JP4439111B2 - Dipeptide apoptosis inhibitors and uses thereof - Google Patents

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Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、医薬品化学の分野である。特に、本発明は、アポトーシスの強力なインヒビターであるジペプチドに関する。本発明はまた、アポトーシス的な細胞死を軽減または処置するためのこれらのジペプチドの使用に関する。
【０００２】
（背景技術の説明）
生物は、調節された細胞死、プログラムされた細胞死またはアポトーシスとして多様に公知のプロセスにより望ましくない細胞を排除する。このような細胞死は、動物の発生の正常な局面として、ならびに組織のホメオスターシスおよび加齢において生じる（Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，Ａ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｈｉｌｏｓ．Ｓｏｃ．２６：５９−８６（１９５１）；Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，Ａ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ７６：４１９−４３７（１９６５）；Ｅｌｌｉｓら、Ｄｅｖ．１１２：５９１−６０３（１９９１）；Ｖａｕｘら、Ｃｅｌｌ ７６：７７７−７７９（１９９４））。アポトーシスは、細胞数を調節し、形態発生を促進し、有害もしくは他の異常な細胞を除去し、そしてすでにその機能を果たした細胞を排除する。さらに、アポトーシスは、低酸素または虚血のような種々の生理的ストレスに対する応答を生じる（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／２０７２１）。
【０００３】
調節された細胞死を経験した細胞に共有されている多くの形態学的変化が存在し、これは血漿および核膜小疱形成、細胞減縮（核細胞質および細胞質の凝結）、オルガネラ再配置および充填、クロマチン凝結ならびにアポトーシス体（細胞内物質を含んだ膜包囲粒子）の産生を含む（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ，Ｓ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３７：５２９−５３６（１９９５））。
【０００４】
アポトーシスは、細胞自殺の内因性メカニズムを介して達成される（Ｗｙｌｌｉｅ、Ａ．Ｈ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ＢｏｗｅｎおよびＬｏｃｋｓｈｉｎ編、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ（１９８１）、９〜３４頁）。細胞は、内在性あるいは外因性シグナルのいずれかの結果として、その内部にコードされた自殺プログラムを活性化する。この自殺プログラムは、注意深く調節された遺伝子プログラムの活性化を通して遂行される（Ｗｙｌｉｅら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔ．６８：２５１（１９８０）；Ｅｌｌｉｓら、Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．７：６６３（１９９１））。アポトーシスの細胞および遺骸は、溶解の前に隣接する細胞またはマクロファージにより普通に認識され、そして除去される。この除去メカニズムがあるため、多数の細胞の除去にもかかわらず炎症は誘導されない（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ，Ｓ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３７：５２９−５３６（１９９５））。
【０００５】
哺乳動物インターロイキンン−１β（ＩＬ−１β）は、慢性および急性の炎症および自己免疫疾患を含む種々の病理的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ Ｊ．Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、７，４５−５６（１９８６））。ＩＬ−βは、ＩＬ−１レセプターに結合できない、そして生物学的に不活性である前駆体ポリペプチド（ｐｒｏ―ＩＬ−１β）関連細胞として合成される（Ｍｏｓｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：２９４１−２９４４（１９８７））。ＩＬ−１βを成熟させるために前駆体ＩＬ−１βの転換を阻害することにより、インターロイキンン−１の活性は阻害され得る。インターロイキンン−１β転換酵素（ＩＣＥ）は、インターロイキンン−１β（ＩＬ−１β）の活性を担うプロテアーゼである（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｎ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：７６８（１９９２））；Ｙｕａｎ、Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：６４１（１９９３））。ＩＣＥは不活性なプロインターロイキンン−１を開裂することで、成熟ＩＬ−１を産生する基質特異的システインプロテアーゼである。ＩＣＥおよびＣＰＰ３２をコードする遺伝子は、現在、少なくとも１２のメンバー：ＩＣＥ、ＣＰＰ３２／Ｙａｍａ／Ａｐｏｐａｉｎ、ｍＩＣＥ２、ＩＣＥ４、ＩＣＨ１、ＴＸ／ＩＣＨ−２、ＭＣＨ２、ＭＣＨ３、ＭＣＨ４、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ／ＭＣＨ５、ＩＣＥ−ＬＡＰ６およびＩＣＥre1ＩＩＩを含む哺乳動物ＩＣＥ／Ｃｅｄ−３遺伝子ファミリーのメンバーである。このシステインプロテアーゼの（その活性部位システイン残基がＩＣＥ−媒介アポトーシスに必須である）ファミリーのタンパク質分解活性は、細胞死の仲介において重要性を示す（Ｍｉｕｒａら、Ｃｅｌｌ ７５：６５３−６６０（１９９３））。この遺伝子ファミリーは、現在、カスパーゼと名付けられている（Ａｌｎｅｉｎｒｉ、Ｅ．Ｓ．らＣｅｌｌ，８７：１７１（１９９６））。
【０００６】
ＩＬ−１はまた、炎症、敗血症性ショック、創傷治癒、造血およびある種の白血病の増殖を含む、広い範囲の生物学的反応の媒介に関与するサイトカインである（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．Ｂｌｏｏｄ ７７：１６２７−１６５２（１９９１）；ｄｉＧｉｏｖｉｎｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：１３（１９９０））。
【０００７】
多くの強力なカスパーゼインヒビターが、カスパーゼのペプチド基質構造に基づいて調製された。しかし、インビトロでのそれらの効力と対照的に、アポトーシスの全細胞モデルにおける良好な効力（ＩＣ50＜１μＭ）を有するインヒビターは報告されていない（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｎ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：Ｒ９７−１０３（１９９８））。従って、アポトーシスの全細胞モデルにおいて効力を示す（ＩＣ50＜１μＭ）、そしてアポトーシスの動物モデルで活性である細胞死のインヒビターの存在が必要とされる。従って、これらのインヒビターは、調節された細胞死およびＩＬ−１のサイトカイン活性が役割を果たす疾患状態の処置のために治療剤として用いられ得る。
【０００８】
ＷＯ９３／０５０７１は以下の式を有するＩＣＥインヒビターペプチドを開示し、
Ｚ−Ｑ2−Ａｓｐ−Ｑ1
ここで、Ｚは、Ｎ末端保護基である；Ｑ2は、配列Ｑ2−Ａｓｐが配列Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐの少なくとも一部に対応するように０から４のアミノ酸である；Ｑ1は、電気的陰性の脱離基を含む。典型的なジペプチドは、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ｃｂｚ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＣＨ2ＦおよびＣｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆである。
【０００９】
ＷＯ９６／０３９８２は、以下の式を有するＩＣＥインヒビターとしてアスパラギン酸アナログを開示した：
【００１０】
【化３】
ここで、Ｒ2は、Ｈまたはアルキルである；Ｒ3は、ハロゲンのような脱離基である；Ｒ1は、ヘテロアリール−ＣＯまたは一つのアミノ酸残基である。
【００１１】
米国特許第５，５８５，３５７号は、以下の式を有するＩＣＥインヒビターとしてペプチドケトンを開示した：
【００１２】
【化４】
ここで、ｎは、０〜２である：各ＡＡは独立してＬ−バリンまたはＬ−アラニンである；Ｒ1は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルおよび他の基からなる群から選択される；Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は、各々独立して水素、低級アルキル基および他の基である。
【００１３】
Ｒｅｖｅｓｚら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５、９６９３−９６９６、１９９４）は強力なＩＣＥインヒビターである対応する酸のプロドラッグとして以下のエチルエステルトリペプチドの調製を報告した：
【００１４】
【化５】
（発明の要旨）
本発明は、以下の式Ｉのジペプチドに関し：
【００１５】
【化６】
ここで、Ｒ1は、Ｎ末端保護基であり；ＡＡは任意の天然αアミノ酸、またはβアミノ酸の残基であり；Ｒ2は、ＨまたはＣＨ2Ｒ4であり、ここでＲ4は電気的陰性の脱離基であり、そしてＲ3は、アルキルまたはＨであり、ただし、ＡＡはＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、またはＰｈｅではない。
【００１６】
本発明は、式Ｉによって示されるジペプチドベースのカスパーゼインヒビターが、この酵素におけるトリペプチドおよびテトラペプチドより酵素アッセイにおいてより少ない程度で強力であるが、細胞ベースの系におけるアポトーシスの驚くほど強力なインヒビターであるという知見に関する。これらの化合物は、インビボで全身的に活性であり、そしてマウス肝臓アポトーシスモデルにおける抗Ｆａｓ誘導性致死性の強力なインヒビターであり、そして虚血性発作のラットモデルにおいて頑健性神経保護効果を有する。
【００１７】
本発明はまた、アポトーシス性細胞死が原因因子または結果のいずれかである疾病を低減、予防、または処置するための、本発明のジペプチドの使用に関する。本発明のための使用の例としては、以下があげられる：病巣虚血および全体の虚血後の神経系の保護；アルツハイマー病、ハンティングトン病、プリオン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、運動失調、毛細管拡張症、および脊髄延髄萎縮症のような神経変性障害の処置；心筋梗塞、うっ血性心不全、および心筋症を含む心疾患の処置；網膜障害の処置；エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎を含む自己免疫疾患の処置；多発性嚢胞腎疾患、および貧血／赤血球形成の処置；ＡＩＤＳおよびＳＣＩＤＳを含む免疫系障害の処置；移植の間の細胞、組織および器官の損傷の軽減または予防；工業的バイオテクノロジーにおける細胞株死の軽減または予防；脱毛症（髪の毛がなくなること）の軽減または予防；ならびに皮膚細胞の成熟前死の軽減。
【００１８】
本発明は、動物におけるアポトーシス性細胞死を軽減するに有効な量の式Ｉの化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物器官もしくは組織のための保存溶液または保存溶液、または哺乳動物もしくは酵母細胞のための増殖培地を提供し、ここで有効な量の式Ｉの化合物は、上記の器官、組織または細胞におけるアポトーシス性細胞死を軽減するために、上記の溶液または培地に含まれる。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明のアポトーシス性細胞死のインヒビターは、以下の一般式Ｉ：
【００２１】
【化７】
を有する化合物、またはその薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグであり、ここで：
Ｒ1は、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、およびベンジルオキシカルボニルを含むＮ末端保護基であり；ＡＡは任意の天然αアミノ酸、またはβアミノ酸の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）、およびβ−Ａｌａのようなβアミノ酸であり、そしてＨｉｓ、Ｔｙｒ、ＰｒｏまたはＰｈｅではなく；Ｒ2は、ＨまたはＣＨ2Ｒ4であり、Ｒ4はＦ、Ｃｌ、ＴｓＯ−、ＭｅＯ−、ＡｒＯ−、ＡｒＣＯＯ、ＡｒＮ−、およびＡｒｓ−のような電気的陰性の脱離基であり；そしてＲ3は、アルキルまたはＨである。
【００２２】
Ｒ3に関して、好ましいアルキル基は、Ｃ1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ペンチル基およびヘキシル基）である。
【００２３】
本発明は、式Ｉによって示されるジペプチドベースのカスパーゼインヒビターが、この酵素におけるトリペプチドおよびテトラペプチドより酵素アッセイにおいてより少ない程度で強力であるが、細胞ベースの系におけるアポトーシスの驚くほど強力なインヒビターであるという知見に関する。これらの化合物は、インビボで全身的に活性であり、そしてマウス肝臓アポトーシスモデルにおける抗Ｆａｓ誘導性致死性の強力なインヒビターであり、そして虚血性発作のラットモデルにおいて頑健性神経保護効果を有する。これらのインヒビターは、種々の臨床条件および工業的適用（ここで、細胞、組織、または器官全体の欠失が生じる）における細胞死を遅延するかまたはブロックする。それゆえ、本発明はまた、アポトーシスが役割を果たす状態を処置、予防、または軽減する方法に関する。これらの状態は、より完全に以下に記載される。
【００２４】
本方法は、このような処置の必要な動物に、本発明のインヒビターまたはその薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグを、アポトーシス性細胞死を阻害するに有効な量で投与する工程を包含する。
【００２５】
アポトーシスのインヒビターとして使用され得る化合物の好ましい実施態様は、以下の式ＩＩ：
【００２６】
【化８】
によって示されるか、またはその薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグであり、ここでＡＡ、Ｒ1およびＲ3は、式Ｉに関して先に規定されたものと同様である。
【００２７】
好ましいＲ1は、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチルおよびベンジルオキシカルボニルである。好ましいＲ3は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔまたはｔ−Ｂｕである。好ましいＡＡは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔおよびβ−Ａｌａのようなβアミノ酸である。
【００２８】
式Ｉを有するアポトーシスの例示的に好ましいインヒビターは、以下を含むがこれらに限定されない：
【００２９】
【数１】
。
【００３０】
本発明の特定の化合物は、光学異性体を含む立体異性体として存在し得る。本発明は、すべての立体異性体、およびこのような立体異性体のラセミ混合物、ならびに当業者に周知の方法に従って分離され得る個々のエナンチオマーを含む。
【００３１】
薬学的に受容可能な付加塩の例は、以下のような無機および有機酸付加塩を含む：塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩およびシュウ酸塩。
【００３２】
プロドラッグの例は、式Ｉ〜ＩＩの化合物を含み、ここでＲ3は、アルキル基またはＣＨ2ＯＣＨ3のような置換アルキル基である。さらに、ＡＡがカルボン酸基を含む場合において、式Ｉ〜ＩＩ（ここで、Ｒ3はＨである）のプロドラッグの例は、カルボキシル基のいずれかもしくは両方がエステル化されるか（例えば、Ｃ1-6アルコールと）または対応するアミドの形態（例えば、Ｃ1-6アミンと）である化合物を含む。
【００３３】
本発明はまた、その障害に罹患する動物におけるアポトーシスの阻害に応答する障害を処置するための方法に関する。本発明の方法に使用するための化合物の特に好ましい実施態様は、先に規定した式ＩＩによって示される。
【００３４】
本発明の化合物は、当業者に公知の方法を用いて調製され得る。具体的には、式Ｉ〜ＩＩを有する化合物は、模式図Ｉにおける例示的反応によって図示されるように調製され得る。中間体１は、Ｒｅｖｅｓｚら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３５，９６９３−９６９６，１９９４）に従って調製された。1のＮ保護化アミノ酸（例えば、Ｚ−Ｖａｌ−ＯＨ）とのカップリングは、アミド２を生じ、これはＲｅｖｅｓｚら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３５，９６９３−９６９６，１９９４）に従ってＤｒｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬によって酸化されて、３を生じる。このエステルの酸触媒化切断は、遊離酸４を生じ、これはエステル５に変換された。
【００３５】
【化９】
本発明の重要な局面は、式Ｉ〜ＩＩを有する化合物が、アポトーシスの強力なインヒビターであるという発見である。それゆえ、これらのインヒビターは、細胞、組織または器官全体の欠失が生じる種々の臨床状態における細胞死を遅延またはブロックすることが予測される。
【００３６】
本発明の細胞死インヒビターは、発作に起因する病巣虚血および心停止に起因する全体の虚血を含むがそれらに限定されない虚血および興奮毒性の種々の状態下で、神経系（脳、脊髄、および末梢神経系）における細胞死を軽減または予防するために使用され得る。１つの特定の使用法は、酸素欠乏の効果を処置することであり、これは高い危険性の分娩における乳児の誕生の間に生じ得る。細胞死インヒビターはまた、外傷性損傷（例えば、頭部外傷）、ウイルス感染または放射誘導性神経細胞死（例えば、ガンの放射線療法の副作用として）に起因する神経系における細胞死を軽減または予防するために使用され得る。細胞死インヒビターはまた、アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および脊髄延髄萎縮症を含むがこれらに限定されない神経変性障害の範囲の細胞死を軽減または予防するために使用され得る。本発明の細胞死インヒビターのインビボでの神経保護性特性は、ラット一過性病巣虚血モデル（Ｘｕｅら、Ｓｔｒｏｋｅ ２１：１６６（１９９０））において試験され得る。
【００３７】
本発明の細胞死インヒビターは、潜在的に心筋の死を生じる任意の状態において、細胞死を予防するために使用され得る。これは、心筋梗塞、うっ血性心不全および心筋症を含む。１つの特定の適用は、心臓の特定のウイルス感染を生じるような、心筋細胞死を軽減または予防することである。
【００３８】
本発明の細胞死インヒビターのインビボ活性は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８４：２０６７−２０７２（１９９６））によって記載される「マウス肝臓アポトーシス」モデルを用いて試験され得る。このモデルにおいて、マウスは、抗Ｆａｓ抗体（これは、肝臓および他の器官における大量のアポトーシスを誘導する）で、静脈内（ＩＶ）処置され、全身性器官不全および死を導く。このモデルは、本発明の細胞死インヒビターの全身性バイオアベイラビリティ、ならびにそれらのインビボでの抗アポトーシス性特性を間接的に試験するために有用である。
【００３９】
本発明の細胞死インヒビターは、眼内圧が増加する障害（例えば、緑内障）を生じ得るような網膜神経の細胞死または加齢プロセスに関連する網膜障害（例えば、加齢性黄斑変性）を予防するために使用され得る。このインヒビターはまた、網膜の遺伝性変性障害（例えば、色素性網膜炎）を処置するために使用され得る。
【００４０】
本発明の細胞死インヒビターはまた、免疫系の細胞の成熟前死を軽減または予防するために使用され得、特に、免疫不全障害（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤＳ）および関連疾患）の処置に有用である。細胞死インヒビターはまた、放射誘導性免疫抑制を処置するために使用され得る。
【００４１】
ヒト器官および組織の移植は、器官不全の一般的な処置である。しかし、移植プロセスの間に、ドナー器官または組織は、細胞死について危険な状態である。なぜなら、宿主に移植される前のその正常な血液供給を奪うからである。この虚血性状態は、ドナー器官もしくは組織への輸液によって、または細胞死インヒビターの器官／組織保存培地への直接添加によって、細胞死インヒビターを用いて処置され得る。細胞死インヒビターはまた、アポトーシスを誘発することによって、それらの標的を殺傷する宿主免疫細胞の効果からドナー器官／組織を保護するために、ドナー器官／組織を移植後に、ドナー器官／組織における細胞死を軽減または予防するために使用され得る。細胞死インヒビターの細胞保護効果はまた、インビトロ受精手順で使用されるヒトまたは動物の***または卵の死を予防するために使用され得る。これらのインヒビターは、採取プロセスのあいだに使用され得、そして保存培地中に含まれ得る。
【００４２】
哺乳動物細胞株および酵母細胞は、工業または医療使用のために、大量の組換えタンパク質（例えば、抗体、酵素またはホルモン）を産生するために一般的に使用される。これらの細胞株のいくつかの寿命は、増殖条件、発現される組換え分子の性質（いくつかは毒性である）および他の未知の要因に起因して制限される。工業用細胞株の寿命は、増殖培地中にこれらの細胞死インヒビターを１０〜２００ｍＭの範囲で含むことによって延長され得る。
【００４３】
髪の成長および損失を支配する因子は、大部分は未知である。しかし髪小胞の退行（退行期と呼ばれる）は少なくとも部分的にはアポトーシスに起因し得るという幾つかの証拠がある。したがって、本発明の細胞死インヒビターを用いて、雄型禿頭症、照射で誘導されるかまたは化学療法で誘導される髪の損失、ならびに感情的なストレスに起因する髪の損失を含むがこれらに限定されない種々の状況に起因して起こる髪の損失を処置し得ることが熟考される。アポトーシスは髪の色の抜けに役割を果たし得るという証拠もまたある。したがって、本発明の細胞死インヒビターはまた、時期尚早の髪の白髪化という症例を処置または予防することにおいて使用され得ることが熟考される。
【００４４】
皮膚上皮細胞の死滅は高レベルの照射、熱、または化学薬品への暴露後に生じ得る。本発明の細胞死インヒビターは、このタイプの皮膚損傷を処置、減少、または予防するために使用され得ることが熟考される。ある特定の適用において、この細胞死インヒビターは、急な日光への過剰な暴露を処置するための、およびこの皮膚の水泡形成および皮膚剥奪を予防するための軟膏において適用され得る。
【００４５】
Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１３：４４２−４４９（１９９６））は最近、ハンティングトン病（ＨＤ）遺伝子のタンパク質産物であるハンティングチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）が、ＣＰＰ３２により切断され得るが、ＩＣＥによっては切断され得ないことを報告した。ＨＤの根底にある変異は、ＨＤ遺伝子の５’末端でのＣＡＧトリヌクレオチドの拡張である。３６反復を超えるトリヌクレオチド拡張がＨＤの臨床的な発症に関連している。ＣＡＧ拡張は、ＣＰＰ３２によるハンティングチンの切断を促進し、従ってＨＤにおけるアポトーシス細胞死におけるＣＰＰ３２の役割と連結する。ＣＰＰ３２活性阻害を備える本発明の化合物は、ＣＰＰ３２誘導アポトーシス細胞死をブロッキングすることにおいて有用であり、従って筋緊張性ジストロフィー、脆弱Ｘ精神遅滞、脊髄延髄筋萎縮症、脊椎小脳性運動失調Ｉ型およびＤｅｎｔａｔｏ−Ｒｕｂｒｏ淡蒼球ルイ体萎縮症のような、トリヌクレオチド反復の拡張により特徴付けられるＨＤおよび他の疾患を予防および処置することにおいて有用である。
【００４６】
本発明の範囲内の組成物には、本発明の化合物が、その意図した目的を達成するために有効である量で含まれるところの全ての組成物が含まれる。個々の要求が変化する一方で、各成分の有効量の至適範囲の決定は、当該分野の技術を伴う。代表的には、これらの化合物は、哺乳動物、例えばヒトに、アポトーシス媒介障害、例えばニューロン細胞死、心臓疾患、網膜障害、多嚢胞腎臓疾患、および免疫系障害について処置されている哺乳動物の体重の、一日当たり０．００２５〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、または薬学的に受容可能なその塩の等価な量を、経口投与され得る。好ましくは、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇがこのような障害を処置または予防するために経口投与される。筋肉注射については、この用量は一般的に経口用量の１／２である。例えば、ニューロン細胞死の処置または予防について、適切な筋肉内用量は約０．００２５〜約１５ｍｇ／ｋｇであり、最も好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【００４７】
単位経口用量は、化合物の約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを含み得る。この単位用量は、各々がこの化合物またはその溶媒和化合物の約０．１〜約１０、都合の良いことには約０．２５〜５０ｍｇを含む、１つ以上の錠剤として、毎日１回以上投与され得る。
【００４８】
精製していない化学薬品のような化合物を投与することに加えて、本発明の化合物は、薬学的に使用され得る製剤へのこの化合物のプロセシングを容易にする賦形剤および補助剤を含む、適当な薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的製剤の一部として投与され得る。好ましくは、この製剤、特に経口投与され得るその製剤、および錠剤、糖剤、およびカプセルのような好ましいタイプの投与で使用され得るその製剤、ならびにまた坐薬のような直腸に投与され得る製剤、ならびに注射によるかまたは経口的な投与に適切な溶液は、約０．０１〜９９％、好ましくは約０．２５〜７５％の活性化合物を賦形剤と共に含む。
【００４９】
また本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の化合物の非毒性の薬学的に受容可能な塩である。酸付加塩は、塩酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、リン酸、およびシュウ酸などのような薬学的に受容可能な非毒性の酸の溶液と、本発明の特定の細胞死インヒビターの溶液を混合することにより形成される。塩基性塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化コリン、および炭酸ナトリウムなどのような薬学的に受容可能な非毒性塩基の溶液と、本発明の特定の細胞死インヒビターの溶液を混合することにより形成される。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物の有益な効果を経験し得る任意の動物に投与し得る。このような動物の真っ先きは哺乳動物、例えばヒトであるが、本発明はそのように限定されることを意図しない。
【００５１】
本発明の薬学的な組成物は、その意図した目的を達成する任意の手段により投与され得る。例えば投与は、非経口的な、皮下の、静脈内の、筋肉内の、腹腔内の、経皮性の、頬の、鞘内の、または頭蓋内の経路によるものであり得る。二者択一的に、または同時に、投与は経口経路であり得る。投与される投薬量は、受容者の年齢、健康、および体重、同時治療の種類、もしあるなら、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。
【００５２】
本発明の薬学的製剤は、それ自体公知である方法で、例えば従来の混合、顆粒化、糖剤作成、溶解、または凍結乾燥プロセスにより製造される。従って、経口使用のための薬学的製剤は、所望であるかまたは必要ならば、錠剤または糖剤コアを得るために、適当な補助剤を添加した後、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、必要に応じて、得られる混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物をプロセシングすることにより得られ得る。
【００５３】
適当な賦形剤は特に、充填剤（例えばサッカリド（例えばラクトースまたはショ糖）、マンニトールまたはソルビトール、セルロース製剤および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸トリカルシウム、またはリン酸水素カルシウム））、ならびに結合剤（例えばとうもろこしスターチ、小麦スターチ、米スターチ、ジャガイモスターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンを使用するスターチペースト）である。所望であれば、上述のスターチ、ならびにまたカルボキシメチルスターチ、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤が添加され得る。補助剤は特に、流量調節薬剤および潤滑剤（例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸あるいはステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムのようなその塩、および／またはポリエチレングリコール）である。糖剤コアは、所望であれば、胃液に耐性である適当なコーティングで提供される。この目的には、濃縮したサッカリド溶液が使用されるが、これは随意にアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。胃液に耐性のコーティングを産生するために、適当なセルロース製剤（例えばアセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）の溶液が使用される。例えば同定用に、または活性化合物用量の組合わせを特徴付けるために、色素原料または色素が、錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【００５４】
経口的に使用され得る他の薬学的製剤には、ゼラチンから作成したプッシュ−フィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンから作成したソフトシールカプセル、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤が含まれる。このプッシュ−フィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、および／または滑石またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ならびに随意に安定剤と混合され得る顆粒の形態にある活性化合物を含み得る。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、好ましくは、脂肪油または液体パラフィンのような適当な液体に、溶解または懸濁される。さらに、安定剤が添加され得る。
【００５５】
直腸に使用され得る可能な薬学的製剤には、例えば、１つ以上の活性化合物の坐薬基剤との組み合わせからなる坐薬が含まれる。適切な坐薬基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素である。さらにこの活性化合物の、基剤との組合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもまた可能である。可能な基剤物質には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素がある。
【００５６】
非経口投与のための適当な処方物には、水溶性の形態（例えば、水溶性の塩およびアルカリ溶液）にあるこの活性化合物の水溶液を含む。Ｔｒｉｓのような緩衝液が存在し得る。さらに、適当な油状注射懸濁液のようなこの活性化合物の懸濁液が投与され得る。適当な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）あるいはトリグリセリドまたはポリエチレングリコール−４００（この化合物はＰＥＧ−４００に可溶性である）が含まれる。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加する物質を含み得るが、これには例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる。随意にこの懸濁液はまた安定剤を含み得る。
【００５７】
本発明の１つの局面に従って、本発明の化合物は、局所および非経口の処方物で使用され、そして高レベルの照射（紫外線照射を含む）熱、または化学薬品に暴露することにより生じるような皮膚損傷の処置に使用され得る。
【００５８】
この皮膚に対して治療的効果を有する１つ以上のさらなる物質もまた、この組成物に取り込まれ得る。従って、この組成物はまた、皮膚におけるサイクリックＡＭＰレベルを増加し得る１つ以上の化合物を含み得る。適当な化合物には、約０．１〜１％の量のアデノシンまたは核酸加水分解物、ならびに約０．５〜５％の量のパパベリンを含む（両方とも組成物の重量に基づく重量％である）。約０．１〜２％の量のイソプロテレノールのようなβアドレナリン作用アゴニスト、または約０．１〜１％の量のサイクリックＡＭＰがまた適切である（これもまた両方とも組成物の重量に基づく重量％である）。本発明の組成物に取り込まれ得る他の適切なタイプのさらなる活性成分には、皮膚に対し有益な効果を有することが知られる任意の化合物がある。このような化合物には、約０．００３〜０．３重量％の量のビタミンＡのようなレチノイド、ならびに約０．１〜１０重量％の量のビタミンＥまたはその誘導体のようなクロマノールがある（ともに組成物の重量に基づく）。さらに、抗炎症性薬剤および角質形成薬剤が化粧品の組成物中に取り込まれ得る。代表的な抗炎症性薬剤は、約０．２５〜５重量％の量のヒドロコルチゾンのようなコルチコステロイドまたはその酢酸塩、あるいは約０．０２５〜０．５重量％の量のデキサメタゾンのようなコルチコステロイドである（ともに組成物の重量に基づく）。代表的な角質形成薬剤は、約０．１〜２０％の量のコールタール、または約０．０５〜２重量％の量のアントラリンがある（ともにこの組成物の重量に基づく）。
【００５９】
本発明の代表的な組成物は、好ましくは、オイル、クリーム、ローション、軟膏などとして、適切なキャリアの選択により処方される。適当なキャリアには、植物油またはミネラルオイル、白色鉱油（白色軟パラフィン）、分枝鎖脂肪またはオイル、動物性脂肪、ならびに高分子量アルコール（Ｃ12以上）が含まれる。好ましいキャリアは、活性成分がそれに可溶性であるキャリアである。乳化剤、安定剤、湿潤剤、および抗酸化剤もまた、所望であれば色または芳香を与える薬剤と同様に含まれる。さらに経皮性貫通エンハンサーが、これらの局所的処方物に使用され得る。このようなエンハンサーの例は、米国特許第３，９８９，８１６号、および同第４，４４４，７６２号に見出され得る。
【００６０】
クリームは、好ましくは、ミネラルオイルの混合物、自己乳化蜜ロウ、および水の混合物から処方され、水にはアーモンドオイルのような少量のオイル中に溶解した活性成分の混合物が混合されている。このようなクリームの代表的な例は、約４０部の水、約２０部の蜜ロウ、約４０部のミネラルオイル、および約１部のアーモンドオイルを含むクリームである。
【００６１】
軟膏は、アーモンドオイルのような植物油中の活性成分の溶液を、温軟パラフィンと混合し、そしてこの混合物を冷却させることにより処方され得る。このような軟膏の代表的な例は、約３０重量％アーモンドオイルおよび約７０重量％軟パラフィンを含む軟膏がある。
【００６２】
ローションは都合の良いことに、この活性成分を、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのような適切な高分子量アルコール中に溶解することにより調製され得る。
【００６３】
さらに、これらの組成物には、当該者に公知または明らかである他の医薬、成長因子、創傷シーラント、キャリアなどが含まれ得る。本発明の組成物は、宿主が処置されない場合よりも迅速に治癒プロセスを進行させるに充分な量で、火傷のような皮膚損傷を既に受けたヒトのような温血動物に投与される。この使用に有効な量は、皮膚損傷の重症度、および処置される患者の一般的な健康状態に依存する。延長した期間にわたる維持投薬量は、必要に応じ調整され得る。獣医学の使用には、必要に応じてより高いレベルが投与され得る。
【００６４】
髪の成長が減少した動物の場合、本発明の組成物は、髪の成長速度を増加するに充分な量で投与される。この使用のための有効量は、髪の成長の減少の程度および処置される患者の一般的な健康状態に依存する。延長した期間にわたる維持投薬量は必要に応じて調整され得る。獣医学の使用には、より高いレベルが必要に応じ投与され得る。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であって、制限するものではない。臨床治療において通常遭遇する、および当業者らに明らかである種々の状況およびパラメーターの他の適切な改変および適応は、本発明の精神および範囲内にある。
【００６６】
（実施例１：ｔ−ブチル５−フルオロ−４−ヒドロキシ−３−ニトロペンタノエート）
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中のシュウ酸（１．９ｍＬ、２１．８ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却し、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中のＤＭＳＯ（３．０ｍＬ，４２．３ｍｍｏｌ）の溶液を、温度が−５０〜−６０℃で保持されるような速度で攪拌しながら添加した。５分攪拌後した、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中の２フルオロエタノール（１．２ｍＬ、１８．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、さらに１５分間攪拌を継続し、次いで乾燥Ｅｔ3Ｎ（１３．５ｍＬ）を添加した。この反応混合物を１５分間攪拌し、次いで室温まで加温した。この反応混合物に、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）中のｔ−ブチル３−ニトロプロピオネート（２．８７ｇ、１６．３８ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合物を室温で３時間攪拌し、次いで水（１００ｍＬ）中に注いだ。有機層を分離し、そして水槽をＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）で抽出した。このＣＨ2Ｃｌ2溶液を塩水で洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。この残留物を、シリカゲル（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、７：３）上で二度クロマトグラフィーにより精製し、無色粘着性オイルとして、９５０ｍｇ（２４．５％）の表題の産物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、１．４５０（ｓ、９Ｈ）、２．８０〜２．９０（ｍ、２Ｈ）、３．１２〜３．２０（ｍ、１Ｈ）、４．４１〜４．５９（ｍ、２Ｈ）、４．５７〜４．５９（ｍ、１Ｈ）、４．９５〜５．０１（ｍ、１Ｈ）。
【００６７】
（実施例２：ｔ−ブチル３−アミノ−５−フルオロ−４−ヒドロキシ−ペンタノエート）
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中ｔ−ブチル５−フルオロ−４−ヒドロキシ−３−ニトロペンタノエート（９５０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネーニッケル（約２００ｍｇ）を添加した。この混合物を室温で１８時間、Ｈ2（３０〜３５ｐｓｉ）下で振盪した。それを濾過し、そしてこの触媒をＭｅＯＨ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。そしてＭｅＯＨ溶液を蒸発させ、そして残留物をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、１０：１）上でクロマトグラフィーにより精製し、黄色がかった粘性のオイルとして８４０ｍｇ（９６％）表題の化合物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、１．４５０（ｓ、９Ｈ）、２．１２（ｂｓ、３Ｈ、ＯＨおよびＮＨ2）、２．２８〜２．３８（ｍ、１Ｈ）、２．４７〜２．５７（ｍ、１Ｈ）、３．２４〜３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．５４〜３．７６（ｍ、１Ｈ）、４．３８〜４．４８（ｍ、１Ｈ）、４．５４〜４．６１（ｍ、１Ｈ）。
【００６８】
（実施例３：ｔ−ブチル３−（Ｃｂｚ−Ｖａｌ−アミド）−５−フルオロ−４−ヒドロキシ−ペンタノエート）
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＣｂｚ−Ｖａｌｉｎｅ（３９６ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣｌ（３００ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２４０ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１２９ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を添加した。得られる混合物を５分間攪拌し、次いでＴＨＦ（１０ｍＬ）中ｔ−ブチル３−アミノ−５−フルオロ−４−ヒドロキシ−ペンタノエート（２１５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そして室温で１８時間攪拌した。この混合物を濾過し、ＴＨＦ溶液を蒸発させ、そして残留物を、シリカゲル（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、３：２）上でクロマトグラフィーにより精製し、白色固体として２９０ｍｇ（６８％）の表題の化合物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、０．９０５（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７）、０．９６５（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７）、１．４２８（ｓ、９Ｈ）、２．０７〜２．１６（ｍ、１Ｈ）、２．５０〜２．５７（ｍ、１Ｈ）、２．６４〜２．７０（ｍ、１Ｈ）、３．５２（ｂｓ、１Ｈ、ＯＨ）、３．９２〜３．９６（ｍ、２Ｈ）、４．２０〜４．２７（ｍ、１Ｈ）、４．４０（ｂｓ、１Ｈ）、４．４９（ｂｓ、１Ｈ）、５．１０（ｓ、２Ｈ）、５．３１〜５．４（ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、６．８６〜６．９３（ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、７．３５０（ｓ、５Ｈ）。
【００６９】
（実施例４：Ｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ ｔ−ブチルエステル）
ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）中、ペリオジナン（ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）（４８５ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）のイミュージョン（ｉｍｕｓｓｉｏｎ）に、ＣＨ2Ｃｌ2（１２ｍＬ）中ｔ−ブチル３−（Ｃｂｚ−Ｖａｌ−アミド）−５−フルオロ−４−ヒドロキシ−ペンタノエート（２３０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そして得られる白色混合物を室温で４０分間攪拌した、次いで１．２６ｇ（８ｍｍｏｌ）のＮａ2Ｓ2Ｏ3を含有する２５ｍＬのＮａＨＣＯ3の飽和水溶液に注いだ。得られる混合物を２０分間攪拌し、得られる清澄ＣＨ2Ｃｌ2溶液を分離し、そして水層をＣＨ2Ｃｌ2（２×２５ｍＬ）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2溶液を塩水で洗浄し、蒸発させ、次いで残留物をシリカゲル（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、３：２）上でクロマトグラフィーにより精製し、白色固体として１９０ｍｇ（８３％）の表題の化合物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、０．９１〜０．９７（ｍ、６Ｈ）、１．４１５（ｓ、９Ｈ）、２．１０〜２．２０（ｍ、１Ｈ）、２．７０〜２．７７（ｍ、１Ｈ）、２．９５〜３．０１（ｍ、１Ｈ）、３．９８〜４．０６（ｍ、１Ｈ）、４．８７〜５．２８（ｍ、６Ｈ）、６．９５〜７．０１（ｍ、１Ｈ）、７．３５０（ｓ、５Ｈ）。
【００７０】
（実施例５：Ｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）中の、Ｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ ｔ−ブチルエステル（１８０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｆ3ＣＣＯ2Ｈ（１．０ｍＬ）を添加し、室温で４０分間攪拌し、次いで蒸発させた。残留物をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ、１０：１）上でクロマトグラフィーにより精製し、白色固体として１２０ｍｇ（７６％）の表題の化合物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）、０．８１〜０．８４（ｍ、６Ｈ）、１．８７〜１．９６（ｍ、１Ｈ）、２．４７〜２．６７（ｍ、２Ｈ）、３．７７〜３．８７（ｍ、１Ｈ）、４．４７〜４．５９（ｍ、１Ｈ）、４．９１〜５．１６（ｍ、４Ｈ）、７．２５〜７．４２（ｓ、５Ｈ）、８．４０〜８．４９（ｍ、１Ｈ）。
【００７１】
以下の化合物は、実施例３〜５に記載と同じ手順を使用して得られた：
（実施例６：Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７２】
【数２】
（実施例７：Ｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７３】
【数３】
（実施例８：Ｚ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７４】
【数４】
（実施例９：Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７５】
【数５】
（実施例１０：Ｚ−Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７６】
【数６】
（実施例１１：Ｚ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７７】
【数７】
（実施例１２：Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７８】
【数８】
（実施例１３：Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００７９】
【数９】
（実施例１４：Ｚ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００８０】
【数１０】
（実施例１５：Ｚ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００８１】
【数１１】
（実施例１６：Ｚ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
白色固体。
【００８２】
【数１２】
（実施例１７：Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ｆｍｋ）
Ｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕ−ｔ）−Ａｓｐ−ｆｍｋ ｔ−ブチルエステルを実施例３および４に記載されるようにＺ−Ｔｙｒ（Ｂｕ−ｔ）−ＯＨおよびｔ−ブチル３−アミノ−５−フルオロ−４−ヒドロキシペンタン酸から調製した。塩化メチレン（１ｍＬ）中のＺ−Ｔｙｒ（Ｂｕ−ｔ）−Ａｓｐ−ｆｍｋ ｔ−ブチルエステル（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で８時間、次いで４℃で２日間攪拌した。それを酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、水（４×２０ｍＬ）およびブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、そして減圧下で濃縮して表題の化合物を黄色固体（１０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、８３％）として得た。
【００８３】
【数１３】
（実施例１８：Ｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ メチルエステル）
アイスバスで冷却したメタノール（２０ｍＬ）中のＺ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｆｍｋ（１１０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）溶液にｐＨ紙によって測定した場合、この溶液が強酸性に変わるまで塩化水素ガスの流れをゆっくりと通した。この溶液を室温で４時間攪拌し、次いで蒸発させた。この残査をシリカゲル（ヘキサン−酢酸エチル、３：２）上でのクロマトグラフィーによって精製し、６３ｍｇ（５５％）の表題化合物を白色固体として与えた。
【００８４】
【数１４】
以下の化合物を実施例１８に記載した同じ手順を使用して得た。
【００８５】
（実施例１９：Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ｆｍｋメチルエステル）
無色の粘性オイル。
【００８６】
【数１５】
（実施例２０：Ｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ｆｍｋメチルエステル）
白色固体。
【００８７】
【数１６】
（実施例２１：ＨｅＬａ細胞を使用した細胞死アッセイ）
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）ＣＨ2Ｆの細胞保護特性を腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）でチャレンジしたＨｅＬａ細胞を使用して試験した。これはよく特徴付けられたアポトーシスの細胞培養モデルであり、これは、一般に抗アポトーシス剤を分析するために使用される。以下の２つのタイプの実験を行った：位相差顕微鏡を使用した細胞の可視化による細胞死の定量評価；および蛍光色素カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭを使用した細胞死の定量評価。
【００８８】
顕微鏡写真に関して、ＨｅＬａ細胞を２ｍＭ グルタミンおよび１０％ ウシ胎児血清を含む最小必須培地中にウェル当たり１００，０００細胞の密度で１２ウェルマルチデッシュに播種する。２４時間後、プレート培地を除去し、そして細胞保護試験化合物を様々な濃度で含む新鮮な培地を加える。この細胞をＣＯ2インキュベーターで３７℃、２時間試験化合物とともにプレインキュベートし、次いでＴＮＦ−αおよびＣＨＸを２５ｎｇ／ｍＬおよび３０μｇ／ｍＬの最終濃度でそれぞれ加える。２４時間のインキュベーション後、この細胞を細胞の形および接着の度合いに基づいた細胞死の証拠について視覚的に検査する。細胞が１つに集まり、そして明るい相となり、そして基体から剥離した場合、死んだとみなされる。細胞はそれらの正常な形態を保持し、そして基体に付着したままである場合、生存しているとみなされる。
【００８９】
定量アッセイに関して、試験化合物の存在における細胞生存の度合いを指標色素カルセイン ＡＭを使用して定量的に分析する。この色素を溶解して、そして生存細胞によって蛍光誘導体に変換する；次いで、各ウェルにおける活性化色素の量を蛍光定量プレートリーダーでアッセイし得、そして蛍光の度合いを生存細胞数の尺度として使用する。これらのアッセイのため、ＨｅＬａ細胞を２ｍＭ グルタミンおよび１０％ ウシ胎児血清を含む０．４ｍＬの最小必須培地中にウェル当たり２５，０００細胞の密度で４８ウェルプレートに播種する。２４時間後、プレート培地を除去し、様々な濃度で試験化合物を含む０．５ｍＬの新鮮培地を加える。この細胞をＣＯ2インキュベーター中で３７℃、２時間試験化合物とプレインキュベートし、次いでＴＮＦ−αおよびＣＨＸを２５ｎｇ／ｍＬおよび３０μｇ／ｍＬの最終濃度でそれぞれ加える。２４時間のインキュベーション期間の後、この培養物を２回、血清を含まない、フェノールレッドを含まないＨａｍ’ｓ Ｆ１２で洗浄し、死んだ細胞を除去し、８μＭ カルセイン ＡＭを含む１２５μＬのＨａｍ’ｓ Ｆ１２を加える。この培養物を室温で１時間インキュベートし、そしてこの蛍光シグナルを４８５ｎｍ（励起）および５３０ｎｍ（発光）のフィルター設定を使用してＢｉｏＴｅｋ プレートリーダーで測定する。このデーターを「パーセントコントロール」として表現し、これは以下の式で計算される：
【００９０】
【数１７】
未処理培養物よりむしろコントロールとしてのＣＨＸ処理培養物の使用は、ＣＨＸの細胞増殖抑制効果について補正することを可能にする。しかし、ＣＨＸは単独ではまたＨｅＬａ細胞中でのアポトーシスの温和なインデューサーであるので、強い抗アポトーシス剤は、１００％より大きいパーセントコントロール値を示す。
【００９１】
代表的な定性アッセイからの結果を図１Ａ〜１Ｇ、２Ａ〜２Ｇおよび３Ａ〜３Ｇに示す。これらの実験において、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆの細胞保護的な能力をＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2ＦおよびＣｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆの細胞保護的な能力と、３つの異なった濃度で比較する：０．５、５および５０μＭ。すべてのこれらの化合物は、このメチルエステル誘導体である。図１Ａ〜１Ｇは、５０μＭの濃度でＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図１Ｄ）がＴＮＦ−αおよびＣＨＸのアポトーシス効果からＨｅＬａ細胞を完全に保護することを示す。５０μＭで、関連したペプチドＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図１Ｃ）およびＣｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図１Ｅ）はまた、保護的である。ＣＰＰ３２インヒビター、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図１Ｆ）は、５０μＭで細胞保護剤としてわずかに有効なだけである。図２Ａ〜２Ｇは、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図２Ｄ）が５μＭの濃度で驚くべきことになお強い細胞保護作用を示すことを示し、一方、５μＭのＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図２Ｃ）および５μＭのＣｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図２Ｅ）はあまり効果的ではない。ＣＰＰ３２インヒビター、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図２Ｆ）は、５μＭで細胞保護特性を有さない。図３Ａ〜３Ｇは、０．５μＭでさえＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（図３Ｄ）が、なお有効な細胞保護剤であり、一方、他の化合物（図３Ｃ、３Ｅおよび３Ｆ）がわずかな細胞保護を示すか、または細胞保護を示さないことを示す。これらの実験は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆが他の推定の抗アポトーシス剤より１０〜１００倍低い濃度でＴＮＦ−α／ＣＨＸ誘導アポトーシスからＨｅＬａ細胞を保護し得ることを示す。
【００９２】
上記のように、カルセイン ＡＭを使用する定量実験は、顕微鏡検査によって得られた結果を確証する。図４および５は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）の細胞保護の特性をＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）（図５）およびＣｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｃ）（図４）と３つの濃度（０．５、５および５０μＭ）で比較した２つのこのような実験の結果を示す。図４は、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）が、使用された最も高い濃度（５０μＭ）でさえＴＮＦ−α／ＣＨＸからのＨｅＬａ細胞保護において最小に有効であるにすぎないことを示す。図５はＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）が５０および５μＭで有効な細胞保護剤であるが、その活性は０．５μＭで劇的に減少することを示す。対照的に、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）は、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）が５０μＭで有効な細胞保護剤であるのと同様に０．５μＭで有効な保護剤である（図４）。さらに、０．５μＭのＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）はより高活性であるが、一方０．５μＭのＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）は不活性である（図５）。
【００９３】
低用量でＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆの効果を決定するために、ＨｅＬａ細胞を０．０５μＭ〜１μＭの濃度域で処置した。図６に示すように、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）は、０．２５μＭほどの低い濃度で有意な細胞保護を示した。対照的に、細胞死研究において広く使用されている抗アポトーシス剤であるＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）は、この濃度域では細胞保護を示さない。
【００９４】
ひとまとめにして考えると、図１Ａ〜６によって示された実験はＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆが驚くべきことに、インタクトな細胞における強力な抗アポトーシス剤であり、そして任意の他の既知のカスパーゼインヒビタ−よりも強力であることを示す。
【００９５】
（実施例２２：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＰＡＲＰ切断の阻害）
酵素ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断は、カスパーゼタンパク質分解カスケードが活性化された全細胞において生じると思われる。この理由のため、ＰＡＲＰ切断は、カスパーゼ媒介アポトーシスのための生化学的なマーカーとして広く使用される。細胞保護薬物のＰＡＲＰ切断をブロックする能力は、カスパーゼタンパク質分解カスケード、特に、主要なＰＡＲＰプロテアーゼであるＣＰＰ３２（カスパーゼ−３）を阻害する薬物の能力を示すと考えられる。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2ＦのＰＡＲＰ切断を阻害する能力をヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞のＦａｓ媒介アポトーシス中に検査する。このアポトーシスの細胞培養モデルはよく特徴付けられており、そして少なくとも２つのカスパーゼ、カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）およびカスパーゼ−８（ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ）の活性化に関与することが知られている。
【００９６】
ＰＡＲＰ切断アッセイに関して、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地中に６ウェルのマルチディシュにおいてウェル当たり５００，０００細胞の密度で播種した。この細胞をＣＯ2インキュベーター中で３７℃、２時間Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆまたは他の試験化合物とプレインキュベートし、次いでＦａｓに対するモノクローナル抗体を５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。ＣＯ2インキュベーターでの３７℃のインキュベーションをさらに４時間続けた。インキュベーション期間の終了時に、この細胞を遠心分離により収穫し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼインヒビターの反応混液を含む緩衝液中で溶解した。１０〜２０μｇのタンパク質に対応する溶解物量を７．５％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、そして２〜２．５時間、２５ｍＡで電気泳動した。次いで、このタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ウサギポリクローナル抗体でＰＡＲＰに対してプローブし、そして化学発光を使用して可視化した。
【００９７】
図７Ａ〜７Ｅは３つのこのような実験の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を０．５、５または５０μＭの以下の化合物でプレインキュベートした：Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物１）；ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物５）；Ｃｂｚ−Ａｓｐ−α−（［２，６−ジクロロベンゾイルオキシ］−メチルケトン）（化合物６）、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物３）、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物２）、Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物４）、またはＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物７）。次いでこの細胞を抗Ｆａｓで処置し、そしてウエスタンブロットで処理した。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物１）は、５０および５μＭでＰＡＲＰ切断を完全に阻害し、そして０．５μＭでさえ切断の有意な阻害を生じる（図７Ａ）。対照的に、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物２）（図７Ａ）およびＣｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物４）（図７Ｂ）ならびにＣｂｚ−Ａｓｐ−ＤＣＢ（化合物６）（図７Ｄ）はＰＡＲＰ切断を５０μＭで完全に阻害したが、５μＭおよび０．５μＭではわずかに有効なインヒビターにすぎない。ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物５）（図７Ｄ）およびＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物７）（図７Ｅ）ならびにＣｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物３）（図７Ｂ）は、５０および５μＭの濃度でＰＡＲＰ切断の有効なインヒビターであるが、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（化合物１）がなお有意な阻害を示す濃度である０．５μＭでは、わずかに有効にすぎなかった（図７Ａ）。これらの実験はＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆが他の既知のカスパーゼインヒビターより少なくとも１０倍低い濃度でインタクトな細胞においてカスパーゼタンパク質分解カスケードをブロックし得ることを示す。
【００９８】
（実施例２３：酵素活性）
ＣＰＰ３２、ＩＣＥおよびカテプシンＢのインヒビターとしてのＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2ＦおよびＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ（遊離酸）の活性を、蛍光比色酵素アッセイにおいて測定した。組換えＣＰＰ３２タンパク質およびＩＣＥタンパク質を、昆虫宿主細胞（ｓｆ９細胞において、バキュロウイルスをベクターとして用いてこれら酵素をコードするＤＮＡクローンを発現させることによって調製した。Ｗｅｂｂ、Ｎ．Ｒ．ら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ」、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２；１７３−１８８（１９９０）を参照のこと。ネイティブのカテプシンの調製物を、商業供給源から得た。酵素活性を、蛍光発生脱離基に結合した合成ペプチド基質を用いて測定した。合成基質のその酵素による切断は、分光蛍光測定器または蛍光測定マイクロタイタープレートリーダーにおいて読まれる蛍光シグナルを生じた。
【００９９】
ＣＰＰ３２活性を、以下の緩衝条件を用いて測定した：１０％スクロース、１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ グルタチオンおよび５μＭペプチド基質を有する、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５。このペプチド基質は、Ｃ末端に結合体化された蛍光発生化合物アミノメチルクマリンとともに配列Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを有するオリゴマーからなった。酵素活性についてのこのアッセイは、代表的に３７℃で３０分間行った。
【０１００】
表１は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2ＦおよびＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ（遊離酸）のＣＰＰ３２および他のプロテアーゼについてのＩＣ50を列挙する。
【０１０１】
（表Ｉ：Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2ＦおよびＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ（遊離酸）のＣＰＰ３２および他のプロテアーゼのインヒビターとしての効力）
【０１０２】
【表１】
表１に示される結果は、本発明の化合物が、ＣＰＰ３２およびＩＣＥの中程度に強力なインヒビターであることを示す。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆは、ＣＰＰ３２およびＩＣＥについての強力かつ選択的なインヒビターであることを示す。
【０１０３】
ＰｈａｒＭｉｎｇｔｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎの子会社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得られた組換えカスパーゼ３、６、７および８におけるＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆの阻害活性を、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを用いて測定した。１アッセイあたりの各酵素の量は以下のとおりであった：１ｎｇ カスパーゼ３．１５ｎｇ カスパーゼ６、２ｎｇ カスパーゼ７および６０ｎｇカスパーゼ８。この酵素反応をカスパーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、および１０％スクロース、ｐＨ７．２）を用いて９６ウェルプレートにおいて行い、そしてその反応を、１０μＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡから購入した）を添加することによって開始した。３０ｐＭから１０μＭに及ぶ１２種の濃度のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆを、３７℃で３０分間組換えカスパーゼとその化合物とのインキュベーション後に試験した。そのプレートを、蛍光プレートリーダー（ＥＧ＆Ｇ ＷＡＬＬＡＧ、モデル１４２０−００２）を用いて、３５５ｎｍの励起フィルター／４６０ｎｍでの発光フィルターを使用して読んだ。このデータをＧｒａｐｈＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析した。このデータを表ＩＩにまとめる。
【０１０４】
（表ＩＩ：カスパーゼのインヒビターとしてのＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆの効力）
【０１０５】
【表２】
表ＩＩに示される結果は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆが試験したすべてのカスパーゼの強力なインヒビターであることを示す。
【０１０６】
表ＩＩＩは、種々のジペプチドインヒビターのカスパーゼ−３活性を示す。その結果は、Ｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆが、試験した化合物の中で最も強力なカスパーゼ−３インヒビターであることを示す。
【０１０７】
（表ＩＩＩ：ジペプチドインヒビターのカスパーゼ−３アッセイ）
【０１０８】
【表３】
（実施例２４：Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋのＰＡＲＰ切断に対する効果）
ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、同定された最初のカスパーゼ−３基質の一つであって、そしてＰＡＲＰの切断はなお、カスパーゼ−３活性化およびカスパーゼ媒介アポトーシスについてのほぼ普遍的なマーカーであると考えられている。それゆえ、抗アポトーシス化合物がＰＡＲＰ切断をブロックする能力は、それがアポトーシスを阻害する能力の有用な指標である。ＰＡＲＰ切断アッセイにおけるＺ−ＶＤ−ｆｍｋの効力を、抗Ｆａｓ処理したＪｕｒｋａｔ細胞を用いて試験した。２×１０6Ｊｕｒｋａｔ細胞を、６ウェルディッシュの各ウェルに播種し、そして試験化合物と３０分間予備インキュベートした。次いで、この細胞に、５００ｎｇ／ｍＬのアゴニスト抗Ｆａｓ抗体またはＰＢＳで４時間チャレンジした。次いで、この細胞を採取し、緩やかにペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。溶解物のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてそのタンパク質をウェスタンブロッティングのためにＰＶＤＦメンブレンに転写した。一次抗体は、全長ＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３生成切断産物の両方と交叉反応するポリクローナル抗ＰＡＲＰ血清であった。
【０１０９】
図８Ａは、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋがＰＡＲＰ切断を、５００および２５０ｎＭ（８５ｋＤのバンドが存在しないことに注意されたい）の濃度で完全に阻害したことを示す。Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋはなお、５０ｎＭでの濃度でさえその阻害活性の殆どを保持する（図８Ａ）。対照的に、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、５μＭでのＰＡＲＰ切断の有効なインヒビター（データ示さず）であるが、５００ｎＭではほとんど有効ではなかった（図８Ｂ）。これらの実験は、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋが、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋよりもインタクトな細胞においてＰＡＲＰ切断のインヒビターとして少なくとも１０倍強力であり、そしてＺ−ＶＤ−ｆｍｋは、全細胞アポトーシスのこのモデルにおいて５０ｎＭ未満のＩＣ50値を有することを示す。
【０１１０】
（実施例２５：ＴＮＦ−α誘発細胞死に対するＺ−ＶＤ−ｆｍｋの影響）
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）は、多数の細胞型におけるアポトーシスを、カスパーゼカスケードを開始することによって誘発し得、そしてそのアポトーシス誘発活性は、ペプチドベースのカスパーゼインヒビターによって阻害され得る。しかし、高濃度（５０μＭ以上）のインヒビターが良好な抗アポトーシス効果を有するために必要である。ＨｅＬａ細胞（ＴＮＦ−α細胞死研究において一般的に使用される細胞株）をここで使用して、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋの抗アポトーシス効力を決定した。
【０１１１】
ＨｅＬａ細胞を、処置前２４時間で、１ウェルあたり、５０，０００細胞の密度で４８ウェルのマルチディッシュに播種した。次いで、これらを、種々の濃度のＺ−ＶＤ−ｆｍｋと、２時間予備インキュベートし、そしてＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍＬ）およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ；３０μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。この培養物を、さらに２４時間インキュベートし、そして死んだ細胞を、ＰＢＳで２回洗浄することによって除去した。次いで、生存細胞密度を、カルセインＡＭ（生存細胞によって取り込まれ、そして蛍光産物に変換される予備蛍光色素）とともに４５分間各培養物をインキュベートすることによって測定した。得られたデータを、％コントロール値（コントロール値は、シクロヘキシミドとであるが、ＴＮＦ−αなしでインキュベートした細胞である）。
【０１１２】
図９は、０〜５００ｎＭの範囲の試験濃度でのＺ−ＶＤ−ｆｍｋの結果を示す。ｚ−ＶＤ−ｆｍｋは、１００ｎＭに近づく濃度で良好な細胞保護を提供した。対照的に、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは、１μＭ未満でその殆どの細胞保護特性を欠失した（データは示さず）。テトラペプチドインヒビター（例えば、Ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）は、５０μＭ未満では全然有効ではない（データは示さず）。従って、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋは、ＰＡＲＰ切断をマイクロモル濃度未満で阻害するのみならず（実施例２４を参照のこと）、マイクロモル濃度未満で細胞死もまた阻害し、そして公知のトリペプチドおよびテトラペプチドインヒビターよりも遥かにより有効である。
【０１１３】
（実施例２６：ＤＮＡラダー形成に対するＺ−ＶＤ−ｆｍｋの効果）
アポトーシスの後期の段階において、細胞は、細胞質の小片が離れ（小胞形成により）そして核が分解するにつれ、文字通り崩壊し始める。核分解の特徴の一つは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソームサイズの断片への切断である（「ＤＮＡラダー形成」と称する）。ＤＮＡラダー形成は、他の後期アポトーシス事象と同様に、不可逆であると考えられ、それゆえ、抗アポトーシス薬物がその発生を妨害し得るか否かを決定することは重要である。
【０１１４】
Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋがＤＮＡラダー形成をブロックする能力を、抗Ｆａｓ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて試験した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、６０ｍｍディッシュに５×１０6細胞の密度でプレートし、そして種々の濃度のＺ−ＶＤ−ｆｍｋで予備インキュベートした。次いで、それらを、抗Ｆａｓで、１００ｎｇ／ｍＬで４時間チャレンジし、採取し、そしてペレット化し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。ゲノムＤＮＡを、Ｅｌｄａｄａｈら（１９９６）の方法を用いて単離した。手短には、この細胞を、２ｍＬの７ＭグアニジンＨＣｌ中で溶解し、そして１ｍＬＷｉｚａｒｄミニプレップＤＮＡ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。樹脂／ＤＮＡ複合体を、緩衝液で２回洗浄し、そしてこのＤＮＡをＴＥ中に溶出した。１〜２μｇのこのＤＮＡサンプルを、１％アガロース／ＴＢＥゲル上で電気泳動し、そしてこのゲルをエチジウムブロミドで染色した。
【０１１５】
図１０は、この細胞をＺ−ＶＤ−ｆｍｋまたは薬物ビヒクル（ＤＭＳＯ）と予備インキュベートしたＤＮＡラダー形成アッセイの結果を示す。抗Ｆａｓでチャレンジしたビヒクル処置細胞は、約３００ｂｐまで下るＤＮＡ伸長の特徴的なラダー形成パターンを示した。対照的に、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋは、５０ｎＭの用量もの低用量でラダー形成を阻害する。
【０１１６】
この結果は、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋが、重要な後期アポトーシス事象（ＤＮＡラダー形成）を、細胞死およびＰＡＲＰ切断をブロックするその濃度に匹敵するマイクロモル濃度未満でブロックし得ることを示す。この実験および実施例２４および２５に記載されたデータに基づいて、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが、アポトーシス全細胞モデルにおける非常に有効な、マイクロモル濃度未満のアポトーシスインヒビターであると結論する。
【０１１７】
（実施例２７：マウス肝臓アポトーシスモデルにおけるＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆの抗アポトーシス活性）
３〜４週齢の雌性マウスをこの研究で使用した。肝臓変性を、８０μｌのリン酸緩衝生理食塩水中に希釈した２〜６μｇのマウスＦａｓ抗Ｔに対する精製ハムスター抗マウスＦａｓモノクローナル抗体（クローンＪｏ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を静脈内注射することによって誘導した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９６）。死亡率を肝臓変性を評価する終期点として用いた。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆを、静脈内注射のためにＴｒｉｓ緩衝液中で処方し、そして尾静脈を経た静脈注射によって与えた１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で試験した。１０分後、動物にＦａｓ抗体を注射した。死亡率を３０分、１時間、３時間および２４時間にて計数した。各化合物について、Ｆａｓ抗体のみを与えるコントロールの群を存在させた。最高用量を与えた群を、急性の行動効果について観察し（例えば、鎮静、歩行運動、歩行変化、痙攣、尾振り（ｓｔｒａｕｂ ｔａｉｌ）、振顫など）、次いで、一晩収容し、そして次の日に毒性／死亡率をチェックした。
【０１１８】
これらの実験において、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆは、抗Ｆａｓ誘導性致死の驚くほど強力なインヒビターであった。単一の１ｍｇ／ｋｇ静脈用量は、抗体投与後１時間まで抗Ｆａｓからマウスを完全に保護し、そして０．２５ｍｇ／ｋｇほどの用量でも、なお、ほとんど１００％保護を与えることが見い出された。対照的に、ビヒクルコントロールグループにおいて、すべてのマウスがこの時点で死んだ。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆはまた、２４時間まで実質的な保護を示した（２８％生存）。別個の研究によって、致死に対するこの保護は、肝臓酵素ＳＰＧＴおよびＳＧＯＴの誘導における予測される減弱と関連したことが示された。
【０１１９】
これらのデータは、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆが、マウス肝臓アポトーシスモデルにおける全身投与後にインビボで非常に活性であることを実証する。
【０１２０】
（実施例２８：焦点虚血のラットモデルにおけるＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆの神経保護）
（ｉ）予備手術：雄性Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４ラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄｒａｗｌｅｙ、ＣＡ）（体重２００〜２４０ｇ）を使用した。動物に、最初に、３０％酸素および７０％空気の混合物中の３％ハロタンで麻酔をかけた。ハロタンレベルを、手術中の麻酔の維持のために１．５％に減じた。予備手術は以下を含む：（ａ）静脈カテーテル移植：左大腿静脈を露出させ、そして続く薬物投与のために、Ｔｅｌｅｆｌｅｘカテーテル（これは、ビヒクルが装填されている）を下大静脈にまで挿入した。（ｂ）動脈カテーテル移植：大腿動脈にカニューレを入れて血圧および他の生理条件（ｐＯ2、ｐＣＯ2、ｐＨ、グルコース、ヘマトクリット、虚血の間、初期薬物投与、および動脈再灌流の時間）のモニターを可能にした。動脈カテーテルおよび静脈カテーテルの両方は、動物の背中を通して外部に出して、自由な動きを可能とした。（ｃ）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＭＩ）を腹膜腔に移植して、動物の体温を２２時間遠隔モニターした。
【０１２１】
（ｉｉ）生理的パラメーター：コア体温を、ＹＳＩ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｕｎｉｔ（Ｍｏｄｅｌ ７３Ａ、ＹＳＩ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｏｈｉｏ）およびＥｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｔｉｎｇ Ｐａｄ（Ｍｏｄｅｌ ７５６、Ｓｕｎｂｅａｎ−Ｏｓｔｅｒ Ｃｏ．Ｉｎｃ．Ｈａｔｔｉｅｓｂｕｒｇ，ＭＳ）に接続されたＹＳＩ Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ（ＹＳＩ ＣＯ．Ｉｎｃ．Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇ，ＯＨ）を用いて手術中３７．５℃に維持した。虚血後、ＰｈｙｓｉｏＴｅｌ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒを作動させ、そしてコア体温を５分ごとに記録した。全身血圧を、手術中を通して、静脈薬物注入（ボーラス）の間、および虚血の開始の１、２、３、および４時間後にモニターした。他の生理条件、（ｐＯ2、ｐＣＯ2、ｐＨ、グルコース、ヘマトクリットを含む）を動脈閉塞および再灌流の時間に検査した。
【０１２２】
（ｉｉｉ）一過性焦点虚血モデル：予備手術後、腹側正中頸切開を行って、両方のＣＣＡを露出させた。右のＣＣＡを、４−ｏ絹結紮で永久結紮し、他方、左のＣＣＡを、非外傷性の動脈瘤クリップで留めた。右の目の側方眼角と、外耳道との間の線に対して垂直かつ二等分するような１ｃｍの切込みを入れた。基底の側頭筋を切り出し、そして再収縮させ、ならびに解剖顕微鏡（Ｍｏｄｅｌ ＳＺーＳＴＢ１、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）の助けをかりて直接可視化し、この中央の大脳動脈（ＭＣＡ）を、頬骨弓と側頭鱗骨の融合から２〜３ｍｍ吻側に開けたの２ｍｍのバー穴を介して露出させた。穴あけを、生理食塩水の連続的な灌注の下で行った。硬膜を切断し、そして再収縮させて、嗅脳溝におけるＭＣＡに曝露させた。Ｃｏｄｍａｎの小さな動脈瘤クリップ（Ｎｏ．１）を使用して、それが嗅脳溝を交叉する再にＭＣＡを一過的に閉塞させた。流れの中断を、解剖顕微鏡を用いて確認した。切開を手術用クリップで閉じ、麻酔を止めた。そして、その動物が覚醒した後（数分以内）にその動物をそのケージに返した。一過性虚血に供したラットに、ＭＣＡ閉塞の後２．５時間後再度麻酔をかけた。ＭＡＣ閉塞の確認後、ＭＣＡ上のクリップおよび左のＣＣＡを除去し、そしてＭＣＡにおいて血流の回復を視覚的に確認した。切開を閉じ、そしてラットをそのケージに戻した。短期の回復を必要とする動物を２４時間生存させた。屠殺前にすべての動物に深く麻酔をかけた。脳を除去し、そして２ｍｍの冠状切片をスライスし、そしてＴＴＣに入れた。梗塞した組織は、青白くみえ、そして隣接した生存組織から識別可能であるようであった。皮質および皮質下の梗塞の面積を、画像処理ソフトウェアを用いて盲目的に測定し、そして梗塞の容量を、公知の厚さを伴う個々の測定量を加算することによって計算した。
【０１２３】
（ｉｖ）統計学的分析：すべての生理的パラメーター、温度記録、および皮質梗塞の容量を、実験群およびコントロール群の間で、各サブセットの動物について、統計学的に比較した。統計分析を、Ｓｉｇｍａｓｔａｔソフトウェア（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ ＣＡ）を用いて実施した。スチューデントのｔ検定を、独立データについて用い、そしておよびＡＮＯＶＡを多比較について用いた。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。グラフを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ ｖ２．０１ソフトウェア（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において調製した。
【０１２４】
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆのインビボ神経保護特性を、ラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ−３４４）一過性焦点虚血モデルにおける２つの不全研究において試験した。Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆを、虚血の発症後１０分間に２０ｍｇ／ｋｇの静脈ボーラスとして与え、次いで、５ｍｇ／ｋｇ／時間の連続静脈注射を行った。実験１において、連続注入を６時間与えた。実験２において、注入を１２時間に延長した。
【０１２５】
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆは、両方の研究において皮質梗塞を有意に減少させることが見い出された：実験１において４６％（ｐ＜０．０５）、および実験２において５７％（ｐ＜０．０５）（図１１Ａおよび１１Ｂ）。薬物投与後の血圧、血中ガス、または温度の変化は存在しなかった。これらの結果は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆが急性の静脈投薬後に寛容であり、そして一過性焦点大脳虚血のラットモデルにおいて強力な神経保護剤であることを実証した。
【０１２６】
今や本発明を完全に記載したので、当業者は、本発明が、本発明の範囲またはその任意の実施態様に影響を与えることなく条件、処方物および他のパラメーターの広範かつ等価な範囲内で実施され得ることを理解する。本明細書において引用された全ての特許および刊行物は、本明細書においてその全体が参考として充分援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｇは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）およびＤＭＳＯ（図１Ａ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）／ＣＨＸおよびＤＭＳＯ（図１Ｂ）；５０μＭ ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図１Ｃ）；５０μＭ Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図１Ｄ）；５０μＭ Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図１Ｅ）；５０μＭ Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図１Ｆ）；およびＤＭＳＯ（図１Ｇ）で試行されたＨｅＬａ細胞の写真を示す。
【図２】 図２Ａ〜２Ｇは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）およびＤＭＳＯ（図２Ａ）、ＴＮＦ−α／ＣＨＸおよびＤＭＳＯ（図２Ｂ）；５μＭ ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図２Ｃ）；５μＭ Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図２Ｄ）；５μＭ Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図２Ｅ）；５μＭ Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図２Ｆ）；およびＤＭＳＯ（図２Ｇ）で試行されたＨｅＬａ細胞の写真を示す。
【図３】 図３Ａ〜３Ｇは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）およびＤＭＳＯ（図３Ａ）、ＴＮＦ−α／ＣＨＸおよびＤＭＳＯ（図３Ｂ）；０．５μＭ ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図３Ｃ）；０．５μＭ Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図３Ｄ）；０．５μＭ Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図３Ｅ）；０．５μＭ Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ、ＴＮＦ−α／ＣＨＸ（図３Ｆ）；およびＤＭＳＯ（図３Ｇ）で試行されたＨｅＬａ細胞の写真を示す。
【図４】 図４は、ＴＮＦ−α／ＣＨＸからのＨｅＬａ細胞のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）の種々の濃度での保護を、Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）と比べて、示す棒グラフを示す。
【図５】 図５は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）およびＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）の種々の濃度によるＴＮＦ−α／ＣＨＸからのＨｅＬａ細胞の保護を示す棒グラフを示す。
【図６】 図６は、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ｂ）と比べて種々の低用量のＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ（ａ）によるＴＮＦ−α／ＣＨＸからのＨｅＬａ細胞の保護を示す棒グラフを示す。
【図７】 図７Ａ〜７Ｅは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＰＡＲＰ切断アッセイの結果を示す。化合物１＝Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。化合物２＝Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。化合物３＝Ｃｂｚ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。化合物４＝Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。化合物５＝ＢＯＣ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。化合物６＝Ｃｂｚ−Ａｓｐ−α−（［２，６−ジクロロベンソイルオキシ］メチルケトン）。化合物７＝Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＣＨ2Ｆ。
【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、ＰＡＲＰ切断の写真を示しており、これは、抗Ｆａｓ処理されたＪｕｒｋｅｔ細胞における、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋおよびＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＰＡＲＰ切断の阻害を示す。
【図９】 図９は、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋ濃度に対する細胞生存のグラフを示し、これはＺ−ＶＤ−ｆｍｋによるＴＮＦ−α−誘導化細胞死の阻害を示す。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡラダーリングの写真を示しており、これは抗Ｆａｓ処理されたＪｕｒｋｅｔ細胞における、Ｚ−ＶＤ−ｆｍｋによるＤＮＡラダーリングの阻害を示す。
【図１１】 図１１Ａおよび１１Ｂは、ラット一過性局所虚血モデルにおける全身的に投与されたＣｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆの神経保護効果を示す。皮膚の梗塞の容量は、一過性局所虚血の２．２５時間後、および再還流の２２時間後に定量された。[0001]
(Background of the Invention)
(Field of Invention)
The present invention is in the field of medicinal chemistry. In particular, the present invention relates to dipeptides that are potent inhibitors of apoptosis. The invention also relates to the use of these dipeptides to reduce or treat apoptotic cell death.
[0002]
(Description of background technology)
Organisms eliminate unwanted cells through processes known variously as regulated cell death, programmed cell death or apoptosis. Such cell death occurs as a normal aspect of animal development and in tissue homeostasis and aging (Glucksmann, A., Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc. 26: 59-86 (1951); Glucksmann, A., Archives de Biology 76: 419-437 (1965); Ellis et al., Dev. 112: 591-603 (1991); Vaux et al., Cell 76: 777-779 (1994)). Apoptosis regulates cell number, promotes morphogenesis, removes harmful or other abnormal cells, and eliminates cells that have already performed its function. Furthermore, apoptosis results in a response to various physiological stresses such as hypoxia or ischemia (PCT published application WO96 / 20721).
[0003]
There are many morphological changes shared by cells that have undergone controlled cell death, including plasma and nuclear membrane blebbing, cytoreduction (nucleocytoplasmic and cytoplasmic coagulation), organelle rearrangement and filling , Including chromatin coagulation as well as the production of apoptotic bodies (membrane-enclosed particles containing intracellular substances) (Orrenius, S., J. Internal Medicine 237: 529-536 (1995)).
[0004]
Apoptosis is achieved through the intrinsic mechanism of cell suicide (Wyllie, AH, Cell Death in Biology and Pathology, Ed. Bowen and Lockshin, Chapman and Hall (1981), pages 9-34). A cell activates its internally encoded suicide program as a result of either endogenous or exogenous signals. This suicide program is accomplished through the activation of a carefully regulated gene program (Wylie et al., Int. Rev. Cyt. 68: 251 (1980); Ellis et al., Ann Rev. Cell Bio. 7: 663 (1991)). ). Apoptotic cells and debris are normally recognized and removed by neighboring cells or macrophages prior to lysis. Because of this removal mechanism, inflammation is not induced despite the removal of a large number of cells (Orrenius, S., J. Internal Medicine 237: 529-536 (1995)).
[0005]
Mammalian interleukin-1β (IL-1β) plays an important role in a variety of pathological processes, including chronic and acute inflammation and autoimmune disease (Openheim JH et al., Immunology Today, 7, 45). -56 (1986)). IL-β is synthesized as a precursor polypeptide (pro-IL-1β) -related cell that cannot bind to the IL-1 receptor and is biologically inactive (Mosley et al., J. Biol. Chem. 262). : 2941-2944 (1987)). By inhibiting the conversion of the precursor IL-1β to mature IL-1β, the activity of interleukin-1 can be inhibited. Interleukin-1β convertase (ICE) is a protease responsible for the activity of interleukin-1β (IL-1β) (Thornberry, NA, et al., Nature 356: 768 (1992)); Yuan, J . Et al., Cell 75: 641 (1993)). ICE is a substrate-specific cysteine protease that cleaves inactive prointerleukin-1 to produce mature IL-1. The genes encoding ICE and CPP32 currently have at least 12 members: ICE, CPP32 / Yama / Apopain, mICE2, ICE4, ICH1, TX / ICH-2, MCH2, MCH3, MCH4, FLICE / MACH / MCH5, ICE- LAP6 and ICEre1It is a member of the mammalian ICE / Ced-3 gene family including III. The proteolytic activity of this cysteine protease family (its active site cysteine residues are essential for ICE-mediated apoptosis) shows importance in mediating cell death (Miura et al., Cell 75: 653-660 (1993)). ). This gene family is now named caspase (Alneinri, ES et al. Cell, 87: 171 (1996)).
[0006]
IL-1 is also a cytokine involved in mediating a wide range of biological responses, including inflammation, septic shock, wound healing, hematopoiesis and the growth of certain leukemias (Dinarello, CA Blood 77 : 1627-1652 (1991); diGiovine et al., Immunology Today 11:13 (1990)).
[0007]
A number of potent caspase inhibitors have been prepared based on the peptide substrate structure of caspases. However, in contrast to their efficacy in vitro, good efficacy in a whole cell model of apoptosis (IC50No inhibitors with <1 μM) have been reported (Thornbury, NA Chem. Biol. 5: R97-103 (1998)). Therefore, it shows efficacy in a whole cell model of apoptosis (IC50<1 μM), and the presence of an inhibitor of cell death that is active in animal models of apoptosis is required. Thus, these inhibitors can be used as therapeutic agents for the treatment of disease states where regulated cell death and IL-1 cytokine activity play a role.
[0008]
WO 93/05071 discloses ICE inhibitor peptides having the formula:
Z-Q2-Asp-Q1
Where Z is an N-terminal protecting group; Q2Is the array Q2-Asp is 0 to 4 amino acids so as to correspond to at least part of the sequence Ala-Tyr-Val-His-Asp;1Contains an electronegative leaving group. A typical dipeptide is Boc-His-Asp-CH2F, Boc-Tyr-Asp-CH2F, Boc-Phe-Asp-CH2F, Ac-His-Asp-CH2F, Ac-Tyr-Asp-CH2F, Ac-Phe-Asp-CH2F, Cbz-His-Asp-CH2F, Cbz-Tyr-Asp-CH2F and Cbz-Phe-Asp-CH2F.
[0009]
WO 96/03982 disclosed aspartic acid analogs as ICE inhibitors having the following formula:
[0010]
[Chemical Formula 3]
Where R2Is H or alkyl; RThreeIs a leaving group such as halogen; R1Is heteroaryl-CO or one amino acid residue.
[0011]
US Pat. No. 5,585,357 disclosed peptide ketones as ICE inhibitors having the following formula:
[0012]
[Formula 4]
Where n is 0-2: each AA is independently L-valine or L-alanine; R1Is selected from the group consisting of N-benzyloxycarbonyl and other groups; R8, R9, RTenAre each independently hydrogen, a lower alkyl group and other groups.
[0013]
Revesz et al. (Tetrahedron Lett. 35, 9963-9696, 1994) reported the preparation of the following ethyl ester tripeptides as prodrugs of the corresponding acids that are potent ICE inhibitors:
[0014]
[Chemical formula 5]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to the following dipeptides of formula I:
[0015]
[Chemical 6]
Where R1Is an N-terminal protecting group; AA is any natural α-amino acid or β-amino acid residue; R2Is H or CH2RFourWhere RFourIs an electronegative leaving group and RThreeIs alkyl or H, except that AA is not His, Tyr, Pro, or Phe.
[0016]
The present invention is a surprisingly potent inhibitor of apoptosis in cell-based systems, although the dipeptide-based caspase inhibitors represented by Formula I are less potent in enzyme assays than tripeptides and tetrapeptides in this enzyme. Regarding the knowledge that there is. These compounds are systemically active in vivo and are potent inhibitors of anti-Fas-induced lethality in a mouse liver apoptosis model and have a robust neuroprotective effect in a rat model of ischemic stroke.
[0017]
The invention also relates to the use of the dipeptides of the invention for reducing, preventing or treating diseases in which apoptotic cell death is either a causative factor or consequence. Examples of uses for the present invention include: protection of the nervous system after focal ischemia and global ischemia; Alzheimer's disease, Huntington's disease, prion disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, muscle Treatment of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis, ataxia, telangiectasia, and spinal medulla atrophy; treatment of heart diseases including myocardial infarction, congestive heart failure, and cardiomyopathy; treatment of retinal disorders; Treatment of autoimmune diseases including lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, type I diabetes, Sjogren's syndrome, and glomerulonephritis; treatment of polycystic kidney disease and anemia / erythropoiesis; treatment of immune system disorders including AIDS and SCIDS; Reduction or prevention of cell, tissue and organ damage during transplantation; reduction or prevention of cell line death in industrial biotechnology; alopecia (hair Reduction or prevention of the hair disappears); and alleviation of premature death of skin cells.
[0018]
The present invention provides a pharmaceutical composition comprising an amount of a compound of formula I effective to reduce apoptotic cell death in an animal.
[0019]
The present invention also provides a preservation solution or preservation solution for mammalian organs or tissues, or a growth medium for mammalian or yeast cells, wherein an effective amount of a compound of formula I is the above described organ, In order to reduce apoptotic cell death in tissues or cells, it is included in the above solution or medium.
[0020]
(Detailed description of the invention)
The inhibitor of apoptotic cell death of the present invention has the following general formula I:
[0021]
[Chemical 7]
Or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, wherein:
R1Is an N-terminal protecting group including t-butyloxycarbonyl, acetyl, and benzyloxycarbonyl; AA is any natural α-amino acid or β-amino acid residue (eg, Gly, Thr, Glu, Lys, Arg, Ser, Asn, Gln, Val, Ala, Leu, Ile, Met), and β-Ala, such as β-Ala, and not His, Tyr, Pro or Phe; R2Is H or CH2RFourAnd RFourAre electronegative leaving groups such as F, Cl, TsO-, MeO-, ArO-, ArCOO, ArN-, and Ars-; and RThreeIs alkyl or H.
[0022]
RThreeWith regard to, preferred alkyl groups are C1-6An alkyl group (for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, an isobutyl group, a pentyl group and a hexyl group);
[0023]
The present invention is a surprisingly potent inhibitor of apoptosis in cell-based systems, although the dipeptide-based caspase inhibitors represented by Formula I are less potent in enzyme assays than tripeptides and tetrapeptides in this enzyme. Regarding the knowledge that there is. These compounds are systemically active in vivo and are potent inhibitors of anti-Fas-induced lethality in a mouse liver apoptosis model and have a robust neuroprotective effect in a rat model of ischemic stroke. These inhibitors delay or block cell death in a variety of clinical conditions and industrial applications, where deletion of cells, tissues, or whole organs occurs. Therefore, the present invention also relates to a method for treating, preventing or alleviating a condition in which apoptosis plays a role. These conditions are described more fully below.
[0024]
The method includes administering to an animal in need of such treatment an inhibitor of the invention or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof in an amount effective to inhibit apoptotic cell death. .
[0025]
Preferred embodiments of compounds that can be used as inhibitors of apoptosis are those of formula II:
[0026]
[Chemical 8]
Or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, wherein AA, R1And RThreeIs similar to that previously defined for Formula I.
[0027]
Preferred R1Are t-butyloxycarbonyl, acetyl and benzyloxycarbonyl. Preferred RThreeIs H, Me, Et or t-Bu. Preferred AA are β amino acids such as Val, Ala, Leu, Ile, Met and β-Ala.
[0028]
Exemplary preferred inhibitors of apoptosis having Formula I include, but are not limited to:
[0029]
[Expression 1]
.
[0030]
Certain compounds of the present invention may exist as stereoisomers including optical isomers. The present invention includes all stereoisomers, and racemic mixtures of such stereoisomers, as well as the individual enantiomers that can be separated according to methods well known to those skilled in the art.
[0031]
Examples of pharmaceutically acceptable addition salts include inorganic and organic acid addition salts such as: hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate, citrate, lactate, tartrate, Maleate, fumarate, mandelate and oxalate.
[0032]
Examples of prodrugs include compounds of Formulas I-II where RThreeIs an alkyl group or CH2OCHThreeA substituted alkyl group such as Further, when AA contains a carboxylic acid group, Formulas I-II (where RThreeExamples of prodrugs are those wherein either or both of the carboxyl groups are esterified (eg, C1-6Alcohol) or the corresponding amide form (eg C1-6And amines).
[0033]
The invention also relates to a method for treating a disorder responsive to inhibition of apoptosis in an animal suffering from the disorder. A particularly preferred embodiment of the compound for use in the method of the invention is shown by formula II as defined above.
[0034]
The compounds of the present invention can be prepared using methods known to those skilled in the art. Specifically, compounds having Formulas I-II can be prepared as illustrated by the exemplary reaction in Scheme I. Intermediate 1 was prepared according to Revezz et al. (Tetrahedron Lett. 35, 9963-9696, 1994). Coupling of 1 with an N-protected amino acid (eg, Z-Val-OH) yields amide 2, which is oxidized by the Dress-Martin reagent according to Revezz et al. (Tetrahedron Lett. 35, 9963-9696, 1994). Yields 3. Acid-catalyzed cleavage of this ester yielded the free acid 4, which was converted to ester 5.
[0035]
[Chemical 9]
An important aspect of the present invention is the discovery that compounds having Formulas I-II are potent inhibitors of apoptosis. Therefore, these inhibitors are expected to delay or block cell death in various clinical conditions that result in deletion of cells, tissues, or whole organs.
[0036]
The cell death inhibitors of the present invention can be found in the nervous system (brain, spinal cord) under various conditions of ischemia and excitotoxicity, including but not limited to focal ischemia resulting from stroke and global ischemia resulting from cardiac arrest. Can be used to reduce or prevent cell death in the peripheral nervous system). One particular use is to treat the effects of hypoxia, which can occur during the birth of an infant in high-risk labor. Cell death inhibitors also reduce or prevent cell death in the nervous system due to traumatic injury (eg, head trauma), viral infection or radiation-induced neuronal cell death (eg, as a side effect of cancer radiotherapy). Can be used for. Cell death inhibitors also cause cell death in a range of neurodegenerative disorders including but not limited to Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, and spinal medullary atrophy. Can be used to reduce or prevent. The in vivo neuroprotective properties of the cell death inhibitors of the present invention can be tested in a rat transient focal ischemia model (Xue et al., Stroke 21: 166 (1990)).
[0037]
The cell death inhibitors of the present invention can be used to prevent cell death in any condition that potentially results in myocardial death. This includes myocardial infarction, congestive heart failure and cardiomyopathy. One particular application is to reduce or prevent cardiomyocyte death, which results in a specific viral infection of the heart.
[0038]
The in vivo activity of the cell death inhibitors of the present invention can be tested using the “mouse liver apoptosis” model described by Rodriguez et al. (Rodriguez et al., J. Exp. Med., 184: 2067-2072 (1996)). In this model, mice are treated intravenously (IV) with anti-Fas antibody, which induces massive apoptosis in the liver and other organs, leading to systemic organ failure and death. This model is useful for indirectly testing the systemic bioavailability of the cell death inhibitors of the present invention, as well as their in vivo anti-apoptotic properties.
[0039]
Cell death inhibitors of the present invention prevent retinal nerve cell death or retinal disorders associated with the aging process (eg age-related macular degeneration) that can result in disorders that increase intraocular pressure (eg glaucoma). Can be used for. This inhibitor can also be used to treat retinal genetic degenerative disorders such as retinitis pigmentosa.
[0040]
The cell death inhibitors of the present invention can also be used to reduce or prevent premature death of cells of the immune system, particularly immunodeficiency disorders (eg acquired immune deficiency syndrome (AIDS), severe combined immunodeficiency) Syndrome (SCIDS) and related diseases). Cell death inhibitors can also be used to treat radiation-induced immunosuppression.
[0041]
Human organ and tissue transplantation is a common treatment of organ failure. However, during the transplantation process, the donor organ or tissue is at risk for cell death. This is because it deprives its normal blood supply before being transplanted into the host. This ischemic condition can be treated with a cell death inhibitor by infusion into a donor organ or tissue or by direct addition of a cell death inhibitor to the organ / tissue preservation medium. Cell death inhibitors can also induce cell death in the donor organ / tissue after transplantation to protect the donor organ / tissue from the effects of host immune cells that kill their targets by inducing apoptosis. Can be used to reduce or prevent. The cytoprotective effects of cell death inhibitors can also be used to prevent the death of human or animal sperm or eggs used in in vitro fertilization procedures. These inhibitors can be used during the harvesting process and can be included in the storage medium.
[0042]
Mammalian cell lines and yeast cells are commonly used to produce large quantities of recombinant proteins (eg, antibodies, enzymes or hormones) for industrial or medical use. The lifetime of some of these cell lines is limited due to growth conditions, the nature of the expressed recombinant molecule (some are toxic) and other unknown factors. The lifetime of industrial cell lines can be extended by including these cell death inhibitors in the growth medium in the range of 10-200 mM.
[0043]
The factors that govern hair growth and loss are largely unknown. However, there is some evidence that hair follicle regression (referred to as the regression phase) can be due, at least in part, to apoptosis. Thus, using the cell death inhibitors of the present invention, including, but not limited to, male baldness, radiation-induced or chemotherapy-induced hair loss, as well as hair loss due to emotional stress It is contemplated that hair loss caused by a variety of non-limiting situations can be treated. There is also evidence that apoptosis can play a role in hair loss. Accordingly, it is contemplated that the cell death inhibitors of the present invention can also be used in treating or preventing cases of premature hair whitening.
[0044]
Skin epithelial cell death can occur after exposure to high levels of irradiation, heat, or chemicals. It is contemplated that the cell death inhibitors of the present invention can be used to treat, reduce, or prevent this type of skin injury. In certain applications, the cell death inhibitor can be applied in an ointment to treat excessive exposure to sudden sunlight and to prevent blistering and skin stripping of the skin.
[0045]
Goldberg et al. (Nature Genetics 13: 442-449 (1996)) recently found that huntingtin, a protein product of the Huntington's disease (HD) gene, can be cleaved by CPP32 but not by ICE. Reported. The mutation underlying HD is an extension of the CAG trinucleotide at the 5 'end of the HD gene. Trinucleotide expansion beyond 36 repeats is associated with clinical development of HD. CAG expansion promotes the cleavage of huntingtin by CPP32 and thus is linked to the role of CPP32 in apoptotic cell death in HD. The compounds of the invention with CPP32 activity inhibition are useful in blocking CPP32-induced apoptotic cell death and are therefore myotonic dystrophy, fragile X mental retardation, spinal medullary atrophy, spinocerebellar ataxia type I and It is useful in preventing and treating HD and other diseases characterized by extended trinucleotide repeats, such as Dentato-Rubro pallidal atrophy.
[0046]
Compositions within the scope of the present invention include all compositions in which a compound of the present invention is included in an amount that is effective to achieve its intended purpose. While individual requirements vary, the determination of the optimal range of effective amounts of each component involves techniques in the art. Typically, these compounds are administered to mammals, such as humans, in the body weight of mammals being treated for apoptosis-mediated disorders such as neuronal cell death, heart disease, retinal disorders, polycystic kidney disease, and immune system disorders. Can be orally administered at a dose of 0.0025-50 mg / kg per day or an equivalent amount of a pharmaceutically acceptable salt thereof. Preferably, about 0.01 to about 10 mg / kg is orally administered to treat or prevent such disorders. For intramuscular injection, this dose is typically half the oral dose. For example, for the treatment or prevention of neuronal cell death, a suitable intramuscular dose is about 0.0025 to about 15 mg / kg, most preferably about 0.01 to about 10 mg / kg.
[0047]
A unit oral dose may contain from about 0.01 to about 50 mg, preferably from about 0.1 to about 10 mg of the compound. The unit dose is administered one or more times daily as one or more tablets each containing about 0.1 to about 10, conveniently about 0.25 to 50 mg of the compound or its solvate. Can be done.
[0048]
In addition to administering compounds such as unpurified chemicals, the compounds of the invention include excipients and adjuvants that facilitate the processing of the compounds into pharmaceutically usable formulations. It can be administered as part of a pharmaceutical formulation containing a suitable pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, this formulation, in particular its formulation that can be administered orally, and its formulation that can be used in preferred types of administration such as tablets, dragees and capsules, and also a formulation that can be administered rectally such as suppositories, and Solutions suitable for injection or oral administration contain from about 0.01 to 99%, preferably from about 0.25 to 75%, of the active compound with excipients.
[0049]
Also included within the scope of the invention are non-toxic pharmaceutically acceptable salts of the compounds of this invention. Acid addition salts include solutions of pharmaceutically acceptable non-toxic acids such as hydrochloric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, acetic acid, citric acid, tartaric acid, carbonic acid, phosphoric acid, and oxalic acid, and the like. Formed by mixing solutions of certain cell death inhibitors of the invention. A basic salt mixes a solution of a pharmaceutically acceptable non-toxic base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, choline hydroxide, sodium carbonate and the like with a solution of a particular cell death inhibitor of the present invention. Is formed.
[0050]
The pharmaceutical compositions of the invention can be administered to any animal that can experience the beneficial effects of the compounds of the invention. The first such animal is a mammal, such as a human, but the present invention is not intended to be so limited.
[0051]
A pharmaceutical composition of the invention may be administered by any means that achieves its intended purpose. For example, administration can be by parenteral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, buccal, intrathecal, or intracranial routes. Alternatively or simultaneously, administration can be by the oral route. The dosage to be administered depends on the age, health, and weight of the recipient, the type of concomitant therapy, if any, the frequency of treatment, and the nature of the desired effect.
[0052]
The pharmaceutical preparations according to the invention are manufactured in a manner known per se, for example by conventional mixing, granulating, dragee making, dissolving or lyophilizing processes. Accordingly, pharmaceutical formulations for oral use can be combined with solid excipients after addition of suitable adjuvants, if desired or necessary, to obtain tablets or dragee cores, If necessary, it can be obtained by grinding the resulting mixture and processing the mixture of granules.
[0053]
Suitable excipients are in particular fillers (eg saccharides (eg lactose or sucrose), mannitol or sorbitol, cellulose preparations and / or calcium phosphates (eg tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate)), and binders (For example, starch paste using corn starch, wheat starch, rice starch, potato starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone). If desired, disintegrants such as those described above, and also carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, or alginic acid or a salt thereof such as sodium alginate may be added. Adjuvants are in particular flow control agents and lubricants (eg silica, talc, stearic acid or magnesium stearate or salts thereof such as calcium stearate, and / or polyethylene glycol). The dragee core is provided with a suitable coating that is resistant to gastric juice, if desired. For this purpose, concentrated saccharide solutions are used, which can optionally include gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions, and suitable organic solvents or solvent mixtures. In order to produce a coating that is resistant to gastric juice, a solution of a suitable cellulose formulation (eg acetylcellulose phthalate or hydroxypropylmethylcellulose phthalate) is used. Dyestuffs or dyes may be added to the tablets or dragee coatings, for example for identification or to characterize combinations of active compound doses.
[0054]
Other pharmaceutical formulations that can be used orally include push-fit capsules made from gelatin, as well as soft seal capsules made from gelatin, and plasticizers such as glycerol or sorbitol. The push-fit capsules are in the form of granules that can be mixed with fillers such as lactose, binders such as starch, and / or lubricants such as talc or magnesium stearate, and optionally stabilizers. Compounds can be included. In soft capsules, the active compounds are preferably dissolved or suspended in suitable liquids, such as fatty oils or liquid paraffin. In addition, stabilizers can be added.
[0055]
Possible pharmaceutical preparations which can be used rectally include, for example, suppositories which consist of a combination of one or more active compounds with a suppository base. Suitable suppository bases are, for example, natural or synthetic triglycerides or paraffin hydrocarbons. It is also possible to use gelatin rectal capsules consisting of this active compound in combination with a base. Possible base materials are, for example, liquid triglycerides, polyethylene glycols, or paraffin hydrocarbons.
[0056]
Suitable formulations for parenteral administration include aqueous solutions of the active compounds in water-soluble form (eg, water-soluble salts and alkaline solutions). A buffer such as Tris may be present. In addition, suspensions of the active compounds as appropriate oily injection suspensions can be administered. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils (eg, sesame oil) or synthetic fatty acid esters (eg, ethyl oleate) or triglycerides or polyethylene glycol-400 (the compound is soluble in PEG-400) . Aqueous injection suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension, including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, and / or dextran. Optionally, this suspension may also contain stabilizers.
[0057]
In accordance with one aspect of the present invention, the compounds of the present invention are used in topical and parenteral formulations and are produced by exposure to high levels of radiation (including ultraviolet radiation) heat, or chemicals. Can be used to treat damage.
[0058]
One or more additional substances having a therapeutic effect on the skin can also be incorporated into the composition. Thus, the composition can also include one or more compounds that can increase cyclic AMP levels in the skin. Suitable compounds include adenosine or nucleic acid hydrolyzate in an amount of about 0.1 to 1%, and papaverine in an amount of about 0.5 to 5% (both in weight percent based on the weight of the composition). ). Also suitable are β-adrenergic agonists such as isoproterenol in an amount of about 0.1-2%, or cyclic AMP in an amount of about 0.1-1% (both also by weight of the composition) % By weight). Other suitable types of additional active ingredients that can be incorporated into the compositions of the present invention are any compounds known to have beneficial effects on the skin. Such compounds include retinoids such as vitamin A in an amount of about 0.003 to 0.3% by weight, and chromanols such as vitamin E or derivatives thereof in an amount of about 0.1 to 10% by weight. (Both based on the weight of the composition). In addition, anti-inflammatory and keratinizing agents can be incorporated into cosmetic compositions. Exemplary anti-inflammatory agents include corticosteroids such as hydrocortisone or acetate thereof in an amount of about 0.25-5% by weight, or dexamethasone in an amount of about 0.025-0.5% by weight. Corticosteroid (both based on the weight of the composition). Exemplary keratinizing agents are about 0.1-20% coal tar, or about 0.05-2% by weight anthralin (both based on the weight of the composition).
[0059]
Exemplary compositions of the present invention are preferably formulated as an oil, cream, lotion, ointment, etc. by selection of a suitable carrier. Suitable carriers include vegetable or mineral oil, white mineral oil (white soft paraffin), branched chain fat or oil, animal fat, and high molecular weight alcohol (C12Included). Preferred carriers are those in which the active ingredient is soluble in it. Emulsifiers, stabilizers, wetting agents, and antioxidants are also included as well as agents that impart color or fragrance, if desired. In addition, transdermal penetration enhancers can be used in these topical formulations. Examples of such enhancers can be found in US Pat. Nos. 3,989,816 and 4,444,762.
[0060]
The cream is preferably formulated from a mixture of mineral oil, self-emulsifying beeswax, and a mixture of water, with water mixed with a mixture of active ingredients dissolved in a small amount of oil such as almond oil. A typical example of such a cream is a cream comprising about 40 parts water, about 20 parts beeswax, about 40 parts mineral oil, and about 1 part almond oil.
[0061]
Ointments can be formulated by mixing a solution of the active ingredient in a vegetable oil such as almond oil with warm soft paraffin and allowing the mixture to cool. A typical example of such an ointment is an ointment comprising about 30% by weight almond oil and about 70% by weight soft paraffin.
[0062]
Lotions may be conveniently prepared by dissolving the active ingredient in a suitable high molecular weight alcohol such as propylene glycol or polyethylene glycol.
[0063]
In addition, these compositions can include other medications, growth factors, wound sealants, carriers, etc. that are known or apparent to those of skill in the art. The composition of the invention is administered to a warm-blooded animal such as a human who has already suffered skin damage such as a burn in an amount sufficient to allow the healing process to proceed more rapidly than if the host is not treated. The effective amount for this use depends on the severity of the skin injury and the general health of the patient being treated. Maintenance dosage over an extended period of time can be adjusted as needed. For veterinary use higher levels may be administered as needed.
[0064]
In the case of animals with reduced hair growth, the composition of the invention is administered in an amount sufficient to increase the hair growth rate. The effective amount for this use depends on the degree of reduction in hair growth and the general health of the patient being treated. Maintenance dosage over an extended period of time can be adjusted as needed. For veterinary use, higher levels can be administered as needed.
[0065]
The following examples are illustrative of the methods and compositions of the present invention and are not limiting. Other suitable modifications and adaptations of the various situations and parameters normally encountered in clinical therapy and that are apparent to those skilled in the art are within the spirit and scope of the invention.
[0066]
Example 1: t-butyl 5-fluoro-4-hydroxy-3-nitropentanoate
Dry CH2Cl2A solution of oxalic acid (1.9 mL, 21.8 mmol) in (100 mL) was cooled to −78 ° C. and dried CH2Cl2A solution of DMSO (3.0 mL, 42.3 mmol) in (10 mL) was added with stirring at a rate such that the temperature was maintained at −50 to −60 ° C. After stirring for 5 minutes, dry CH2Cl2A solution of 2 fluoroethanol (1.2 mL, 18.4 mmol) in (10 mL) was added and stirring was continued for an additional 15 minutes, then dry EtThreeN (13.5 mL) was added. The reaction mixture was stirred for 15 minutes and then warmed to room temperature. To this reaction mixture, CH2Cl2A solution of t-butyl 3-nitropropionate (2.87 g, 16.38 mmol) in (20 mL) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours and then poured into water (100 mL). The organic layer is separated and the aquarium is CH2Cl2Extracted with (2 × 50 mL). This CH2Cl2The solution was washed with brine, dried and evaporated. The residue was purified by chromatography twice on silica gel (hexane-EtOAc, 7: 3) to give 950 mg (24.5%) of the title product as a colorless sticky oil.11 H NMR (CDClThree), 1.450 (s, 9H), 2.80-2.90 (m, 2H), 3.12-3.20 (m, 1H), 4.41-4.59 (m, 2H), 4.57 to 4.59 (m, 1H), 4.95 to 5.01 (m, 1H).
[0067]
Example 2: t-butyl 3-amino-5-fluoro-4-hydroxy-pentanoate
To a solution of t-butyl 5-fluoro-4-hydroxy-3-nitropentanoate (950 mg, 4.0 mmol) in MeOH (20 mL) was added Raney nickel (ca. 200 mg). The mixture is left at room temperature for 18 hours with H2Shake under (30-35 psi). It was filtered and the catalyst was washed with MeOH (2 × 10 mL). The MeOH solution was then evaporated and the residue was purified by chromatography on silica gel (EtOAc-MeOH, 10: 1) to give 840 mg (96%) of the title compound as a yellowish viscous oil.11 H NMR (CDClThree), 1.450 (s, 9H), 2.12 (bs, 3H, OH and NH)2), 2.28 to 2.38 (m, 1H), 2.47 to 2.57 (m, 1H), 3.24 to 3.30 (m, 1H), 3.54 to 3.76 (m) 1H), 4.38 to 4.48 (m, 1H), 4.54 to 4.61 (m, 1H).
[0068]
Example 3: t-Butyl 3- (Cbz-Val-amido) -5-fluoro-4-hydroxy-pentanoate
To a solution of Cbz-Valine (396 mg, 1.58 mmol) in THF (20 mL) was added EDCl (300 mg, 1.57 mmol), HOBT (240 mg, 1.57 mmol), and DMAP (129 mg, 1.06 mmol). . The resulting mixture was stirred for 5 minutes, then a solution of t-butyl 3-amino-5-fluoro-4-hydroxy-pentanoate (215 mg, 1.04 mmol) in THF (10 mL) was added and stirred at room temperature for 18 hours. did. The mixture was filtered, the THF solution was evaporated and the residue was purified by chromatography on silica gel (hexane-EtOAc, 3: 2) to give 290 mg (68%) of the title compound as a white solid. .11 H NMR (CDClThree), 0.905 (d, 3H, J = 7), 0.965 (d, 3H, J = 7), 1.428 (s, 9H), 2.07 to 2.16 (m, 1H), 2.50 to 2.57 (m, 1H), 2.64 to 2.70 (m, 1H), 3.52 (bs, 1H, OH), 3.92 to 3.96 (m, 2H), 4.20-4.27 (m, 1H), 4.40 (bs, 1H), 4.49 (bs, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.31-5.4 (m, 1H, NH), 6.86 to 6.93 (m, 1H, NH), 7.350 (s, 5H).
[0069]
(Example 4: Z-Val-Asp-fmk t-butyl ester)
CH2Cl2(20 mL) in periodinane (485 mg, 1.14 mmol) immunization with CH2Cl2A solution of t-butyl 3- (Cbz-Val-amido) -5-fluoro-4-hydroxy-pentanoate (230 mg, 0.52 mmol) in (12 mL) is added and the resulting white mixture is stirred at room temperature for 40 minutes. Then 1.26 g (8 mmol) Na2S2OThreeOf NaHCO3 containingThreeWas poured into a saturated aqueous solution of. The resulting mixture is stirred for 20 minutes and the resulting clear CH2Cl2The solution is separated and the aqueous layer is CH2Cl2Extracted with (2 × 25 mL). CH2Cl2The solution was washed with brine and evaporated, then the residue was purified by chromatography on silica gel (hexane-EtOAc, 3: 2) to give 190 mg (83%) of the title compound as a white solid.11 H NMR (CDClThree), 0.91 to 0.97 (m, 6H), 1.415 (s, 9H), 2.10 to 2.20 (m, 1H), 2.70 to 2.77 (m, 1H), 2.95 to 3.01 (m, 1H), 3.98 to 4.06 (m, 1H), 4.87 to 5.28 (m, 6H), 6.95 to 7.01 (m, 1H) ), 7.350 (s, 5H).
[0070]
(Example 5: Z-Val-Asp-fmk)
Dry CH2Cl2To a solution of Z-Val-Asp-fmk t-butyl ester (180 mg, 0.41 mmol) in (5 mL) FThreeCCO2H (1.0 mL) was added and stirred at room temperature for 40 minutes and then evaporated. The residue was purified by chromatography on silica gel (EtOAc-MeOH, 10: 1) to give 120 mg (76%) of the title compound as a white solid.11 H NMR (DMSO-d6), 0.81-0.84 (m, 6H), 1.87-1.96 (m, 1H), 2.47-2.67 (m, 2H), 3.77-3.87 (m) 1H), 4.47 to 4.59 (m, 1H), 4.91 to 5.16 (m, 4H), 7.25 to 7.42 (s, 5H), 8.40 to 8.49. (M, 1H).
[0071]
The following compounds were obtained using the same procedure as described in Examples 3-5:
(Example 6: Z-Leu-Asp-fmk)
White solid.
[0072]
[Expression 2]
(Example 7: Z-Ile-Asp-fmk)
White solid.
[0073]
[Equation 3]
(Example 8: Z-Ala-Asp-fmk)
White solid.
[0074]
[Expression 4]
(Example 9: Ac-Val-Asp-fmk)
White solid.
[0075]
[Equation 5]
(Example 10: ZN-Me-Val-Asp-fmk)
White solid.
[0076]
[Formula 6]
(Example 11: Z-Ala-Asp-fmk)
White solid.
[0077]
[Expression 7]
(Example 12: Z-Gly-Asp-fmk)
White solid.
[0078]
[Equation 8]
(Example 13: Z-Phe-Asp-fmk)
White solid.
[0079]
[Equation 9]
(Example 14: Z-Glu-Asp-fmk)
White solid.
[0080]
[Expression 10]
(Example 15: Z-Pro-Asp-fmk)
White solid.
[0081]
## EQU11 ##
(Example 16: Z-His-Asp-fmk)
White solid.
[0082]
[Expression 12]
(Example 17: Z-Tyr-Asp-fmk)
Z-Tyr (Bu-t) -Asp-fmk t-butyl ester was prepared as described in Examples 3 and 4 with Z-Tyr (Bu-t) -OH and t-butyl 3-amino-5-fluoro- Prepared from 4-hydroxypentanoic acid. To a solution of Z-Tyr (Bu-t) -Asp-fmk t-butyl ester (15 mg, 0.027 mmol) in methylene chloride (1 mL) was added TFA (1 mL). The mixture was stirred at room temperature for 8 hours and then at 4 ° C. for 2 days. It is diluted with ethyl acetate (30 mL) and washed with water (4 × 20 mL) and brine, Na2SOFourAnd concentrated under reduced pressure to give the title compound as a yellow solid (10 mg, 0.022 mmol, 83%).
[0083]
[Formula 13]
(Example 18: Z-Val-Asp-fmk methyl ester)
When measured by pH paper into a solution of Z-Val-Asp-fmk (110 mg, 0.28 mmol) in methanol (20 mL) cooled in an ice bath, the flow of hydrogen chloride gas was slowly reduced until the solution turned strongly acidic. I passed. The solution was stirred at room temperature for 4 hours and then evaporated. The residue was purified by chromatography on silica gel (hexane-ethyl acetate, 3: 2) to give 63 mg (55%) of the title compound as a white solid.
[0084]
[Expression 14]
The following compounds were obtained using the same procedure described in Example 18.
[0085]
(Example 19: Z-Leu-Asp-fmk methyl ester)
Colorless viscous oil.
[0086]
[Expression 15]
(Example 20: Z-Ile-Asp-fmk methyl ester)
White solid.
[0087]
[Expression 16]
(Example 21: Cell death assay using HeLa cells)
Cbz-Val-Asp (OMe) CH2The cytoprotective properties of F were tested using HeLa cells challenged with tumor necrosis factor-α (TNF-α) and cycloheximide (CHX). This is a well-characterized cell culture model of apoptosis, which is commonly used to analyze anti-apoptotic agents. Two types of experiments were performed: quantitative assessment of cell death by visualizing cells using a phase contrast microscope; and quantitative assessment of cell death using the fluorescent dye calcein AM.
[0088]
For photomicrographs, HeLa cells are seeded in a 12-well multi-dish at a density of 100,000 cells per well in minimal essential medium containing 2 mM glutamine and 10% fetal calf serum. After 24 hours, the plate medium is removed and fresh medium containing various concentrations of cytoprotective test compound is added. This cell is CO2Preincubate with test compound at 37 ° C. for 2 hours in incubator, then add TNF-α and CHX at final concentrations of 25 ng / mL and 30 μg / mL, respectively. After 24 hours of incubation, the cells are visually inspected for evidence of cell death based on cell shape and degree of adhesion. A cell is considered dead if it gathers together and becomes a bright phase and detaches from the substrate. Cells are considered viable if they retain their normal morphology and remain attached to the substrate.
[0089]
For quantitative assays, the degree of cell survival in the presence of a test compound is quantitatively analyzed using the indicator dye calcein AM. This dye is lysed and converted to a fluorescent derivative by viable cells; the amount of activated dye in each well can then be assayed with a fluorometric plate reader and the degree of fluorescence is used as a measure of the number of viable cells . For these assays, HeLa cells are seeded in 48-well plates at a density of 25,000 cells per well in 0.4 mL minimal essential medium containing 2 mM glutamine and 10% fetal calf serum. After 24 hours, the plate medium is removed and 0.5 mL of fresh medium containing test compounds at various concentrations is added. This cell is CO2Preincubate with test compound at 37 ° C. for 2 hours in incubator, then add TNF-α and CHX at final concentrations of 25 ng / mL and 30 μg / mL, respectively. After the 24 hour incubation period, the culture was washed twice with serum-free, phenol red-free Ham's F12 to remove dead cells and 125 μL Ham's containing 8 μM calcein AM. Add F12. The culture is incubated for 1 hour at room temperature and the fluorescence signal is measured on a BioTek plate reader using 485 nm (excitation) and 530 nm (emission) filter settings. This data is expressed as “percent control”, which is calculated by the following formula:
[0090]
[Expression 17]
The use of a CHX-treated culture as a control rather than an untreated culture makes it possible to correct for the cytostatic effect of CHX. However, since CHX alone is also a mild inducer of apoptosis in HeLa cells, strong anti-apoptotic agents show percent control values greater than 100%.
[0091]
Results from representative qualitative assays are shown in FIGS. 1A-1G, 2A-2G and 3A-3G. In these experiments, Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2The cytoprotective ability of F to BOC-Asp (OMe) -CH2F, Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F and Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2Compare the cytoprotective capacity of F at three different concentrations: 0.5, 5 and 50 μM. All these compounds are the methyl ester derivatives. 1A-1G shows Cbz-Val-Asp (OMe) -CH at a concentration of 50 μM.2F (FIG. 1D) shows complete protection of HeLa cells from the apoptotic effects of TNF-α and CHX. At 50 μM the related peptide BOC-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 1C) and Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 1E) is also protective. CPP32 inhibitor, Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 1F) is only slightly effective as a cytoprotective agent at 50 μM. 2A-2G show Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 2D) shows surprisingly still strong cytoprotective effect at a concentration of 5 μM, while 5 μM BOC-Asp (OMe) —CH2F (FIG. 2C) and 5 μM Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 2E) is not very effective. CPP32 inhibitor, Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (FIG. 2F) has no cytoprotective properties at 5 μM. 3A-3G show Cbz-Val-Asp (OMe) -CH even at 0.5 μM.2F (FIG. 3D) is still an effective cytoprotective agent, while the other compounds (FIGS. 3C, 3E and 3F) show little or no cytoprotection. These experiments show that Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2FIG. 5 shows that F can protect HeLa cells from TNF-α / CHX-induced apoptosis at concentrations 10-100 times lower than other putative anti-apoptotic agents.
[0092]
As mentioned above, quantitative experiments using calcein AM confirm the results obtained by microscopy. 4 and 5 show Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2The cytoprotective properties of F (a) are expressed as BOC-Asp (OMe) -CH2F (b) (FIG. 5) and Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2The results of two such experiments comparing F (c) (FIG. 4) with three concentrations (0.5, 5 and 50 μM) are shown. FIG. 4 shows Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2We show that F (b) is only minimally effective in protecting HeLa cells from TNF-α / CHX, even at the highest concentration used (50 μM). FIG. 5 shows BOC-Asp (OMe) -CH2Although F (b) is an effective cytoprotective agent at 50 and 5 μM, it shows that its activity decreases dramatically at 0.5 μM. In contrast, Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (a) is Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2Just as F (b) is an effective cytoprotective agent at 50 μM, it is an effective protective agent at 0.5 μM (FIG. 4). Furthermore, 0.5 μM Cbz-Val-Asp (OMe) —CH2F (a) is more active while 0.5 μM BOC-Asp (OMe) -CH2F (b) is inactive (FIG. 5).
[0093]
Cbz-Val-Asp (OMe) -CH at low dose2To determine the effect of F, HeLa cells were treated in a concentration range of 0.05 μM to 1 μM. As shown in FIG. 6, Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (a) showed significant cytoprotection at concentrations as low as 0.25 μM. In contrast, Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH, an anti-apoptotic agent widely used in cell death studies2F (b) does not show cytoprotection in this concentration range.
[0094]
Taken together, the experiment shown by FIGS. 1A-6 is Cbz-Val-Asp (OMe) —CH.2F surprisingly shows that it is a potent anti-apoptotic agent in intact cells and is more potent than any other known caspase inhibitor.
[0095]
Example 22: Inhibition of PARP cleavage in Jurkat cells
The cleavage of the enzyme poly (ADP) ribose polymerase (PARP) appears to occur in all cells in which the caspase proteolytic cascade has been activated. For this reason, PARP cleavage is widely used as a biochemical marker for caspase-mediated apoptosis. The ability to block PARP cleavage of cytoprotective drugs is thought to indicate the ability of the drug to inhibit the caspase proteolytic cascade, particularly CPP32 (caspase-3), a major PARP protease. Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2The ability of F to inhibit PARP cleavage is examined during Fas-mediated apoptosis of Jurkat cells, a human T cell line. This cell culture model of apoptosis is well characterized and is known to be involved in the activation of at least two caspases, caspase-3 (CPP32) and caspase-8 (FLICE / MACH).
[0096]
For the PARP cleavage assay, Jurket cells were seeded at a density of 500,000 cells per well in 6 well multi-dish in RPMI 1640 medium containing 10% FBS. This cell is CO2Cbz-Val-Asp (OMe) -CH at 37 ° C. for 2 hours in an incubator2Preincubated with F or other test compound, then monoclonal antibody against Fas was added at a final concentration of 500 ng / mL. CO2Incubation at 37 ° C. in the incubator was continued for another 4 hours. At the end of the incubation period, the cells were harvested by centrifugation and 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA and protease inhibitors. Dissolved in buffer containing the reaction mixture. The amount of lysate corresponding to 10-20 μg protein was loaded on a 7.5% SDS polyacrylamide gel and electrophoresed at 25 mA for 2-2.5 hours. The protein was then transferred to a PVDF membrane, probed against PARP with a rabbit polyclonal antibody, and visualized using chemiluminescence.
[0097]
Figures 7A-7E show the results of three such experiments. Jurkat cells were preincubated with 0.5, 5 or 50 μM of the following compound: Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (compound 1); BOC-Asp (OMe) -CH2F (compound 5); Cbz-Asp-α-([2,6-dichlorobenzoyloxy] -methylketone) (compound 6), Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (compound 3), Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (compound 2), Cbz-Ile-Glu (OMe) -Thr-Asp (OMe) -CH2F (compound 4), or Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F (compound 7). The cells were then treated with anti-Fas and treated with Western blot. Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (Compound 1) completely inhibits PARP cleavage at 50 and 5 μM and results in significant inhibition of cleavage even at 0.5 μM (FIG. 7A). In contrast, Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (compound 2) (FIG. 7A) and Cbz-Ile-Glu (OMe) -Thr-Asp (OMe) -CH2F (Compound 4) (FIG. 7B) and Cbz-Asp-DCB (Compound 6) (FIG. 7D) completely inhibited PARP cleavage at 50 μM, but are only slightly effective inhibitors at 5 μM and 0.5 μM. BOC-Asp (OMe) -CH2F (compound 5) (Figure 7D) and Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F (Compound 7) (FIG. 7E) and Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F (Compound 3) (FIG. 7B) is an effective inhibitor of PARP cleavage at concentrations of 50 and 5 μM, but Cbz-Val-Asp (OMe) —CH2At a concentration of 0.5 μM where F (Compound 1) still shows significant inhibition, it was only slightly effective (FIG. 7A). These experiments show that Cbz-Val-Asp (OMe) -CH24 shows that F can block the caspase proteolytic cascade in intact cells at a concentration at least 10-fold lower than other known caspase inhibitors.
[0098]
(Example 23: Enzyme activity)
Cbz-Val-Asp (OMe) -CH as an inhibitor of CPP32, ICE and cathepsin B2F and Cbz-Val-Asp-CH2The activity of F (free acid) was measured in a fluorescence colorimetric enzyme assay. Recombinant CPP32 and ICE proteins were prepared by expressing DNA clones encoding these enzymes in insect host cells (sf9 cells using baculovirus as a vector. Webb, NR et al., “Expression of See proteins using recombinant Baculovirus, Techniques 2; 173-188 (1990) .Native cathepsin preparations were obtained from commercial sources.Synthetic peptide substrates conjugated with fluorogenic leaving groups. The enzymatic cleavage of the synthetic substrate produced a fluorescent signal that was read on a spectrofluorometer or fluorometric microtiter plate reader.
[0099]
CPP32 activity was measured using the following buffer conditions: 100 mM HEPES pH 7.5 with 10% sucrose, 1% CHAPS, 5 mM glutathione and 5 μM peptide substrate. This peptide substrate consisted of an oligomer having the sequence Asp-Glu-Val-Asp with the fluorogenic compound aminomethylcoumarin conjugated at the C-terminus. This assay for enzyme activity was typically performed at 37 ° C. for 30 minutes.
[0100]
Table 1 shows Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F and Cbz-Val-Asp-CH2IC for F (free acid) CPP32 and other proteases50Is enumerated.
[0101]
(Table I: Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F and Cbz-Val-Asp-CH2Efficacy of F (free acid) as an inhibitor of CPP32 and other proteases)
[0102]
[Table 1]
The results shown in Table 1 indicate that the compounds of the invention are moderately potent inhibitors of CPP32 and ICE. Cbz-Val-Asp-CH2F indicates that it is a potent and selective inhibitor for CPP32 and ICE.
[0103]
Cbz-Val-Asp-CH in recombinant caspases 3, 6, 7 and 8 obtained from PharMington (Becton subsidiary, San Diego, CA)2F inhibitory activity was measured using Ac-DEVD-AMC. The amount of each enzyme per assay was as follows: 1 ng caspase 3.15 ng caspase 6, 2 ng caspase 7 and 60 ng caspase 8. The enzyme reaction is performed in 96 well plates using caspase buffer (20 mM PIPES, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1% CHAPS, and 10% sucrose, pH 7.2) and the reaction is performed at 10 μM. Start by adding Ac-DEVD-AMC (purchased from Quality Controlled Biochemicals, Inc. Hopkinton, MA). 12 concentrations of Cbz-Val-Asp-CH ranging from 30 pM to 10 μM2F was tested after incubation of the recombinant caspase with the compound for 30 minutes at 37 ° C. The plate was read using a fluorescence plate reader (EG & G WALLAG, model 1420-002) using an excitation filter at 355 nm / emission filter at 460 nm. This data was analyzed using GraphPrism software. This data is summarized in Table II.
[0104]
Table II: Cbz-Val-Asp-CH as inhibitors of caspases2F efficacy)
[0105]
[Table 2]
The results shown in Table II are Cbz-Val-Asp-CH2Shows that F is a potent inhibitor of all caspases tested.
[0106]
Table III shows the caspase-3 activity of various dipeptide inhibitors. The result is Z-Val-Asp-CH.2Shows that F is the most potent caspase-3 inhibitor of the compounds tested.
[0107]
Table III: Dipeptide inhibitor caspase-3 assay
[0108]
[Table 3]
(Example 24: Effect of Z-VD-fmk on PARP cleavage)
Poly (ADP) ribose polymerase (PARP) is one of the first caspase-3 substrates identified, and cleavage of PARP is still a nearly universal marker for caspase-3 activation and caspase-mediated apoptosis It is considered to be. Therefore, the ability of an anti-apoptotic compound to block PARP cleavage is a useful indicator of its ability to inhibit apoptosis. The efficacy of Z-VD-fmk in the PARP cleavage assay was tested using anti-Fas treated Jurkat cells. 2 × 106Jurkat cells were seeded in each well of a 6-well dish and preincubated with test compound for 30 minutes. The cells were then challenged with 500 ng / mL agonist anti-Fas antibody or PBS for 4 hours. The cells were then harvested, gently pelleted, washed twice with PBS, and lysed in RIPA buffer. An aliquot of the lysate was analyzed by SDS-PAGE and the protein was transferred to a PVDF membrane for Western blotting. The primary antibody was a polyclonal anti-PARP serum that cross-reacts with both full-length PARP and caspase-3 production cleavage products.
[0109]
FIG. 8A shows that Z-VD-fmk completely inhibited PARP cleavage at concentrations of 500 and 250 nM (note the absence of the 85 kD band). Z-VD-fmk still retains most of its inhibitory activity even at a concentration of 50 nM (FIG. 8A). In contrast, Z-VAD-fmk is an effective inhibitor of PARP cleavage at 5 μM (data not shown) but was hardly effective at 500 nM (FIG. 8B). These experiments show that Z-VD-fmk is at least 10 times more potent as an inhibitor of PARP cleavage in intact cells than Z-VAD-fmk, and Z-VD-fmk is in this model of whole cell apoptosis. IC less than 50nM50Indicates that it has a value.
[0110]
(Example 25: Effect of Z-VD-fmk on TNF-α-induced cell death)
Tumor necrosis factor α (TNF-α) can induce apoptosis in a number of cell types by initiating a caspase cascade, and its apoptosis-inducing activity can be inhibited by peptide-based caspase inhibitors. However, high concentrations (more than 50 μM) of inhibitor are necessary for having a good anti-apoptotic effect. HeLa cells (a cell line commonly used in TNF-α cell death studies) were used here to determine the anti-apoptotic efficacy of Z-VD-fmk.
[0111]
HeLa cells were seeded in 48-well multi-dish at a density of 50,000 cells per well 24 hours prior to treatment. They were then preincubated with various concentrations of Z-VD-fmk for 2 hours and challenged with TNF-α (25 ng / mL) and cycloheximide (CHX; 30 μg / mL). The culture was further incubated for 24 hours and dead cells were removed by washing twice with PBS. Viable cell density was then measured by incubating each culture for 45 minutes with calcein AM (a prefluorescent dye that was taken up by viable cells and converted to a fluorescent product). Data obtained are% control values (control values are cells incubated with cycloheximide but without TNF-α).
[0112]
FIG. 9 shows the Z-VD-fmk results at test concentrations ranging from 0 to 500 nM. z-VD-fmk provided good cytoprotection at concentrations approaching 100 nM. In contrast, Z-VAD-fmk lacked most of its cytoprotective properties below 1 μM (data not shown). Tetrapeptide inhibitors (eg, Z-DEVD-fmk and Ac-DEVD-CHO) are not effective at all below 50 μM (data not shown). Thus, Z-VD-fmk not only inhibits PARP cleavage at submicromolar concentrations (see Example 24), but also inhibits cell death below micromolar concentrations, and known tripeptides and It is much more effective than tetrapeptide inhibitors.
[0113]
(Example 26: Effect of Z-VD-fmk on DNA ladder formation)
In the late stages of apoptosis, the cells literally begin to collapse as the cytoplasmic pieces leave (due to vesicle formation) and the nucleus breaks down. One feature of nuclear degradation is the cleavage of genomic DNA into nucleosome-sized fragments (referred to as “DNA ladder formation”). DNA ladder formation, like other late apoptotic events, is considered irreversible and therefore it is important to determine whether anti-apoptotic drugs can interfere with their development.
[0114]
The ability of Z-VD-fmk to block DNA ladder formation was tested using anti-Fas treated Jurkat cells. Jurkat cells in a 60 mm dish 5 × 106Plated at cell density and preincubated with various concentrations of Z-VD-fmk. They were then challenged with anti-Fas at 100 ng / mL for 4 hours, harvested and pelleted and washed twice with PBS. Genomic DNA was isolated using the method of Eldadah et al. (1996). Briefly, the cells were lysed in 2 mL of 7M guanidine HCl and mixed with 1 mL Wizard miniprep DNA purification resin (Promega). The resin / DNA complex was washed twice with buffer and the DNA was eluted in TE. 1-2 μg of this DNA sample was electrophoresed on a 1% agarose / TBE gel and the gel was stained with ethidium bromide.
[0115]
FIG. 10 shows the results of a DNA ladder formation assay in which the cells were preincubated with Z-VD-fmk or drug vehicle (DMSO). Vehicle treated cells challenged with anti-Fas showed a characteristic ladder formation pattern of DNA elongation down to about 300 bp. In contrast, Z-VD-fmk inhibits ladder formation at doses as low as 50 nM.
[0116]
This result indicates that Z-VD-fmk can block significant late apoptotic events (DNA ladder formation) at sub-molar concentrations comparable to its concentration that blocks cell death and PARP cleavage. Based on this experiment and the data described in Examples 24 and 25, we conclude that Z-VAD-fmk is a highly effective submicromolar apoptosis inhibitor in an apoptotic whole cell model.
[0117]
Example 27: Cbz-Val-Asp-CH in mouse liver apoptosis model2Anti-apoptotic activity of F)
Three to four week old female mice were used in this study. Liver degeneration was induced by intravenous injection of purified hamster anti-mouse Fas monoclonal antibody (clone Jo2, Pharmingen) against 2-6 μg mouse Fas anti-T diluted in 80 μl phosphate buffered saline (Rodriguez et al., 1996). Mortality was used as the end point to assess liver degeneration. Cbz-Val-Asp-CH2F was formulated in Tris buffer for intravenous injection and tested at a dose of 1-10 mg / kg given by intravenous injection via the tail vein. Ten minutes later, the animals were injected with Fas antibody. Mortality was counted at 30 minutes, 1 hour, 3 hours and 24 hours. For each compound, there was a control group that gave only Fas antibody. The group receiving the highest dose is observed for acute behavioral effects (eg sedation, gait, gait changes, convulsions, strail tail, tremor, etc.), then housed overnight and The day was checked for toxicity / mortality.
[0118]
In these experiments, Cbz-Val-Asp-CH2F was a surprisingly potent inhibitor of anti-Fas-induced lethality. A single 1 mg / kg intravenous dose was found to completely protect mice from anti-Fas up to 1 hour after antibody administration, and still give almost 100% protection at doses as low as 0.25 mg / kg. . In contrast, all mice died at this time in the vehicle control group. Cbz-Val-Asp-CH2F also showed substantial protection up to 24 hours (28% survival). Separate studies have shown that this protection against lethality was associated with expected attenuation in the induction of liver enzymes SPGT and SGOT.
[0119]
These data are Cbz-Val-Asp-CH2We demonstrate that F is very active in vivo after systemic administration in a mouse liver apoptosis model.
[0120]
Example 28: Cbz-Val-Asp-CH in a rat model of focal ischemia2F nerve protection)
(I) Pre-surgery: Male Fischer-344 rats (Harlan Sprague Drawley, CA) (weight 200-240 g) were used. The animals were first anesthetized with 3% halothane in a mixture of 30% oxygen and 70% air. Halothane levels were reduced to 1.5% for maintenance of anesthesia during surgery. Pre-surgery includes: (a) Venous catheter implantation: the left femoral vein was exposed and a Teleflex catheter (which is loaded with vehicle) was inserted into the inferior vena cava for subsequent drug administration . (B) Arterial catheter transplantation: femoral artery cannulated to blood pressure and other physiological conditions (pO2, PCO2, PH, glucose, hematocrit, ischemia, initial drug administration, and time of arterial reperfusion). Both arterial and venous catheters exited through the animal's back to allow free movement. (C) PhysioTel Transmitter (Data Sciences International, MI) was implanted into the peritoneal cavity and the animal's body temperature was remotely monitored for 22 hours.
[0121]
(Ii) Physiological parameters: Core body temperature was connected to YSI Temperature Control Unit (Model 73A, YSI Co. Inc., Ohio) and Electric Heating Pad (Model 756, Sunbean-Oster Co. Inc. Hattiesburg, MS). YSI Reusable Temperature Probe (YSI CO. Inc. Yellow Spring, OH) was used to maintain at 37.5 ° C. during the operation. After ischemia, the PhysioTel Transmitter was turned on and the core body temperature was recorded every 5 minutes. Systemic blood pressure was monitored throughout the surgery, during intravenous drug infusion (bolus), and 1, 2, 3, and 4 hours after the onset of ischemia. Other physiological conditions, (pO2, PCO2(Including pH, glucose, hematocrit) at the time of arterial occlusion and reperfusion.
[0122]
(Iii) Transient focal ischemia model: After preliminary surgery, a ventral midline cervical incision was performed to expose both CCA. The right CCA was permanently ligated with 4-o silk ligature, while the left CCA was clamped with an atraumatic aneurysm clip. A 1 cm cut was made to bisect and perpendicular to the line between the lateral eye angle of the right eye and the ear canal. The basal temporal muscle was excised and recontracted, and visualized directly with the help of a dissecting microscope (Model SZ-STB1, Olympus, Japan), and this central cerebral artery (MCA) was connected to the zygomatic arch and temporal It was exposed through a 2 mm bar hole opened 2 to 3 mm rostrally from the fusion of the scale bone. Drilling was performed under continuous irrigation of saline. The dura mater was cut and recontracted and exposed to MCA in the olfactory sulcus. A small Codman aneurysm clip (No. 1) was used to temporarily occlude the MCA once it crossed the olfactory sulcus. Flow interruption was confirmed using a dissecting microscope. The incision was closed with a surgical clip to stop anesthesia. The animal was then returned to its cage after it awakened (within a few minutes). Rats subjected to transient ischemia were anesthetized again 2.5 hours after MCA occlusion. After confirmation of MAC occlusion, the clip on the MCA and the left CCA were removed and blood flow recovery was visually confirmed in the MCA. The incision was closed and the rat was returned to its cage. Animals requiring short-term recovery were allowed to survive for 24 hours. All animals were deeply anesthetized prior to sacrifice. The brain was removed and 2 mm coronal slices were sliced and placed in TTC. Infarcted tissue appeared pale and appeared to be distinguishable from adjacent living tissue. Cortical and subcortical infarct areas were measured blindly using image processing software, and infarct volume was calculated by adding individual measurements with known thickness.
[0123]
(Iv) Statistical analysis: All physiological parameters, temperature recordings, and cortical infarct volumes were statistically compared for each subset of animals between experimental and control groups. Statistical analysis was performed using Sigmastat software (Jandel Scientific Software, San Rafael CA). Student's t-test was used for independent data, and ANOVA was used for multiple comparisons. A p value of less than 0.05 was considered significant. The graph was prepared in SigmaPlot v2.01 software (Jandel Scientific).
[0124]
Cbz-Val-Asp-CH2The in vivo neuroprotective properties of F were tested in two failure studies in the rat (Fischer-344) transient focal ischemia model. Cbz-Val-Asp-CH2F was given as a 20 mg / kg venous bolus 10 minutes after the onset of ischemia followed by a continuous intravenous injection of 5 mg / kg / hour. In Experiment 1, continuous infusion was given for 6 hours. In experiment 2, the infusion was extended to 12 hours.
[0125]
Cbz-Val-Asp-CH2F was found to significantly reduce cortical infarction in both studies: 46% (p <0.05) in experiment 1 and 57% (p <0.05) in experiment 2 (FIG. 11A and 11B). There was no change in blood pressure, blood gas, or temperature after drug administration. These results show that Cbz-Val-Asp-CH2It has been demonstrated that F is tolerant after acute intravenous dosing and is a potent neuroprotective agent in a rat model of transient focal cerebral ischemia.
[0126]
Now that the invention has been fully described, those skilled in the art will recognize that the invention falls within the broad and equivalent scope of conditions, formulations and other parameters without affecting the scope of the invention or any embodiment thereof. Understand that it can be implemented. All patents and publications cited herein are hereby fully incorporated by reference in their entirety.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A-1G shows cyclohexamide (CHX) and DMSO (FIG. 1A), tumor necrosis factor-α (TNF-α) / CHX and DMSO (FIG. 1B); 50 μM BOC-Asp (OMe) — CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 1C); 50 μM Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 1D); 50 μM Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 1E); 50 μM Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2Shown are photographs of HeLa cells tried with F, TNF-α / CHX (FIG. 1F); and DMSO (FIG. 1G).
FIGS. 2A-2G show cyclohexamide (CHX) and DMSO (FIG. 2A), TNF-α / CHX and DMSO (FIG. 2B); 5 μM BOC-Asp (OMe) —CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 2C); 5 μM Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 2D); 5 μM Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 2E); 5 μM Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2Shown are photographs of HeLa cells tried with F, TNF-α / CHX (FIG. 2F); and DMSO (FIG. 2G).
FIGS. 3A-3G show cyclohexamide (CHX) and DMSO (FIG. 3A), TNF-α / CHX and DMSO (FIG. 3B); 0.5 μM BOC-Asp (OMe) —CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 3C); 0.5 μM Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 3D); 0.5 μM Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F, TNF-α / CHX (FIG. 3E); 0.5 μM Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2Shown are photographs of HeLa cells tried with F, TNF-α / CHX (FIG. 3F); and DMSO (FIG. 3G).
FIG. 4 shows Cbz-Val-Asp (OMe) -CH of HeLa cells from TNF-α / CHX.2Protection at various concentrations of F (a) was achieved with Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH.2The bar graph shown is shown in comparison with F (b).
FIG. 5 shows Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F (a) and BOC-Asp (OMe) -CH21 shows a bar graph showing protection of HeLa cells from TNF-α / CHX by various concentrations of F (b).
FIG. 6 shows Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2Various lower doses of Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH compared to F (b)21 shows a bar graph showing protection of HeLa cells from TNF-α / CHX by F (a).
7A-7E show the results of a PARP cleavage assay in Jurkat cells. Compound 1 = Cbz-Val-Asp (OMe) -CH2F. Compound 2 = Cbz-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F. Compound 3 = Cbz-Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -CH2F. Compound 4 = Cbz-Ile-Glu (OMe) -Thr-Asp (OMe) -CH2F. Compound 5 = BOC-Asp (OMe) -CH2F. Compound 6 = Cbz-Asp-α-([2,6-dichlorobenzoyloxy] methyl ketone). Compound 7 = Cbz-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F.
FIGS. 8A and 8B show photographs of PARP cleavage, which shows inhibition of PARP cleavage by Z-VD-fmk and Z-VAD-fmk in anti-Fas-treated Jurket cells.
FIG. 9 shows a graph of cell survival versus Z-VD-fmk concentration, which shows inhibition of TNF-α-induced cell death by Z-VD-fmk.
FIG. 10 shows a photograph of DNA laddering, which shows inhibition of DNA laddering by Z-VD-fmk in anti-Fas treated Jurket cells.
FIGS. 11A and 11B show systemically administered Cbz-Val-Asp-CH in a rat transient focal ischemia model.2The neuroprotective effect of F is shown. Cutaneous infarct volume was quantified 2.25 hours after transient focal ischemia and 22 hours after reperfusion.

Claims (17)

以下の式ＩＩ：
を有する化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩であり、
ここで：Ｒ1はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アセチル（Ａｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）からなる群より選択されるＮ末端保護基であり；
ＡＡは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）からなる群より選択されるアミノ酸残基であり；かつ
Ｒ3は、アルキル基またはＨである、化合物。Formula II below:
Or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
Where: R 1 is an N-terminal protecting group selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl (Boc), acetyl (Ac) and benzyloxycarbonyl (Cbz);
AA is an amino acid residue selected from the group consisting of valine (Val), isoleucine (Ile) and leucine (Leu); and R 3 is an alkyl group or H. 請求項１に記載の化合物であって、ここで前記化合物は、以下からなる群より選択される化合物：
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、および
Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ。2. A compound according to claim 1, wherein the compound is selected from the group consisting of:
Boc-Val-Asp-CH 2 F,
Boc-Leu-Asp-CH 2 F,
Ac-Val-Asp-CH 2 F,
Ac-Ile-Asp-CH 2 F,
Cbz-Val-Asp-CH 2 F,
Cbz-Leu-Asp-CH 2 F,
Cbz-Ile-Asp-CH 2 F,
Boc-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Boc-Leu-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Ile-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Leu-Asp-CH 2 F,
Boc-Ile-Asp-CH 2 F,
Cbz-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Cbz-Leu-Asp (O CH 3) -CH 2 F, and Cbz-Ile-Asp (O CH 3) -CH 2 F. 請求項１に記載の化合物であって、ここで前記化合物は、以下からなる群より選択される化合物：
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、および
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ。2. A compound according to claim 1, wherein the compound is selected from the group consisting of:
Cbz-Val-Asp-CH 2 F, and Cbz-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F. 請求項１に記載の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアーを含有する薬学的組成物。  A pharmaceutical composition comprising a compound according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 細胞死、または細胞もしくは組織を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量の以下の式Ｉ：
を有する化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含み、ここで、
Ｒ1はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アセチル（Ａｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）からなる群より選択されるＮ末端保護基であり；
ＡＡは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）からなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ2は、ＨまたはＣＨ2Ｒ4であり、ここでＲ4は、Ｆ、Ｃｌ、ＴｓＯ−、ＣＨ ３ Ｏ−、ＡｒＯ−、ＡｒＣＯＯ−、ＡｒＮ−またはＡｒＳ−であり；そして
Ｒ3は、アルキル基またはＨである、
組成物。A composition for inhibiting cell death or cells or tissues, said composition comprising an effective amount of the following formula I:
Comprise a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof having, where
R 1 is an N-terminal protecting group selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl (Boc), acetyl (Ac) and benzyloxycarbonyl (Cbz);
AA is an amino acid residue selected from the group consisting of valine (Val), isoleucine (Ile) and leucine (Leu);
R 2 is H or CH 2 R 4 , where R 4 is F, Cl, TsO—, CH 3 O—, ArO—, ArCOO—, ArN— or ArS—; and R 3 is An alkyl group or H,
Composition. 動物の中枢神経系および末梢神経系、網膜のニューロン、心筋または免疫系細胞における細胞死を処置または寛解させるための組成物であって、有効量の以下の式Ｉ：
を有する化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含み、ここで、
Ｒ1はｔ−ブトキシカルボニル、アセチルおよびベンジルオキシカルボニルからなる群より選択されるＮ末端保護基であり；
ＡＡは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）からなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ2は、ＨまたはＣＨ2Ｒ4であり、ここでＲ4は、Ｆ、Ｃｌ、ＴｓＯ−、ＣＨ ３ Ｏ−、ＡｒＯ−、ＡｒＣＯＯ−、ＡｒＮ−またはＡｒＳ−であり；そして
Ｒ3は、アルキル基またはＨである、
組成物。A composition for treating or ameliorating cell death in an animal's central and peripheral nervous system, retinal neurons, cardiac muscle or immune system cells, comprising an effective amount of the following formula I:
Comprise a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof having, where
R 1 is an N-terminal protecting group selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl, acetyl and benzyloxycarbonyl;
AA is an amino acid residue selected from the group consisting of valine (Val), isoleucine (Ile) and leucine (Leu);
R 2 is H or CH 2 R 4 , where R 4 is F, Cl, TsO—, CH 3 O—, ArO—, ArCOO—, ArN— or ArS—; and R 3 is An alkyl group or H,
Composition. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、中枢神経系または末梢神経系にあり、かつ以下の一つが原因である、組成物：
（ａ）発作による局所虚血および心停止による全体虚血からなる群より選択される虚血および興奮毒性の状態
（ｂ）外傷性の傷害；
（ｃ）ウイルス感染；
（ｄ）放射線誘引性神経細胞死；
（ｅ）アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および脊髄延髄の萎縮からなる群より選択される神経変性性障害；または
（ｆ）脊髄障害。7. The composition of claim 6, wherein the cell death is in the central nervous system or peripheral nervous system and is due to one of the following:
(A) ischemic and excitotoxic conditions selected from the group consisting of focal ischemia due to stroke and global ischemia due to cardiac arrest (b) traumatic injury;
(C) viral infection;
(D) radiation-induced neuronal cell death;
(E) a neurodegenerative disorder selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, prion disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and spinal medulla atrophy; or (f) spinal cord disorder. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、中枢神経系または末梢神経系にあり、かつ特定の遺伝子のトリヌクレオチド反復の伸長が原因である、組成物。  7. A composition according to claim 6, wherein the cell death is in the central nervous system or the peripheral nervous system and is due to an extension of a trinucleotide repeat of a particular gene. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、ハンチントン病が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is due to Huntington's disease. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、心筋組織にあり、かつ心筋梗塞、慢性心不全、心筋症または心臓のウイルス感染が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is in myocardial tissue and is due to myocardial infarction, chronic heart failure, cardiomyopathy or cardiac viral infection. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、網膜のニューロンにあり、かつ眼内圧の亢進、加齢関連黄斑変性症または網膜色素変性症が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is in retinal neurons and is caused by increased intraocular pressure, age-related macular degeneration or retinitis pigmentosa. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、免疫系にあり、かつ後天性免疫不全症候群、重度合併免疫不全症候群および放射線誘引性免疫抑制からなる群より選択される免疫不全障害が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is in the immune system and is selected from the group consisting of acquired immune deficiency syndrome, severe combined immune deficiency syndrome and radiation-induced immunosuppression A composition caused by a failure disorder. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、エリテマトーデス、慢性関節リューマチおよび糖尿病Ｉ型からなる群より選択される自己免疫障害が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is caused by an autoimmune disorder selected from the group consisting of lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and diabetes type I. 請求項６に記載の組成物であって、ここで前記細胞死は、糖尿病Ｉ型が原因である、組成物。  7. The composition of claim 6, wherein the cell death is due to diabetes type I. 動物において多発性嚢胞腎症または貧血／赤血球生成を処置または予防する組成物であって、該組成物は、有効量の以下の式Ｉ：
を有する化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含み、ここで、
Ｒ1はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アセチル（Ａｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）からなる群より選択されるＮ末端保護基であり；
ＡＡは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）およびロイシン（Ｌｅｕ）からなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
Ｒ2は、ＨまたはＣＨ2Ｒ4であり、ここでＲ4は、Ｆ、Ｃｌ、ＴｓＯ−、ＣＨ ３ Ｏ−、ＡｒＯ−、ＡｒＣＯＯ−、ＡｒＮ−またはＡｒＳ−であり；そして
Ｒ3は、アルキル基またはＨである、
組成物。A composition for treating or preventing polycystic nephropathy or anemia / erythropoiesis in an animal, said composition comprising an effective amount of the following formula I:
Comprise a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof having, where
R 1 is an N-terminal protecting group selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl (Boc), acetyl (Ac) and benzyloxycarbonyl (Cbz);
AA is an amino acid residue selected from the group consisting of valine (Val), isoleucine (Ile) and leucine (Leu);
R 2 is H or CH 2 R 4 , where R 4 is F, Cl, TsO—, CH 3 O—, ArO—, ArCOO—, ArN— or ArS—; and R 3 is An alkyl group or H,
Composition. Ｒ３はメチルまたはＨである、請求項１５に記載の組成物R 3 is methyl or H, A composition according to claim 15 前記式Ｉの化合物は、以下：
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、
Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ、および
Ｃｂｚ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯＣＨ ３ ）−ＣＨ2Ｆ
からなる群より選択されるかまたはその薬学的に受容可能な塩である、請求項１５に記載の組成物。The compound of formula I is:
Boc-Val-Asp-CH 2 F,
Boc-Leu-Asp-CH 2 F,
Ac-Val-Asp-CH 2 F,
Ac-Ile-Asp-CH 2 F,
Cbz-Val-Asp-CH 2 F,
Cbz-Leu-Asp-CH 2 F,
Cbz-Ile-Asp-CH 2 F,
Boc-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Boc-Leu-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Ile-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Ac-Leu-Asp-CH 2 F,
Boc-Ile-Asp-CH 2 F,
Cbz-Val-Asp (O CH 3) -CH 2 F,
Cbz-Leu-Asp (O CH 3) -CH 2 F, and Cbz-Ile-Asp (O CH 3) -CH 2 F
16. The composition of claim 15, wherein the composition is selected from the group consisting of: or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
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