JPH04300896A - ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法 - Google Patents
ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法Info
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- JPH04300896A JPH04300896A JP3089162A JP8916291A JPH04300896A JP H04300896 A JPH04300896 A JP H04300896A JP 3089162 A JP3089162 A JP 3089162A JP 8916291 A JP8916291 A JP 8916291A JP H04300896 A JPH04300896 A JP H04300896A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト妊婦尿由来のヒト
絨毛性ゴナドトロピン[human chorioni
cgonadotropin (hCG)] の粗原末
から得られた、ロゼット抑制反応 (rosettei
nhibition test) の増強作用を有する
、ヒト由来の早期妊娠因子 [human early
pregnency factor (hEPF)]
及びその分離・精製法に係わる。この因子は、主として
、妊娠の超早期診断の指標として利用される。
絨毛性ゴナドトロピン[human chorioni
cgonadotropin (hCG)] の粗原末
から得られた、ロゼット抑制反応 (rosettei
nhibition test) の増強作用を有する
、ヒト由来の早期妊娠因子 [human early
pregnency factor (hEPF)]
及びその分離・精製法に係わる。この因子は、主として
、妊娠の超早期診断の指標として利用される。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決すべき課題】妊娠時の内分
泌系の変化が、幾つかのホルモン生産量に影響を及ぼす
ことが知られている。妊娠の早期診断、切迫流産の診断
と予後の判定、妊娠後半期の胎児・胎盤機能検査に直接
役立つヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG)、ヒト胎
盤性ラクトーゲン [human placental
lactogen (hPL)] 等の蛋白ホルモン
や、エストロゲンのようなステロイドホルモン等が胎盤
で産生されている。これらの内でもhCG は妊娠初期
における黄体賦活作用や、妊娠中期・後期での胎盤ステ
ロイドホルモン合成能に関与しているものと考えられて
おり、妊娠や切迫流産の診断における重要な指標となっ
ている。しかしながら、hCG が出現するのは、尿中
では妊娠 5 週(着床後 2 − 3 週)頃からで
あり、又、血中 hCG の微量測定も受精卵の着床後
約 1 週間を経た後に初めて可能となる。従って、更
に早期に妊娠の診断を可能にすること、即ち受精卵の着
床前に妊娠の診断を可能にすることが望まれていた。
泌系の変化が、幾つかのホルモン生産量に影響を及ぼす
ことが知られている。妊娠の早期診断、切迫流産の診断
と予後の判定、妊娠後半期の胎児・胎盤機能検査に直接
役立つヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG)、ヒト胎
盤性ラクトーゲン [human placental
lactogen (hPL)] 等の蛋白ホルモン
や、エストロゲンのようなステロイドホルモン等が胎盤
で産生されている。これらの内でもhCG は妊娠初期
における黄体賦活作用や、妊娠中期・後期での胎盤ステ
ロイドホルモン合成能に関与しているものと考えられて
おり、妊娠や切迫流産の診断における重要な指標となっ
ている。しかしながら、hCG が出現するのは、尿中
では妊娠 5 週(着床後 2 − 3 週)頃からで
あり、又、血中 hCG の微量測定も受精卵の着床後
約 1 週間を経た後に初めて可能となる。従って、更
に早期に妊娠の診断を可能にすること、即ち受精卵の着
床前に妊娠の診断を可能にすることが望まれていた。
【0003】妊娠初期には、超早期妊娠関与蛋白である
早期妊娠因子 (EPF) が存在するであろうことが
以前から知られていた。即ち、H. Morton 等
は 1974 年に交配後極めて早期のマウスに脾細胞
とヒト赤血球の間に生じるロゼットを抗脾細胞抗体で抑
制する反応 (rosette inhibition
test) を増強する因子の存在することを報告し
、これを early pregnency fact
or (早期妊娠因子) と命名している [”Nat
ure”, Vol. 249, pages 459
− 460 (1974)]。その後、EPF 活性
の存在は他の種々の哺乳動物に関しても報告され、その
出現開始時期も種によって多少の差はあるものの、受精
後極めて早期より出現し、妊娠経過中、少なくとも 2
/3 の期間にわたり活性が検出された。即ち、マウス
では交配後 6 時間 [H. Morton 等 ”
Pro. R. Soc. Lond. B”, Vo
l. 193, pages 413 − 419,
(1976)]、ウサギでは 16 時間 [K.Su
eoka 等 ”J. Reprod. Fert.”
, Vol. 84, pages 325 − 33
1 (1988)]、ヒツジ及びブタでは 24 時間
[B. E. Rolfe 等 ”Fert. St
eril.”, Vol. 37, pages665
− 660, (1982); C. D. Nan
carrow 等 ”J. Reprod. Fert
.Suppl.”, Vol. 30, pages
191 − 199, (1981)]、ヒトでは 4
8 時間で出現したことが報告された [H. Mor
ton 等 ”Lancet, i”, pages
394 − 397, (1977); Y. C.
Smart 等 ”Fert.Steril.”, V
ol. 37, pages 779 −785, (
1982)]。
早期妊娠因子 (EPF) が存在するであろうことが
以前から知られていた。即ち、H. Morton 等
は 1974 年に交配後極めて早期のマウスに脾細胞
とヒト赤血球の間に生じるロゼットを抗脾細胞抗体で抑
制する反応 (rosette inhibition
test) を増強する因子の存在することを報告し
、これを early pregnency fact
or (早期妊娠因子) と命名している [”Nat
ure”, Vol. 249, pages 459
− 460 (1974)]。その後、EPF 活性
の存在は他の種々の哺乳動物に関しても報告され、その
出現開始時期も種によって多少の差はあるものの、受精
後極めて早期より出現し、妊娠経過中、少なくとも 2
/3 の期間にわたり活性が検出された。即ち、マウス
では交配後 6 時間 [H. Morton 等 ”
Pro. R. Soc. Lond. B”, Vo
l. 193, pages 413 − 419,
(1976)]、ウサギでは 16 時間 [K.Su
eoka 等 ”J. Reprod. Fert.”
, Vol. 84, pages 325 − 33
1 (1988)]、ヒツジ及びブタでは 24 時間
[B. E. Rolfe 等 ”Fert. St
eril.”, Vol. 37, pages665
− 660, (1982); C. D. Nan
carrow 等 ”J. Reprod. Fert
.Suppl.”, Vol. 30, pages
191 − 199, (1981)]、ヒトでは 4
8 時間で出現したことが報告された [H. Mor
ton 等 ”Lancet, i”, pages
394 − 397, (1977); Y. C.
Smart 等 ”Fert.Steril.”, V
ol. 37, pages 779 −785, (
1982)]。
【0004】更にウサギの局所循環では、受精後 3
時間で EPF 活性の発現が認められ、その一部のコ
ンポーネントは偽妊娠でも卵管から出現し、他のコンポ
ーネントは受精後に卵巣から出現することが報告されて
いる [H. Morton 等 ”J. Repro
d. Immunol.”, Vol. 2, pag
es 73 − 82, (1980); K.Sue
oka 等 ”Am. J. Obstet. Gyn
ecol.”, Vol. 159(6), page
s 1580 − 1584, (1988)]。即ち
、EPF は、ヒトにおいても妊娠の極めて早期に、特
に着床前から出現し、胚の予後を知る指標として、又妊
娠成立に関与する物質として重要であると考えられてい
る [末岡 浩、「日不妊誌」、Vol. 30(4
), pages 403, (1985); 末岡
浩、「臨婦産」、Vol. 40(3), page
s 223 − 224, (1986)]。しかしな
がら、EPF の産生メカニズム、生体内作用、生化学
的な作用等において未知な点も多い。尚、EPF に関
しては、検出系を如何に設定するか、検出所要時間、処
理検体数の制限、活性を保つための条件設定等に困難が
存在するために、従来その精製・単離は行われていなか
ったのが実情である。
時間で EPF 活性の発現が認められ、その一部のコ
ンポーネントは偽妊娠でも卵管から出現し、他のコンポ
ーネントは受精後に卵巣から出現することが報告されて
いる [H. Morton 等 ”J. Repro
d. Immunol.”, Vol. 2, pag
es 73 − 82, (1980); K.Sue
oka 等 ”Am. J. Obstet. Gyn
ecol.”, Vol. 159(6), page
s 1580 − 1584, (1988)]。即ち
、EPF は、ヒトにおいても妊娠の極めて早期に、特
に着床前から出現し、胚の予後を知る指標として、又妊
娠成立に関与する物質として重要であると考えられてい
る [末岡 浩、「日不妊誌」、Vol. 30(4
), pages 403, (1985); 末岡
浩、「臨婦産」、Vol. 40(3), page
s 223 − 224, (1986)]。しかしな
がら、EPF の産生メカニズム、生体内作用、生化学
的な作用等において未知な点も多い。尚、EPF に関
しては、検出系を如何に設定するか、検出所要時間、処
理検体数の制限、活性を保つための条件設定等に困難が
存在するために、従来その精製・単離は行われていなか
ったのが実情である。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者等は EPF
の性質を更に詳しく調べるためには EPF を充分に
精製する必要があると考え鋭意検討した。即ち、本発明
者等は市販の hCG 粗原末中に hCG 活性とは
異なる EPF 活性が存在することを見い出し、そこ
で hCG 粗原末を多量に入手した後、ロゼット抑制
反応の増強作用活性を指標として、EPF を分離・精
製した。その結果得られたヒト EPF の性質は次の
ようなものであった。 EPF の性質 : (a) 活性 ;リンパ球と異種の赤血球の間に生じる
ロゼットを抗リンパ球抗体で抑制する反応 (rose
tte inhibition test) を増強す
る。 (b) 分子量 ;SDS ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により測定した場合の分子量は 24000−
30000 である。 (c) 等電点 ;等電点電気泳動法により測定した等
電点は pI 3.5 − 3.75 である。 (d) アミノ酸配列 ;N 末端に X − Se
r− X −Gln− X −Asp− X −Ala
−Pro−Val−Gly− X−Ser−Met−T
yr−Ala−(X は Cys 又は天然に存在する
20 種類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)に
て表わされるアミノ酸配列を有している。
の性質を更に詳しく調べるためには EPF を充分に
精製する必要があると考え鋭意検討した。即ち、本発明
者等は市販の hCG 粗原末中に hCG 活性とは
異なる EPF 活性が存在することを見い出し、そこ
で hCG 粗原末を多量に入手した後、ロゼット抑制
反応の増強作用活性を指標として、EPF を分離・精
製した。その結果得られたヒト EPF の性質は次の
ようなものであった。 EPF の性質 : (a) 活性 ;リンパ球と異種の赤血球の間に生じる
ロゼットを抗リンパ球抗体で抑制する反応 (rose
tte inhibition test) を増強す
る。 (b) 分子量 ;SDS ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により測定した場合の分子量は 24000−
30000 である。 (c) 等電点 ;等電点電気泳動法により測定した等
電点は pI 3.5 − 3.75 である。 (d) アミノ酸配列 ;N 末端に X − Se
r− X −Gln− X −Asp− X −Ala
−Pro−Val−Gly− X−Ser−Met−T
yr−Ala−(X は Cys 又は天然に存在する
20 種類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)に
て表わされるアミノ酸配列を有している。
【0006】本発明方法によれば、上記のヒト由来の早
期妊娠因子 (hEPF) は、ヒト正常妊婦尿由来の
ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 粗原末を緩衝
液中に懸濁させて超音波処理し、遠心分離により得た上
清をセファロース CL−6B カラムでゲル濾過して
分画し、ヒト絨毛性ゴナドトロピンよりも遅れて溶出す
る活性フラクションを集め、このフラクションを 70
% 飽和硫安塩析し、沈澱をトリス緩衝液に透析した後
に Q セファロース ファースト フロー (Q S
epharose Fast Flow) クロマトグ
ラフィーにかけ、NaCl の直線濃度勾配で溶出させ
、活性フラクションを硫安含有緩衝液に透析し、フェニ
ル セファロース CL−4B カラムにかけ、溶出す
る活性フラクションを集めて水に透析し、凍結乾燥させ
て部分精製品とし、これを再度水に透析し、逆相 HP
LC により精製することにより得ることができる。
期妊娠因子 (hEPF) は、ヒト正常妊婦尿由来の
ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 粗原末を緩衝
液中に懸濁させて超音波処理し、遠心分離により得た上
清をセファロース CL−6B カラムでゲル濾過して
分画し、ヒト絨毛性ゴナドトロピンよりも遅れて溶出す
る活性フラクションを集め、このフラクションを 70
% 飽和硫安塩析し、沈澱をトリス緩衝液に透析した後
に Q セファロース ファースト フロー (Q S
epharose Fast Flow) クロマトグ
ラフィーにかけ、NaCl の直線濃度勾配で溶出させ
、活性フラクションを硫安含有緩衝液に透析し、フェニ
ル セファロース CL−4B カラムにかけ、溶出す
る活性フラクションを集めて水に透析し、凍結乾燥させ
て部分精製品とし、これを再度水に透析し、逆相 HP
LC により精製することにより得ることができる。
【0007】
【製造例等】次に、製造例、試験例等により本発明を更
に詳細に且つ具体的に説明する。尚、EPF 活性の測
定や蛋白の定量等は下記の方法で行った。
に詳細に且つ具体的に説明する。尚、EPF 活性の測
定や蛋白の定量等は下記の方法で行った。
【0008】a) EPF 活性の測定EPF 活性の
検出法としては、ロゼット抑制反応 (rosette
inhibtion test) を用いた。即ち、
ヒトでは男性末梢血リンパ球と、ヒツジ赤血球との間に
生ずるE−ロゼットを、1000 − 128000
倍に倍数希釈した抗リンパ球抗体で抑制し、抗体を作用
しないロゼット数に比較し、75% 以下に抑制する抗
体の最大希釈倍数の対数を rosette inhi
bition titer (RIT) で表示する方
法を用いた。尚、数値の比較を簡易化するために、抗体
の希釈倍数 1 x 103 倍を 1 とし、以下
2 x 103倍を 2 とし、22 x 103 倍
を 3 とするように単純化し、これをロゼット抑制値
[rosette inhibition value
(RIV)] とした。RIT を RIV に換算
する場合の、換算式は下記の通りである。
検出法としては、ロゼット抑制反応 (rosette
inhibtion test) を用いた。即ち、
ヒトでは男性末梢血リンパ球と、ヒツジ赤血球との間に
生ずるE−ロゼットを、1000 − 128000
倍に倍数希釈した抗リンパ球抗体で抑制し、抗体を作用
しないロゼット数に比較し、75% 以下に抑制する抗
体の最大希釈倍数の対数を rosette inhi
bition titer (RIT) で表示する方
法を用いた。尚、数値の比較を簡易化するために、抗体
の希釈倍数 1 x 103 倍を 1 とし、以下
2 x 103倍を 2 とし、22 x 103 倍
を 3 とするように単純化し、これをロゼット抑制値
[rosette inhibition value
(RIV)] とした。RIT を RIV に換算
する場合の、換算式は下記の通りである。
【数1】RIV = log2RIT/1000 +
1更に、対照と比較して倍数希釈でどの程度の差がある
かを示すために、対照のRIV との差を解離値 [d
issocicaion value (DV)] と
して表示した。
1更に、対照と比較して倍数希釈でどの程度の差がある
かを示すために、対照のRIV との差を解離値 [d
issocicaion value (DV)] と
して表示した。
【0009】測定に際しては、先ず、検体を 56℃
において 30 分間加熱して非働化し、男性リンパ球
2 x 106 cells に対し、検体 100
μl を加え、37℃ で 30 分間インキュベート
する。ハンクス平衡塩溶液 [Hanks’ bala
nced salt solution(HBSS)]
にて 3 回洗浄し、107 cells/ml の
濃度の細胞 20μl に対し、倍数希釈した抗リンパ
球抗体 (抗 T−cell monoclonal
antibody; OKT−11, Ortho)と
補体 (guinea pig complement
) とを各々20μl、10μl 加え、更に 37℃
において 30 分間インキュベートする。その後、
ヒツジ赤血球を 1.5 x 108 cells/m
l(20μl) 加えて、250g で 5 分間遠心
し、形成されたロゼットをブリリアント・クレシル・ブ
ルー (brilliant cresyl blue
) にて染色、スライドグラス上で 400 倍の倍率
で鏡検観察する。クロマトグラフィー等、精製操作を行
った検体に関しては、HBSS で一昼夜透析を行った
後に、EPF 活性の検出を行った。
において 30 分間加熱して非働化し、男性リンパ球
2 x 106 cells に対し、検体 100
μl を加え、37℃ で 30 分間インキュベート
する。ハンクス平衡塩溶液 [Hanks’ bala
nced salt solution(HBSS)]
にて 3 回洗浄し、107 cells/ml の
濃度の細胞 20μl に対し、倍数希釈した抗リンパ
球抗体 (抗 T−cell monoclonal
antibody; OKT−11, Ortho)と
補体 (guinea pig complement
) とを各々20μl、10μl 加え、更に 37℃
において 30 分間インキュベートする。その後、
ヒツジ赤血球を 1.5 x 108 cells/m
l(20μl) 加えて、250g で 5 分間遠心
し、形成されたロゼットをブリリアント・クレシル・ブ
ルー (brilliant cresyl blue
) にて染色、スライドグラス上で 400 倍の倍率
で鏡検観察する。クロマトグラフィー等、精製操作を行
った検体に関しては、HBSS で一昼夜透析を行った
後に、EPF 活性の検出を行った。
【0010】b) 蛋白の定量
蛋白量の測定はビシンコニン酸 (Bicinchon
inic acid)を用いる方法 (ピアス社、BC
A プロテインアッセイ試薬)によった。検体又は標準
溶液 0.1ml に対して BCA ワーキング試薬
を 2.0ml 添加して 37℃ で 30 分間反
応させ、562nm における吸光度を測定した。検量
線は標準蛋白質 (BSA) の倍数希釈液 (1.3
8mg/ml、0.69mg/ml、0.345mg/
ml、0.173mg/ml、0.087mg/ml)
を準備し、上記の方法で測定することにより作成した
。
inic acid)を用いる方法 (ピアス社、BC
A プロテインアッセイ試薬)によった。検体又は標準
溶液 0.1ml に対して BCA ワーキング試薬
を 2.0ml 添加して 37℃ で 30 分間反
応させ、562nm における吸光度を測定した。検量
線は標準蛋白質 (BSA) の倍数希釈液 (1.3
8mg/ml、0.69mg/ml、0.345mg/
ml、0.173mg/ml、0.087mg/ml)
を準備し、上記の方法で測定することにより作成した
。
【0011】c) hCG 量の測定
hCG のβ鎖に対するモノクローナル抗体を利用した
サンドイッチ法による血中、尿中 hCG 測定用試薬
であるメイアッセイ hCG (EIA) (明治製菓
株式会社製)を用いて測定した。
サンドイッチ法による血中、尿中 hCG 測定用試薬
であるメイアッセイ hCG (EIA) (明治製菓
株式会社製)を用いて測定した。
【0012】試験例 1 [ヒト絨毛性ゴナドトロピン
(hCG)中の EPF 活性] 正常妊婦尿を安息香酸吸着法、アセトン洗浄、酢酸ナト
リウム − エタノール抽出により hCG を部分精
製した hCG 粗原末を出発原料とした。この hC
G 粗原末の性状は、10g 当り乾燥減量 3 −
4%、蛋白量 80 − 85%、hCG 力価は 1
000 IU/mg であった。この hCG 粗原末
中に存在する EPF 活性を調べた結果は下記の通り
であった。
(hCG)中の EPF 活性] 正常妊婦尿を安息香酸吸着法、アセトン洗浄、酢酸ナト
リウム − エタノール抽出により hCG を部分精
製した hCG 粗原末を出発原料とした。この hC
G 粗原末の性状は、10g 当り乾燥減量 3 −
4%、蛋白量 80 − 85%、hCG 力価は 1
000 IU/mg であった。この hCG 粗原末
中に存在する EPF 活性を調べた結果は下記の通り
であった。
【0013】
【表1】
【0014】製造例 1 [ヒト早期妊娠因子 (hE
PF) の分離・精製] (a) セファロース CL−6B ゲル濾過クロマト
グラフィー上記の試験例 1 により得た hCG 粗
原末 2g を 10mM 燐酸ナトリウム緩衝液(p
H 7.0) 15ml に懸濁し、超音波処理した後
、遠心分離 (3000rpm、15 分間) して得
た上清を、0.22μm フィルター Millex
GV で濾過して不溶物を除去し、濾液を上記の緩衝液
で平衡化したセファロースCL−6B カラム (32
mmφ x 820mm :660ml) に添加し、
通過させ、分画した (各 15ml 宛)。結果は図
1に示される通りであった。EPF 活性はフラクショ
ン 35 から 40 に認められ、hCG のピーク
よりも遅れて溶出した。フラクション 36 − 40
を EPF 活性フラクションとしてプールした (
57ml、蛋白量 182.6mg)。
PF) の分離・精製] (a) セファロース CL−6B ゲル濾過クロマト
グラフィー上記の試験例 1 により得た hCG 粗
原末 2g を 10mM 燐酸ナトリウム緩衝液(p
H 7.0) 15ml に懸濁し、超音波処理した後
、遠心分離 (3000rpm、15 分間) して得
た上清を、0.22μm フィルター Millex
GV で濾過して不溶物を除去し、濾液を上記の緩衝液
で平衡化したセファロースCL−6B カラム (32
mmφ x 820mm :660ml) に添加し、
通過させ、分画した (各 15ml 宛)。結果は図
1に示される通りであった。EPF 活性はフラクショ
ン 35 から 40 に認められ、hCG のピーク
よりも遅れて溶出した。フラクション 36 − 40
を EPF 活性フラクションとしてプールした (
57ml、蛋白量 182.6mg)。
【0015】(b) 硫安塩析
上記の EPF 活性フラクション (57ml) を
4℃ 下の温度条件下で飽和度 25%になるように
硫安を 7.92g 添加し、30 分間攪拌した後、
遠心分離 (3000rpm 、4℃) を行った。上
清に対して飽和度が 70% になるように更に硫安
16.9g を添加し、上記と同様の操作を行った。遠
心分離して得た沈澱を 10ml の精製水に溶解し、
最初に精製水 3 リットルに対して、次に 20mM
トリス塩酸緩衝液 (pH 8.5) 3 リットル
に対して透析し、透析内液 21.5ml を得た。こ
の溶液の EPF 活性は DV 4.5、蛋白量は
31.2mg であった。
4℃ 下の温度条件下で飽和度 25%になるように
硫安を 7.92g 添加し、30 分間攪拌した後、
遠心分離 (3000rpm 、4℃) を行った。上
清に対して飽和度が 70% になるように更に硫安
16.9g を添加し、上記と同様の操作を行った。遠
心分離して得た沈澱を 10ml の精製水に溶解し、
最初に精製水 3 リットルに対して、次に 20mM
トリス塩酸緩衝液 (pH 8.5) 3 リットル
に対して透析し、透析内液 21.5ml を得た。こ
の溶液の EPF 活性は DV 4.5、蛋白量は
31.2mg であった。
【0016】(c) Q セファロース ファースト
フロー クロマトグラフィー 上記の透析内液 21.5ml を 20mM トリス
塩酸緩衝液 (pH 8.5) で平衡化したQ セフ
ァロース ファースト フロー カラム (1.3cm
φ x 15.7cm, 20.8ml, CL タイ
プ) に吸着させた。吸着物をカラム容量の 3 倍量
の上記の緩衝液で洗浄し、0− 0.35M の塩化ナ
トリウムを含有するトリス塩酸緩衝液 (pH 8.5
) 160ml を用いた直線濃度勾配法により溶出さ
せた。結果は図2に示される通りであり、EPF活性は
フラクション 68 − 73 において認められ、蛋
白量は 10.0mg であった。
フロー クロマトグラフィー 上記の透析内液 21.5ml を 20mM トリス
塩酸緩衝液 (pH 8.5) で平衡化したQ セフ
ァロース ファースト フロー カラム (1.3cm
φ x 15.7cm, 20.8ml, CL タイ
プ) に吸着させた。吸着物をカラム容量の 3 倍量
の上記の緩衝液で洗浄し、0− 0.35M の塩化ナ
トリウムを含有するトリス塩酸緩衝液 (pH 8.5
) 160ml を用いた直線濃度勾配法により溶出さ
せた。結果は図2に示される通りであり、EPF活性は
フラクション 68 − 73 において認められ、蛋
白量は 10.0mg であった。
【0017】(d) フェニル セファロース CL−
4B クロマトグラフィー 上記の (c) 項で得た活性フラクション 18.5
ml を 1M の硫安を含有する 20mMトリス塩
酸緩衝液 (pH 8.5,緩衝液 A) 3 リット
ルに透析し、透析内液を フェニル セファロース C
L−4B カラム (1.3cmφ x 11.3cm
, 15ml) に吸着させ、未吸着蛋白を緩衝液 A
で洗浄した後、0.5M の硫安を含有する 20m
M トリス塩酸緩衝液(pH 8.5) で溶出した。 結果は図3に示される通りであった。フラクション 7
4− 84 を EPF 活性画分としてプールした。 これを3 リットルの精製水に透析した後に凍結乾燥し
て、部分精製品を得た (0.27mg)。
4B クロマトグラフィー 上記の (c) 項で得た活性フラクション 18.5
ml を 1M の硫安を含有する 20mMトリス塩
酸緩衝液 (pH 8.5,緩衝液 A) 3 リット
ルに透析し、透析内液を フェニル セファロース C
L−4B カラム (1.3cmφ x 11.3cm
, 15ml) に吸着させ、未吸着蛋白を緩衝液 A
で洗浄した後、0.5M の硫安を含有する 20m
M トリス塩酸緩衝液(pH 8.5) で溶出した。 結果は図3に示される通りであった。フラクション 7
4− 84 を EPF 活性画分としてプールした。 これを3 リットルの精製水に透析した後に凍結乾燥し
て、部分精製品を得た (0.27mg)。
【0018】(e) 逆相 HPLC クロマトグラフ
ィーによる精製 上記の (d) 項で得た粉末状部分精製品を 1ml
の脱イオン水に溶解し、分画サイズ分子量 1000
0 の透析チューブ (三光純薬社製) を用いて、脱
イオン水 2 リットルに対して 2 回透析し、減圧
遠心濃縮機を用いて透析内液を 50μl 迄濃縮した
。この濃縮液の内の 40μl を予め 0.1% ト
リフルオロ酢酸 (TFA) 水溶液で平衡化しておい
たイナートシル 300−C8カラム (4.6 x
100mm:ガスクロ工業社製) に吸着させ、0 −
100% のアセトニトリルを含有する 0.1%
TFA水溶液の 30分間の直線密度勾配法により溶出
させ、ブランクと比較して、保持 (溶出) 時間が
15.40 分の位置に単一な EPF ピークを確認
した (図4)。アミノ酸自動分析より換算した EP
F 蛋白量は 12.19μg であった。
ィーによる精製 上記の (d) 項で得た粉末状部分精製品を 1ml
の脱イオン水に溶解し、分画サイズ分子量 1000
0 の透析チューブ (三光純薬社製) を用いて、脱
イオン水 2 リットルに対して 2 回透析し、減圧
遠心濃縮機を用いて透析内液を 50μl 迄濃縮した
。この濃縮液の内の 40μl を予め 0.1% ト
リフルオロ酢酸 (TFA) 水溶液で平衡化しておい
たイナートシル 300−C8カラム (4.6 x
100mm:ガスクロ工業社製) に吸着させ、0 −
100% のアセトニトリルを含有する 0.1%
TFA水溶液の 30分間の直線密度勾配法により溶出
させ、ブランクと比較して、保持 (溶出) 時間が
15.40 分の位置に単一な EPF ピークを確認
した (図4)。アミノ酸自動分析より換算した EP
F 蛋白量は 12.19μg であった。
【0019】試験例 2 (アミノ酸配列の解析)上記
の製造例において得られた EPF 蛋白の N 末端
アミノ酸配列を、AppliedBiosystems
社製の Protein Sequencer 47
0A を用いて調べた結果は、X − Ser− X
−Gln− X −Asp− X −Ala−Pro−
Val−Gly−X −Ser−Met−Tyr−Al
a−(X は Cys 又は天然に存在する 20 種
類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)であった。興
味あることに、このアミノ酸配列は、ヒト上皮成長因子
[human epidermalgrowth f
actor (hEGF)] の前駆体蛋白の部分配列
と一致していた。
の製造例において得られた EPF 蛋白の N 末端
アミノ酸配列を、AppliedBiosystems
社製の Protein Sequencer 47
0A を用いて調べた結果は、X − Ser− X
−Gln− X −Asp− X −Ala−Pro−
Val−Gly−X −Ser−Met−Tyr−Al
a−(X は Cys 又は天然に存在する 20 種
類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)であった。興
味あることに、このアミノ酸配列は、ヒト上皮成長因子
[human epidermalgrowth f
actor (hEGF)] の前駆体蛋白の部分配列
と一致していた。
【0020】製造例 2 (SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による EPF の回収) 製造例 1 の途次 (d 項) で得た部分精製品
1.4mg を、2−メルカプトエタノールを除いたサ
ンプルバッファー [50mM トリス塩酸緩衝液 (
pH 6.8)、2% SDS、0.1% ブロモフェ
ノールブルー、10% グリセロール) 中で、56℃
において 1 時間保持した後、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動 (泳動バッファー : 0.025M
トリス、0.192M グリシン、0.1% SDS
、pH 8.4) を行い、泳動終了後にゲルを 2m
m 間隔でスライスし、50mM NH4HCO3 水
溶液で抽出して、水に透析した後、EPF 活性を測定
した結果、分子量約 26000 付近に活性を示した
(EPF の分子量は 24000 −30000
と推定された)。又、この抽出サンプルを製造例 1
の (e) 項におけると同一の条件下で逆相HPLC
クロマトグラフィーを行った結果、ほぼ同一の保持時
間の位置にピークを示した。
ドゲル電気泳動法による EPF の回収) 製造例 1 の途次 (d 項) で得た部分精製品
1.4mg を、2−メルカプトエタノールを除いたサ
ンプルバッファー [50mM トリス塩酸緩衝液 (
pH 6.8)、2% SDS、0.1% ブロモフェ
ノールブルー、10% グリセロール) 中で、56℃
において 1 時間保持した後、SDS−ポリアクリル
アミド電気泳動 (泳動バッファー : 0.025M
トリス、0.192M グリシン、0.1% SDS
、pH 8.4) を行い、泳動終了後にゲルを 2m
m 間隔でスライスし、50mM NH4HCO3 水
溶液で抽出して、水に透析した後、EPF 活性を測定
した結果、分子量約 26000 付近に活性を示した
(EPF の分子量は 24000 −30000
と推定された)。又、この抽出サンプルを製造例 1
の (e) 項におけると同一の条件下で逆相HPLC
クロマトグラフィーを行った結果、ほぼ同一の保持時
間の位置にピークを示した。
【0021】
【発明の効果】本発明による EPF は、受精診断
(受精後において着床前に出現するので、超早期妊娠診
断を行う場合や胚の予後判定に役立つ) に有用であり
、又医薬として免疫抑制作用 (ロゼット形成抑制の増
強作用)、成長因子 (生体内での胚成長に関与)、抗
体による受精抑制 (EPF 抗体による受精及び胚成
長の抑制に関与) 等に利用できる。
(受精後において着床前に出現するので、超早期妊娠診
断を行う場合や胚の予後判定に役立つ) に有用であり
、又医薬として免疫抑制作用 (ロゼット形成抑制の増
強作用)、成長因子 (生体内での胚成長に関与)、抗
体による受精抑制 (EPF 抗体による受精及び胚成
長の抑制に関与) 等に利用できる。
【図1】ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 粗原
末を緩衝液に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離して得
た上清をセファロース CL−6B ゲル濾過クロマト
グラフィーにかけて分画し、hCG 活性、早期妊娠因
子(EPF) 活性及び蛋白量を測定した結果を示す。
末を緩衝液に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離して得
た上清をセファロース CL−6B ゲル濾過クロマト
グラフィーにかけて分画し、hCG 活性、早期妊娠因
子(EPF) 活性及び蛋白量を測定した結果を示す。
【図2】図1における活性フラクション (フラクショ
ン番号 36 −40) を硫安塩析し、緩衝液に透析
した後に、Q−セファロース ファースト フロー ク
ロマトグラフィーにかけて分画し、EPF 活性、蛋白
量及び伝導度を測定した結果を示す。
ン番号 36 −40) を硫安塩析し、緩衝液に透析
した後に、Q−セファロース ファースト フロー ク
ロマトグラフィーにかけて分画し、EPF 活性、蛋白
量及び伝導度を測定した結果を示す。
【図3】図2における活性フラクション (フラクショ
ン番号 68 −73) を硫安含有緩衝液に透析した
後に、フェニル セファロース CL−4B カラムに
かけて分画し、EPF活性及び蛋白量を測定した結果を
示す。
ン番号 68 −73) を硫安含有緩衝液に透析した
後に、フェニル セファロース CL−4B カラムに
かけて分画し、EPF活性及び蛋白量を測定した結果を
示す。
【図4】図3における活性フラクション (フラクショ
ン番号 74 −843) を精製水に透析し、凍結乾
燥させた部分精製粉末脱イオン水に溶解し、脱イオン水
に対して透析した後に、逆相 HPLC クロマトグラ
フィー結果を示すクロマトグラムである。
ン番号 74 −843) を精製水に透析し、凍結乾
燥させた部分精製粉末脱イオン水に溶解し、脱イオン水
に対して透析した後に、逆相 HPLC クロマトグラ
フィー結果を示すクロマトグラムである。
【図5】図4と同様の分析条件で、但しブランクを対象
とした場合のクロマトグラムである。
とした場合のクロマトグラムである。
Claims (2)
- 【請求項1】 次の性質、即ち a) リンパ球と異種の赤血球の間に生じるロゼットを
抗リンパ球抗体で抑制する反応 (rosette i
nhibition test) を増強し、 b) SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り測定した分子量が 24000 −30000 であ
り、c) 等電点電気泳動法により測定した等電点が
pI 3.5 − 3.75 であり、 d) N 末端のアミノ酸配列がX − Ser− X
−Gln− X −Asp− X −Ala−Pro
−Val−Gly− X −Ser−Met−Tyr−
Ala−(X は Cys 又は天然に存在する 20
種類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)にて表わ
されるものであることを特徴とする、ヒト由来の早期妊
娠因子。 - 【請求項2】 次の性質、即ち a) リンパ球と異種の赤血球の間に生じるロゼットを
抗リンパ球抗体で抑制する反応 (rosette i
nhibition test) を増強し、 b) SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り測定した分子量が 24000 −30000 であ
り、c) 等電点電気泳動法により測定した等電点が
pI 3.5 − 3.75 であり、 d) N 末端のアミノ酸配列がX − Ser− X
−Gln− X −Asp− X −Ala−Pro
−Val−Gly− X −Ser−Met−Tyr−
Ala−(X は Cys 又は天然に存在する 20
種類のアミノ酸の内の 1 つを意味する)にて表わ
されるものであるヒト由来の早期妊娠因子の分離・精製
法において、ヒト正常妊婦尿由来のヒト絨毛性ゴナドト
ロピン粗原末を緩衝液中に懸濁させて超音波処理し、遠
心分離により得た上清をセファロース CL−6B カ
ラムでゲル濾過して分画し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン
よりも遅れて溶出する活性フラクションを集め、このフ
ラクションを 70% 飽和硫安塩析し、沈澱をトリス
緩衝液に透析した後に Q セファロース ファースト
フロー (Q Sepharose Fast Fl
ow) クロマトグラフィーにかけ、NaCl の直線
濃度勾配で溶出させ、活性フラクションを硫安含有緩衝
液に透析し、フェニル セファロース CL−4B カ
ラムにかけ、溶出する活性フラクションを集めて水に透
析し、凍結乾燥させて部分精製品とし、これを再度水に
透析し、逆相 HPLC により精製することを特徴と
する、ヒト由来の早期妊娠因子の分離・精製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3089162A JPH04300896A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3089162A JPH04300896A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04300896A true JPH04300896A (ja) | 1992-10-23 |
Family
ID=13963128
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3089162A Pending JPH04300896A (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04300896A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6583109B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
US6699656B2 (en) | 1996-06-24 | 2004-03-02 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Treatment and prevention of HIV infection by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin |
US6927034B2 (en) | 1998-02-03 | 2005-08-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for detecting trophoblast malignancy by HCG assay |
US7399636B2 (en) | 1998-02-03 | 2008-07-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Diagnostic kit for predicting pregnancy outcome |
US7994278B1 (en) | 1999-08-06 | 2011-08-09 | Nobel Biosciences Llc | Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA) |
JP2011529173A (ja) * | 2008-07-25 | 2011-12-01 | ゼボ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 体液検査における細胞性成分の崩壊 |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3089162A patent/JPH04300896A/ja active Pending
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US6596688B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-07-22 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for promoting hematopoiesis |
US6620416B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-09-16 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for treating HIV |
US6699834B1 (en) | 1997-06-24 | 2004-03-02 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for treating cancer |
US6805882B1 (en) | 1997-06-24 | 2004-10-19 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Therapeutic fractions of sources of HCG |
US7977104B2 (en) | 1998-02-03 | 2011-07-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
US8691585B2 (en) | 1998-02-03 | 2014-04-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
US7399636B2 (en) | 1998-02-03 | 2008-07-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Diagnostic kit for predicting pregnancy outcome |
US7790403B2 (en) | 1998-02-03 | 2010-09-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting preganancy outcome in a subject by hCG assay |
US6927034B2 (en) | 1998-02-03 | 2005-08-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for detecting trophoblast malignancy by HCG assay |
US7993858B2 (en) | 1998-02-03 | 2011-08-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
US9541563B2 (en) | 1998-02-03 | 2017-01-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
US8802381B2 (en) | 1998-02-03 | 2014-08-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by HCG assay |
US8163508B2 (en) | 1998-02-03 | 2012-04-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
US8420339B2 (en) | 1998-02-03 | 2013-04-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by hCG assay |
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US7994278B1 (en) | 1999-08-06 | 2011-08-09 | Nobel Biosciences Llc | Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA) |
JP2011529173A (ja) * | 2008-07-25 | 2011-12-01 | ゼボ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 体液検査における細胞性成分の崩壊 |
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