JP4393422B2 - Sensor unit using total reflection attenuation and measurement method using total reflection attenuation. - Google Patents

Description

本発明は、リガンドと試料との結合反応を測定する全反射減衰を利用するセンサユニット及び全反射減衰を利用する測定方法。   The present invention relates to a sensor unit that uses total reflection attenuation for measuring the binding reaction between a ligand and a sample, and a measurement method that uses total reflection attenuation.

例えば、細胞から発現する物質のうち、ペプチドやタンパク質と結合する未知の物質を同定，解析するために、質量分析計（マススペクトロメーター）を用いて、質量分析が行われている。質量分析計は、試料となる物質をイオン化し、その質量／電荷比に基づいて分離し、最後にそのイオンを検出し、検出したイオンの分子量を記録する。   For example, mass spectrometry is performed using a mass spectrometer in order to identify and analyze unknown substances that bind to peptides and proteins among substances expressed from cells. The mass spectrometer ionizes a sample material, separates it based on its mass / charge ratio, finally detects the ion, and records the molecular weight of the detected ion.

この質量分析の対象となる未知の物質を回収する方法として、細胞から発現した物質を試料として含む試料溶液を、ペプチドやタンパク質をリガンドとして固定したリガンド固定膜に送液して接触させ、この後、溶出液をリガンド固定膜に送液して、リガンド固定膜に結合した物質（以下、結合物質という）をリガンドから解離させて、解離した結合物質を回収する回収方法が知られている。   As a method for recovering an unknown substance to be subjected to mass spectrometry, a sample solution containing a substance expressed from a cell as a sample is transferred to a ligand-immobilized membrane immobilized with a peptide or protein as a ligand, and then contacted. A recovery method is known in which an eluate is fed to a ligand-immobilized membrane, a substance bound to the ligand-immobilized film (hereinafter referred to as a bound substance) is dissociated from the ligand, and the dissociated bound substance is recovered.

下記特許文献１では、こうした結合物質の回収を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）センサチップと、このＳＰＲセンサチップを使用してＳＰＲ検出を行うＳＰＲ測定装置を使用して行う方法が開示されている。ＳＰＲとは、金属中の自由電子が集団的に振動することによって生じ、その金属の表面に沿って進む自由電子の粗密波である。ＳＰＲセンサチップは、透明な誘電体と、この誘電体上に形成され、一方の面が試料の反応を検知するセンサ面となる金属膜を持っている。前記誘電体を通じて前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように（臨界角以上の入射角で）光を入射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波はエバネッセント波と呼ばれ、このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。   Patent Document 1 below discloses a method of collecting such a binding substance using a surface plasmon resonance (SPR) sensor chip and an SPR measurement device that performs SPR detection using the SPR sensor chip. Has been. SPR is a density wave of free electrons generated by collective vibration of free electrons in a metal and traveling along the surface of the metal. The SPR sensor chip has a transparent dielectric and a metal film formed on the dielectric, and one surface serves as a sensor surface for detecting the reaction of the sample. When light is incident on the light incident surface on the back surface of the sensor surface through the dielectric so as to satisfy the total reflection condition (at an incident angle greater than the critical angle), total reflection occurs at the light incident surface. Slight light passes through the metal film without being reflected and oozes out to the sensor surface. This leaked light wave is called an evanescent wave, and when the frequency of the evanescent wave and the surface plasmon coincides and resonates (when SPR occurs), the intensity of the reflected light is greatly attenuated. The SPR measurement device detects the SPR generated on the sensor surface on the back side by capturing the attenuation of the reflected light reflected by the light incident surface.

ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。   The incident angle (resonance angle) of light for generating SPR depends on the refractive index of the medium through which the evanescent wave and the surface plasmon propagate. In other words, if the refractive index of the medium changes, the resonance angle that generates SPR changes. The substance in contact with the sensor surface becomes a medium for propagating evanescent waves and surface plasmons. For example, when a reaction such as bonding or dissociation between two types of molecules occurs on the sensor surface, it changes the refractive index of the medium. And the resonance angle changes. The SPR measurement device measures the interaction between molecules by capturing the change in the resonance angle.

このＳＰＲ測定装置を使用して、リガンドと試料とを接触させれば、ＳＰＲ信号の測定により、試料とリガンドとの結合の有無を調べられるので、質量分析の前に、回収液に結合物質が含まれているかいないかを識別して、質量分析の対象を絞り込むことができるので、質量分析作業を効率化できる。   If the SPR measurement device is used to bring the ligand into contact with the sample, the presence or absence of binding between the sample and the ligand can be examined by measuring the SPR signal. It is possible to narrow down the target of mass analysis by identifying whether it is included or not, so that mass analysis work can be made more efficient.

下記特許文献１記載のＳＰＲ測定装置には、ＳＰＲセンサチップが着脱自在にセットされる。このＳＰＲセンサチップのセンサ面には、リガンドを固定するリガンド固定膜が形成される。ＳＰＲ測定装置には、前記センサ面へ液体を送液する流路が形成された流路部材が設けられており、ＳＰＲセンサチップは、前記流路とセンサ面とが対向するように装着される。   An SPR sensor chip is detachably set in the SPR measurement device described in Patent Document 1 below. A ligand fixing film for fixing a ligand is formed on the sensor surface of the SPR sensor chip. The SPR measuring device is provided with a flow path member in which a flow path for supplying a liquid to the sensor surface is formed, and the SPR sensor chip is mounted so that the flow path and the sensor surface face each other. .

リガンド固定膜への結合物質の結合の有無は、試料溶液を流路へ注入して、試料溶液とリガンド固定膜とを接触するときのＳＰＲ信号を測定することにより調べられる。   The presence / absence of binding of the binding substance to the ligand-immobilized membrane is examined by injecting the sample solution into the flow path and measuring the SPR signal when the sample solution comes into contact with the ligand-immobilized membrane.

特表平９−５００２０８号公報JP-T 9-500208

所定量の試料溶液を用いて結合物質の結合量を多くするには、試料溶液をリガンド固定膜と接触させる流路長は長い方がよいため、流路の形状は細長になる。こうした細長の流路では、流路の注入口から排出口までの全長のうち、どの位置をＳＰＲ信号の測定ポイントとするかによってＳＰＲ信号の出力レベルが変化する。出力レベルが小さいと測定精度が低下するため、高い出力レベルのＳＰＲ信号を取得することが求められていた。   In order to increase the binding amount of the binding substance using a predetermined amount of the sample solution, it is preferable that the length of the flow path in which the sample solution is brought into contact with the ligand-fixed membrane is longer, and therefore the shape of the flow path is elongated. In such an elongate channel, the output level of the SPR signal changes depending on which position of the total length from the inlet to the outlet of the channel is the SPR signal measurement point. When the output level is small, the measurement accuracy is lowered, so that it is required to acquire an SPR signal having a high output level.

本発明の目的は、高い出力レベルの測定信号を取得して、結合物質とリガンドとの結合反応の測定精度を向上することである。   An object of the present invention is to obtain a measurement signal with a high output level and improve the measurement accuracy of the binding reaction between the binding substance and the ligand.

本発明の全反射減衰を利用するセンサユニットは、透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され、前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有し、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光を入射させときに、前記結合反応に応じて、その反射光が全反射減衰を生じる減衰角が変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、前記結合反応の測定ポイントが、前記流路の全長の半分よりも上流側の一部のみに設けられていることを特徴とする。 The sensor unit using total reflection attenuation according to the present invention includes a transparent dielectric, a ligand-fixed film formed on an upper surface of the dielectric, the ligand-fixed film being fixed, and disposed opposite to the ligand-fixed film. A channel member formed with an elongate channel for feeding a sample solution containing a binding substance that binds to the ligand-immobilized membrane while contacting the ligand-immobilized membrane; and the ligand-immobilized membrane formed between the ligand-immobilized membrane and the dielectric. One surface in contact with the film has a thin film serving as a sensor surface for detecting a binding reaction between the ligand and the binding substance, and light is incident on the back surface of the thin film through the dielectric so as to satisfy a total reflection condition. Sometimes, in the sensor unit using total reflection attenuation in which the attenuation angle at which the reflected light causes total reflection attenuation changes according to the binding reaction, the measurement point of the binding reaction is And it is provided only on a part of the upstream side than half of the total length of the channel.

前記測定ポイントは、例えば、前記薄膜を、前記リガンド固定膜のうち、前記測定ポイントに対応する部分にのみ形成することにより、上流側に設定される。   The measurement point is set on the upstream side, for example, by forming the thin film only at a portion corresponding to the measurement point in the ligand-fixed film.

前記誘電体に照射される照射光の光路内に配置され、前記照射光のうち、前記誘電体を通じて前記測定ポイントに向かう光を透過して、他の部分へ向かう光を遮断する照射光規制部材を設けてもよい。   An irradiation light restricting member that is disposed in the optical path of the irradiation light irradiated on the dielectric and that transmits the light directed to the measurement point through the dielectric and blocks the light directed to the other part of the irradiation light. May be provided.

前記流路は、前記リガンド固定膜と対向する対向部分が、例えば、うずまき状又はつづらおり状に屈曲されていることが好ましい。   In the flow channel, it is preferable that a facing portion facing the ligand fixing membrane is bent in, for example, a spiral shape or a spiral shape.

前記リガンド固定膜は、前記流路のほぼ全域に渡って形成されていることが好ましい。   It is preferable that the ligand fixing membrane is formed over almost the entire area of the flow path.

本発明の全反射減衰を利用する測定方法は、透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有するセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記結合反応を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、前記流路の全長の半分よりも上流側の一部のみに前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定することを特徴とする。 The measurement method using total reflection attenuation according to the present invention includes a transparent dielectric, a ligand-immobilized film formed on the upper surface of the dielectric, and a ligand-immobilized film, and disposed opposite to the ligand-immobilized film. A channel member formed with an elongate channel for feeding a sample solution containing a binding substance that binds to the ligand-immobilized membrane while contacting the ligand-immobilized membrane; and the ligand-immobilized membrane formed between the ligand-immobilized film and the dielectric A sensor unit having a thin film serving as a sensor surface for detecting a binding reaction between the ligand and the binding substance on one surface thereof, and from a light source so as to satisfy a total reflection condition on the back surface of the thin film through the dielectric Measurement using the total reflection attenuation for measuring the binding reaction is performed by detecting the change in the attenuation angle at which light is incident, the reflected light is received, and the reflected light causes total reflection attenuation. In the method, by setting the measuring point for detecting the binding reaction only part of the upstream side than half of the total length of the flow path, and measuring the binding reaction.

前記測定ポイントにのみ前記薄膜を形成して前記結合反応を測定したり、前記測定ポイントにのみ前記光を入射させて前記結合反応を測定することが好ましい。   It is preferable that the thin film is formed only at the measurement point to measure the binding reaction, or the light is incident only on the measurement point to measure the binding reaction.

本発明は、誘電体上に形成されたリガンド固定膜に対応して流路が形成された流路部材を備えたセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記リガンドと試料との結合反応を測定する際に、前記流路の全長の半分よりも上流側に前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定するようにしたから、高い出力レベルの測定信号を取得して、測定精度を向上することができる。   The present invention uses a sensor unit including a flow path member in which a flow path is formed corresponding to a ligand-fixed film formed on a dielectric so that a total reflection condition is satisfied on the back surface of the thin film through the dielectric. The light is incident on the light source, the reflected light is received, and the change of the attenuation angle at which the reflected light causes total reflection attenuation is detected. Since the measurement point for detecting the binding reaction is set upstream of the half of the total length of the path and the binding reaction is measured, a measurement signal with a high output level is acquired to improve the measurement accuracy. be able to.

図１に示すセンサユニット１２は、透明な誘電体であるプリズム１４と、液体を送液する流路１６が形成された流路部材１８と、この流路部材１８を、プリズム１４の上面に圧接させ、流路部材１８とプリズム１４とを一体的に保持する保持部材１９と、この保持部材１９の上面に、両面テープ２１によって取り付けられる蓋部材２２とからなる。   The sensor unit 12 shown in FIG. 1 includes a prism 14 that is a transparent dielectric, a flow path member 18 in which a flow path 16 for sending liquid is formed, and the flow path member 18 that is pressed against the upper surface of the prism 14. The holding member 19 that integrally holds the flow path member 18 and the prism 14, and the lid member 22 that is attached to the upper surface of the holding member 19 by the double-sided tape 21.

プリズム１４の上面には、リガンドを固定するリガンド固定膜となるリンカー膜２３が形成されている。このリンカー膜２３には、流路１６を通じて、リガンドと結合する結合物質を含む試料を溶媒に溶かした試料溶液が送液される。試料溶液がリンカー膜２３と接触すると、結合物質がリガンドと結合してリンカー膜２３に固定される。   On the upper surface of the prism 14, a linker film 23 serving as a ligand fixing film for fixing a ligand is formed. A sample solution in which a sample containing a binding substance that binds to a ligand is dissolved in a solvent is sent to the linker film 23 through the channel 16. When the sample solution comes into contact with the linker film 23, the binding substance binds to the ligand and is fixed to the linker film 23.

センサユニット１２は、ＳＰＲを利用して、この結合物質のリンカー膜２３への結合反応を測定するＳＰＲセンサである。図２に示すように、センサユニット１２は、ＳＰＲ測定機に着脱自在にセットされる。ＳＰＲ測定機には、前記結合反応を測定する測定部と、前記流路１６への前記試料溶液の注入と排出とを行う一対のピペット２８ａ，２８ｂを備えた分注ヘッド２８とが設けられている。測定部は、センサユニット１２に対して光を照射する照明部２６と、センサユニット１２で反射した反射光を受光して測定信号を出力する検出器２７とからなる。   The sensor unit 12 is an SPR sensor that measures the binding reaction of this binding substance to the linker film 23 using SPR. As shown in FIG. 2, the sensor unit 12 is detachably set on the SPR measuring machine. The SPR measuring device is provided with a measuring unit for measuring the binding reaction, and a dispensing head 28 having a pair of pipettes 28a and 28b for injecting and discharging the sample solution to and from the flow path 16. Yes. The measurement unit includes an illumination unit 26 that irradiates light to the sensor unit 12 and a detector 27 that receives reflected light reflected by the sensor unit 12 and outputs a measurement signal.

保持部材１９の上部には、流路１６の注入口１６ａ及び排出口１６ｂに対応する位置に、ピペット２８ａ，２８ｂの先端を、注入口１６ａ及び排出口１６ｂに誘い込む受け入れ口１９ｂが形成されている。保持部材１９が流路部材１８を挟み込んでプリズム１４と係合すると、受け入れ口１９ｂと、注入口１６ａ及び排出口１６ｂとが連結される。   In the upper part of the holding member 19, a receiving port 19 b is formed at a position corresponding to the inlet 16 a and the outlet 16 b of the flow channel 16 to guide the tips of the pipettes 28 a and 28 b into the inlet 16 a and the outlet 16 b. . When the holding member 19 sandwiches the flow path member 18 and engages with the prism 14, the receiving port 19b is connected to the injection port 16a and the discharge port 16b.

また、これら各受け入れ口１９ｂの両脇には、円筒形のボス１９ｃが設けられている。これらのボス１９ｃは、蓋部材２２に形成された穴２２ａと嵌合して、蓋部材２２を位置決めするためのものである。   Also, cylindrical bosses 19c are provided on both sides of each receiving port 19b. These bosses 19 c are for fitting the holes 22 a formed in the lid member 22 to position the lid member 22.

蓋部材２２は、流路１６に通じる受け入れ口１９ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材２２は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口１９ｂに対応する位置に、十字形のスリット２２ｂが形成されている。ピペット２８ａ，２８ｂは、スリット２２ｂを押し広げながら挿入される。スリット２２ｂは、ピペット２８ａ，２８ｂが引き抜かれると、弾性力によって初期状態に復帰して、受け入れ口１９ｂを塞ぐ。   The lid member 22 covers the receiving port 19 b that communicates with the flow path 16, thereby preventing the liquid in the flow path 16 from evaporating. The lid member 22 is formed of an elastic member, for example, rubber or plastic, and a cross-shaped slit 22b is formed at a position corresponding to each receiving port 19b. The pipettes 28a and 28b are inserted while expanding the slit 22b. When the pipettes 28a and 28b are pulled out, the slit 22b returns to the initial state by the elastic force and closes the receiving port 19b.

流路部材１８は、断面が四角形の長尺の各柱状をしており、弾性部材で形成されている。流路１６は、リンカー膜２３と対向して配置され試料溶液をリンカー膜２３に接触させながら送液する直線状の対向部分１６ｃと、この対向部分１６ｃの両端から流路部材１８の上面１８ａに向けて流路部材１８を縦方向に貫通する貫通部分１６ｄとからなる。   The flow path member 18 has a long column shape with a square cross section, and is formed of an elastic member. The flow channel 16 is arranged to face the linker film 23 and feeds the sample solution while bringing the sample solution into contact with the linker film 23, and the upper surface 18a of the flow channel member 18 from both ends of the opposed portion 16c. And a through portion 16d penetrating the flow path member 18 in the vertical direction.

一方の貫通部分１６ｄの上端が、注入口１６ａとなり、他方の貫通部分１６ｄの上端が、排出口１６ｂとなる。流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、注入口１６ａと排出口１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。対向部分１６ｃは、流路部材１８の底面１８ｂに形成された溝であり、流路部材１８の底面に圧接されるプリズム１４の上面によってその開放部位が覆われて封止される。   The upper end of one penetration part 16d becomes the injection port 16a, and the upper end of the other penetration part 16d becomes the discharge port 16b. The tube diameter of the channel 16 is, for example, about 1 mm, and the interval between the inlet 16a and the outlet 16b is, for example, about 10 mm. The facing portion 16 c is a groove formed in the bottom surface 18 b of the flow path member 18, and its open portion is covered and sealed by the top surface of the prism 14 that is pressed against the bottom surface of the flow path member 18.

プリズム１４は、例えば、断面が台形の棒状をしている。プリズム１４の素材としては、例えば、ホウケイクラウン（ＢＫ７）やバリウムクラウン（Ｂａｋ４）などに代表される光学ガラスや、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）などに代表される光学プラスチックなどが用いられる。   The prism 14 has, for example, a bar shape with a trapezoidal cross section. Examples of the material of the prism 14 include optical glass represented by borosilicate crown (BK7) and barium crown (Bak4), polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), and amorphous polyolefin (APO). Representative optical plastics are used.

プリズム１４と流路部材１８とは、保持部材１９によって一体的に保持される。プリズム１４の長手方向の両側面１４ｃには、保持部材１９の係合部１９ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材１８が、保持部材１９とプリズム１４とによって挟み込まれる。また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。この突部１４ｂは、センサユニット１２をホルダ（図示せず）に収納する際に、その内壁と係合してその収納位置を位置決めする位置決め部材である。   The prism 14 and the flow path member 18 are integrally held by a holding member 19. Engaging claws 14 a that engage with the engaging portions 19 a of the holding member 19 are provided on both side surfaces 14 c in the longitudinal direction of the prism 14. With these engagements, the flow path member 18 is sandwiched between the holding member 19 and the prism 14. In addition, protrusions 14 b are provided at both ends in the short side direction of the prism 14. The protrusion 14b is a positioning member that engages with the inner wall of the sensor unit 12 to position the storage position when the sensor unit 12 is stored in a holder (not shown).

プリズム１４の上面には、リンカー膜２３が短冊状に形成されている。このリンカー膜２３は、対向部分１６ｃを流れる試料溶液と接触する接触面積が多くなるように、対向部分１６ｃのほぼ全域に渡って設けられる。   A linker film 23 is formed in a strip shape on the upper surface of the prism 14. The linker film 23 is provided over almost the entire area of the facing portion 16c so that the contact area in contact with the sample solution flowing through the facing portion 16c is increased.

図３（Ａ）に示すように、試料溶液は、注入口１６ａから注入されて、対向部分１６ｃを通過して、排出口１６ｂから排出される。この送液中に試料溶液内の結合物質が拡散してリガンドと結合する。そのため、図３（Ｃ）に示すように、リンカー膜２３への試料の結合量は、対向部分１６ｃの上流側（注入口１６ａ側）ほど多く、下流側（排出口１６ｂ）に向けて少ない。結合量が多い方が測定信号のレベルも高いので、図３（Ｂ）に示すように、リガンドと結合物質との結合反応を測定する測定ポイントは、対向部分１６ｃの全長の半分よりも上流側に設けられている。   As shown in FIG. 3A, the sample solution is injected from the injection port 16a, passes through the facing portion 16c, and is discharged from the discharge port 16b. During this liquid feeding, the binding substance in the sample solution diffuses and binds to the ligand. Therefore, as shown in FIG. 3C, the amount of the sample bound to the linker film 23 increases toward the upstream side (injection port 16a side) of the facing portion 16c and decreases toward the downstream side (discharge port 16b). Since the level of the measurement signal is higher when the amount of binding is larger, as shown in FIG. 3B, the measurement point for measuring the binding reaction between the ligand and the binding substance is upstream of the half of the total length of the facing portion 16c. Is provided.

測定ポイントには、表面が前記結合反応を検知するセンサ面３１ａとなる金属膜３１が設けられる。金属膜３１は、略矩形状をしており、その長さは、リンカー膜２３の長さに比べて短い。金属膜３１は、プリズム１４の上面に、例えば、蒸着によって形成される。金属膜３１としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長などに応じて適宜選択される。リンカー膜２３は、その一部がセンサ面３１ａを横切るように金属膜３１に重ねられる。これにより、金属膜３１がプリズム１４とリンカー膜２３との間に挟み込まれる。   The measurement point is provided with a metal film 31 whose surface becomes a sensor surface 31a for detecting the binding reaction. The metal film 31 has a substantially rectangular shape, and its length is shorter than the length of the linker film 23. The metal film 31 is formed on the upper surface of the prism 14, for example, by vapor deposition. As the metal film 31, for example, gold is used, and the film thickness is, for example, 50 nm. This film thickness is appropriately selected according to the material of the metal film, the emission wavelength of the irradiated light, and the like. The linker film 23 is overlaid on the metal film 31 so that a part thereof crosses the sensor surface 31a. As a result, the metal film 31 is sandwiched between the prism 14 and the linker film 23.

プリズム１４の各側面１４ｃは、一方が光照射面となり、他方が光出射面となる。照明部２６は、一方の側面１４ｃに光を照射して、センサ面３１ａの裏面３１ｂに向けて全反射条件を満足するように光を入射させる。検出器２７は、裏面３１ｂで反射して他方の側面１４ｃから出射した光を受光する。   One of the side surfaces 14c of the prism 14 is a light emitting surface, and the other is a light emitting surface. The illuminating unit 26 irradiates one side surface 14c with light and makes the light incident toward the back surface 31b of the sensor surface 31a so as to satisfy the total reflection condition. The detector 27 receives light reflected from the back surface 31b and emitted from the other side surface 14c.

裏面３１ｂに、全反射条件を満たすように光を入射すると、センサ面３１ａにはＳＰＲが発生する。ＳＰＲが発生すると、裏面３１ｂで反射する反射光は、減衰する。この減衰が生じる共鳴角は、センサ面３１ａ上の前記結合反応に応じて変化する。共鳴角の変化は、検出器３３の受光面内の減衰位置の変化として現れる。検出器３３は、前記減衰位置の変化を表す測定信号を出力する。この測定信号に応じて前記結合反応の有無が測定される。   When light is incident on the back surface 31b so as to satisfy the total reflection condition, SPR is generated on the sensor surface 31a. When SPR occurs, the reflected light reflected by the back surface 31b is attenuated. The resonance angle at which this attenuation occurs changes according to the binding reaction on the sensor surface 31a. The change in the resonance angle appears as a change in the attenuation position in the light receiving surface of the detector 33. The detector 33 outputs a measurement signal representing the change in the attenuation position. The presence or absence of the binding reaction is measured in response to the measurement signal.

また、図示しないが、このセンサユニット１２には、個々のユニットを識別できるように各ユニット毎の識別ＩＤなどの情報を含むバーコードが記録されている。各センサユニット１２に識別ＩＤを記録しておけば、例えば、各センサユニット１２毎の測定結果と、注入した試料溶液の種類などを対応付けてデータを管理することが可能になる。なお、バーコードを設ける代わりに、例えば、ＲＦＩＤタグなどのＩＣタグを設けてもよい。   Although not shown, a bar code including information such as an identification ID for each unit is recorded in the sensor unit 12 so that each unit can be identified. If an identification ID is recorded in each sensor unit 12, for example, it becomes possible to manage data by associating the measurement result for each sensor unit 12 with the type of sample solution injected. Instead of providing a barcode, for example, an IC tag such as an RFID tag may be provided.

以下、上記構成による作用について説明する。測定部による信号測定を開始した後、リガンド固定済みのセンサユニット１２に対して、分注ヘッド２８によって、試料溶液が注入される。注入口１６ａから注入された試料溶液は、対向部分１６ｃに進入し、対向部分１６ｃを注入口１６ａから排出口１６ｂに向けて流れてその間にリンカー膜２３と接触する。これにより、試料に含まれる結合物質とリンカー膜２３とが結合する。この間、センサ面３１ａの反応状況に応じた測定信号が取得される。測定ポイントは、対向部分１６ｃの上流側にあるため、信号レベルの高い測定信号が得られるので、高い精度で測定することができる。   Hereinafter, the operation of the above configuration will be described. After starting the signal measurement by the measurement unit, the sample solution is injected by the dispensing head 28 into the sensor unit 12 on which the ligand is fixed. The sample solution injected from the injection port 16a enters the facing portion 16c, flows through the facing portion 16c from the injection port 16a toward the discharge port 16b, and contacts the linker film 23 therebetween. Thereby, the binding substance contained in the sample and the linker film 23 are bonded. During this time, a measurement signal corresponding to the reaction status of the sensor surface 31a is acquired. Since the measurement point is on the upstream side of the opposed portion 16c, a measurement signal with a high signal level can be obtained, so that measurement can be performed with high accuracy.

この測定結果に基づいて、結合反応を検知した場合には、試料に結合物質が含まれていたことが検知されるので、分注ヘッド２８で解離用バッファを流路１６に注入して、結合物質をリンカー膜２３から解離させて回収する。回収された結合物質は、質量分析機に送られて分析がなされる。   When the binding reaction is detected based on the measurement result, it is detected that the sample contains a binding substance. Therefore, the dissociation buffer is injected into the flow path 16 by the dispensing head 28 to bind the sample. The substance is dissociated from the linker film 23 and recovered. The collected binding substance is sent to a mass spectrometer for analysis.

上記実施形態では、短冊状のリンカー膜に対応して直線状の流路を持つセンサユニットを例に説明しているが、流路は直線状でなくてもよく、図４（Ａ），（Ｂ）に示すように、屈曲した流路を用いてもよい。図４（Ａ），（Ｂ）は、各流路４１，４６の上面図である。図４（Ａ）に示す流路４１は、注入口４１ａと排出口４１ｂの間が渦巻き状に屈曲しており、この流路４１の屈曲に合わせてリンカー膜が形成されている。そして、金属膜が設けられる測定ポイント４２は、流路４１の注入口４１ａに近い上流側に設定される。図４（Ｂ）に示す流路４６は、注入口４６ａと排出口４６ｂの間がつづら折り状に屈曲されており、測定ポイント４７が流路４６の上流側に設定される。   In the above embodiment, the sensor unit having a linear flow path corresponding to the strip-shaped linker film is described as an example. However, the flow path may not be linear, and FIG. A bent channel may be used as shown in B). 4A and 4B are top views of the flow paths 41 and 46, respectively. In the channel 41 shown in FIG. 4A, the space between the inlet 41 a and the outlet 41 b is bent in a spiral shape, and a linker film is formed in accordance with the bending of the channel 41. The measurement point 42 where the metal film is provided is set on the upstream side of the flow channel 41 near the inlet 41a. In the channel 46 shown in FIG. 4B, the inlet 46 a and the outlet 46 b are bent in a zigzag manner, and the measurement point 47 is set on the upstream side of the channel 46.

このように、流路を屈曲させることで、センサユニットの全長を抑えながら、流路長を長くすることができる。流路長を長くすると、リンカー膜の面積が広がるので、結合物質の結合量及び回収量を稼ぐことができる。なお、流路の屈曲形状として、渦巻き状及びつづら折り状を例に説明したが、屈曲形状はこれ以外にも各種の形状が考えられ、どのような形状でもよい。   In this way, by bending the flow path, the flow path length can be increased while suppressing the overall length of the sensor unit. When the flow path length is increased, the area of the linker film is increased, so that the binding amount and the recovery amount of the binding substance can be earned. In addition, although the spiral shape and the zigzag folded shape have been described as examples of the bent shape of the flow path, various shapes other than this can be considered, and any shape may be used.

また、上記実施形態では、リンカー膜の一部に金属膜を設けて、これを測定ポイントとする例で説明したが、このように金属膜の位置で測定ポイントを設定しなくてもよい。例えば、図５に示すセンサユニット５１は、保持部材５２の側板５３が、プリズム１４の側面１４ｃ全体を覆う大きさで形成されており、その側板５３には、光透過窓５３ａが形成されている。側板５３は、照明部がプリズム１４に照射する照射光の光路内に配置されているので、照射光は、光透過窓５３ａを通してのみプリズム１４に入射し、他の部分では遮断される。このように側板５３によって照射光を規制すれば、図５（Ｂ）に示すように、金属膜５４をリンカー膜２３の全面に設けても、光の入射位置が制限される。光透過窓５３ａを流路１６の全長の半分よりも上流側に配置すれば、測定ポイントを上流側に設定することができる。   In the above-described embodiment, the metal film is provided on a part of the linker film and used as the measurement point. However, the measurement point may not be set at the position of the metal film. For example, in the sensor unit 51 shown in FIG. 5, the side plate 53 of the holding member 52 is formed to have a size that covers the entire side surface 14 c of the prism 14, and the light transmission window 53 a is formed on the side plate 53. . Since the side plate 53 is disposed in the optical path of the irradiation light that the illumination unit irradiates the prism 14, the irradiation light enters the prism 14 only through the light transmission window 53a and is blocked at other portions. If the irradiation light is regulated by the side plate 53 in this way, the incident position of the light is limited even if the metal film 54 is provided on the entire surface of the linker film 23 as shown in FIG. If the light transmission window 53a is arranged on the upstream side of half of the entire length of the flow path 16, the measurement point can be set on the upstream side.

また、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを利用して、リガンドと試料との結合反応を測定する例で説明しているが、ＳＰＲセンサに限らず、全反射減衰を利用する他のセンサを用いてもよい。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。   In the present embodiment, an example is described in which a binding reaction between a ligand and a sample is measured using an SPR sensor that generates SPR on the sensor surface and detects the attenuation of reflected light at that time. However, the sensor is not limited to the SPR sensor, and other sensors using total reflection attenuation may be used. As a sensor using total reflection attenuation, for example, a leakage mode sensor is known in addition to the SPR sensor. The leakage mode sensor is composed of a dielectric, and a thin film composed of a clad layer and an optical waveguide layer that are sequentially layered thereon. One surface of the thin film serves as a sensor surface, and the other surface receives light. It becomes a surface. When light is incident on the light incident surface so as to satisfy the total reflection condition, a part of the light is transmitted through the cladding layer and taken into the optical waveguide layer. In this optical waveguide layer, when the waveguide mode is excited, the reflected light at the light incident surface is greatly attenuated. The incident angle at which the waveguide mode is excited changes according to the refractive index of the medium on the sensor surface, similar to the resonance angle of SPR. By detecting the attenuation of the reflected light, the reaction on the sensor surface is measured.

センサユニットの分解斜視図である。It is a disassembled perspective view of a sensor unit. リガンドと試料との結合反応を測定する測定方法の説明図である。It is explanatory drawing of the measuring method which measures the binding reaction of a ligand and a sample. 測定ポイントの位置の説明図である。It is explanatory drawing of the position of a measurement point. 屈曲した流路の説明図である。It is explanatory drawing of the bent flow path. 光の入射位置を制限して測定ポイントを設定する例の説明図である。It is explanatory drawing of the example which restrict | limits the incident position of light and sets a measurement point.

符号の説明Explanation of symbols

１２ センサユニット
１４ プリズム
１６ 流路
１６ａ 注入口
１６ｂ 排出口
１６ｃ 対向部分
１８ 流路部材
２３ リンカー膜
２８ 分注ヘッド
３１ 金属膜
３１ａ センサ面
12 sensor unit 14 prism 16 flow path 16a inlet 16b outlet 16c facing portion 18 flow path member 23 linker film 28 dispensing head 31 metal film 31a sensor surface

Claims (9)

透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され、前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有し、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光を入射させときに、前記結合反応に応じて、その反射光が全反射減衰を生じる減衰角が変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、
前記結合反応の測定ポイントが、前記流路の全長の半分よりも上流側の一部のみに設けられていることを特徴とする全反射減衰を利用するセンサユニット。 A sample solution containing a transparent dielectric, a ligand-fixed film formed on the top surface of the dielectric and fixed with a ligand, and a binding substance that is disposed opposite to the ligand-fixed film and binds to the ligand is fixed to the ligand. A channel member formed with an elongate channel for feeding a liquid while being in contact with the membrane, and formed between the ligand-fixed film and the dielectric, and one surface in contact with the ligand-fixed film is the ligand and the binding substance A thin film serving as a sensor surface for detecting a binding reaction with the light, and when light is incident on the back surface of the thin film through the dielectric so as to satisfy a total reflection condition, the reflected light depends on the binding reaction. In a sensor unit that uses total reflection attenuation in which the attenuation angle changes to generate total reflection attenuation,
A sensor unit using total reflection attenuation, wherein the measurement point of the binding reaction is provided only in a part upstream of a half of the total length of the flow path. 前記薄膜を、前記リガンド固定膜のうち、前記測定ポイントに対応する部分にのみ形成することにより、前記測定ポイントを設定することを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。   The sensor unit using total reflection attenuation according to claim 1, wherein the measurement point is set by forming the thin film only in a portion corresponding to the measurement point in the ligand-fixed film. 前記誘電体に照射される照射光の光路内に配置され、前記照射光のうち、前記誘電体を通じて前記測定ポイントに向かう光を透過して、他の部分へ向かう光を遮断する照射光規制部材を設けたことを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。   An irradiation light restricting member that is disposed in the optical path of the irradiation light irradiated on the dielectric and that transmits the light directed to the measurement point through the dielectric and blocks the light directed to the other part of the irradiation light. The sensor unit using the total reflection attenuation according to claim 1. 前記流路は、前記リガンド固定膜と対向する対向部分が屈曲していることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。   The sensor unit using total reflection attenuation according to any one of claims 1 to 3, wherein the flow path has a bent portion facing the ligand-fixing film. 前記流路は、うずまき状又はつづらおり状に屈曲していることを特徴とする請求項４記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。   5. The sensor unit using total reflection attenuation according to claim 4, wherein the flow path is bent in a spiral shape or a spiral shape. 前記リガンド固定膜は、前記流路のほぼ全域に渡って形成されていることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。   The sensor unit using total reflection attenuation according to any one of claims 1 to 5, wherein the ligand fixing film is formed over substantially the entire area of the flow path. 透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有するセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記結合反応を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、
前記流路の全長の半分よりも上流側の一部のみに前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定することを特徴とする全反射減衰を利用する測定方法。 A sample solution containing a transparent dielectric, a ligand-fixed film formed on the top surface of the dielectric and fixed with a ligand, and a binding substance that is disposed opposite to the ligand-fixed film and binds to the ligand is fixed to the ligand. A flow path member formed with an elongate flow path for feeding a liquid while being in contact with the membrane; and one surface formed between the ligand-fixed film and the dielectric and in contact with the ligand-fixed film is the ligand and the binding substance. A sensor unit having a thin film serving as a sensor surface for detecting a binding reaction of the light, incident light from a light source so as to satisfy a total reflection condition on the back surface of the thin film through the dielectric, and receiving the reflected light to receive the reflected light In a measurement method using total reflection attenuation for measuring the binding reaction by detecting a change in attenuation angle at which reflected light causes total reflection attenuation,
A measurement method using total reflection attenuation, wherein a measurement point for detecting the binding reaction is set only in a part upstream of a half of the entire length of the flow path, and the binding reaction is measured. 前記測定ポイントにのみ前記薄膜を形成して前記結合反応を測定することを特徴とする請求項７記載の全反射減衰を利用する測定方法。   8. The measurement method using total reflection attenuation according to claim 7, wherein the thin film is formed only at the measurement point and the binding reaction is measured. 前記測定ポイントにのみ前記光を入射させて前記結合反応を測定することを特徴とする請求項７記載の全反射減衰を利用する測定方法。   8. The measuring method using total reflection attenuation according to claim 7, wherein the light is incident only on the measurement point to measure the binding reaction.

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