JP4451518B2 - Hybrid cell, monoclonal antibody, production method and measurement method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トロンビンに対する高い特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞、トロンビンに対する高い特異性を有するモノクローナル抗体、その製造方法及びモノクローナル抗体を利用したトロンビンの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンは血管障害部位で形成されるセリンプロテアーゼの一種として知られる血液凝固に関与する非常に重要な酵素である。トロンビンの作用としては、従来フィブリノーゲンを切断してフィブリン血栓を形成することがよく知られているが、それだけではなく、さまざまな細胞に作用する生理活性物質でもあることが明らかとなってきている（実験医学 ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．２ １６４頁 １９９５年 秀潤社）。それらの作用としては、例えば、血小板を活性化して凝集させ、セロトニンやＡＤＰなどの化学物質を放出させる作用、単球に対する遊走因子としての作用、リンパ球、線維芽細胞、血管平滑筋細胞に対する増殖刺激作用等が挙げられる。また、血管内皮細胞に対しては、プロスタサイクリン、ＰＤＧＦ、プラスミノゲンアクチベータインヒビターなどの産生を促したり、ＧＭＰ１４０の細胞表面への輸送を促進して好中球の接着を促すと言った作用をも有する。すなわち、トロンビンは、トロンビンが単なる血液凝固因子としての作用のみならず、血管壁や組織の炎症、傷害に際して修復ならびに増殖に係わる情報伝達分子という機能をも有する。従って、トロンビンは、血液凝固因子に加えて、炎症、創傷治癒、動脈硬化にも関与する非常に重要な物質である。
【０００３】
上記の説明から明らかなように、生体内のトロンビンの量あるいは活性を測定することは、臨床上、非常に有意義である。現在、トロンビンを臨床的に測定する場合、例えば、トロンビン活性を測定する凝固時間法、あるいは、合成基質法が用いられる。一般的に被検体が血液由来である場合、血液凝固第II因子をトロンビンに転化してトロンビン活性を測定するが、凝固時間法は検体の凝固時間、すなわち、トロンビンによるフィブリン転化にかかる時間を測定することによる血液凝固第II因子の正常血清に対する相対量を求める方法であるが、測定操作に熟練を要する、測定操作が煩雑である、使用する試薬、また、ロットにより測定値が異なると言った問題があった。合成基質法はトロンビンのプロテアーゼ作用に対して反応する発色性合成基質を用いる方法であるが、（ｉ）特異性は絶対的ではなく若干他の凝固因子と交差反応をすること、（ii）天然の基質に対するセリンプロテアーゼ活性と反応性が異なること、（iii）測定装置が高価である等の問題があった。また、トロンビン活性を測定する方法は、生体内で生成されたトロンビン量を間接的には評価できるものの、被検体中の活性のあるトロンビン量を直接的に測定するものではなかった。
【０００４】
トロンビンは前述したように血液凝固の中心となる分子であり、種々の疾患に関与すると考えられている。腎疾患のひとつである糸球体腎炎では凝固の活性化がその進展に関わっており、抗凝固療法が広く実施されているが、凝固の活性化を直接示す指標がないために、治療法の適応や薬剤の決定が困難となっている疾患である。われわれは鋭意研究の末、腎炎患者尿中のトロンビン活性を合成基質法を用いて測定した結果、メサンギウム性増殖性腎炎患者尿中にはトロンビン活性があることを見い出した。しかしながら、合成基質法を用いる場合、トロンビンに特異的な活性を測定するためには、トロンビンと特異的に結合してトロンビン活性を阻害するトロンビン阻害物質（抗トロンビン物質）、例えばヒルジンを添加して、ヒルジン添加前後のトロンビン活性の差を算出することにより真のヒトトロンビン活性を求める必要があり、安価かつ簡易に測定する方法ではなかった（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．５４，１７６７−１７６８，１９９８年）。
【０００５】
トロンビンを直接測定するための測定方法としては、例えば、トロンビンに特異性の高い抗体を用いて免疫学的に測定する方法が考えられる。しかしながら、トロンビンを直接測定するための免疫学的測定法は知られていない。ヒトトロンビンに対する抗体としては、Ｊ．Ｄａｗｅｓらのヒトトロンビンに対する抗体等が既に公知である（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ３９７−４０９，１９８４）。しかしながら、トロンビンは種間の保存性が高いこと、かつ、血液凝固活性を有することからヒトトロンビンを免疫源とした場合、前記文献でも報告されているように、ほとんどの個体に抗ヒトトロンビン抗体は産生されず、ヒトトロンビンに対する抗体を得ることは非常に難しかった。また、トロンビンを不活化方法としては、例えば、Ｔｓｉａｎｇらのジイソプロピルフルオロホスフェート（＝ＤＦＰ）を修飾トロンビンに修飾する方法が知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．４７，１０６０２−１０６１２，１９９０）が、トロンビンに対する抗体を得るために不活化したトロンビンを抗原として用いる方法は知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、トロンビンを特異性高く認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を提供することにある。
本発明の第２の目的は、モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞より得ることができるモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明の第３の目的は、トロンビンに対して特異性高く反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を用いたモノクローナル抗体の製造方法を提供することにある。
本発明の第４の目的は、トロンビンに対して特異性高く反応するモノクローナル抗体を用いたトロンビンの測定方法を提供することにある。また、尿中トロンビンの免疫学的測定方法を提供することにある。
【０００７】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み検討した結果、トロンビンの不活化物、特にジイソプロピルフロロホスフェイトで修飾することにより不活化したトロンビンを抗原として免疫することにより、トロンビンに対して特異性の高い抗体を効率よく産生するハイブリッド細胞が得られることを初めて見いだした。また、本発明により得られた抗体を用いることにより、トロンビンを特異性高く測定することができることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００８】
従って、本発明は、以下の（１）〜（８）である。
（１）プロトロンビン及びトロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を認識せず、ヒトトロンビンのフィブリンクロット形成及び血小板凝集反応を阻害しないことを特徴とする、モノクローナル抗体。
（２）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５３であるハイブリドーマから分泌される前記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）前記（１）に記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
（４）トロンビン及びプロトロンビンを認識し、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を認識せず、ヒトトロンビンのフィブリンクロット形成及び血小板凝集反応を阻害しないことを特徴とする、モノクローナル抗体。
（５）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５４であるハイブリドーマから分泌される、前記（４）に記載のモノクローナル抗体。
（６）前記（４）に記載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
（７）前記（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体、及び前記（４）又は（５）に記載のモノクローナル抗体を使用することを特徴とするトロンビンのサンドイッチ酵素免疫測定方法。
（８）前記トロンビンが尿中トロンビンである、前記（７）に記載のサンドイッチ酵素免疫測定方法。
更に、本願明細書は、以下の（９）〜（１４）の発明を開示する。
（９）トロンビンの不活化物を抗原として免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリッド細胞。
（１０）トロンビンの不活化物が、ジイソプロピルフロロホスフェイトで修飾することにより不活化して得られるトロンビンの不活化物であることを特徴とする前記（９）記載のハイブリッド細胞。
【０００９】
（１１）前記（９）または（１０）に記載のハイブリッド細胞を培養して得られる培養物中より取得した、トロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（１２）トロンビンの不活化物を抗原として、該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリッド細胞を培養して得られる培養物中より、トロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
（１３）前記（１２）に記載のトロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を使用することを特徴とするトロンビンの測定方法。
（１４）前記（１２）に記載のトロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする尿中トロンビンの測定方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明のハイブリッド細胞は、トロンビンの不活化物を抗原として免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得ることができる。
本発明では、トロンビンの不活化物を抗原として用いることができるが、本発明でトロンビンの不活化物を得るために用いるトロンビンとしては、得たい動物種のトロンビンであればいかなるものでもよく、市販のものを用いることもできる。例えば、ヒトトロンビンに対する抗体を得たい場合はヒトトロンビンを用いれば良い。トロンビンのアミノ酸組成は動物種間での相同性が高く、かつ血液凝固活性を有するためトロンビン自体を抗原として免疫しても有効な免疫応答産物が得られないため、本発明ではトロンビンの不活化物を抗原として用いる。
【００１１】
トロンビンの不活化物は、前記のトロンビンを通常知られる方法により不活化することで得ることができるが、好ましくは酸処理、アルカリ処理、プロテアーゼ処理、熱処理、修飾反応等で不活化することにより得られ、より好ましくは修飾反応を用いることにより不活化して得られる。このとき修飾に要する物質は、蛋白質のアミノ酸側鎖と容易に反応するものであれば特に限定されず、アセトアルデヒドやグルタルアルデヒド、活性型脂肪酸のようなアシル化剤、ジイソプロピルフルオロホスフェイト、ジイソプロピルクロロホスフェイト等を用いることができるが、特に、ジイソプロピルフルオロホスフェイトを好ましく使用することができる。
【００１２】
トロンビンを修飾反応により不活化するための方法は、公知の方法で行ってよいが、例えば、修飾に要する物質とヒトトロンビンを緩衝液中で混合（攪拌）して得ることが可能である。用いる緩衝液としては、トロンビンと修飾に要する物質の反応が進行しうる緩衝液であれば良く、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、修飾に要する物質としてジイソプロピルフロロホスフェイト等を用いる場合には、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されないが、１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの緩衝液である。反応条件は、例えば、４〜４５℃で５分〜９６時間であり、好ましくは１０〜４０℃で１〜４０時間である。
【００１３】
本発明でトロンビンの不活化物を抗原として用いて免疫される動物は、通常知られた恒温動物を使用する。恒温動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ等であれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが使用される。
【００１４】
恒温動物に免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。１回の投与量は、免疫される動物により異なるが、例えば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせるのが好ましい。なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００１５】
上記の抗原を免疫した恒温動物を７〜３０日間処置せずに放置した後、必要があれば該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等により測定することもできる。好ましくは酵素免疫測定法により測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うことができる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。
【００１６】
免疫した恒温動物から抗体産生細胞を得るには、最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む抹消リンパ系組織ならどこでも良いが、好ましくは脾臓である。
【００１７】
抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合するには、得られた組織を、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック、安藤民衛ら１９９１年）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすればよく、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ 第３９巻：２８５−３０８頁，１９８０年）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成させた後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。
以上のようにして本発明のハイブリット細胞を得ることができる。
【００１８】
本発明で得られるハイブリッド細胞を培養するには、本発明によるハイブリッド細胞が生存・増殖可能な公知の技術を用いれば良く、例えば、ハイブリッド細胞をマウス腹腔内に投与して腹水を得る方法や無血清培地、例えば５〜１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地等で培養する方法がある。これらの培養液中には目的の抗体が含まれているため、このまま利用しても良いし、下記の方法により目的の抗体を精製することも可能である。
【００１９】
培養物中よりトロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を取得するには、既に公知の技術を用いれば良く、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができるが、より具体的には、プロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。
以上のようにして本発明のトロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２０】
本発明のトロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を使用したトロンビンの測定方法としては、既に公知である免疫学的測定法が使用できるが、好ましくは酵素免疫学的測定法、特に好ましくはサンドイッチタイプの酵素免疫学的測定法である。例えば、サンドイッチタイプの酵素免疫学的測定法により試料中のトロンビン量を測定する方法としては、トロンビンに対する抗体を固定化可能な担体と接触させることにより物理的あるいは化学的に吸着させ、洗浄して余剰の抗体を分離することにより抗体固定化担体を得ることができる。このようにして得られた抗体固定化担体は非特異的な吸着反応を阻害するためのブロッキング処理を行っても良いし、乾燥処理等の後処理を行っても良い。得られた抗体固定化担体に既知濃度のトロンビンを含んだ試料およびトロンビンを含むサンプルを接触させることによりトロンビンを担体に固定化された抗体と反応させ（一次反応）、洗浄後、酵素標識したトロンビンに対する抗体を担体に固定化された抗体と反応したトロンビンに反応させ（二次反応）、洗浄後、担体に結合した酵素標識抗体の酵素を検出し、既知濃度のトロンビンを含む試料から得られるシグナルと、トロンビン濃度が未知であるサンプルから得られるシグナルを比較することにより、トロンビン量が未知である試料中のトロンビン量を測定することが可能である。
【００２１】
尿中トロンビンの測定方法としては、サンプルである尿を原液のまま、あるいは適当な緩衝液で希釈したものをサンプルとして上記免疫学的測定法で測定すれば良い。
以上のようにして尿中のトロンビンを測定することができる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のハイブリッド細胞は、トロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞である。また本発明のハイブリッド細胞により産生されるモノクローナル抗体は、トロンビンを特異的に認識するモノクローナル抗体である。また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、前記のハイブリッド細胞を用いた効率的な製造方法である。
さらには、本発明のトロンビンの測定方法は、前記の本発明のモノクローナル抗体を用いたトロンビンの測定方法であり、直接的にまた、特異的に精確に測定できる方法である。
したがって、本発明のモノクローナル抗体の製造方法を用いて製造されたモノクローナル抗体は、臨床学的に非常に有意義であり、また、本発明によるヒトトロンビンの免疫学的測定方法は、ヒトトロンビン活性と相関があることが明らかであるので、臨床診断、分析等において有用性が有り、特にヒトトロンビンの疾患・病態との関連性の解明のための一助となることが期待される。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．抗原の調製
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解したヒトトロンビン（ＣＡＬＢＩＯＣＥＭ社製 略語：ｈＴＢ）溶液（濃度：２ｍｇ／ｍｌ）に終濃度１００mMとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）溶液で調製したジイソプロピルフロロホスフェイト（シグマ社製，略語：ＤＦＰ）を加え、３７℃で２時間反応させてｈＴＢとＤＦＰのコンジュゲート（略語：ｈＴＢ−ＤＦＰ）を得て、これを抗原とした。
【００２４】
２．免疫方法
ｈＴＢ−ＤＦＰ（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これを５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略語：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が全例に産生していることを確認した（ｎ＝６）。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００２５】
３．抗体価の確認方法
抗体価はｈＴＢを固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、ｈＴＢを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＴＴＢＳと略す）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略すこともある。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルに任意の倍率に希釈されたマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（略語：ＰＯＤ）で標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。なお、コントロールとしては、免疫していないマウスから得られた血清を使用した。抗血清の力価について図１に示す。図１に示されるように、不活化したヒトトロンビンを抗原とした場合、全てのマウスにヒトトロンビンに対する抗体が産生されることが確認された。結果的に最も力価の高かったＮｏ．１のマウスを細胞融合に用いることとした。
なお、図中のＤＦＰはＤＦＰで修飾された不活化したトロンビンを抗原として免疫したマウスを示し、続く数字はマウスの固体番号を表す。
【００２６】
４．細胞融合
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、細胞を得た。
【００２７】
５．クローニング
前述の得られた細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μｌづつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。培養上清については酵素免疫化学的方法により抗体価を確認し、スクリーニングを行った。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用いる試料を血清の代わりに得られた培養上清を用いた。スクリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことによりｈＴＢに対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン５株を得た。このうち、２Ｃ１２株および２Ｇ３株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該２Ｃ１２株は、通商産業省工業技術院生命工学技術研究所に平成１１年７月９日に寄託番号（FＥＲＭ Ｐ−１７４５３）、および該２Ｇ３株は平成１１年７月９日に寄託番号（FＥＲＭ Ｐ−１７４５４）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、ハイブリッド細胞をマウス腹腔内に投与して得られた腹水をプロテインＡ結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した抗体を用いた。また、２Ｃ１２、２Ｇ３株について抗体のサブクラスを検討したところ、ＩｇＧ２ａであった。
【００２８】
〔比較例１〕
抗原をトロンビンとする以外は実施例１に従い抗原をマウスに免疫し、マウスに誘導される抗トロンビン抗体の抗体価を評価した。結果を図１に示す。なお、図中Ｔはトロンビンを抗原として免疫されたことを示し、続く数字はマウス番号を表す。
図１に示されるように、抗原が不活化したトロンビンである場合、６例全例に抗力価の抗トロンビン抗体が産生しているが、抗原がトロンビンである場合、免疫した６例全例で抗体価を確認することができなかった。
【００２９】
〔実施例２〕抗体の反応特異性評価結果
得られた５株のクローンから得られたｈＴＢを認識するモノクローナル抗体の内、サンドイッチタイプの酵素免疫学的測定方法を構築可能な２株、２Ｃ１２および２Ｇ３の両者の反応特異性について確認を行った。
１．モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブロッティングにより評価した。トロンビン、プロトロンビンおよびトロンビン・アンチヒトトロンビンIII複合体を電気泳動後、メンブレンにブロッティングした後、本発明により得られた任意濃度の本発明によるモノクローナル抗体を適当な条件下反応させた後、任意濃度のペルオキシダーゼにより標識したマウス抗体に対する抗体を反応させた。最終的にジニトロベンチジン、あるいはＥＣＬ法で検出し、本発明によるモノクローナル抗体のトロンビン、プロトロンビンおよびトロンビン・アンチトロンビンIII複合体への反応性を評価した。その結果を図２および図３に示す。図２中、１は還元プロトロンビン、２は還元トロンビン、３は非還元プロトロンビン、４は非還元トロンビンを示し、図３中、１はトロンビン・アンチトロンビンIII複合体、２はトロンビン、３はアンチトロンビンIIIを示す。図２，３より明らかなように、本抗体２Ｃ１２および２Ｇ３はトロンビンのみに非常に強く反応した。
【００３０】
２．トロンビン活性の中和試験
２．１凝固活性
トロンビンによるフィブリンクロットの形成を評価した。１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カルシウム、６．６ｍｇ／ｍｌのポリエチレングリコール６０００濃度となるように調製した１０ｍＭイミダゾール塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）６４μｌに１０μｌのトロンビン溶液および８４μｌのイオン交換水を加えた。この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン液４０μｌを加えてから凝固するまでの時間を測定してフィブリンクロットの形成を評価した。なお、添加するトロンビン溶液は以下のように調製された。１．６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように１％の濃度の牛血清アルブミン溶液（ＢＳＡ溶液）で調製したトロンビン溶液９．９μｌに１％ＢＳＡ溶液あるいは１％ＢＳＡ溶液で６．６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製した本発明による抗体液０．１μｌを混合攪拌し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、この溶液を１％ＢＳＡ液で１０倍希釈したものをトロンビン溶液として使用した。その結果どちらの抗体もコントロールと比較してクロッティング時間に差は認められず、どちらの抗体もヒトトロンビンによるフィブリンクロットの形成に対して影響はなかった。
【００３１】
２．２血小板凝集反応
トロンビンによる血小板凝集活性を評価した。反応容器に１５０μｌの多血小板血漿を入れ、２分間プレインキュベートした。それに、５０μｌのヒトトロンビン溶液を加え、１分間プレインキュベートした。最後に１Ｍ 塩化カルシウム液を２２μｌ添加攪拌し、ヘマトレーサーで血小板凝集能について評価した。なお、添加するトロンビン溶液は、１．５４μｇ／ｍｌのヒトトロンビン液を加えたものをコントロール、終濃度で１．５４μｇ／ｍｌのヒトトロンビン、１ｍｇ／ｍｌの各抗体となるように調製した液を４℃で１時間インキュベートした液とを用いた。その結果どちらの抗体も血小板凝集能に対して影響がなかった。
【００３２】
〔実施例３〕尿中ヒトトロンビン量の測定
本発明のモノクローナル抗体を用いて、ヒトトロンビンのサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定システムを構築し、メサンギウム性増殖性腎炎患者尿中のトロンビン量を測定した。すなわち、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μｌの抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体（２Ｃ１２）液（ＰＢＳ）を入れ、４℃で一昼夜固定化した。ウエル当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエースをウエル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。サンプル（ヒト尿）をウエル当たり１００μl入れ、室温で１時間反応させた。０．０５％ＴＴＢＳで４回洗浄し、直ちに、ＰＯＤ標識した抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体（２Ｇ３）をウエル当たり１００μl入れ、室温で１時間反応させた。０．０５％ＴＴＢＳで４回洗浄し、ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、尿中のヒトトロンビン濃度を測定した。なお、標準としては市販のヒトトロンビンを用いた。標準曲線を図４に、ヒト尿中のトロンビン量を表１に示した。このようにメサンギウム性増殖性腎炎患者尿中にはトロンビンが存在していた。
【００３３】
【表１】

【００３４】
〔実施例４〕尿中トロンビン活性の測定
上記で使用したメサンギウム性増殖性腎炎患者尿中のトロンビン活性を合成基質法で測定した。すなわち、トロンビンの合成ペプチド基質である３０９３−Ｖ（ペプチド研究所社製）を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で０．１Ｍとなるように調製した液１０μｌとヒト尿５０μｌをセルに入れ、全量を６２０μlとなるように混合攪拌した。日立製作所社製６５０−４０型蛍光分光光度計にて、励起波長３８０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍで５分間測定し、その勾配からトロンビン活性を求めた。標準曲線を図５に示す。また、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）で調製したヒルジン液（１０μl）を添加したヒト尿サンプルを用いて同様の測定を実施し、ヒルジン無添加サンプルより得られた活性からヒルジン添加サンプルより得られた活性の差を求めてヒトトロンビン活性とした。標準としては、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製ヒトトロンビンを用いた。結果を表２に示す。このように、メサンギウム性増殖性腎炎患者尿中からヒトトロンビン活性が検出された。
【００３５】
【表２】

【００３６】
注 −Ｈはヒルジン未添加、＋Ｈはヒルジン添加を示す。
【００３７】
〔実施例５〕ヒトトロンビン量の相関性についての評価
実施例４で得られた尿中のトロンビン活性を横軸、実施例３で得られた本発明によるヒトトロンビンに対する抗体を用いた免疫学的測定方法により測定された尿中のトロンビン量を縦軸として、トロンビン活性に対するヒトトロンビン量の相関性について評価した。その結果を図６に示す。図に示すように、本発明によるトロンビンの測定方法により得られたトロンビン濃度と、合成基質法により得られたトロンビン活性は、相関係数Ｒ＝９９９９、直線の式ｙ＝３４．５８５ｘ−０．０２９７と、非常に良好な相関を示した。
【００３８】
以上の結果より、本発明のハイブリッド細胞により、ヒトトロンビンに対する良好なモノクローナル抗体が産生できることがわかる。また、前記のモノクローナル抗体の製造方法により、ヒトトロンビンに対する良好なモノクローナル抗体が製造できることがわかる。
また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法を用いて製造されたモノクローナル抗体は臨床学的に非常に有意義である。また、本発明によるヒトトロンビンの免疫学的測定方法は、ヒトの尿中のヒトトロンビンを直接精確に測定できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１における免疫したマウスから得た血清の力価、および比較例１における免疫していないマウスから得た血清の力価の図である。
【図２】図２は、実施例２の抗体の反応特異性評価における、トロンビンおよびプロトロンビンに対するウエスタンブロット試験結果の図である。
【図３】図３は、実施例２の抗体の反応特異性評価における、トロンビンおよびトロンビン・アンチトロンビンIII複合体に対するウエスタンブロット試験結果の図である。
【図４】図４は、実施例３の市販のヒトトロンビンを用いたヒトトロンビン量測定の標準曲線の図である。
【図５】図５は、実施例４の尿の試料を用いたヒトトロンビン活性量の測定の標準曲線の図である。
【図６】実施例５におけるトロンビン活性とヒトトロンビン量との相関図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a hybrid cell producing a monoclonal antibody having a high specificity for thrombin, a monoclonal antibody having a high specificity for thrombin, a method for producing the same, and a method for immunoassay of thrombin using the monoclonal antibody.
[0002]
[Prior art]
Thrombin is a very important enzyme involved in blood coagulation known as a kind of serine protease formed at the site of vascular injury. As for the action of thrombin, it has been well known that fibrinogen is cleaved to form a fibrin thrombus. However, it has become clear that it is also a physiologically active substance that acts on various cells. Experimental medicine vol.13 No.2 page 164 1995 Shujunsha). These actions include, for example, activation and aggregation of platelets to release chemical substances such as serotonin and ADP, action as a migration factor for monocytes, proliferation to lymphocytes, fibroblasts, and vascular smooth muscle cells Examples include stimulating effects. It also has the action of promoting the production of prostacyclin, PDGF, plasminogen activator inhibitor and the like, and promoting the transport of GMP140 to the cell surface to promote the adhesion of neutrophils to vascular endothelial cells. . That is, thrombin not only functions as a blood coagulation factor, but also functions as a signal transduction molecule related to repair and proliferation in the case of inflammation or injury of a blood vessel wall or tissue. Thrombin is therefore a very important substance involved in inflammation, wound healing and arteriosclerosis in addition to blood clotting factors.
[0003]
As is clear from the above explanation, it is clinically very meaningful to measure the amount or activity of thrombin in a living body. At present, when clinically measuring thrombin, for example, a coagulation time method for measuring thrombin activity or a synthetic substrate method is used. In general, when the specimen is derived from blood, blood coagulation factor II is converted to thrombin and thrombin activity is measured. The clotting time method measures the clotting time of the specimen, that is, the time required for fibrin conversion by thrombin. It is a method to calculate the relative amount of blood coagulation factor II to normal serum by doing, but the measurement operation requires skill, the measurement operation is complicated, the reagent used, and the measurement value differs depending on the lot There was a problem. The synthetic substrate method uses a chromogenic synthetic substrate that reacts with the protease action of thrombin, but (i) specificity is not absolute but slightly cross-reacts with other coagulation factors, (ii) natural The serine protease activity and reactivity with respect to the substrate of (ii) were different, and (iii) the measuring device was expensive. In addition, although the method for measuring thrombin activity can indirectly evaluate the amount of thrombin generated in the living body, it does not directly measure the amount of active thrombin in the specimen.
[0004]
As described above, thrombin is a molecule that is the center of blood coagulation and is considered to be involved in various diseases. In glomerulonephritis, which is one of the kidney diseases, coagulation activation is related to its progress, and anticoagulant therapy is widely practiced, but there is no index that directly indicates the activation of coagulation. It is a disease that makes it difficult to determine drugs. As a result of intensive research, we measured thrombin activity in the urine of patients with nephritis using the synthetic substrate method, and found that there was thrombin activity in the urine of patients with mesangial proliferative nephritis. However, when using the synthetic substrate method, in order to measure the activity specific to thrombin, a thrombin inhibitor (antithrombin substance) that specifically binds to thrombin and inhibits thrombin activity, such as hirudin, is added. Therefore, it was necessary to calculate the true human thrombin activity by calculating the difference in thrombin activity before and after the addition of hirudin, and this was not an inexpensive and simple method (Kidney International, vol. 54, 1767-1768, 1998). .
[0005]
As a measurement method for directly measuring thrombin, for example, a method of immunological measurement using an antibody highly specific for thrombin is conceivable. However, there is no known immunoassay for measuring thrombin directly. As an antibody against human thrombin, J. et al. Dawes et al.'S antibodies against human thrombin are already known (Thrombosis Research 36, 397-409, 1984). However, since thrombin is highly conserved among species and has blood clotting activity, when human thrombin is used as an immunogen, as reported in the above literature, anti-human thrombin antibodies are not available to most individuals. It was very difficult to obtain antibodies against human thrombin that were not produced. In addition, as a method for inactivating thrombin, for example, a method in which diisopropyl fluorophosphate (= DFP) of Tsiang et al. Is modified to a modified thrombin is known (Biochemistry, vol. 29, No. 47, 10602-10612, 1990). However, a method using inactivated thrombin as an antigen to obtain an antibody against thrombin has not been known.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
A first object of the present invention is to provide a hybrid cell that produces a monoclonal antibody that recognizes thrombin with high specificity.
A second object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that can be obtained from a hybrid cell that produces the monoclonal antibody.
A third object of the present invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody using a hybrid cell that produces a monoclonal antibody that reacts with high specificity to thrombin.
A fourth object of the present invention is to provide a method for measuring thrombin using a monoclonal antibody that reacts with high specificity to thrombin. It is another object of the present invention to provide an immunological measurement method for urinary thrombin.
[0007]
[Means for Solving the Invention]
As a result of investigations in view of the above problems, the present inventors have demonstrated that thrombin is immunized as an antigen with an inactivated thrombin, particularly thrombin inactivated by modification with diisopropylfluorophosphate, and thus has specificity for thrombin. For the first time, it was found that hybrid cells that efficiently produce high antibodies can be obtained. Further, it was found that thrombin can be measured with high specificity by using the antibody obtained by the present invention, and the present invention was completed.
[0008]
Therefore, this invention is the following (1)-(8).
(1) A monoclonal antibody characterized by not recognizing prothrombin and thrombin / antithrombin III complex and not inhibiting fibrin clot formation and platelet aggregation reaction of human thrombin.
(2) The monoclonal antibody according to (1), which is secreted from a hybridoma having the accession number FERM P-17453.
(3) A hybridoma that secretes the monoclonal antibody according to (1).
(4) A monoclonal antibody characterized by recognizing thrombin and prothrombin, not recognizing thrombin / antithrombin III complex, and not inhibiting fibrin clot formation and platelet aggregation reaction of human thrombin.
(5) The monoclonal antibody according to (4), which is secreted from a hybridoma having the accession number FERM P-17454.
(6) A hybridoma that secretes the monoclonal antibody according to (4).
(7) A thrombin sandwich enzyme immunoassay method using the monoclonal antibody according to (1) or (2) and the monoclonal antibody according to (4) or (5).
(8) The sandwich enzyme immunoassay method according to (7), wherein the thrombin is urinary thrombin.
Furthermore, the present specification describes:belowThe inventions of (9) to (14) are disclosed.
(9) A hybrid cell obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from an isothermal animal immunized with an inactivated thrombin as an antigen and a myeloma cell.
(10The thrombin inactivated product is an inactivated product of thrombin obtained by inactivation by modification with diisopropyl fluorophosphate (9) The hybrid cell described.
[0009]
(11) (9) Or (10A monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin, obtained from a culture obtained by culturing the hybrid cells described in 1).
(12) Specific use of thrombin from a culture obtained by culturing hybrid cells obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from an isothermal animal immunized with thrombin as an antigen with myeloma cells A method for producing a monoclonal antibody, comprising obtaining a monoclonal antibody that is recognized by
(13) (12A method for measuring thrombin, which comprises using the monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin.
(14) (12A method for measuring thrombin in urine, which comprises using the monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
The hybrid cell of the present invention can be obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from a homeothermic animal immunized with an inactivated product of thrombin as an antigen and a myeloma cell.
In the present invention, an inactivated product of thrombin can be used as an antigen, but as the thrombin used for obtaining the inactivated product of thrombin in the present invention, any thrombin of the animal species to be obtained may be used, and commercially available. Can also be used. For example, human thrombin may be used to obtain an antibody against human thrombin. The thrombin amino acid composition is highly homologous between animal species and has a blood coagulation activity. Therefore, an effective immune response product cannot be obtained even when immunized with thrombin itself as an antigen. Is used as an antigen.
[0011]
The inactivated product of thrombin can be obtained by inactivating the above thrombin by a generally known method, but preferably obtained by inactivating it by acid treatment, alkali treatment, protease treatment, heat treatment, modification reaction, etc. More preferably, it is obtained by inactivation by using a modification reaction. The substance required for the modification is not particularly limited as long as it easily reacts with the amino acid side chain of the protein, and includes acylating agents such as acetaldehyde, glutaraldehyde and activated fatty acid, diisopropyl fluorophosphate, diisopropyl chlorophosphate. Although a fate etc. can be used, Diisopropyl fluorophosphate can be used preferably especially.
[0012]
A method for inactivating thrombin by a modification reaction may be carried out by a known method. For example, a substance required for modification and human thrombin can be mixed (stirred) in a buffer solution. The buffer solution to be used may be a buffer solution capable of allowing the reaction between thrombin and the substance required for modification to proceed. Examples of the buffer solution include buffers such as phosphates and carbonates, and phosphate buffers are preferably used. The pH of the buffer is not particularly limited as long as the reaction proceeds. However, when diisopropyl fluorophosphate or the like is used as a substance required for modification, the pH is 6 to 11, preferably 7 to 9. The concentration of the buffer is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but it is 1 mM to 1 M, preferably 10 to 100 mM. The reaction conditions are, for example, 4 to 45 ° C. for 5 minutes to 96 hours, preferably 10 to 40 ° C. for 1 to 40 hours.
[0013]
As the animal immunized with the inactivated product of thrombin as an antigen in the present invention, a conventionally known constant temperature animal is used. The isothermal animal is not particularly limited as long as it is, for example, mouse, hamster, rat, guinea pig, rabbit, dog, etc. However, since myeloma cells that fuse antibody-producing cells are derived from mice, mice are preferably used. .
[0014]
As a method for immunizing a thermostatic animal, a normal known immunization method can be used. For example, administration of 2 or 3 times at intervals of 7 to 30 days, particularly 12 to 16 days is preferable. A single dose varies depending on the animal to be immunized, but is, for example, about 0.05 to 2 mg. The administration route can be selected from subcutaneous injection, intradermal injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, and the like. The administration form is preferably performed by injection into the peritoneal cavity, subcutaneously or intramuscularly. More preferably, it is preferable to combine all the administration routes, such as peritoneal cavity injection, subcutaneous injection and intramuscular injection, by combining 2 to 3 administration routes. In this case, the antigen is contained in an appropriate buffer such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, sodium phosphate buffer containing one kind of commonly used adjuvants such as aluminum hydroxide, physiological saline and the like. Although it can be used by dissolving, it is not necessary to use the above adjuvant. Here, an adjuvant means a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances an immune response to the antigen.
[0015]
After leaving the isothermal animal immunized with the above antigen untreated for 7 to 30 days, if necessary, a small amount of serum of the thermostatic animal is collected, and the antibody titer is determined by Western blotting, agglutination, enzyme immunoassay, It can also be measured by a single radial immunodiffusion method or the like. Preferably, it can be measured by enzyme immunoassay. If the antibody titer increases, additional administration of antigen can be performed an appropriate number of times depending on the situation. For example, one or two additional administrations are performed at a dose of 0.01 to 1 mg, particularly 0.05 to 0.5 mg.
[0016]
In order to obtain antibody-producing cells from the immunized constant temperature animal, a tissue containing antibody-producing lymphocytes is excised from 1 to 30 days after the last administration, particularly preferably 1 to 7 days after. The tissue to be removed may be any peripheral lymphoid tissue containing antibody-producing lymphocytes, but is preferably the spleen.
[0017]
In order to fuse an antibody-producing cell and a myeloma cell, the obtained tissue is treated by a method described in, for example, “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedure” (Kodansha Scientific, Ando Tamie et al. 1991). Thus, cells that can be cultured in subculture can be used. For example, hybrid cells can be obtained by cell fusion with certain cancer cells in the presence of Sendai virus or polyethylene glycol. The cancer cells used here are preferably the same isothermal animal cancer cells of the same species, and for example, when a mouse is fused with a spleen cell obtained as an immunized animal, a mouse myeloma cell is preferably used. As a method of cell fusion actually used, a known technique (J. Immunol. Method 39: 285-308, 1980) can be used. For example, spleen obtained from an immunized mouse and mouse myeloma cells are fused in the presence of polyethylene glycol, and selectively by a HAT medium (medium supplemented with hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in which only hybrid cells can grow. After the hybrid cells are grown and the hybrid cells form colonies, the antibodies in the culture supernatant are screened to obtain hybrid cells that produce the target antibody. Examples of screening methods include Western blotting or enzyme immunochemical measurement. A hybrid cell producing the target antibody can be finally obtained as a single hybrid cell by repeating the limiting dilution method.
The hybrid cell of the present invention can be obtained as described above.
[0018]
In order to culture the hybrid cells obtained by the present invention, a known technique that allows the hybrid cells according to the present invention to survive and proliferate may be used. For example, there is no method for obtaining ascites by administering the hybrid cells intraperitoneally to mice. There is a method of culturing in a serum medium such as RPMI 1640 medium supplemented with 5 to 10% FBS. Since the target antibody is contained in these culture solutions, it can be used as it is, or the target antibody can be purified by the following method.
[0019]
In order to obtain a monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin from the culture, a known technique may be used. Antibodies produced by hybrid cells that produce these target antibodies can be obtained by, for example, centrifugation, ammonium sulfate. Or common biochemical separation methods for proteins such as protein fractionation using polyethylene glycol, aqueous bilayer partitioning, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, etc. Although it can refine | purify using it combining a method, the affinity chromatography using protein A or protein G is used more specifically.
As described above, a monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin of the present invention can be obtained.
[0020]
As a method for measuring thrombin using the monoclonal antibody specifically recognizing thrombin of the present invention, a known immunoassay can be used, preferably an enzyme immunoassay, particularly preferably a sandwich type. This is an enzyme immunoassay method. For example, as a method of measuring the amount of thrombin in a sample by a sandwich-type enzyme immunoassay, the antibody against thrombin is physically or chemically adsorbed by contacting it with an immobilizable carrier and washed. An antibody-immobilized carrier can be obtained by separating excess antibody. The antibody-immobilized carrier thus obtained may be subjected to a blocking treatment for inhibiting a nonspecific adsorption reaction, or may be subjected to a post-treatment such as a drying treatment. The obtained antibody-immobilized carrier is contacted with a sample containing thrombin at a known concentration and a sample containing thrombin to react thrombin with the antibody immobilized on the carrier (primary reaction), and after washing, enzyme-labeled thrombin The antibody against the antibody reacts with thrombin reacted with the antibody immobilized on the carrier (secondary reaction), and after washing, the enzyme-labeled antibody enzyme bound to the carrier is detected and a signal obtained from a sample containing thrombin at a known concentration And a signal obtained from a sample whose thrombin concentration is unknown, it is possible to measure the thrombin amount in a sample whose thrombin amount is unknown.
[0021]
As a method for measuring urinary thrombin, urine as a sample may be measured by the above-described immunological measurement method using the urine as a stock solution or diluted with an appropriate buffer.
As described above, urinary thrombin can be measured.
[0022]
【The invention's effect】
The hybrid cell of the present invention is a hybrid cell that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin. The monoclonal antibody produced by the hybrid cell of the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes thrombin. The method for producing a monoclonal antibody of the present invention is an efficient production method using the hybrid cells.
Furthermore, the method for measuring thrombin of the present invention is a method for measuring thrombin using the above-described monoclonal antibody of the present invention, which can be directly and specifically measured accurately.
Therefore, the monoclonal antibody produced using the production method of the monoclonal antibody of the present invention is clinically very significant, and the immunoassay method of human thrombin according to the present invention correlates with human thrombin activity. Therefore, it is useful in clinical diagnosis, analysis, etc., and is expected to help elucidate the relationship between human thrombin and diseases / pathological conditions.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, this invention is not limited to a present Example.
[Example 1]
1. Antigen preparation
50 mM phosphate buffer (pH 7.2) solution in human thrombin (CALBIOCEM abbreviation: hTB) solution (concentration: 2 mg / ml) dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) to a final concentration of 100 mM. Diisopropyl fluorophosphate (Sigma, abbreviation: DFP) prepared in (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours to obtain a conjugate of hTB and DFP (abbreviation: hTB-DFP), which was used as an antigen.
[0024]
2. Immunization method
hTB-DFP (1 mg / ml) was mixed well with an equal volume of Freund's complete adjuvant to give an emulsion, which was immunized with 100 μl intraperitoneally in 5 mice (BALB / c, male, 6-8 weeks old). . Ten to 14 days after the first immunization, the antigen and Freund's incomplete adjuvant were mixed well to give an emulsion as a booster immunization. Three weeks after the booster immunization, the antigen and phosphate buffered saline (abbreviation: PBS) were mixed for final immunization. The antibody titer was determined by collecting blood from the mouse eye vein 1 week after the booster immunization, and using the obtained serum to produce antibodies against the antigen by enzyme immunochemical methods in all cases. (N = 6). In the enzyme immunochemical method, a large antibody titer difference was observed between the serum obtained from the immunized mouse and the serum obtained from the pre-immunized mouse as a comparative control, and an increase in the antibody titer was confirmed.
[0025]
3. Confirmation method of antibody titer
The antibody titer was confirmed by enzyme immunoassay using hTB as a solid phase. Specifically, hTB was physically adsorbed on a 96-well immunoplate, washed three times with 0.05% Tween 20-Tris buffer (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as TTBS), and then tris buffer containing 1% BSA ( Blocking was performed at pH 7.4) (hereinafter sometimes abbreviated as “blocking solution”). Serum (100 μl / well) obtained from a mouse diluted to an arbitrary magnification was added to the well of this plate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the wells, a solution (100 μl / well) obtained by diluting a rabbit antibody against a mouse antibody labeled with horseradish peroxidase (abbreviation: POD) 5000 times with TTBS (hereinafter abbreviated as “enzyme-labeled antibody solution”). The mixture was allowed to react at 37 ° C. for 1 hour. After washing the well, 0.1 M citrate-phosphate buffer solution (pH 5) (100 μl / well) containing O-phenylenediamine (0.4 mg / ml) and hydrogen peroxide (0.003%) (hereinafter, color development) Abbreviated as liquid) and allowed to react at room temperature for 15-20 minutes. The color reaction was stopped by adding 1 M sulfuric acid (50 μl / well) (hereinafter abbreviated as reaction stop solution), and the antibody titer was confirmed by measuring the absorbance at 492 nm with a microplate reader. As a control, serum obtained from an unimmunized mouse was used. The antiserum titer is shown in FIG. As shown in FIG. 1, when inactivated human thrombin was used as an antigen, it was confirmed that antibodies against human thrombin were produced in all mice. As a result, the No. One mouse was used for cell fusion.
In addition, DFP in a figure shows the mouse | mouth which immunized using the inactivated thrombin modified with DFP as an antigen, and a following number represents the solid number of a mouse | mouth.
[0026]
4). Cell fusion
The mouse spleen was removed from the immunized mouse and loosened to obtain spleen cells. The obtained splenocytes were washed with RPMI-1640 medium. Similar to the washed spleen cells, mouse 653 cells (P3X63-Ag8,653: CRL · 1580), which are myeloma cells thoroughly washed with RPMI-1640 medium, were mixed so that the cell number was 7: 1. A 50 w / v% polyethylene glycol 1540 solution was gradually added to the medium and mixed for 5 minutes. RPMI-1640 medium was added thereto to stop the reaction, and then centrifuged for 5 minutes to discard the supernatant. After RPMI-1640 medium was added thereto, the mixture was centrifuged for 5 minutes and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice to wash the cells to obtain cells.
[0027]
5. Cloning
30 ml of HAT medium was added to the obtained cells to suspend the cells, and 100 μl each was dispensed into each well of a 96-well microplate, and hybrid cells were selectively grown on the HAT medium. Ten days after the fusion, ½ volume of the culture supernatant in the well was replaced with HT medium (HAT medium minus aminopterin). This operation was repeated 2-3 times. The culture supernatant was screened after confirming the antibody titer by an enzyme immunochemical method. The method for confirming the antibody titer was the same as the method for confirming the antibody titer described above, but the culture supernatant obtained instead of serum was used as a sample for the test. Cells in wells that have been confirmed to have antibody activity by screening are subjected to limiting dilution and cultured, and finally a clone consisting of a single cell that has high antibody activity against hTB by repeating screening and limiting dilution. Five strains were obtained. Among these, the reaction specificity of the monoclonal antibodies of 2C12 strain and 2G3 strain was confirmed. The 2C12 strain was deposited with the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, Biotechnology Research Institute on July 9, 1999 (FERM P-17453), and the 2G3 strain was deposited with a deposit number on July 9, 1999 ( FERM P-17454). In addition, the monoclonal antibody used for examination used the antibody which refine | purified the ascites obtained by administering a hybrid cell intraperitoneally to a mouse | mouth by affinity chromatography with a protein A binding carrier. Further, when the subclass of the antibody was examined for the 2C12 and 2G3 strains, it was IgG2a.
[0028]
[Comparative Example 1]
Mice were immunized with the antigen according to Example 1 except that the antigen was thrombin, and the antibody titer of the antithrombin antibody induced in the mouse was evaluated. The results are shown in FIG. In the figure, T indicates that immunization was performed using thrombin as an antigen, and the subsequent numbers represent mouse numbers.
As shown in FIG. 1, when the antigen is inactivated thrombin, anti-thrombin antibody of anti-titer is produced in all 6 cases, but when the antigen is thrombin, in all 6 immunized cases The antibody titer could not be confirmed.
[0029]
[Example 2] Results of antibody reaction specificity evaluation
Among the monoclonal antibodies recognizing hTB obtained from the obtained 5 strain clones, the reaction specificity of both 2 strains, 2C12 and 2G3 capable of constructing a sandwich type enzyme immunoassay was confirmed. .
1. Evaluation Method of Reaction Specificity of Monoclonal Antibody-1
The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated by Western blotting. After electrophoresis of thrombin, prothrombin and thrombin / anti-human thrombin III complex, blotting on a membrane, the monoclonal antibody according to the present invention of any concentration obtained according to the present invention was reacted under suitable conditions, An antibody against a mouse antibody labeled with peroxidase was reacted. Finally detected by dinitrobenzidine or ECL method, the monoclonal antibodies according to the present invention, thrombin, prothrombin and thrombin antithrombinIIIThe reactivity to the complex was evaluated. The results are shown in FIG. 2 and FIG. In FIG. 2, 1 is reduced prothrombin, 2 is reduced thrombin, 3 is non-reduced prothrombin, 4 is non-reduced thrombin, and in FIG. 3, 1 is a thrombin / antithrombin III complex, 2 is thrombin, 3 is antithrombin III is shown. As apparent from FIGS. 2 and 3, the present antibodies 2C12 and 2G3 reacted very strongly only with thrombin.
[0030]
2. Thrombin activity neutralization test
2.1 Coagulation activity
The formation of fibrin clot by thrombin was evaluated. Add 10 μl of thrombin solution and 84 μl of ion-exchanged water to 64 μl of 10 mM imidazole hydrochloride buffer (pH 7.4) prepared to a concentration of 150 mM sodium chloride, 10 mM calcium chloride, and 6.6 mg / ml polyethylene glycol 6000. It was. The formation of a fibrin clot was evaluated by measuring the time from adding 40 μl of a 10 mg / ml fibrinogen solution to the solution until coagulation. The thrombin solution to be added was prepared as follows. Concentration of 6.6 mg / ml with 1% BSA solution or 1% BSA solution in 9.9 μl of thrombin solution prepared with bovine serum albumin solution (BSA solution) with 1% concentration to a concentration of 1.6 mg / ml Then, 0.1 μl of the antibody solution prepared according to the present invention was mixed and stirred, and incubated at 4 ° C. for 1 hour. After incubation, this solution diluted 10 times with 1% BSA solution was used as a thrombin solution. As a result, neither antibody showed any difference in clotting time compared to the control, and neither antibody had any effect on the formation of fibrin clot by human thrombin.
[0031]
2.2 Platelet aggregation reaction
Platelet aggregation activity by thrombin was evaluated. 150 μl of platelet-rich plasma was placed in the reaction vessel and preincubated for 2 minutes. To it, 50 μl of human thrombin solution was added and preincubated for 1 minute. Finally, 22 μl of 1M calcium chloride solution was added and stirred, and the platelet aggregation ability was evaluated with a hematracer. The thrombin solution to be added is a control prepared by adding 1.54 μg / ml human thrombin solution, and a solution prepared so that the final concentration of each antibody is 1.54 μg / ml human thrombin and 1 mg / ml. A solution incubated at 4 ° C. for 1 hour was used. As a result, neither antibody had any effect on platelet aggregation ability.
[0032]
[Example 3] Measurement of urinary human thrombin amount
Using the monoclonal antibody of the present invention, a human thrombin sandwich ELISA system was constructed, and the amount of thrombin in the urine of mesangial proliferative nephritis patients was measured. That is, 100 μl per well of an anti-human thrombin monoclonal antibody (2C12) solution (PBS) was placed in a 96-well immunoplate and immobilized at 4 ° C. overnight. After washing 3 times with 300 μl of TTBS per well, 300 μl of ACEBS containing 1% BSA or 4 times diluted with distilled water was added to block. A sample (human urine) was added at 100 μl per well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with 0.05% TTBS, immediately 100 μl of POD-labeled anti-human thrombin monoclonal antibody (2G3) was added per well and allowed to react at room temperature for 1 hour. The plate was washed 4 times with 0.05% TTBS, 100 μl of color developing solution was added per well, and incubated at room temperature for 15 to 20 minutes. After adding 50 μl of the reaction stop solution per well, the absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader to measure the human thrombin concentration in urine. As a standard, commercially available human thrombin was used. The standard curve is shown in FIG. 4 and the amount of thrombin in human urine is shown in Table 1. Thus, thrombin was present in the urine of mesangial proliferative nephritis patients.
[0033]
[Table 1]

[0034]
[Example 4] Measurement of urinary thrombin activity
Thrombin activity in the urine of mesangial proliferative nephritis patients used above was measured by the synthetic substrate method. That is, 10 μl of a solution prepared by adjusting 3093-V (manufactured by Peptide Laboratories), a synthetic peptide substrate of thrombin, to 0.1 M with 0.1 M Tris buffer (pH 7.6) containing 150 mM NaCl. And 50 μl of human urine were placed in a cell and mixed and stirred so that the total volume was 620 μl. Using a 650-40 type fluorescence spectrophotometer manufactured by Hitachi, Ltd., an excitation wavelength of 380 nm and a measurement wavelength of 440 nm were measured for 5 minutes, and thrombin activity was determined from the gradient. A standard curve is shown in FIG. In addition, the same measurement was performed using a human urine sample added with hirudin solution (10 μl) prepared with 0.1 M Tris buffer (pH 7.6) so as to be 10 units / ml. From the obtained activity, the difference in activity obtained from the hirudin-added sample was determined and defined as human thrombin activity. As a standard, human thrombin manufactured by CALBIOCHEM was used. The results are shown in Table 2. Thus, human thrombin activity was detected in the urine of patients with mesangial proliferative nephritis.
[0035]
[Table 2]

[0036]
Note -H indicates no hirudin added, + H indicates hirudin added.
[0037]
[Example 5] Evaluation of correlation between human thrombin amounts
The urinary thrombin activity obtained in Example 4 is plotted on the horizontal axis, and the amount of thrombin in the urine measured by the immunoassay using the antibody against human thrombin obtained in Example 3 according to the present invention is plotted on the vertical axis. The correlation of the amount of human thrombin with the thrombin activity was evaluated. The result is shown in FIG. As shown in the figure, the thrombin concentration obtained by the method for measuring thrombin according to the present invention and the thrombin activity obtained by the synthetic substrate method have a correlation coefficient R = 9999 and a linear equation y = 34.585x-0. It showed a very good correlation with 0297.
[0038]
From the above results, it can be seen that the hybrid cell of the present invention can produce a good monoclonal antibody against human thrombin. Moreover, it turns out that the favorable monoclonal antibody with respect to a human thrombin can be manufactured with the manufacturing method of the said monoclonal antibody.
Moreover, the monoclonal antibody manufactured using the manufacturing method of the monoclonal antibody of this invention is very significant clinically. It can also be seen that the human thrombin immunoassay method according to the present invention can directly and accurately measure human thrombin in human urine.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph of the titer of serum obtained from an immunized mouse in Example 1 and the titer of serum obtained from an unimmunized mouse in Comparative Example 1.
FIG. 2 is a view showing the results of Western blot test for thrombin and prothrombin in the reaction specificity evaluation of the antibody of Example 2. FIG.
FIG. 3 is a view of a Western blot test result for thrombin and thrombin / antithrombin III complex in the reaction specificity evaluation of the antibody of Example 2.
4 is a standard curve for measuring the amount of human thrombin using the commercially available human thrombin of Example 3. FIG.
5 is a diagram of a standard curve for measuring the amount of human thrombin activity using the urine sample of Example 4. FIG.
6 is a correlation diagram between thrombin activity and human thrombin amount in Example 5. FIG.

Claims (6)

トロンビンを特異的に認識し、プロトロンビン及びトロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を認識せず、ヒトトロンビンのフィブリンクロット形成及び血小板凝集反応を阻害しない、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５３であるハイブリドーマから分泌される、モノクローナル抗体。 Secreted from a hybridoma with accession number FERM P-17453, which specifically recognizes thrombin, does not recognize prothrombin and thrombin-antithrombin III complex, and does not inhibit fibrin clot formation and platelet aggregation of human thrombin . Monoclonal antibody. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を分泌する、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５３であるハイブリドーマ。 A hybridoma having the accession number FERM P-17453, which secretes the monoclonal antibody according to claim 1. トロンビン及びプロトロンビンを認識し、トロンビン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を認識せず、ヒトトロンビンのフィブリンクロット形成及び血小板凝集反応を阻害しない、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５４であるハイブリドーマから分泌される、モノクローナル抗体。A monoclonal antibody secreted from a hybridoma with accession number FERM P-17454 that recognizes thrombin and prothrombin, does not recognize thrombin-antithrombin III complex, and does not inhibit fibrin clot formation and platelet aggregation of human thrombin. 請求項３に記載のモノクローナル抗体を分泌する、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５４であるハイブリドーマ。 A hybridoma having the accession number FERM P-17454, which secretes the monoclonal antibody according to claim 3. 請求項１に記載のモノクローナル抗体、及び請求項３に記載のモノクローナル抗体を使用することを特徴とするトロンビンのサンドイッチ酵素免疫測定方法。The monoclonal antibody of claim 1, and a sandwich enzyme immunoassay of thrombin, which comprises using the monoclonal antibody according to claim 3. 前記トロンビンが尿中トロンビンである、請求項５に記載のサンドイッチ酵素免疫測定方法。The sandwich enzyme immunoassay method according to claim 5 , wherein the thrombin is urinary thrombin.

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