JP4440151B2 - Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法 - Google Patents

Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP4440151B2
JP4440151B2 JP2005078282A JP2005078282A JP4440151B2 JP 4440151 B2 JP4440151 B2 JP 4440151B2 JP 2005078282 A JP2005078282 A JP 2005078282A JP 2005078282 A JP2005078282 A JP 2005078282A JP 4440151 B2 JP4440151 B2 JP 4440151B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
detection
dna microarray
fullerene
detection part
electrically
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2005078282A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006258670A (ja
Inventor
竜彦 森
正恭 坂根
智隆 赤松
晴樹 白石
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissha Printing Co Ltd
Original Assignee
Nissha Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nissha Printing Co Ltd filed Critical Nissha Printing Co Ltd
Priority to JP2005078282A priority Critical patent/JP4440151B2/ja
Publication of JP2006258670A publication Critical patent/JP2006258670A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4440151B2 publication Critical patent/JP4440151B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、電気化学的にＤＮＡやＲＮＡを検出する方法において用いることができるＤＮＡマイクロアレイとその製造方法に関する。
従来より、多種類の遺伝子構造を効率的に解析するための解析ユニットとしてＤＮＡマイクロアレイがある（ＤＮＡチップともいう。ここでは、ＤＮＡマイクロアレイと総称する）。
ＤＮＡマイクロアレイの基本的な構成は、基材上に異種で多数の塩基配列が既知のオリゴヌクレオチド（プローブＤＮＡという）を適当な間隔でスポット状に固定化したものである。通常、一つのスポットの大きさは、２０〜２００μｍ程度である。基材としては、ガラス板、Ｓｉ板、プラスチック板が用いられている。これら基材表面にプローブＤＮＡを固定化するには、物理吸着、化学吸着、イオン結合、疎水結合、共有結合などの結合を利用している。
ＤＮＡの実装数に関しては、データマイニングなどにより解析を行うが、その実装数に応じて得られる情報が増え高度な解析をすることができる。
ＤＮＡマイクロアレイの基材上には、数百〜数万個の電極を形成していることが多い。具体的な固定化方法としては、フォトリソグラフィー技術やインクジェット技術により基材上で一塩基ずつ、プローブＤＮＡを合成させながら固定化する方法と、あらかじめ別途合成させておいたプローブＤＮＡをメカニカルマイクロスポッティング技術やインクジェット技術で基材上に固定化する方法がある。
前者の方法は、後者よりクロスハイブリダイゼーションの影響を受けにくいとされるが、その製作において多数のマスク処理が必要となる他工程が非常に多いのが問題である。
ＤＮＡマイクロアレイでの測定は、初めに検査対象から抽出したＤＮＡやＲＮＡ（ターゲットＤＮＡという）をプローブＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイ部分（検出部という）に添加する。ターゲットＤＮＡと相補関係にあるＤＮＡマイクロアレイ上のプローブＤＮＡには水素結合によりターゲットＤＮＡとの二本鎖が生じる。この水素結合による二本鎖の形成は、ハイブリダイゼーションと呼ばれる。この二本鎖の形成の有無で検査対象のターゲットＤＮＡの種類を判別する。
具体的に二本鎖の形成を判別する方法としては、光学検出方式、電気化学検出方式の２種類に大別される。
電気化学検出方式は、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）と呼ばれる標識をハイブリダイズ後の二本鎖間に挿入し、インターカレーターの酸化還元能を利用して検出するものである。又塩基対間に並行に挿入される芳香族の板状分子を縫込み型インターカレータと呼び一般的に広く用いられている。電気化学検出方式の読取装置は、光学検出方式の読取装置に比べると、ＣＣＤやレーザー装置などを大掛かりに装備する必要がないため、安価でまた小型化が可能である。
またこれら電気化学検出方式のＤＮＡマイクロアレイをＥＣＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｒｒａｙ）チップとも言う場合がある。
現在ＤＮＡマイクロアレイは研究、開発用途が主であり、臨床検査など各種検査への応用が期待されているがその製造方法や検出装置などが比較的高価であるためコンシューマ用途には余り普及していない。そのため安価なチップや検出装置の小型化が望まれている。
そこで電気化学検出方式で安価なＤＮＡマイクロアレイとして、カーボンなどの安価な材料を用い、検出部およびリード部を印刷法により形成し、検出部に核酸を固定化したものが提案されている（たとえば、特許文献１参照）。
特開２００３−２９４７４０
しかし、このようなカーボンインキでの電極では、ＤＮＡの実装度を高めるために検出部の面積を小さくすると、それに伴いＳ／Ｎ比が低減し、ターゲットとするＤＮＡの有無によって得られる電気信号の差が小さくなるという問題点があった。
したがって、本発明は、上記のような欠点を解消し、検出部の面積を小さくしてもＳ／Ｎ比が低下することがないＤＮＡマイクロアレイとその製造方法を提供することを目的とする。
本発明のＤＮＡマイクロアレイとその製造方法は、上記の目的を達成するために、つぎのように構成した。
すなわち、本発明の第１態様のＤＮＡマイクロアレイは、絶縁性を有する基材上にリード部と表面に核酸が固定化された検出部とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出部が導電性インキにより形成され、検出部中にフラーレンを含有するように構成した。
また、第２態様として、ＤＮＡマイクロアレイは、絶縁性を有する基材上にリード部と表面に核酸が固定化された検出部とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出部が導電性インキにより形成され、検出部表面にフラーレンが付着しているように構成することもできる。
また、上記発明の第３態様として、第１〜２態様のＤＮＡマイクロアレイは、フラーレンが、少なくともＣ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ９０、Ｃ９４、Ｃ９６のいずれか１種以上であるように構成することもできる。
また、上記発明の第４態様として、第１〜２態様のＤＮＡマイクロアレイは、フラーレンがＣ６０であるように構成することもできる。
また、本発明の第５態様のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させるように構成した。
また、第６態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンを付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させるように構成することもできる。
また、第７態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に導電性微粉末を付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させるように構成することもできる。
また、第８態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンと導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させるように構成することもできる。
また、第９態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化された導電性微粉末を付着させ、次いで検出部を乾燥させるように構成することもできる。
また、第１０態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンと、核酸が固定化された導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させるように構成することもできる。
また、第１１態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンを付着させ、次いで検出部を乾燥させるように構成することもできる。
また、第１２態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンと、核酸が固定化された導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させるように構成することもできる。
また、第１３態様として、ＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンと、導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させるように構成することもできる。
また、上記発明の第１４態様として、第５〜１３態様のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、リード部を検出部と同時に導電性インキを用いて印刷法にて形成するように構成することもできる。
本発明のＤＮＡマイクロアレイは、絶縁性を有する基材上にリード部と表面に核酸が固定化された検出部とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出部が導電性インキにより形成され、検出部中にフラーレンを含有するように構成したので、検出部の面積を小さくしてもＳ／Ｎ比が低下することがないものである。
また、本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させるように構成したので、検出部の面積を小さくしてもＳ／Ｎ比が低下することがないＤＮＡマイクロアレイを容易に得ることができる。
図面を参照しながら本発明の実施の形態について詳しく説明する。
図１〜２は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。図３は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの実施例１〜２と比較例のＳ／Ｎ比を示す表である。図４は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの実施例１〜２と比較例のＳ／Ｎ比を示すグラフである。図中、１はＤＮＡマイクロアレイ、２は基材、３はリード部、４は検出部、５は核酸、６はフラーレンである。なお、各図において同じ構成部分については同じ符号を付している。
本発明の実施態様にかかるＤＮＡマイクロアレイ１は、絶縁性を有する基材２上にリード部３と表面に核酸５が固定化された検出部４とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイ１において、検出部４が導電性インキにより形成され、検出部４中にフラーレン６を含有するように構成されている（図１参照）。なお、本発明でいうＤＮＡマイクロアレイ１とは、ＤＮＡの検出だけでなく、ＲＮＡの検出を行うものも含む。
基材２としては、絶縁性を有し、導電性インキが印刷可能なものであればよく、たとえば、紙類、ポリエチレン樹脂、エチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリイソブチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリ酢酸ビニル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリビニルアセタール樹脂、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリスチレン樹脂、アセタール樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリアミド樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド樹脂、ポリスルホン樹脂などの有機材料や、ガラス、アルミナなどの無機材料などを使用することができる。
リード部３は、電流量を測定する機器に接続する端子と検出部４との間を、電気的に接続するために形成されるものであって、たとえば、導電性インキの印刷によって所望の抵抗値を有する回路として形成することができる。また、めっき法、スパッタリング法などによって金属膜を形成し、次いでフォトリソ法などにより金属膜をパターン化して形成してもよい。
検出部４は、導電性インキの印刷によって形成される。検出部４は導電性インキを印刷して形成する。
導電性インキは、導電性フィラー、バインダー、溶剤から少なくとも構成される。導電性フィラーとしては、導電性に優れた物質である銅粉、金粉、黒鉛、カーボンブラック、炭素繊維、ニッケル粉などを用いることができる。なお、銀粉は試料溶液中に溶出するなどマイグレーションが生じるおそれがあるため、他の物質をフィラーとして用いるのが好ましい。バインダーとしては、エポキシ系樹脂、アルキド系樹脂、アクリル系樹脂、ポリウレタン系樹脂、メラミン系樹脂、フェノール系樹脂、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体系樹脂などを用いることができる。溶剤としては、バインダーとして用いる樹脂を溶解するものを用いるとよい。また、必要に応じて、分散剤、滑剤、カップリング剤などの添加剤を加えてもよい。
導電性インキの印刷方法としては、たとえば、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、オフセット印刷法、インクジェット印刷法など、通常の印刷法を用いることができる。特に容易に厚膜、パターン化可能なスクリーン印刷が好ましい。乾燥方法や膜厚は、所望の抵抗値になるよう適宜選択すればよい。
また、リード部３と検出部４とは、導電性インキの印刷によって、リード部３および検出部４が直列になるように連続したパターンとして１回の印刷工程で連続して印刷して形成することができる。また、試料に含まれる複数種類の核酸５を同時に検出させる場合には、複数の検出部４を同一の基材２上に形成することになるため、検出部４を微細に形成することによって集積度を高めることができる。
本発明においては、検出部４中にフラーレン６を含有するように構成すること（図１参照）、あるいは、検出部４表面にフラーレン６が付着するように構成すること（図２参照）が重要である。
フラーレン６とは、炭素原子が形作る六角形（６員環）と五角形（５員環）が組み合わせられてできるボール形状を有した分子の総称のことである。
フラーレン６の種類としては、包括する炭素数によりＣ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ９０、Ｃ９４、Ｃ９６などが知られており、最近では、炭素原子数が１００を越えるような大きなサイズの球形フラーレン６が単離されるようになってきた。
その中でもフラーレンＣ６０は、その発見者のＲ．Ｅ．Ｓｍａｌｌｅｙ、Ｈ．Ｗ． Ｋｒｏｔｏ、Ｒ．Ｆ．Ｃｕｒｌらが１９９６年にノーベル化学賞を受賞したことでよく知られているサッカーボール形状を有する直径は約０．７ｎｍの炭素化合物である。これら形状についてはフラーレン分子での炭素原子の配列は、２つ以上の五員環が隣り合わせになることはないという「孤立五員環則（Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｐｅｎｔａｇｏｎ Ｒｕｌｅ：ＩＰＲ）」というフラーレンの幾何学を考える上で最も基本的な法則に従うとされており、この規則による制限によって、フラーレンを形成する炭素原子のダングリングボンドの数はゼロとなり系が安定している。Ｃ６０には、５員環と６員環からなるケージ構造として、１７９０種にも上る異性体が考えられるが、ＩＰＲの制限によって、Ｃ６０はサッカーボール型構造唯一つになってしまう。最密充填構造にバッキングした面心立方格子（ｆｃｃ）構造の固体結晶を作る。ｆｃｃ構造のＣ６０固体は２ｅＶ程度の有限なバンドギャップを有する半導体となる。
一般に球形フラーレン固体は半導体であり、キャリヤのドーピングにより興味ある電子物性を発現させることができる。理論的にもこの構造が抜きん出たπ電子的な安定性を持つことが示されている。
その他の性質として、フラーレン６は炭素原子だけでできているため、疎水性が強く水にまったく溶けない。また、光エネルギーを吸収しやすく、化学反応性も高いなど多くの機能を有している。さらに空フラーレンの炭素ケージ内に１つあるいは複数個の金属原子を閉じ込めた金属内包フラーレンが知られており、これらの電子的特性や反応性は空フラーレンと比べて著しく異なることが見い出されている。
フラーレン６は、検出部４を形成する導電性インキ中に含有させるとよい。また、導電性インキを用いて検出部４を印刷後、導電性インキが未乾燥の状態にあるときにフラーレン６の粒子を検出部４表面に付着させ、余分なフラーレン６をエアーガンなどで除去したのち、導電性インキを乾燥して検出部４の表層に固定化してもよい。
フラーレン６の含有量は、検出信号の再現性、作業性、混入方法により適宜選択するとよい。
本発明において、現時点では明確ではないが、検出部４にフラーレン６を混入したことにより、フラーレン６の粒子による表面凹凸が増えたため、ハイブリダイズがしやすくなったほか、検出部４に正電荷を付加し、負電荷を持つターゲットＤＮＡを引き付ける際フラーレン６が核酸５の疎水性部分（たとえば、ＤＮＡの主溝）と相互作用しやすくハイブリダイズの効率を高めているため、Ｓ／Ｎ比が改善されたと考えられる。
電気化学的検出法で検出部４にＣ６０のフラーレン６を混入することにより、Ｓ／Ｎ比を改善することを可能とした。
また、検出部４表面には核酸５が固定化された状態とする。核酸５の固定化は、検出部４にプローブＤＮＡを含むリン酸緩衝溶液で吸着法により行うことにより行うことができる。また、検出部４をプローブ浴に浸漬中に検出部４に正電位を印加し電気的に固定化する方法がある。また、検出部４表面にプラズマ処理により固定化する方法がある。これら検出部４へのプラズマ処理は、大気プラズマでも酸素プラズマでも構わない。プラズマ処理による核酸５の固定化は、プラズマ照射により検出部４表面に生ずるＣＨＯ，−ＣＯＯＨ，−ＣＯなどの官能基を利用するものと考えられる。これらの方法により、検出部４の表面にある導電性インキの導電性物質に核酸５を固定化することができる。
また、核酸５があらかじめ固定化されたフラーレン６を用いることによって検出部４表面に核酸５が固定化された状態にすることもできる。フラーレン６に核酸５を固定化するには、たとえば、リン酸緩衝溶液に核酸５を溶解させた液中にフラーレン６を添加し攪拌することにより固定化する方法がある。
また、核酸５があらかじめ固定化された導電性微粉末を用いることによって検出部４表面に核酸５が固定化された状態にすることもできる。導電性微粉末に核酸５を固定化するには、たとえば、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することにより検出部４表面にカルボン酸を導入し、核酸５のアミノ基とアミド結合を形成させて固定化する方法がある。グラシーカーボンへの固定化は、Ｋｅｌｌｙ Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ａｎｄ Ｓｕｓａｎ Ｒ．Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ， Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６５，２３１７−２３２３（１９９３）に記載されている。
導電性インキを用いて検出部４を印刷後、導電性インキが未乾燥の状態にあるときに、核酸５があらかじめ固定化された導電性微粉末を検出部４の表面に付着させ、余分な導電性微粉末をエアーガンなどで除去したのち、導電性インキを乾燥して検出部４の表層に付着させるようにしてもよい。
導電性微粉末としては、導電性を有し、核酸５を固定化することができるものを用いる。たとえば、金、グラシーカーボン、炭素などからなる微粉末を用いることができる。導電性微粉末の形状や大きさとしては、検出能力や再現性の点から印刷された導電性インキ上に一面に形成されるものであればよく、たとえば、球状、板状、針状など種々の形状のものを用いることができる。特に、形状が球状であると、検出部４に均一に付着させることができるので好ましい。
なお、本発明でいう核酸５（プローブＤＮＡ）とは、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片またはＰＮＡ断片をいう。核酸５（プローブＤＮＡ）は、鎖長数ｍｅｒ〜５０ｍｅｒ程度が好ましい。これは鎖長が長くなるとハイブリダイズが困難になったり、クロスハイブリダイゼーションなどの影響により安定した電極信号が得られなくなるからである。
以上のようにしてＤＮＡマイクロアレイ１を得ることができる。
また、ＤＮＡマイクロアレイ１は、複数列のリード部３および検出部４を有し、各検出部４に異なる種類の核酸５が付着されるように構成してもよい。
本発明のＤＮＡマイクロアレイ１は、いわゆる電気化学的検出方式に用いることができるものである。電気化学的検出方式は、大掛かりな検出装置を必要とせず即時的に判定することができ、また蛍光検出方式よりも感度がはるかに高い方式である。
本願発明のように電気化学的にハイブリダイズを検出するインターカレーターとしては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビオローゲン化合物などが挙げられる。ハイブリダイズの検出は、インターカレーター自身がハイブリダイス部以外の検出部４表面に付着する場合があるのであらかじめハイブリダイズさせずに検出部４表面だけに付着するインターカレーター量をブランク値として測定する必要がある。次いでハイブリダイズさせブランクと同様の操作で電流電位曲線を測定する。得られた電流電位曲線からブランクを差し引いて補正すればハイブリダイズ部に使用されたインターカレーター量を算出することができる。
本発明のＤＮＡマイクロアレイ１は、検出部４を対極と共に試料溶液に浸漬させることによって検出を行うことができる。また、対極と共に並べ、検出部４に試料溶液を滴下することによって検出を行うことができる。
このようにして得られたフラーレン６を混入した検出部４は、水で洗浄してもプローブＤＮＡの酸化還元を示す電気信号に変化が見られないことからＤＮＡ分子がフラーレン６を含む検出部４表面に強く結合していることが分かる。
厚さ２５０μｍ、大きさ１０ｍｍ×４０ｍｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを基材とし、その上に導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）をスクリーン印刷にて５ｍｍ×３０ｍｍのリード部を印刷し、オーブンで７０℃、２時間の乾燥処理を行った。
次いで、５ｍｍ角の検出部を５ｍＭフラーレンＣ６０（東京化成工業株式会社製）／ベンゼン（ナカライテスク株式会社製）を導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）に１：９の割合で混合したインキにて印刷し、オーブンで７０℃、２時間乾燥した。
次いで、アクリル系樹脂インキ（十条ケミカル株式会社製）を用いて検出部およびリード部の端部のみが露出するよう、スクリーン印刷にて７ｍｍ×１５ｍｍの大きさで印刷してリード部のマスキングを行った。
次いで、酢酸緩衝液（ｐＨ５）に上記基材の検出部が十分浸漬するよう挿入し、電位を＋１．５Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１分間印加した。次いで、ポリグアニル酸カリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ＰＯＬＹＧＵＡＮＹＬＩＣＡＣＩＤ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓａｌｔ）を０．２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で３０ｐｐｍになるよう調整した液中に上記作製した基材の検出部を挿入し、＋０．５Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）に保って３分間印加し、核酸を固定化してＤＮＡマイクロアレイを得た。
次いで、このようにして得たＤＮＡマイクロアレイを用い、相補的ＤＮＡであるポリシチジル酸（ＰＯＬＹＣＹＴＩＤＹＬＩＣＡＣＩＤ）の検出を行った。
まず、ＤＮＡマイクロアレイの検出部表面に二本鎖以外に自然付着するインターカレーター量を把握するため、作製したＤＮＡマイクロアレイをインターカレーター、１．０ｍＭトリス（１．１０フェナントロリン）コバルト（ＩＩＩ）塩（Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３ ３＋）を０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン一塩酸（トリス緩衝液）で調整した溶液に１０分間浸漬し、検出部の表面にインターカレーターを付着させた。ここでは上記ＤＮＡマイクロアレイを作用電極、対極にＰｔ電極、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌを用い、電流電位曲線の測定を行った。測定装置としては、ＡＬＳ社製電気化学アナライザーＭｏｄｅｌ４１０を用いた。
次いで、０．０５Ｍトリス緩衝液中で開始電位＋０．５Ｖから負側に走査電位２０Ｖ／ｓで電位−電流の測定を行い、酸化還元曲線を得た（ブランク）。
次いで、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製ポリシチジル酸カリウム（ＰＯＬＹＣＹＴＩＤＹＬＩＣ ＡＣＩＤ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓａｌｔ）を、０．３ＭＮａＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝溶液で５０ｐｐｍになるよう調整した溶液を用い、３５℃、電極電位＋０．５Ｖ、１０分間の条件下で核酸のハイブリダイゼーションを行った後、上記と同様にして電位−電流の測定を行い、ハイブリタイズ後の電極による酸化還元曲線を得た。
このようにして得た還元ピーク（インターカレーターＣｏ（ｐｈｅｎ）３ ３＋のＣｏ３＋→Ｃｏ２＋によるピーク）の値を図３〜４に示す。図中、「ブランク」はブランクの還元ピーク値を、「ハイブリダイズ後」はハイブリダイズ後の還元ピーク値をそれぞれ示す。ハイブリダイズ後のインターカレーターに起因する還元ピークがブランク時のものより大きくなっていることから、ポリシチジル酸を検出したことが確認できた。
実施例１と同様の基材上に、導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）をスクリーン印刷にて５ｍｍ×３０ｍｍのリード部を印刷し、オーブンで７０℃、２時間の乾燥処理を行った。
次いで、実施例１と同様に５ｍｍ角の検出部を導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）にて印刷した後、フラーレンＣ６０（東京化成工業株式会社製）を基材上方より散布した。
次いで、余分なフラーレン粉末をエアーガンで除去した後、オーブンで７０℃、２時間乾燥した。
次いで、実施例１と同様にしてマスキングを行った後、核酸を固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
このようにして得たＤＮＡマイクロアレイについて実施例１と同様にして酸化還元電位を測定したところポリシチジル酸を検出したことが確認された（図３〜４参照）。
比較例
実施例１と同様の基材上に、導電性インキ（十条ケミカル株式会社製カーボンペーストインキＣＨ−１）をスクリーン印刷にて５ｍｍ角の検出部と５ｍｍ×３０ｍｍのリード部とがそれぞれ直列になるよう印刷し、オーブンで７０℃、２時間乾燥した。
次いで、実施例１と同様にしてマスキングを行った後、核酸を固定化し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
このようにして得たＤＮＡマイクロアレイについて実施例１と同様にして酸化還元電位を測定したところポリシチジル酸を検出したことが確認された（図３〜４参照）。
実施例１、実施例２、比較例のＳ／Ｎ比は、それぞれ２．４２、５．４５、１．１１であり、実施例１および実施例２において優れたＳ／Ｎ比を有することが確認できた。
本発明は、電気化学的にＤＮＡやＲＮＡを検出する方法において好適に用いることができ、産業上有用なものである。
本発明のＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。 本発明のＤＮＡマイクロアレイの一実施例を示す断面図である。 本発明のＤＮＡマイクロアレイの実施例１〜２と比較例のＳ／Ｎ比を示す表である。 本発明のＤＮＡマイクロアレイの実施例１〜２と比較例のＳ／Ｎ比を示すグラフである。
符号の説明
１ ＤＮＡマイクロアレイ
２ 基材
３ リード部
４ 検出部
５ 核酸
６ フラーレン

Claims (14)

  1. 絶縁性を有する基材上にリード部と表面に核酸が固定化された検出部とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出部が導電性インキにより形成され、検出部中にフラーレンを含有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
  2. 絶縁性を有する基材上にリード部と表面に核酸が固定化された検出部とが電気的に直列になるように形成されたＤＮＡマイクロアレイにおいて、検出部が導電性インキにより形成され、検出部表面にフラーレンが付着していることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
  3. フラーレンが、少なくともＣ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ９０、Ｃ９４、Ｃ９６のいずれか１種以上である請求項１〜２のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  4. フラーレンが、Ｃ６０である請求項１〜２のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  5. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  6. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンを付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  7. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に導電性微粉末を付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  8. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンと導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させ、次いで検出部に核酸を電気的に固定化させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  9. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるようにフラーレンが混入した導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化された導電性微粉末を付着させ、次いで検出部を乾燥させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  10. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部にフラーレンと、核酸が固定化された導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  11. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンを付着させ、次いで検出部を乾燥させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  12. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンと、核酸が固定化された導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  13. 絶縁性を有する基材上に、リード部を形成するとともに、リード部および検出部が電気的に直列になるように導電性インキを用いて印刷法にて検出部を形成し、次いで未乾燥の検出部に核酸が固定化されたフラーレンと、導電性微粉末とを付着させ、次いで検出部を乾燥させることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
  14. リード部を検出部と同時に導電性インキを用いて印刷法にて形成する請求項５〜１３のいずれかに記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
JP2005078282A 2005-03-18 2005-03-18 Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法 Expired - Fee Related JP4440151B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005078282A JP4440151B2 (ja) 2005-03-18 2005-03-18 Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005078282A JP4440151B2 (ja) 2005-03-18 2005-03-18 Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2006258670A JP2006258670A (ja) 2006-09-28
JP4440151B2 true JP4440151B2 (ja) 2010-03-24

Family

ID=37098094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005078282A Expired - Fee Related JP4440151B2 (ja) 2005-03-18 2005-03-18 Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4440151B2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008043654A1 (de) * 2008-11-11 2010-05-20 Leibniz-Institut Für Festkörper- Und Werkstoffforschung Dresden E.V. Diagnostisches und/oder therapeutisches Agens, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung
JP6694635B2 (ja) * 2014-12-26 2020-05-20 国立大学法人大阪大学 マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法
JP2020150946A (ja) * 2020-04-13 2020-09-24 国立大学法人大阪大学 マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003083968A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Jsr Corp Ｄｎａチップおよびアッセイ方法
JP4136418B2 (ja) * 2002-03-29 2008-08-20 日本写真印刷株式会社 Ｄｎａマイクロアレイの製造方法
JP2004045144A (ja) * 2002-07-10 2004-02-12 Unitika Ltd 生化学物質固定用アモルファスカーボン基板
JP2004198406A (ja) * 2002-12-02 2004-07-15 Toyo Kohan Co Ltd ポリヌクレオチドを固体支持体上へ固定化する方法、その方法により固定化されてなる固体支持体、その固体支持体から標的ポリヌクレオチドを検出する方法、およびポリヌクレオチド固定化溶液
JP3890417B2 (ja) * 2003-08-27 2007-03-07 独立行政法人産業技術総合研究所 接着及び剥離が可能な保護フィルムを有するバイオセンサ

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006258670A (ja) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Evtugyn et al. Electrochemical DNA sensors and aptasensors based on electropolymerized materials and polyelectrolyte complexes
Sassolas et al. DNA biosensors and microarrays
Erdem et al. Methylene blue as a novel electrochemical hybridization indicator
He et al. Applications of carbon nanotubes in electrochemical DNA biosensors
US7573186B2 (en) Electrode for electrochemical measurement
CA2393766A1 (en) Column and row addressable high density biochip array
Popovich et al. New strategies for electrochemical nucleic acid detection
Feng et al. High-throughput and sensitive fluorimetric strategy for microRNAs in blood using wettable microwells array and silver nanoclusters with red fluorescence enhanced by metal organic frameworks
Asadi et al. Graphene-based electrochemical biosensor for impedimetric detection of miRNAs as potential cancer biomarkers
Ong et al. Critical reviews of electro-reactivity of screen-printed nanocomposite electrode to safeguard the environment from trace metals
JP4440151B2 (ja) Ｄｎａマイクロアレイとその製造方法
Jankowska-Śliwińska et al. Comparison of electrochemical determination of purines and pyrimidines by means of carbon, graphite and gold paste electrodes
Khoshfetrat et al. Amplified electrochemical genotyping of single-nucleotide polymorphisms using a graphene–gold nanoparticles modified glassy carbon platform
Moeller et al. Chip-based electrical detection of DNA
CN105334253A (zh) 碳点@氧化石墨烯复合材料的电化学生物传感器检测PML/RARα基因的方法
Tokonami et al. Preparation of nanogapped gold nanoparticle array for DNA detection
Lee et al. Gold Nanoparticle‐Catalyzed Silver Electrodeposition on an Indium Tin Oxide Electrode and Its Application in DNA Hybridization Transduction
Tran et al. Electrochemically Effective Surface Area of a Polyaniline Nanowire‐Based Platinum Microelectrode and Development of an Electrochemical DNA Sensor
Gayathri et al. Development of electrochemical DNA biosensors-a review
Li et al. Label-free electrochemical detection of short sequences related to the hepatitis B virus using 4, 4′-diaminoazobenzene based on multiwalled carbon nanotube-modified GCE
US20080272006A1 (en) Electrochemical Method of Detecting an Analyte
JP4939945B2 (ja) Ｄｎａおよびタンパク質分子の結合のための炭素電極表面
EP1960308A1 (en) Nanoparticle and methods therefor
US20020051975A1 (en) Reporterless genosensors using electrical detection methods
JP4136418B2 (ja) Ｄｎａマイクロアレイの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080201

TRDD Decision of grant or rejection written
A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20091224

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100105

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100106

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140115

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees