JPH04300896A

JPH04300896A - ヒト由来の早期妊娠因子及びその分離・精製法

Info

Publication number: JPH04300896A
Application number: JP3089162A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sueoka; 末岡　浩; Hiroshi Murakami; 博志村上; Atsushi Baba; 淳馬場; Takeshi Kusama; 健草間; Osamu Makabe; 真壁　理
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1992-10-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト妊婦尿由来のヒト
絨毛性ゴナドトロピン［ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉ
ｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　（ｈＣＧ）］　の粗原末
から得られた、ロゼット抑制反応　（ｒｏｓｅｔｔｅｉ
ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　の増強作用を有する
、ヒト由来の早期妊娠因子　［ｈｕｍａｎ　ｅａｒｌｙ
ｐｒｅｇｎｅｎｃｙ　ｆａｃｔｏｒ　（ｈＥＰＦ）］　
及びその分離・精製法に係わる。この因子は、主として
、妊娠の超早期診断の指標として利用される。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決すべき課題】妊娠時の内分
泌系の変化が、幾つかのホルモン生産量に影響を及ぼす
ことが知られている。妊娠の早期診断、切迫流産の診断
と予後の判定、妊娠後半期の胎児・胎盤機能検査に直接
役立つヒト絨毛性ゴナドトロピン　（ｈＣＧ）、ヒト胎
盤性ラクトーゲン　［ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａｌ
　ｌａｃｔｏｇｅｎ　（ｈＰＬ）］　等の蛋白ホルモン
や、エストロゲンのようなステロイドホルモン等が胎盤
で産生されている。これらの内でもｈＣＧ　は妊娠初期
における黄体賦活作用や、妊娠中期・後期での胎盤ステ
ロイドホルモン合成能に関与しているものと考えられて
おり、妊娠や切迫流産の診断における重要な指標となっ
ている。しかしながら、ｈＣＧ　が出現するのは、尿中
では妊娠　５　週（着床後　２　−　３　週）頃からで
あり、又、血中　ｈＣＧ　の微量測定も受精卵の着床後
約　１　週間を経た後に初めて可能となる。従って、更
に早期に妊娠の診断を可能にすること、即ち受精卵の着
床前に妊娠の診断を可能にすることが望まれていた。

【０００３】妊娠初期には、超早期妊娠関与蛋白である
早期妊娠因子　（ＥＰＦ）　が存在するであろうことが
以前から知られていた。即ち、Ｈ．　Ｍｏｒｔｏｎ　等
は　１９７４　年に交配後極めて早期のマウスに脾細胞
とヒト赤血球の間に生じるロゼットを抗脾細胞抗体で抑
制する反応　（ｒｏｓｅｔｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
　ｔｅｓｔ）　を増強する因子の存在することを報告し
、これを　ｅａｒｌｙ　ｐｒｅｇｎｅｎｃｙ　ｆａｃｔ
ｏｒ　（早期妊娠因子）　と命名している　［”Ｎａｔ
ｕｒｅ”，　Ｖｏｌ．　２４９，　ｐａｇｅｓ　４５９
　−　４６０　（１９７４）］。その後、ＥＰＦ　活性
の存在は他の種々の哺乳動物に関しても報告され、その
出現開始時期も種によって多少の差はあるものの、受精
後極めて早期より出現し、妊娠経過中、少なくとも　２
／３　の期間にわたり活性が検出された。即ち、マウス
では交配後　６　時間　［Ｈ．　Ｍｏｒｔｏｎ　等　”
Ｐｒｏ．　Ｒ．　Ｓｏｃ．　Ｌｏｎｄ．　Ｂ”，　Ｖｏ
ｌ．　１９３，　ｐａｇｅｓ　４１３　−　４１９，　
（１９７６）］、ウサギでは　１６　時間　［Ｋ．Ｓｕ
ｅｏｋａ　等　”Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔ．”
，　Ｖｏｌ．　８４，　ｐａｇｅｓ　３２５　−　３３
１　（１９８８）］、ヒツジ及びブタでは　２４　時間
　［Ｂ．　Ｅ．　Ｒｏｌｆｅ　等　”Ｆｅｒｔ．　Ｓｔ
ｅｒｉｌ．”，　Ｖｏｌ．　３７，　ｐａｇｅｓ６６５
　−　６６０，　（１９８２）；　Ｃ．　Ｄ．　Ｎａｎ
ｃａｒｒｏｗ　等　”Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔ
．Ｓｕｐｐｌ．”，　Ｖｏｌ．　３０，　ｐａｇｅｓ　
１９１　−　１９９，　（１９８１）］、ヒトでは　４
８　時間で出現したことが報告された　［Ｈ．　Ｍｏｒ
ｔｏｎ　等　”Ｌａｎｃｅｔ，　ｉ”，　ｐａｇｅｓ　
３９４　−　３９７，　（１９７７）；　Ｙ．　Ｃ．　
Ｓｍａｒｔ　等　”Ｆｅｒｔ．Ｓｔｅｒｉｌ．”，　Ｖ
ｏｌ．　３７，　ｐａｇｅｓ　７７９　−７８５，　（
１９８２）］。

【０００４】更にウサギの局所循環では、受精後　３　
時間で　ＥＰＦ　活性の発現が認められ、その一部のコ
ンポーネントは偽妊娠でも卵管から出現し、他のコンポ
ーネントは受精後に卵巣から出現することが報告されて
いる　［Ｈ．　Ｍｏｒｔｏｎ　等　”Ｊ．　Ｒｅｐｒｏ
ｄ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．”，　Ｖｏｌ．　２，　ｐａｇ
ｅｓ　７３　−　８２，　（１９８０）；　Ｋ．Ｓｕｅ
ｏｋａ　等　”Ａｍ．　Ｊ．　Ｏｂｓｔｅｔ．　Ｇｙｎ
ｅｃｏｌ．”，　Ｖｏｌ．　１５９（６），　ｐａｇｅ
ｓ　１５８０　−　１５８４，　（１９８８）］。即ち
、ＥＰＦ　は、ヒトにおいても妊娠の極めて早期に、特
に着床前から出現し、胚の予後を知る指標として、又妊
娠成立に関与する物質として重要であると考えられてい
る　［末岡　　浩、「日不妊誌」、Ｖｏｌ．　３０（４
），　ｐａｇｅｓ　４０３，　（１９８５）；　末岡　
　浩、「臨婦産」、Ｖｏｌ．　４０（３），　ｐａｇｅ
ｓ　２２３　−　２２４，　（１９８６）］。しかしな
がら、ＥＰＦ　の産生メカニズム、生体内作用、生化学
的な作用等において未知な点も多い。尚、ＥＰＦ　に関
しては、検出系を如何に設定するか、検出所要時間、処
理検体数の制限、活性を保つための条件設定等に困難が
存在するために、従来その精製・単離は行われていなか
ったのが実情である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は　ＥＰＦ　
の性質を更に詳しく調べるためには　ＥＰＦ　を充分に
精製する必要があると考え鋭意検討した。即ち、本発明
者等は市販の　ｈＣＧ　粗原末中に　ｈＣＧ　活性とは
異なる　ＥＰＦ　活性が存在することを見い出し、そこ
で　ｈＣＧ　粗原末を多量に入手した後、ロゼット抑制
反応の増強作用活性を指標として、ＥＰＦ　を分離・精
製した。その結果得られたヒト　ＥＰＦ　の性質は次の
ようなものであった。ＥＰＦ　の性質　：（ａ）　活性　；リンパ球と異種の赤血球の間に生じる
ロゼットを抗リンパ球抗体で抑制する反応　（ｒｏｓｅ
ｔｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　を増強す
る。（ｂ）　分子量　；ＳＤＳ　ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により測定した場合の分子量は　２４０００−
　３００００　である。（ｃ）　等電点　；等電点電気泳動法により測定した等
電点は　ｐＩ　３．５　−　３．７５　である。（ｄ）　アミノ酸配列　；Ｎ　末端に　　Ｘ　−　Ｓｅ
ｒ−　Ｘ　−Ｇｌｎ−　Ｘ　−Ａｓｐ−　Ｘ　−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−　Ｘ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｙｒ−Ａｌａ−（Ｘ　は　Ｃｙｓ　又は天然に存在する
　２０　種類のアミノ酸の内の　１　つを意味する）に
て表わされるアミノ酸配列を有している。

【０００６】本発明方法によれば、上記のヒト由来の早
期妊娠因子　（ｈＥＰＦ）　は、ヒト正常妊婦尿由来の
ヒト絨毛性ゴナドトロピン　（ｈＣＧ）　粗原末を緩衝
液中に懸濁させて超音波処理し、遠心分離により得た上
清をセファロース　ＣＬ−６Ｂ　カラムでゲル濾過して
分画し、ヒト絨毛性ゴナドトロピンよりも遅れて溶出す
る活性フラクションを集め、このフラクションを　７０
％　飽和硫安塩析し、沈澱をトリス緩衝液に透析した後
に　Ｑ　セファロース　ファースト　フロー　（Ｑ　Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）　クロマトグ
ラフィーにかけ、ＮａＣｌ　の直線濃度勾配で溶出させ
、活性フラクションを硫安含有緩衝液に透析し、フェニ
ル　セファロース　ＣＬ−４Ｂ　カラムにかけ、溶出す
る活性フラクションを集めて水に透析し、凍結乾燥させ
て部分精製品とし、これを再度水に透析し、逆相　ＨＰ
ＬＣ　により精製することにより得ることができる。

【０００７】

【製造例等】次に、製造例、試験例等により本発明を更
に詳細に且つ具体的に説明する。尚、ＥＰＦ　活性の測
定や蛋白の定量等は下記の方法で行った。

【０００８】ａ）　ＥＰＦ　活性の測定ＥＰＦ　活性の
検出法としては、ロゼット抑制反応　（ｒｏｓｅｔｔｅ
　ｉｎｈｉｂｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　を用いた。即ち、
ヒトでは男性末梢血リンパ球と、ヒツジ赤血球との間に
生ずるＥ−ロゼットを、１０００　−　１２８０００　
倍に倍数希釈した抗リンパ球抗体で抑制し、抗体を作用
しないロゼット数に比較し、７５％　以下に抑制する抗
体の最大希釈倍数の対数を　ｒｏｓｅｔｔｅ　ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒ　（ＲＩＴ）　で表示する方
法を用いた。尚、数値の比較を簡易化するために、抗体
の希釈倍数　１　ｘ　１０３　倍を　１　とし、以下　
２　ｘ　１０３倍を　２　とし、２２　ｘ　１０３　倍
を　３　とするように単純化し、これをロゼット抑制値
［ｒｏｓｅｔｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ
　（ＲＩＶ）］　とした。ＲＩＴ　を　ＲＩＶ　に換算
する場合の、換算式は下記の通りである。

【数１】ＲＩＶ　＝　ｌｏｇ２ＲＩＴ／１０００　＋　
１更に、対照と比較して倍数希釈でどの程度の差がある
かを示すために、対照のＲＩＶ　との差を解離値　［ｄ
ｉｓｓｏｃｉｃａｉｏｎ　ｖａｌｕｅ　（ＤＶ）］　と
して表示した。

【０００９】測定に際しては、先ず、検体を　５６℃　
において　３０　分間加熱して非働化し、男性リンパ球
　２　ｘ　１０６　ｃｅｌｌｓ　に対し、検体　１００
μｌ　を加え、３７℃　で　３０　分間インキュベート
する。ハンクス平衡塩溶液　［Ｈａｎｋｓ’　ｂａｌａ
ｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）］
　にて　３　回洗浄し、１０７　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　の
濃度の細胞　２０μｌ　に対し、倍数希釈した抗リンパ
球抗体　（抗　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
ａｎｔｉｂｏｄｙ；　ＯＫＴ−１１，　Ｏｒｔｈｏ）と
補体　（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
）　とを各々２０μｌ、１０μｌ　加え、更に　３７℃
　において　３０　分間インキュベートする。その後、
ヒツジ赤血球を　１．５　ｘ　１０８　ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ（２０μｌ）　加えて、２５０ｇ　で　５　分間遠心
し、形成されたロゼットをブリリアント・クレシル・ブ
ルー　（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｃｒｅｓｙｌ　ｂｌｕｅ
）　にて染色、スライドグラス上で　４００　倍の倍率
で鏡検観察する。クロマトグラフィー等、精製操作を行
った検体に関しては、ＨＢＳＳ　で一昼夜透析を行った
後に、ＥＰＦ　活性の検出を行った。

【００１０】ｂ）　蛋白の定量蛋白量の測定はビシンコニン酸　（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎ
ｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）を用いる方法　（ピアス社、ＢＣ
Ａ　プロテインアッセイ試薬）によった。検体又は標準
溶液　０．１ｍｌ　に対して　ＢＣＡ　ワーキング試薬
を　２．０ｍｌ　添加して　３７℃　で　３０　分間反
応させ、５６２ｎｍ　における吸光度を測定した。検量
線は標準蛋白質　（ＢＳＡ）　の倍数希釈液　（１．３
８ｍｇ／ｍｌ、０．６９ｍｇ／ｍｌ、０．３４５ｍｇ／
ｍｌ、０．１７３ｍｇ／ｍｌ、０．０８７ｍｇ／ｍｌ）
　を準備し、上記の方法で測定することにより作成した
。

【００１１】ｃ）　ｈＣＧ　量の測定ｈＣＧ　のβ鎖に対するモノクローナル抗体を利用した
サンドイッチ法による血中、尿中　ｈＣＧ　測定用試薬
であるメイアッセイ　ｈＣＧ　（ＥＩＡ）　（明治製菓
株式会社製）を用いて測定した。

【００１２】試験例　１　［ヒト絨毛性ゴナドトロピン
　（ｈＣＧ）中の　ＥＰＦ　活性］正常妊婦尿を安息香酸吸着法、アセトン洗浄、酢酸ナト
リウム　−　エタノール抽出により　ｈＣＧ　を部分精
製した　ｈＣＧ　粗原末を出発原料とした。この　ｈＣ
Ｇ　粗原末の性状は、１０ｇ　当り乾燥減量　３　−　
４％、蛋白量　８０　−　８５％、ｈＣＧ　力価は　１
０００　ＩＵ／ｍｇ　であった。この　ｈＣＧ　粗原末
中に存在する　ＥＰＦ　活性を調べた結果は下記の通り
であった。

【００１３】

【表１】

【００１４】製造例　１　［ヒト早期妊娠因子　（ｈＥ
ＰＦ）　の分離・精製］（ａ）　セファロース　ＣＬ−６Ｂ　ゲル濾過クロマト
グラフィー上記の試験例　１　により得た　ｈＣＧ　粗
原末　２ｇ　を　１０ｍＭ　燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ　７．０）　１５ｍｌ　に懸濁し、超音波処理した後
、遠心分離　（３０００ｒｐｍ、１５　分間）　して得
た上清を、０．２２μｍ　フィルター　Ｍｉｌｌｅｘ　
ＧＶ　で濾過して不溶物を除去し、濾液を上記の緩衝液
で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂ　カラム　（３２
ｍｍφ　ｘ　８２０ｍｍ　：６６０ｍｌ）　に添加し、
通過させ、分画した　（各　１５ｍｌ　宛）。結果は図
１に示される通りであった。ＥＰＦ　活性はフラクショ
ン　３５　から　４０　に認められ、ｈＣＧ　のピーク
よりも遅れて溶出した。フラクション　３６　−　４０
　を　ＥＰＦ　活性フラクションとしてプールした　（
５７ｍｌ、蛋白量　１８２．６ｍｇ）。

【００１５】（ｂ）　硫安塩析上記の　ＥＰＦ　活性フラクション　（５７ｍｌ）　を
　４℃　下の温度条件下で飽和度　２５％になるように
硫安を　７．９２ｇ　添加し、３０　分間攪拌した後、
遠心分離　（３０００ｒｐｍ　、４℃）　を行った。上
清に対して飽和度が　７０％　になるように更に硫安　
１６．９ｇ　を添加し、上記と同様の操作を行った。遠
心分離して得た沈澱を　１０ｍｌ　の精製水に溶解し、
最初に精製水　３　リットルに対して、次に　２０ｍＭ
　トリス塩酸緩衝液　（ｐＨ　８．５）　３　リットル
に対して透析し、透析内液　２１．５ｍｌ　を得た。こ
の溶液の　ＥＰＦ　活性は　ＤＶ　４．５、蛋白量は　
３１．２ｍｇ　であった。

【００１６】（ｃ）　Ｑ　セファロース　ファースト　
フロー　クロマトグラフィー上記の透析内液　２１．５ｍｌ　を　２０ｍＭ　トリス
塩酸緩衝液　（ｐＨ　８．５）　で平衡化したＱ　セフ
ァロース　ファースト　フロー　カラム　（１．３ｃｍ
φ　ｘ　１５．７ｃｍ，　２０．８ｍｌ，　ＣＬ　タイ
プ）　に吸着させた。吸着物をカラム容量の　３　倍量
の上記の緩衝液で洗浄し、０−　０．３５Ｍ　の塩化ナ
トリウムを含有するトリス塩酸緩衝液　（ｐＨ　８．５
）　１６０ｍｌ　を用いた直線濃度勾配法により溶出さ
せた。結果は図２に示される通りであり、ＥＰＦ活性は
フラクション　６８　−　７３　において認められ、蛋
白量は　１０．０ｍｇ　であった。

【００１７】（ｄ）　フェニル　セファロース　ＣＬ−
４Ｂ　クロマトグラフィー上記の　（ｃ）　項で得た活性フラクション　１８．５
ｍｌ　を　１Ｍ　の硫安を含有する　２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液　（ｐＨ　８．５，緩衝液　Ａ）　３　リット
ルに透析し、透析内液を　フェニル　セファロース　Ｃ
Ｌ−４Ｂ　カラム　（１．３ｃｍφ　ｘ　１１．３ｃｍ
，　１５ｍｌ）　に吸着させ、未吸着蛋白を緩衝液　Ａ
　で洗浄した後、０．５Ｍ　の硫安を含有する　２０ｍ
Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．５）　で溶出した。結果は図３に示される通りであった。フラクション　７
４−　８４　を　ＥＰＦ　活性画分としてプールした。これを３　リットルの精製水に透析した後に凍結乾燥し
て、部分精製品を得た　（０．２７ｍｇ）。

【００１８】（ｅ）　逆相　ＨＰＬＣ　クロマトグラフ
ィーによる精製上記の　（ｄ）　項で得た粉末状部分精製品を　１ｍｌ
　の脱イオン水に溶解し、分画サイズ分子量　１０００
０　の透析チューブ　（三光純薬社製）　を用いて、脱
イオン水　２　リットルに対して　２　回透析し、減圧
遠心濃縮機を用いて透析内液を　５０μｌ　迄濃縮した
。この濃縮液の内の　４０μｌ　を予め　０．１％　ト
リフルオロ酢酸　（ＴＦＡ）　水溶液で平衡化しておい
たイナートシル　３００−Ｃ８カラム　（４．６　ｘ　
１００ｍｍ：ガスクロ工業社製）　に吸着させ、０　−
　１００％　のアセトニトリルを含有する　０．１％　
ＴＦＡ水溶液の　３０分間の直線密度勾配法により溶出
させ、ブランクと比較して、保持　（溶出）　時間が　
１５．４０　分の位置に単一な　ＥＰＦ　ピークを確認
した　（図４）。アミノ酸自動分析より換算した　ＥＰ
Ｆ　蛋白量は　１２．１９μｇ　であった。

【００１９】試験例　２　（アミノ酸配列の解析）上記
の製造例において得られた　ＥＰＦ　蛋白の　Ｎ　末端
アミノ酸配列を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　社製の　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　４７
０Ａ　を用いて調べた結果は、Ｘ　−　Ｓｅｒ−　Ｘ　
−Ｇｌｎ−　Ｘ　−Ａｓｐ−　Ｘ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｘ　−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−（Ｘ　は　Ｃｙｓ　又は天然に存在する　２０　種
類のアミノ酸の内の　１　つを意味する）であった。興
味あることに、このアミノ酸配列は、ヒト上皮成長因子
　［ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆ
ａｃｔｏｒ　（ｈＥＧＦ）］　の前駆体蛋白の部分配列
と一致していた。

【００２０】製造例　２　（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による　ＥＰＦ　の回収）製造例　１　の途次　（ｄ　項）　で得た部分精製品　
１．４ｍｇ　を、２−メルカプトエタノールを除いたサ
ンプルバッファー　［５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液　（
ｐＨ　６．８）、２％　ＳＤＳ、０．１％　ブロモフェ
ノールブルー、１０％　グリセロール）　中で、５６℃
において　１　時間保持した後、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動　（泳動バッファー　：　０．０２５Ｍ
　トリス、０．１９２Ｍ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ
、ｐＨ　８．４）　を行い、泳動終了後にゲルを　２ｍ
ｍ　間隔でスライスし、５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３　水
溶液で抽出して、水に透析した後、ＥＰＦ　活性を測定
した結果、分子量約　２６０００　付近に活性を示した
　（ＥＰＦ　の分子量は　２４０００　−３００００　
と推定された）。又、この抽出サンプルを製造例　１　
の　（ｅ）　項におけると同一の条件下で逆相ＨＰＬＣ
　クロマトグラフィーを行った結果、ほぼ同一の保持時
間の位置にピークを示した。

【００２１】

【発明の効果】本発明による　ＥＰＦ　は、受精診断　
（受精後において着床前に出現するので、超早期妊娠診
断を行う場合や胚の予後判定に役立つ）　に有用であり
、又医薬として免疫抑制作用　（ロゼット形成抑制の増
強作用）、成長因子　（生体内での胚成長に関与）、抗
体による受精抑制　（ＥＰＦ　抗体による受精及び胚成
長の抑制に関与）　等に利用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト絨毛性ゴナドトロピン　（ｈＣＧ）　粗原
末を緩衝液に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離して得
た上清をセファロース　ＣＬ−６Ｂ　ゲル濾過クロマト
グラフィーにかけて分画し、ｈＣＧ　活性、早期妊娠因
子（ＥＰＦ）　活性及び蛋白量を測定した結果を示す。

【図２】図１における活性フラクション　（フラクショ
ン番号　３６　−４０）　を硫安塩析し、緩衝液に透析
した後に、Ｑ−セファロース　ファースト　フロー　ク
ロマトグラフィーにかけて分画し、ＥＰＦ　活性、蛋白
量及び伝導度を測定した結果を示す。

【図３】図２における活性フラクション　（フラクショ
ン番号　６８　−７３）　を硫安含有緩衝液に透析した
後に、フェニル　セファロース　ＣＬ−４Ｂ　カラムに
かけて分画し、ＥＰＦ活性及び蛋白量を測定した結果を
示す。

【図４】図３における活性フラクション　（フラクショ
ン番号　７４　−８４３）　を精製水に透析し、凍結乾
燥させた部分精製粉末脱イオン水に溶解し、脱イオン水
に対して透析した後に、逆相　ＨＰＬＣ　クロマトグラ
フィー結果を示すクロマトグラムである。

【図５】図４と同様の分析条件で、但しブランクを対象
とした場合のクロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　次の性質、即ちａ）　リンパ球と異種の赤血球の間に生じるロゼットを
抗リンパ球抗体で抑制する反応　（ｒｏｓｅｔｔｅ　ｉ
ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　を増強し、ｂ）　ＳＤＳ　ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り測定した分子量が　２４０００　−３００００　であ
り、ｃ）　等電点電気泳動法により測定した等電点が　
ｐＩ　３．５　−　３．７５　であり、ｄ）　Ｎ　末端のアミノ酸配列がＸ　−　Ｓｅｒ−　Ｘ
　−Ｇｌｎ−　Ｘ　−Ａｓｐ−　Ｘ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−　Ｘ　−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−
Ａｌａ−（Ｘ　は　Ｃｙｓ　又は天然に存在する　２０
　種類のアミノ酸の内の　１　つを意味する）にて表わ
されるものであることを特徴とする、ヒト由来の早期妊
娠因子。
【請求項２】　　次の性質、即ちａ）　リンパ球と異種の赤血球の間に生じるロゼットを
抗リンパ球抗体で抑制する反応　（ｒｏｓｅｔｔｅ　ｉ
ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）　を増強し、ｂ）　ＳＤＳ　ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り測定した分子量が　２４０００　−３００００　であ
り、ｃ）　等電点電気泳動法により測定した等電点が　
ｐＩ　３．５　−　３．７５　であり、ｄ）　Ｎ　末端のアミノ酸配列がＸ　−　Ｓｅｒ−　Ｘ
　−Ｇｌｎ−　Ｘ　−Ａｓｐ−　Ｘ　−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−　Ｘ　−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−
Ａｌａ−（Ｘ　は　Ｃｙｓ　又は天然に存在する　２０
　種類のアミノ酸の内の　１　つを意味する）にて表わ
されるものであるヒト由来の早期妊娠因子の分離・精製
法において、ヒト正常妊婦尿由来のヒト絨毛性ゴナドト
ロピン粗原末を緩衝液中に懸濁させて超音波処理し、遠
心分離により得た上清をセファロース　ＣＬ−６Ｂ　カ
ラムでゲル濾過して分画し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン
よりも遅れて溶出する活性フラクションを集め、このフ
ラクションを　７０％　飽和硫安塩析し、沈澱をトリス
緩衝液に透析した後に　Ｑ　セファロース　ファースト
　フロー　（Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌ
ｏｗ）　クロマトグラフィーにかけ、ＮａＣｌ　の直線
濃度勾配で溶出させ、活性フラクションを硫安含有緩衝
液に透析し、フェニル　セファロース　ＣＬ−４Ｂ　カ
ラムにかけ、溶出する活性フラクションを集めて水に透
析し、凍結乾燥させて部分精製品とし、これを再度水に
透析し、逆相　ＨＰＬＣ　により精製することを特徴と
する、ヒト由来の早期妊娠因子の分離・精製法。