低いｈＣＧレベルを含有した。限定された量の試料のため、これらの検体の全ては１：１０の初期希釈で実行した。血清のｈＣＧレベルは低かった。血清の最高ｈＣＧ濃度はＢ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイでは２０２ｆモル／ｍｌであり、Ｂ１０９−Ｂ１０８^＊測定では対応する値は１４８ｆモル／ｍｌであった。血清中の１７試料中の６つは検出可能なレベルを有し、４／６はＢ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイではより高い数値を有した。しかしながら、１５／２８陽性尿試料のうち、１４／１５はＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイにおいてよりもＢ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイでより高いレベルを有し、最高のｈＣＧ値はＢ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイでは２００００ｆモル／ｍｌであり、対応するＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイでは１８７１５ｆモル／ｍｌであった。小さな試料サイズのため、このデータでは統計学的処理は行わなかったが、これらの処理後患者においてさえ、Ｂ１５２／Ｂ１０９比は≧１であり、これは初期妊娠ｈＣＧイソ形態比に対応する。
【００７１】
前記した検体の制限は、栄養膜病試料の分析に対して本発明者らが決定的な結論に到達するのを排除した。しかしながら、予測されるごとく、処理後においてさえ、栄養膜病患者の血液および尿でｈＣＧ免疫反応性を検出するにおいて、Ｂ１５２アッセイはＢ１０９アッセイよりも感度が良好であるように見える。
【００７２】
妊娠プールの第１週のクロマトグラフィー
Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイが無傷ｈＣＧ分子に加えてｈＣＧ関連免疫反応性の他の形態を認識したか否かを判断するために、検体をプールした。ｈＣＧの特徴づけられた形態の全てについてのタンデムＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムでのＦＰＬＣ、続いての画分のイムノアッセイは、無傷ｈＣＧ分子（ｈＣＧ遊離ベータサブユニット）がこのアッセイにおいてシグナルを与えたことを明らかとした（図７参照）。Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイによって同定された低分子量画分はなかった。ｈＣＧ遊離ベータ分析物は図２に記載された尿で測定され、これらの検体における全てのｈＣＧ免疫反応性にわたって無視できる寄与を成すことが判明した。
【００７３】
尿および下垂体抽出物におけるモノクローナル抗体Ｂ１５２によって認識された分子
Ｂ１５２によって認識されたｈＣＧイソ形態の性質を規定するために、下垂体抽出物および閉経後尿濃縮物双方の高分解能ゲル濾過を用いた。下垂体抽出物の使用に対する根本的な理由、交差反応性分子、特にグリコシル化されたもの、糖蛋白質ホルモンの全ファミリー、ｈＬＨ、ｈＴＳＨ、およびｈＦＳＨならびに遊離サブユニットおよび下垂体形態のｈＣＧを含有する下垂体に豊富なものを測定することにある。２つのピークがこれらの場合の双方で検出される。１つのピークのみが前記した妊娠尿濃縮物の同様の実験で検出された。下垂体においては、より大きな分子は下垂体ｈＣＧであり（７０Ｋ）、他方、より小さなサイズの分子はｈＬＨであるようである。ｈＬＨは下垂体ｈＣＧと比較して１００×位で存在するので、免疫反応性の見かけの同様の濃度は、Ｂ１５２がｈＣＧと比較してｈＬＨに対した低下した交差反応性を有することを示す。同様に、ｈＣＧおよびｈＬＨは共に閉経後尿中で見いだされ、再度、ｈＣＧおよびＢ１５２パターンよりもより多いｈＬＨは下垂体抽出物のそれと同様である。これらの結果は、Ｂ１５２が一般的には（表Ｉ中の標準交差反応実験によって示されるごとく）ｈＬＨに対する交差反応性を除いてｈＣＧ特異的であり、その炭水化物特異性は蛋白質部分に対するものならびにｈＣＧの炭水化物基に対するもの（およびより程度は低いがｈＬＨに対するもの）双方のものであることを示す。というのは、それは下垂体に存在する多数の他のグリコシル化蛋白質と反応せず、またｈＣＧまたはｈＬＨ−関連分子を除き閉経後尿にあるものと反応しないからである。
【００７４】
ｈＣＧの分子イソ形態における差異を認識する２つのアッセイＢ１０９−Ｂ１０８^＊およびＢ１５２−Ｂ２０７^＊を用いて血清および尿検体を分析した。表Ｉ参照。ｈＬＨ／ｈＣＧについてのイン・ビトロバイオアッセイは前記した（図１参照）イムノメトリックアッセイは９６−ウェルのマイクロリットルプレート技術を使用する。感度および範囲の最も満足できる組合せを供するために決定した濃度において、コーティング抗体を炭酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ９．５）中のマイクロタイターウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＶ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に適用する。プレートを４℃にてコーティング溶液と共に一晩インキュベートし、次いで吸引し、洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、０．１５Ｎ ＮａＣｌ）で洗浄し、ＢＳＡの１％溶液でブロックする（室温で３時間）。ＢＳＡ溶液を吸引し、検体マトリックスに適当には、緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／０．１％ウシＩｇＧ／０．１％アジ化ナトリウム）中、ｈＣＧ遊離血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）中、またはｈＣＧフリー尿中の適当なｈＣＧ標準（２００μｌ／ウェル）、および検体をウェルに添加する。プレートをプレートシーラーでシールし、４℃で一晩インキュベートする。次いで、対照、検体および標準を吸引し、プレートを洗浄溶液で５回洗浄し、緩衝液Ｂ（２００μｌ／ウェル、１０００００ｃｐｍ／ウェル）中のヨウ素化検出抗体を添加し、４℃で一晩インキュベートする。ウェルを再度吸引し、洗浄溶液で５回洗浄し、分離し、カウントする（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａガンマでカウントする）。カウントデータの平滑化値をスクライン変換から内挿する。このアッセイ手法ならびにアッセイ有効化は従前に報告されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｆ．ら、１９８８）。
【００７５】
クレアチニン分析
は、尿値をクレアチニンに正規化した場合に、Ｔａｕｓｓｋｙ手法の修飾法に従ってマイクロタイタープレートフォーマットにて行う（Ｔａｕｓｓｋｙ、Ｈ．Ｈ．，１９５４）。
【００７６】
記載的統計学的およびグラフィク方法を正常な健康妊娠からの血清および尿試料の測定に適用してａ）患者の第１トリメスター平均Ｂ１５２レベル、Ｂ１０９レベルおよびＢ１５２／Ｂ１０９比の間；ｂ）１．００に到達するＢ１５２／Ｂ１０９比に間に合った患者の変動性間を；およびｃ）第１トリメスター最大レベルから１／３だけ減少するＢ１５２／Ｂ１０９比に間に合った患者の変動性間の分布を確認する。これらの２つの分析物の比率における交差のタイミングでの変動性は、生きた第３トリメスター胎児の生化学兆候としてのこれらのマーカーの値をそれから見積もる経験的ベースを提供する。
【００７７】
失敗したＩＶＦ着床、２つの非バロメーター仮定からの不成功妊娠のものに対する健康な正常妊娠のアッセイプロフィールの比較は入手可能である：１）Ｂ１５２／Ｂ１０９比が１．００未満となる妊娠の割合は健康正常および不成功ＩＶＦ妊娠で差異はない；Ｂ１５２／Ｂ１０９比が第１トリメスター最大値から１／３だけ減少する妊娠の割合は健康正常および不成功ＩＶＦ妊娠で差異はない。これらの仮定は２つの割合の間の差異としてテストすることができる。例えば、各々、健康正常妊娠および不成功ＩＶＦ着床においてＢ１５２／Ｂ１０９比の逆転を示すための、週１４−対−週９、週１３−対−週６、週１２−対−週５または週１１−対−週４妊娠の比較。パワー分析は、第１トリメスター最大レベルから１／３だけＢ１５２／Ｂ１０９比が減少する時間と定義される見込みに適用されるが、この見込みはＢ１５２／Ｂ１０９比の逆転よりも妊娠失敗の早期の検出を必ずしも提供しないであろう。これらからあまり異ならない結果のパターンは、妊娠失敗の臨床的に意味のあるマーカーとしてのＢ１５２／Ｂ１０９比逆転の両分的見込みの拒絶を示す。
【００７８】
別法として、健康正常妊娠および失敗したＩＶＦ着床からの不成功妊娠のアッセイプロフィール内の生化学的事象のタイミングを考慮することによって、同一の２つの非パラメーター仮定をパラメーター仮定として練り直すことができる；１）Ｂ１５２／Ｂ１０９比が１．００未満となる時間は健康正常および不成功ＩＶＦ妊娠で差異はない；２）Ｂ１５２／Ｂ１０９比が第１トリメスター最大レベルから１／３だけ減少する時間は健康正常および不成功ＩＶＦ妊娠で差異はない。もちろん、目的は、臨床家がその患者をそれからカウンセリングできる経験的基礎を提供することである。かくして、データ分析のこの構成要素につき理論的モデルを採用するのは重要である。見込みとしての妊娠成功では、理論的モデルは、Ｂ１５２／Ｂ１０９比が第１トリメスターベースライン最大値から１／３だけ減少しなかった、あるいはＢ１５２／Ｂ１０９比が（数週間内に測定して）１．００未満とならなかった各さらなる週につき妊娠失敗の危険性の増加の（対称）仮定の見積もりを可能とする。妊娠間に規則的に入手できるアッセイデータを仮定すれば、理論的モデルは、結果が特定の妊娠が失敗の先験的規定の尤度を越えることを示す時点の仕様を可能とし、同一のデータ解析フレームワークに妊娠失敗についての他の危険性を入れ込むことにより、妊娠喪失に対する心配の相対的寄与を評価することができるようにする。Ｃｏｘ比例有害モデルを用いて交差率のプリディクターを調べることができる。また、混合効果モデルは全サイクルの間に採取したＢ１５２／Ｂ１０９比の反復測定を解析することができる。これらのモデルは不完全なおよび釣り合いの取れないデータ（すなわち、失われた値およびデータ収集の等しくないタイミングを伴うデータ）を含めても、時間を変動させた共変量の効果を見積もり、反復測定の依存性構造をモデル化し、および各実験群内の比測定の可能な不均一性をモデル化するのを可能とするので、該モデルは特に有用である。
【００７９】
初期妊娠尿から単離されたＢ１５２ｈＣＧイソ形態およびその蛋白質および炭水化物構造の測定
尿の濃縮および免疫親和性抽出の既に開発されたスキームを用い、蛋白質および炭水化物双方の分析のために、早期妊娠の婦人から収集した尿からｈＣＧ分子を単離する。１つのアプローチによると、分子をＨＰＬＣ画分から単離し、ジスルフィルド結合の還元、質量分析および／または配列分析による得られたペプチドの調査、グリコシダーゼ消化後の炭水化物基の単離および特異的グリコシダーゼの組合せおよび既知の分岐鎖オリゴ糖標準と比較した特殊アニオン交換カラムでの保持時間による炭水化物構造の測定の前後にプロテアーゼで消化する。同様のアプローチにおいて、単離されたｈＣＧイソ形態についての最終精製段階はＳＤＳゲル電気泳動である。プロテアーゼ消化およびグリコシダーゼ消化は共にブロットし切り出したバンドで行う。この方法の結果、精製された蛋白質におけるものではないが、汚染物外に由来する炭水化物による汚染のため、蛋白質のより大きな純度およびより小さな人工的誤差が得られる。
【００８０】
炭水化物組成分析およびオリゴ糖分岐鎖同定
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析方法を用いて、糖ペプチドに対して特異的グリコシダーゼを用い、糖が糖ペプチドから消化されて去るにつれての分子量の変化を測定することによって、オリゴ糖の構造を確認することができる。ｈＣＧベータＣＯＯＨペプチドのみがＯ−結合糖部位を含有すると予測することができる。Ｂ１５２はこの領域とかなり反応すると考えられるのでこれらは特に興味深い。Ｏ−結合グリカンを特異的に放出する酵素を用い、この領域の構造を同様に決定することができる。Ｏ−結合構造は、標準的な参照妊娠ｈＣＧを用いてこれまでに調べられている（Ｃｏｌｅ，Ｌ．Ａ．ら、１９８５）。Ｏ−結合分岐鎖構造は、Ｄｉｏｎｅｘクロマトグラフィー系ならびにＣ−末端糖ペプチドに対する特異的グリコシダーゼおよび質量分析を用いて同様の戦略によって決定される。１つの研究（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９７）において、これらの技術を用いて、ＣＲシリーズｈＣＧ調製物（標準尿妊娠ｈＣＧ）の炭水化物構造が解明され、抗体Ｂ１５２を生成させるのに使用された免疫原であるＣ５のごとき患者試料の構造とそれらを比較した。Ｃ５は、Ｎ−Ａｓｎ残基上にかなり多いモノおよびトリアンテナを含有する（ＣＲ調製物よりも２倍のモノおよび３倍のトリ構造）ことが判明した。また、ＣＲ調製物におけるよりも絨毛癌ｈＣＧイソ形態において、より多くの四糖構造がｈＣＧ ＣＯＯＨ−末端ペプチドＯ−セリン残基上にあることも判明した。
【００８１】
ｈＣＧイソ形態の生物学的活性および代謝クリアランス
生物学的活性は分子構造よび構造によって影響され得る循環における半減期双方の関数である。糖蛋白質の炭水化物／シアル酸含有量の変化は妊娠を通じて観察されたｈＣＧの生物学的／免疫学的活性の変化の原因であると考えられる。加えて、受容体でのシグナル変換はｈＣＧイソ形態のｐＩおよび炭水化物の存在もしくは不存在によって影響される。かくして、イン・ビトロで受容体結合および生物学的活性を共に調べ、作用メカニズムを決定するために、受容体結合およびシグナル変換ならびに循環半減期のごときイン・ビボ生物活性決定基と共にシグナル変換の相対的能力を区別するのは価値あることである。クリアランス速度を含めた研究は初期の成功した妊娠のＢ１５２ ｈＣＧイソ形態、第３トリメスター妊娠からのｈＣＧ、および参照尿ｈＣＧ調製物、ＣＲ１２７で行う。
【００８２】
実施例３： 非栄養膜悪性疾患におけるＢ１５２およびＢ１５１免疫反応性
栄養膜病および精巣癌を除き、全ての他のタイプの癌を持つ患者の約２０％の血液で発現される（Ｈｕｓｓａ，Ｒ．Ｏ．，１９８７）。尿中のｈＣＧベータコア断片は、特に婦人科学悪性疾患においてかなり高レベルの発現を有する。Ｂ１５２抗体は悪性疾患で生産されたｈＣＧの形態に対して開発されたので、非栄養膜悪性疾患においてＢ１５２およびニック入りｈＣＧ免疫反応性（Ｂ１５１）の発現を調べるのて興味深かった。従って、前立腺癌につき化学療法を受けている男性または卵巣癌につき化学療法を受けている婦人に由来する血液および尿を、血漿および尿中でのｈＣＧイソ形態の発現につき評価した。前立腺癌においては、Ｂ１５２ ｈＣＧ免疫反応性がＢ１０９−Ｂ１０８^＊によって検出されたｈＣＧが無い場合の例において前立腺癌患者の血液および尿で見いだされることは重要である。評価した卵巣癌患者においては、Ｂ１０９およびＢ１５２免疫反応性両者の不存在下においてさえ、血液中でのニック入りｈＣＧの証拠がある。前記群のいずれも、標準妊娠由来のｈＣＧアッセイを使用した場合、ｈＣＧ免疫反応性の不存在を示さなかった。その存在がいく人かの研究者によって記載されているニック入りｈＣＧが臨床的状況で見いだすことができ、信頼性良く測定することができることが判明したのは喜ばしいことである。
【００８３】
実験の考察
これらの研究において、潜在的に重要な新しいシグナル、すなわち、妊娠を担う成功を示すことができるようであるｈＣＧの形態のエピトープが妊娠初期の婦人の尿で観察された。同様に、このシグナルの不存在はＥＰＬが起こるのを示すことができる。ＥＰＬは環境トキシンの非常の感度のよいマーカーであり（Ｈａｋｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９５）、しばしば、暴露の疫学的マーカーとして使用されるので、このエピトープの発見は環境の安全性をモニタリングするための強力なツールを提供する。加えて、このアッセイはＩＶＦ不妊プログラムの成功率の増大を容易とする。というのは、新しい測定系の予測される価値は成功したアプローチを迅速に示すだろうからである。成功した妊娠が妊娠の最初の数週間維持されるｈＣＧのユニークなイソ形態の高い含有量を示し、次いで、妊娠が進行するにつれて迅速に低下するという新規で完全に予期されぬ発見をここに記載する。イムノアッセイ系の特性に基づき、これらのｈＣＧイソ形態は超グリコシル化できると仮定される。これは決して報告されておらず、また以前には疑われていなかった驚くべき観察である。炭水化物分析（Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．，１９９７）は、抗体Ｂ１５２についての免疫原として使用されたＣ５ ｈＣＧが、天然妊娠尿ｈＣＧのＣＲシリーズと比較して、分岐鎖糖の２倍のモノアンテナ含有量および３倍のトリアンテナ含有量を含むことを示す。加えて、Ｏ−結合炭水化物はＣＲ１２７ｈＣＧと比較してＣ５中の二糖の代わりにほとんどが三糖である（ＣＲ１２７ｈＣＧは、ＣａｎｆｉｌｄおよびＢｉｒｋｅｎによって２０年前に調製され、今日以前として使用されているＣＲ１１９ｈＣＧであるＷＨＯ調製物である第３国際ｈＣＧ標準と同様である）（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９９１ａ）。Ｂ１５２はニック入りＣＲ１２７ ｈＣＧまたは非ニック入りＣＲ１２７ ｈＣＧよりもかなり良好にＣ５ ｈＣＧを認識する（Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９９３）。加えて、ＪＡＲ細胞型ｈＣＧは同様のアレイの炭水化物基を含有することが知られている。それは、健康妊娠における初期妊娠イソ形態と同様なＢ１５２によって認識されることが判明した。培養中のＪＡＲ細胞によって生産されたｈＣＧイソ形態（Ｂ１５２／Ｂ１０９比）が初期妊娠ｈＣＧイソ形態で見いだされるものと同様であるという観察は、特別のグリコシル化パターンを持つｈＣＧのタイプの生産が生きた妊娠のための要件であることを支持する。このグリコシル化パターンは後期妊娠に特徴的ではない。
【００８４】
種々の妊娠障害はテスト可能である。患者の１つのカテゴリーは、高い率の再発流産を経験する婦人からなる。公知の受精能問題を持たない集団においてさえ、妊娠喪失の全割合は３２％である（ＥＰＬ＋臨床的に認識された流産）（Ｗｉｌｃｏｘ，Ａ．Ｊ．，１９８８）。再発流産の危険性は過去に経験した自然発生の流産の数と共に増加し、三連続流産後には３２％の発生率に達する（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，１９９９）。遺伝的、感染、ホルモンアンバランス、または免疫学的因子を含む再発自然発生流産のありそうな原因は全ての自然発生流産の６０％未満で確立することができ、自然発生流産の４０＋％は完全に確率されていない原因とされる。外因性ｈＣＧの投与は再発自然発生の履歴を持つ対象で効果的な治療となり得ることを確立する報告（Ｑｅｕｎｂｙ，Ｓ．およびＦａｒｑｕｈａｒｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．，１９９４；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｆ．，１９８５）と一緒にするとこれらの事実は、初期妊娠におけるｈＣＧの効果的でないイソ形態の比例しない生産が初期前臨床喪失ならびに自然発生流産双方における原因因子であるという仮説に対して支持を与える。
【００８５】
第２のカテゴリーは胚導入を受けた婦人を含む。これらの患者はいくつかの区別される利点を提供する：この手法を受けている患者は粗製ｈＣＧ調製物で処置せず、これはｈＣＧイソ形態の測定を容易かつ決定的なものとする。というのは、全てのｈＣＧ形態は胚に由来し、いずれの注入されたｈＣＧ調製物に由来するものも無いからである。第２に、成功妊娠第９日からのイソ形態の性質をモニターする機会である。第３に、その構造を決定するための初期妊娠イソ形態を精製する多量の尿を得る能力である。第４に妊娠喪失はこの集団では５０％ないし７０％であるので、該喪失は、Ｂ１５２によって認識される必須ｈＣＧイソ形態の欠如または他の原因によるものと規定することができる。試験官内受精手法を受けない婦人の集団における初期妊娠と胚着床を受けるものとの比較が、かくして、初期妊娠状況が当該プロセスの間にｈＣＧイソ形態の同様なまたは異なるパターンを表すか否かを評価することができる。ＩＶＦプログラムにおけるかなり高い率の胚喪失と比較した一般的集団における妊娠喪失のメカニズムは異なり得る。加えて、絨毛癌で生産されたｈＣＧは炭水化物構造、シアル酸含有量および生物学的活性において差異を有することが確立されている（Ｗｉｄｅ，Ｌ．およびＨｏｂｓｏｎ、Ｂ．，１９８７；Ｅｌｌｉｏｔ，Ｍ．ら、１９９７；Ｈｕｓｓａ，Ｒ．Ａ．，１９８７）。Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイは絨毛癌に由来する免疫原に対して生起されたモノクローナル抗体を取り込むので、妊娠栄養膜病を持つ患者からの検体を評価して、前記アッセイが、精巣および卵巣癌で生産されたｈＣＧで明らかに当てはまるように、正常妊娠のｈＣＧに基づくアッセイよりも高い感度および特異性にてこれらの疾患で生産されたｈＣＧを認識するか否かを判断することができる。
【００８６】
妊娠の間のｈＣＧ−関連分子の炭水化物含有量の変化についての報告はほとんどない。Ｂｌｉｔｈｅおよび同僚は、その炭水化物含有量がさらなる炭水化物アンテナおよびフコースによるｈＣＧ内のアルファのそれと異なるｈＣＧの遊離アルファサブユニットを研究した。遊離アルファの炭水化物は妊娠が進行するにつれてより多い分岐およびより高い含有量の点でますます複雑となる。また、妊娠が進行するにつれてｈＣＧおよび遊離アルファ双方においてフコースの含有量が増大したということが報告されている（Ｓｋａｒｕｌｉｓ、Ｍ．Ｃ．ら、１９９２）。かくして、該文献はｈＣＧおよび遊離アルファサブユニットの炭水化物の増大する含有量および複雑性を示す。しかしながら、Ｂ１５２モノクローナル抗体を用いる免疫学的データは、妊娠の間のより単純な炭水化物含有量に対して進歩を意味する。ベータＣＯＯＨ−領域のＯ−結合炭水化物はＢ１５２によって認識されるエピトープに関与し得るので、この領域の炭水化物構造はＢｌｉｔｈｅおよび同僚によって研究されたＮ−結合グリカンとは異なるパターンで変化し得ることが考えられる（Ｓｋａｒｕｌｉｓ、Ｍ．Ｃ．ら、１９９２；Ｂｌｉｔｈｅ，Ｄ．Ｌ．およびＩｌｅｓ，Ｒ．Ｋ．，１９９５）。Ｓｋａｒｕｌｉｓらからのデータは、ヘテロダイマーｈＣＧがさらなるフコースを含有できることを示すが、この後期妊娠ｈＣＧが遊離アルファのように超グリコシル化されるようになるというデータを提供しない。
【００８７】
他の研究は、ＥＰＬの間のｈＣＧの形態が成功妊娠におけるｈＣＧイソ形態とは生物学的活性が異なるようであることを示す（Ｈｏ，Ｈ．−Ｈ．ら、１９９７）。それらの研究で使用されたイン・ビトロバイオアッセイは大規模な実験では不適当であって、本明細書中に記載したイムノアッセイほどは信頼できない。さらに、イン・ビボアッセイは異なる結果を与えるようである。というのは、イン・ビトロおよびイン・ビボアッセイは、時々、完全に共通点のない結果を与えるからである。この場合では、ｈＣＧイソ形態が全動物で真により優れたものであるか否かを判断し、および増大した能力に対する理由を確認するのに、イン・ビボおよびクリアランスアッセイが最も重要である。かくして、ｈＣＧの初期妊娠イソ形態のイン・ビトロおよびイン・ビボ生物活性はかなり重要である。
【００８８】
炭水化物の差異は、ＥＰＬの種々の研究（Ｈｏ，Ｈ．−Ｈ．ら、１９９７）によって観察された形態のごとき生物学的ないして免疫学的比率において広く認められた変異の説明である。種々の研究（Ｇｒｏｔｊａｎ，Ｈ．Ｒ．Ｊ．、およびＣｏｌｅ，Ｌ．Ａ．，１９８９；Ｈｏｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，１９９７；Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、１９９３；Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．ら、１９９５、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，Ｎ．Ｒ．ら、１９９４；Ｓｚｋｕｄｌｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．，１９９３）は、シアル酸の差異が糖蛋白質の生物学的活性におけるかかる不均一性の説明であることを示した。これらの研究は、イン・ビトロ生物学的活性が後者の研究における改変された代謝クリアランス速度のためイン・ビボ研究とは反対の結果を生じ得るというドグマも確認した。かくして、ゴナドトロピンのより酸性（より高度にシアル化された）形態は延長された循環半減期のため全動物でより生物活性である。同一分子は、より高い酸性度、より大きい負のシアル酸含有量のためイン・ビトロアッセイではより優れないようである。Ｈｏｅｒｍａｎｎら（Ｈｏｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら、１９９７）は尿からの酸性循環ホルモン形態の多くが排出され、かくしてその半減期を延長することを示した。血清中の正常妊娠ならびに栄養膜癌ｈＣＧのｐＩパターンは尿のそれとかなり異なる。本明細書中に記載した研究はＥＰＬ／ｈＣＧイソ形態が減少したイン・ビトロ生物学的活性を有することを示すので、この発見は生物学的活性およびシアル酸含有量で知られていることのみを持ってしては説明することができなない。モノクローナル抗体Ｂ１５２によって認識された初期妊娠イソ形態は、それらが次いで同様に受容体において増大したシグナル変換を示すことができる延長された半減期によってイン・ビボでより優れているであろう。これは超シアル化されていないｈＣＧの超グリコシル化形態によって説明することができる。この場合、過剰の糖部分は、イン・ビトロ生物活性を増大させたｈＣＧのより塩基性ｐＩ形態の循環半減期を延長するのを助けるであろう。
【００８９】
実施例４： 妊娠栄養膜病の診断
前記したＢ１５２（初期ｈＣＧイソ形態／Ｂ１０９（後期ｈＣＧイソ形態）比率分析の重要な適用は妊娠栄養膜病の非常に初期の（かつ容易な）診断である。妊娠栄養膜病の例は絨毛癌または胞状奇胎を含む。正常妊娠においては、ｈＣＧの２つのイソ形態のＢ１５２／Ｂ１０９の比率は迅速に低下し、結局は逆転する。絨毛癌または胞状奇胎を含めた妊娠栄養膜病においては、該比率は最初は正常妊娠で見いだされるものより高いが、明らかな妊娠のうちに減少しない。このアプローチは妊娠栄養膜病に対してかなり感度良好で特異的な診断マーカーを提供する。
【００９０】
ｈＣＧレベルが異常に高いか異常に低い他の妊娠障害はダウン症候群もしくは他の異数体妊娠、異所性妊娠、子癇前症状および子宮内成長遅延を含む。これらの疾患におけるｈＣＧ生産は正常妊娠と比較して量的に異常であるので、Ｂ１５２（初期ｈＣＧイソ形態）およびＢ１０９（後期ｈＣＧイソ形態）によって同定されたｈＣＧイソ形態の変化した比率を検出することができる。
【００９１】
かくして、デュアルイソ形態分析（Ｂ１５２／Ｂ１０９）は、さらに、妊娠障害および妊娠栄養膜病を診断するための方法を提供する。
【００９２】
＜材料および方法＞
ホルモン
ｈＣＧのＣＲ１２７調製物から単離された非ニック入りｈＣＧを両アッセイで標準として用いた（Ｂｉｒｋｅｎら、１９９３）。下垂体ｈＣＧは記載されているごとくに単離した（Ｂｉｒｋｅｎら、１９９６）。絨毛癌患者の尿から精製されたＮ−Ｏ−結合炭水化物基双方上に過剰の糖を有する１００％ニック入りｈＣＧであるＣ５（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９７）はＬａｕｒｅｎｃａ Ｃｏｌｅ博士（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から供給された。Ｂ１５２抗体の生成で用いられたＣ５免疫原は１００％ニック入りｈＣＧイソ形態であったが（すなわち、ｂサブユニットのループ２のペプチド骨格に切断を有したが）、該抗体は非ニック入りｈＣＧからニック入りｈＣＧを区別しなかった（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８）。
【００９３】
非ニック入りｈＣＧ、下垂体ｈＣＧおよびＣ５の同一系列希釈をｈＣＧアッセイにおける結合特徴付けで用いた。最初のストック標準溶液のホルモン濃度はアミノ酸分析によって測定した。
【００９４】
イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）
１Ｂ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイの構築および有効化で用いた方法は他の文献で十分に記載されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９８８）。また、該Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイも特徴付けられている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８）。両アッセイは公表された手法をわずかに修飾して行った：４℃にてコーティング緩衝液（０．２Ｍ炭酸水素塩、ｐＨ９．５）中で５μｇ／ｍｌ溶液（Ｂ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイ）または２５ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイ）を一晩インキュベートすることによって、捕獲抗体をマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＶ Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）のウェルに吸着させた。コーティング抗体溶液を吸引し、プレートを洗浄し（洗浄溶液：０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のＢＳＡの１％溶液でブロックした。ＢＳＡ溶液でのインキュベーション（室温で最小３時間）に続き、ブロッキング溶液を除去し、ウェルを再度洗浄溶液で洗浄し、２００ｍｌ／ウェルの適当なｈＣＧ標準を、リン酸緩衝液Ｂ（０．１％ウシ・ガンマグロブリンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中にて添加した。４℃での一晩のインキュベーション後に、プレートを再度吸引し、洗浄した。２００ｍｌ（５００００ｃｐｍ−１０００００ｃｐｍ）の１２５Ｉ−標識抗体をウェルに添加し、これを再度４℃で２４時間インキュベートした。トレーサーを吸引し、プレートを洗浄溶液で洗浄し、個々のウェルをガラス試験官中に入れ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａガンマカウンターで放射能を測定した。データ点の平滑化スプライン変換からの内挿によって用量を測定した。（最初の抗体は捕獲抗体であり、星印を付した第２の抗体はヨウ素化検出抗体である）。
【００９５】
全ての試料はアッセイに先立って−２０℃で凍結保存した。試料ｐＨの極端な値は抗体結合に緩衝し得るので、最終ｐＨが７−７．４の範囲になるように、１．０Ｍトリス（ｐＨ９．０）、５０μｌ／ｍｌ尿で尿ｐＨを調整した（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９８８）。アッセイ内変動は両アッセイで６％であり、アッセイ間変動はＢ１０９−Ｂ１０８^＊につき１２％であって、Ｂ１５２−Ｂ２０７アッセイでは１３％であった。ゼロキャリブレーターからの＋２ＳＤと定義される感度（最小検出可能用量）はＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイでは１ｆモル／ｍｌであって、Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイでは２．２ｆモル／ｍｌであった。
【００９６】
患者の試料
ＩＶＦ患者の尿試料はＬ．Ｃｏｌｅ博士からの贈られたものであった。それらは自然発生流産（ｎ＝１４、ＥＴ−胚導入から妊娠年齢１．８−４．１週の範囲）、異所性妊娠（ｎ＝７、妊娠年齢２．３−４週）および正常妊娠対照（ｎ＝６５、ＥＴから０．６ないし５．４週の範囲を含む）を含むものであった。妊娠を通じての正常妊娠尿試料のいくらかもＣｏｌｅ博士から得た。他のものはＣｏｌｕｍｂｉａ Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＰＭＣ）の共同研究医師の臨床的実線から得た（合計ｎ＝１０３）。第１（ｎ＝１２）および第３（ｎ＝１１）トリメスターからのマッチした血清／尿試料はＣＰＭＣのＡｍａｌｉａ Ｋｅｌｌｙ博士から提供された。栄養膜病血清（ｎ＝１７）および尿（ｎ＝２８）試料はＣｏｌｅ博士から入手したが、Ｅｄｗａｒｄ Ｎｅｗｌａｎｄｓ（Ｃｈａｒｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ロンドン、英国）によって収集された。全ての検体収集プロトコルは適当なＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ によって認可されたものであった。
【００９７】
統計学的解析
ｌｏｇ変換ホルモン比の多項回帰モデルを用いて、正常妊娠における妊娠年齢の関数として比率の変化の間の相関を記載した。ペアードｔ−検定を用いてマッチいた血清および尿ホルモン比の間の相関を評価した。共分散解析（ＡＮＣＯＶＡ）を用いて、正常妊娠に対する異所性妊娠および自然発生流産におけるホルモン値の時間調整された相関を記載した。
【００９８】
尿加工
２４時間尿試料は胚導入を受けた婦人ならびに初期自然妊娠の婦人から収集する。尿は収集手法の間に冷蔵する。尿を研究所に送った後、アジ化ナトリウムを１ｇ／リットルまで添加する。試験管内胚導入を受けた婦人はｈＣＧでは予備処理しない。かくして、その血液または尿に出現するすべてのｈＣＧは（全ての人々に存在する少量の下垂体ｈＣＧを除き）胚に由来する。生尿は遠心、続いての０．４５ミクロン膜を通すＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過によって粒子から遊離させる。次に、該手法は、３０００ＭＷカットオフ膜を用い、３０ｌから５００ｍｌへとかなり一晩で（４℃）濃縮するＰｅｌｌｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）系で尿を濃縮することである。その２時間未満で小容量を濃縮することができる。次に、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム中の大容量のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を通すことによって尿を脱塩し、脱脂質する。この工程は免疫アフィニティーカラムへのＣＧへの結合を大いに増加する。脱塩された尿濃縮物を次にＰｈａｒｍａｓｉａ Ｈｉｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００でサイズ分画し、ｈＣＧおよびｈＣＧサブユニットピークを特異的イムノアッセイ（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．ら、１９９４）によって同定し、適当な画分をプールし、乾燥する。ｈＣＧおよびｈＣＧサブユニットは、溶離剤として４Ｍグアニジン（０．１Ｍトリスアセテート、ｐＨ５）またはチオシアン酸アンモニウムいずれかを使用する以外は前記したごとくに不溶化ｈＣＧ抗体カラム上での免疫アフィニティーによってゲル濾過された尿濃縮物を生成して、ホルモンからのシアル酸の喪失を減少させる。別法として、ｈＣＧは通常のクロマトグラフィー手法、アニオン交換および疎水性クロマトグラフィーによって精製される。４Ｍグアニジン、０．１Ｍトリスアセテート、ｐＨ５でのインキュベーション後、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５緩衝液およびアセトニトリルを用いてサブユニットを逆相ＨＰＬＣで分離する。第３の方法は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動でのｈＣＧサブユニットの最終精製および分離、続いてのＰＶＤＦへの電気ブロッティングである。ＰＶＤＦバンドをプロテアーゼ消化に付してペプチドおよび糖ペプチドを放出させ、これを中性ｐＨを緩衝液にて逆相ＨＰＬＣで分離することができる。
【００９９】
単離されたｈＣＧサブユニットからの糖ペプチドの分離
ｈＣＧサブユニットからの糖ペプチドの単離を容易とするために、サブユニットを共にトリプシン消化し、消化の生成物を（ｐＨ５緩衝液を用いる）逆相ＨＰＬＣで分離する。この手法の結果、Ｏ−結合糖を含有する大きなベータＣＯＯＨ−末端ペプチドが除去される。それは両サブユニットから小さな非糖ペプチドも放出させる（Ｐｏｌｌｋ，Ｓ．ら、１９９０、Ｂｉｒｋｅｎ、Ｓ．ら、１９８７；Ｂｉｒｋｅｎ，Ｓ．ら、１９８６）。次に各ｈＣＧサブユニットの主要なジスルフィド−結合コアを還元し、カルボキシメチル化し、ｐＨ５で逆相ＨＰＬＣで分離する。この段階で、糖ペプチドを含めた大きなペプチドは単離される。各分離された糖ペプチドをトリプシンで再度消化し、ｐＨ５にてＨＰＬＣで再度分離する。これらの糖ペプチドは次に糖鎖分析の２つの異なる方法で使用される。１つの方法は、Ｎ−結合グリカンのためのＰＮＧａｓｅ Ｆを用いる酵素消化によってオリゴ糖を放出させるアプローチである。放出されたグリカンはエタノール沈殿によってペプチドから分離し、ノイラミニダーゼで脱シアル化し、Ｄｉｏｎｅｘ Ｃａｒｂｏｔａｃ ＰＡ−１００カラムで直接分離する。オリゴ糖標準は種々のグリカンについてのカラム溶出時間を較正するためにＴｉｏｎｅｘ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他の会社から入手できる（Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．およびＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，１９９４，Ｒｏｈｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、１９９３、Ｗｅｉｔｚｈａｎｂｌｅｒ，Ｍ．ら、１９９３；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．ら、１９８９）。放出された構造の確認は、溶出されたグリカンピークの炭水化物組成分析を行うことによって、ならびに特異的グリコシダーゼで消化を行い、Ｄｉｏｎｅｘ系で修飾されたグリカンを再度クロマトグラフィーに付すことによって得られる（Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，１９９４；Ｒｏｈｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら,１９９３；Ｗｅｉｔｚｈａｎｌｄｅｒ，Ｍ．ら，１９９３；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．ら，１９９１；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，１９８９；Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．，およびＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，１９８９；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．ら，１９８８；Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．ら，１９９７；Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．，およびＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，１９８８；Ｄｉｏｎｅｘ，１９９７；Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｍ．Ｗ．，１９９０；Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ，Ｒ．，１９９０）。新しく修飾されたグリカンは適当な標準オリゴ糖と同時に溶出するのを観察することができ、加えて、放出された単糖はしばしば同様に同定することができる（Ｄｉｏｎｅｘ，１９９７）。構造の決定は、分岐鎖切断ならびに分岐鎖の各々からの個々の糖の消化のための特異的グリコシダーゼの使用によって促進される。例えば、エンドＨは高マンノースタイプおよびハイブリッドオリゴ糖鎖を切断し、他方、グリコシダーゼエンドＦ２はＢアンテナ複合体型を切断し、ＰＮＡａｓｅ Ｆはトリおよびテトラーアンテナ鎖をＮ−Ａｓｎ結合まで切断する。
【０１００】
競合受容体結合およびイン・ビトロバイオアッセイ
バイオアッセイは、ＬＨ／ＣＧ細胞に対するヒト受容体でトランスフェクトされた組換え作成ＣＨＯ細胞で行い、ハムのＦ−１２培地、４ｍＭグルタミン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）、５％胎児ウシ血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中に維持する。ｖｅｒｓｅｎｅのみによってフラスコ表面から細胞を取り除く。
【０１０１】
競合受容体アッセイは以下のごとくに組み立てる：受容体結合アッセイ混合物は１００μｌの血清／尿試料の適当な希釈または標準曲線のためのｈＣＧ希釈、１００μｌの緩衝液Ａ（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）中の１２５Ｉ−ｈＣＧ（５００００−１０００００ｃｐｍ）および１００μｌのＣＨＯ細胞（ＰＢＳ中の２×１０５細胞）を含有する。混合物を、わずかに震盪しつつ３７℃でインキュベートし、続いて７５０×ｇにて１０分間遠心する。上澄みを吸引し、細胞ペレットをガンマカウンターで計数する。
【０１０２】
イン・ビトロバイオアッセイ
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養培地中の２５ウェルプレートに接種し（２０００００細胞／ウェル）、細胞が密集に到達するまで２ないし３日間インキュベートする。非トランスフェクトＣＨＯ細胞を含ませて、非特異的応答をモニターする。培地を取り出し、テストした血清または尿の適当な希釈と共に１ｍＭイソブチルメチルキサンチンを含有する培地で置き換える。プレートを３７℃で２時間インキュベートする。上澄みを除去し、ウェルをハンクスのバランス塩溶液で洗浄する。細胞内ｃＡＭＰを９５％エタノールで抽出し、これを、ｃＡＭＰキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）によって提供されたアッセイ緩衝液中で１：５または（ｃＡＭＰ含有量に応じて１：４０まで）希釈する。ｃＡＭＰアッセイは製造業者の指示に従って行う。応答をウェル蛋白質含有量に対して正規化する（ＢＣＡ蛋白質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）。
【０１０３】
イン・ビボバイオアッセイはＷｉｄｅおよびＨｏｂｓｏｎ（Ｗｉｄｅ，Ｌ．およびＨｏｂｓｏｎ，Ｂ．，１９８７）の手法に従って未成熟雌マウスにての尿重量アッセイによって測定する。３連続日にマウスを合計用量の１／３のゴナドトロピンで皮下注射し、最初の注射から７２時間後に犠牲にする。子宮を腸管膜、脂質および卵管から切開し、ブロットして子宮内流体を取り出し、０．１ｍｇに非常に近くまで漂流する。５ないし１０匹のマウスをこれらの用量レベルの各々で用いる。用いたｈＣＧ標準調製物はニック入りｈＣＧである。この物質は第１および第３トリメスター妊娠から単離した検体と同時に泳動することができる。偽セーライン注射を対照として用いることができる。応答シグナルはｌｏｇマウス子宮重量である。
【０１０４】
ｈＣＧイソ形態のクリアランス
ｈＣＧのクリアランスをラットで測定する。Ｎｅｗｍａｎら（Ｎｅｗｍａｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９８５）およびＢｒｏｗｎおよびＨｅｄｇｅ（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｒ．およびＨｅｄｇｅ，Ｇ．Ａ．，１９７２）によって記載されている手法に従って、カテーテルを入れた外部頚静脈中の内在カテーテルから、注射後０、１２０、２４０、３６０および４８０分に血液（２００μｌ／試料）を得る。略言すれば、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ ＭＡ）、体重１７５−２２５ｇ、を食料および水に自由に接近させる。ラットは到着後一週間順応のために取り扱い、ｈＣＧ注入の数日前に、ペントバルビタール麻酔下でラットにカニューレを入れる。２１ゲージのステンレス鋼カニューレを１つの外部頚静脈に挿入する。カニューレの置き換えは、制限されずストレスを与えられないラットからの血液の収集を可能とする。動物がカニューレ置換から回復させた後、ｈＣＧイソ形態をカニューレを入れた静脈を介して注射する（１０μｇ／ｍｌ滅菌セーライム）。血液試料は前記リストの４回の間隔で得る。血液を凝固させ、血清を分離し、異なるｈＣＧイソ形態に特異的なイムノメトリックアッセイのために−８０℃で保存する。
【０１０５】
ラットの循環からのｈＣＧのイソ形態のクリアランス速度は、一般的な形態の方程式に濃度データをコンピューター適合させることによって評価される：濃度＝時刻ｔにおけるＡｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ；Ａおよびαは迅速成分のパラメーターであり、Ｂおよびβは遅い成分のパラメーターである。代謝クリアランス速度（ＭＣＲ）はＭＣＲ＝用量／（Ａ／β＋Ｂ／β）として計算され、分布の初期容量はＶｄ＝用量／（Ａ＋Ｂ）から計算される。ＭＣＲは統計学的解析のために体重に対して正規化され、これは有意性判断のためにダンカンの範囲検定にてＡＮＯＶＡを用いて行われる（Ｃａｓｓａｌｓ、Ｊ．Ｗ．ら、１９８９）。
【０１０６】
マウス
本明細書中に記載された実験で使用したマウス種はＢａｌｂ／ｃマウス（年齢１２−２０週齢でいずれかの性の成体Ｓｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙラット）である。マウスは腹水を通じてのモノクローナル抗体の生産および記載されたイン・ビボ生物学的活性の測定のために用いる。ハイブリドーマ細胞系はＢａｌｂ／Ｃ脾臓細胞を用いて開発されたので、Ｂａｌｂｃ／ｃマウスを用いる。
【０１０７】
【参照文献】
【表５】

【０１０８】
【表６】

【０１０９】
【表７】

【０１１０】
【表８】

【０１１１】
【表９】

【０１１２】
【表１０】

【０１１３】
【表１１】

【０１１４】
【表１２】

【０１１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｈＣＧの形態についてのバイオアッセイ。これはＬＨ／ＣＧ受容体を発現する組換え体ＣＨＯ細胞からのデーターである。応答因子はｃＡＭＰ生産である。ｘ軸はグラフの脚注に記載されているごとく４つの較正され純粋なホルモンのうちの１つの用量である。発現されたｈＣＧはニックを有さず；絨毛癌ｈＣＧ（Ｃ５）は１００％ニックされており；ＣＲ１２７は示されるごとくニックフリー（無傷）およびニック豊富画分に精製された。
【図２】 測定された分析の各々についての陽性試料におけるｈＣＧ−関連分子の発生率（パネルＡ）および発現レベル（パネルＢ）（初期正常妊娠においては、ｎ＝２１４；ＥＰＬサイクル、ｎ＝４９；および陰性サイクル、ｎ＝２９７）。
【図３】 Ｂ１５２−Ｂ２０７^＊アッセイ（上方パネル）およびＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイ（下方パネル）における３つのｈＣＧタイプについての結合曲線。
【図４】 異なる妊娠年齢における正常妊娠尿（ｎ＝１０３）でのＢ１５２−Ｂ２０７^＊およびＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイによって測定されたｈＣＧイソ形態の比率（回帰曲線および９５％信頼区間を示す、γ２＝０．７９）。曲線中の変曲点はほぼ２９週間で起こる。
【図５】 ５−６週の妊娠年齢（ｎ＝１２）；または３６−３９週の妊娠年齢（ｎ＝１１）およびＪＡＲ細胞上澄みにおける妊娠にマッチした血清尿／尿についてのＢ１５２／Ｂ１０９比率のボックスプロット。ボックスは第２５および第７５百分位数まで拡大される。上方および下方記号は、各々、第９０および第１０百分位数を示す。ボックス内部の実線は第５０百分位数の値を記す。
【図６】 ＩＶＦ患者（ｎ＝６５）の尿においてＢ１５２−Ｂ２０７^＊およびＢ１０９−Ｂ１０８^＊アッセイによって測定されたｈＣＧイソ形態の比率。（回帰曲線および９５％信頼区間を示す、γ２＝０．５９）
【図７】 妊娠婦人からのプールされた尿濃度のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムクロマトグラフィーからの画分のイムノアッセイプロフィール。

Claims (21)

1. （ａ）対象から得た試料を、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する捕獲抗体と接触させ、それにより、前記捕獲抗体を、前記試料中に存在する前記ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に結合させて、複合体を形成させる工程;
   ここにおいて、前記イソ形態は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｂ１５２によって生産される抗体によって認識され、前記抗体は、モノクローナル抗体Ｂ１５２、または、モノクローナル抗体Ｂ１５２と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である：
   （ｂ）工程（ａ）で形成された任意の複合体を、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する標識した検出抗体と接触させ、それにより、前記ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に結合させる工程;
   ここにおいて、前記検出抗体は、前記捕獲抗体と交差反応しない：
   （ｃ）その複合体に結合される標識した検出抗体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する工程；
   ここにおいて、前記検出抗体は、前記捕獲抗体と交差反応しない：
   （ｄ）正常妊娠対象から得られた試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する工程：および
   （ｅ）工程（ｃ）で測定したｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を、工程（ｄ）で測定された量と比較し、工程（ｃ）にて測定された量が工程（ｄ）の場合と比較して低いことが、対象についての妊娠の陰性を予測する工程：
   を含む女性の対象における妊娠結果を予測する方法。
2. 試料が、尿試料または血液試料である請求項１に記載の方法。
3. 試料が、少なくとも１日から摂取した凝集試料である請求項１に記載の方法。
4. 抗体が、検出可能なマーカーで標識される請求項１に記載の方法。
5. 検出可能なマーカーが、放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズ、またはビオチンである請求項４に記載の方法。
6. 放射性同位体が、Ｉ^１２５である請求項５に記載の方法。
7. （ａ）固体マトリックス上に、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する捕獲抗体を固定化する工程；
   ここにおいて、前記イソ形態は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｂ１５２によって生産される抗体によって認識され、前記抗体は、モノクローナル抗体Ｂ１５２、または、モノクローナル抗体Ｂ１５２と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である：
   （ｂ）前記固定化された捕獲抗体を、対象から得た適切な試料に接触させ、それにより、前記固定化捕獲抗体を、前記試料中に存在する前記ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に結合させて、複合体を形成させる工程：
   （ｃ）前記複合体から結合していないｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態を除去する工程：
   （ｄ）前記複合体を、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する検出抗体と接触させ、それにより、前記検出抗体を、前記複合体の前記ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に結合させる工程；
   ここにおいて、前記検出抗体は、前記捕獲抗体と交差反応しない：
   （ｅ）前記複合体から結合していない検出抗体を除去する工程：
   （ｆ）マトリックスに結合した検出抗体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する工程：
   （ｇ）正常妊娠対象から得られた試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する工程：および
   （ｈ）工程（ｆ）で測定したｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を、工程（ｇ）で測定した量と比較し、工程（ｆ）にて測定されたｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量が工程（ｇ）の場合と比較して低いことが、対象についての妊娠の陰性を予測する工程：
   を含む女性の対象における妊娠結果を予測する方法。
8. 試料が、尿試料または血液試料である請求項７に記載の方法。
9. 試料が、少なくとも連続した２日から摂取した凝集試料である請求項７に記載の方法。
10. 抗体が、検出可能なマーカーで標識される請求項７に記載の方法。
11. 検出可能なマーカーが、放射性同位体、酵素、色素、磁性ビーズ、またはビオチンである請求項１０に記載の方法。
12. 放射性同位体が、Ｉ^１２５である請求項１１に記載の方法。
13. （ａ）抗体とｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態との複合体の形成を可能にする条件下で、試料を、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態に特異的に結合する抗体と接触させる工程；
    ここにおいて、前記抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７として寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｂ１５２によって生産されるモノクローナル抗体Ｂ１５２、または、モノクローナル抗体Ｂ１５２と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である：および
    （ｂ）形成された複合体の量を測定し、それにより、試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する工程：
    を含む試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の量を測定する方法。
14. 抗体が、炭水化物基を含むことを特徴とする、ｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態の領域を特異的に結合する請求項１３に記載の方法。
15. 前記モノクローナル抗体が絨毛癌Ｃ５ｈＣＧに結合する、請求項１４に記載の方法。
16. 抗体が、Ｂ１５２である請求項１５に記載の方法。
17. （ａ）固体マトリックスに結合された第１の抗体；
    ここにおいて、前記抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２４６７として寄託されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体Ｂ１５２、または、モノクローナル抗体Ｂ１５２と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である：
    （ｂ）前記第１の抗体と同時にＥＰＭＩ−ｈＣＧに結合する、第２の標識した抗体：および
    （ｃ）抗体と試料との間の複合体の形成を可能にする試薬：
    を含む、尿試料中のｈＣＧの初期妊娠関連分子イソ形態（ＥＰＭＩ−ｈＣＧ）の量を測定するための診断キット。
18. さらに、対照試料および正常な妊娠試料を含む請求項１７に記載の診断キット。
19. 抗体が、検出可能なマーカーで標識される請求項１７に記載の診断キット。
20. 検出可能なマーカーが、放射性同位体、酵素、磁性ビーズ、色素またはビオチンである請求項１９に記載の診断キット。
21. 放射性同位体が、Ｉ^１２５である請求項２０に記載の診断キット。

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