JP4064169B2

JP4064169B2 - Sensors using specific substance recovery methods and total reflection attenuation

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Publication number: JP4064169B2
Application number: JP2002186632A
Authority: JP
Inventors: 信文森
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2002-06-26
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2008-03-19
Anticipated expiration: 2022-06-26
Also published as: JP2004028832A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して試料中の物質の特性を分析する表面プラズモンセンサー等の、全反射減衰を利用したセンサーおよび該全反射減衰を利用したセンサーに利用される測定チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。
【０００３】
従来より、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料中の物質の特性を分析する表面プラズモンセンサーが種々提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、 Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号参照）。
【０００４】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、この光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０００６】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θ_ＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント波の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００７】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００８】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角θ_ＳＰより表面プラズモンの波数が分かると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫ_ＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、ε_ｍとε_ｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【０００９】
【数１】

試料の誘電率ε_ｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料中の特定物質の濃度が分かるので、結局、上記反射光強度が低下する入射角である全反射減衰角θ_ＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【００１０】
なおこの種の表面プラズモンセンサーにおいては、上記全反射減衰角θ_ＳＰを精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に並設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００１１】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の並設方向に関して微分して出力する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値、特に暗線部分に対応した微分値に基づいて試料の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００１２】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似のセンサーとして、例えば「分光研究」第４７巻第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モードセンサーも知られている。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、この光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態、つまり全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【００１３】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。この光強度の低下は、一般に光検出手段により暗線として検出される。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１４】
上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の物質の溶液（試料液）を添加し、所定時間が経過する毎に前述の微分値を測定している。添加した物質が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記微分値を測定し、この微分値に変化が生じているか否か測定することにより、添加した物質とセンシング物質の結合が行われているか否か、すなわち添加した物質がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、化合物と蛋白質、遺伝子と蛋白質などが挙げられる。
【００１５】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、必ずしも全反射減衰角θ_ＳＰの角度そのものを検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角θ_ＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。
【００１６】
また、本出願人は、特願2001-92666において、使い勝手のよいウェル形状の測定チップを用いて、上記全反射減衰の状態の測定を行うセンサーを提案している。ウェル形状の測定チップを用いることにより、例えば試料として液体試料を用いる場合であれば、測定チップ内に入る少量の液体試料を準備するのみで、測定を行うことができる。また測定チップを複数個保持可能なテーブルあるいはアレイ等を用いることにより、短時間で容易に多種の試料の測定を行うことができる。
【００１７】
一方、上記のような全反射減衰の状態の測定を行うセンサーとしては、センシング物質が固定された平板上の測定チップ上に流路機構を用いて、試料を連続的に供給して測定を行うセンサーが知られている。この形態のセンサーを用いれば、センシング物質と特定物質との結合状態を測定する際に、常に新しい試料が測定チップ上に供給されるため、試料中の被検体の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。また、センシング物質と特定物質の結合状態を測定したのち、結合が行われている場合には、この結合体が固定されている測定チップ上に、特定物質が含まれていないバッファ液を流すことより、センシング物質と特定物質との解離状態を測定することができる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従来の表面プラズモンセンサー等の全反射減衰を用いたセンサーでは、センシング物質と特定物質の結合状態あるいは解離状態が主に測定対象とされていた。しかし、近年化合物、遺伝子あるいは蛋白質等のセンシング物質と、蛋白質などの特定物質の結合の測定を行う際に、結合状態または解離状態の解析に加え、センシング物質と、一旦結合した特定物質（以下結合特定物質と記載）との結合を脱離液などを用いて強制的に外し、脱離した結合特定物質の解析を行う手法が使用されようになっている。このような解析を行うセンシング物質と特定物質の組み合わせとしては、化合物と蛋白質、遺伝子と蛋白質、あるいは蛋白質と蛋白質等が知られている。
【００１９】
例えば蛋白質フィッシングと呼ばれる解析方法では、多種類の蛋白質を含む試料液をセンシング物質であるＤＮＡ等が固定された薄膜層上に供給し、結合反応が生じた場合には、結合した蛋白質（以下結合蛋白質と記載）を脱離液等を用いてて脱離させて回収し、その結合蛋白質を解析することにより、蛋白質の種類の特定および結合状態の解析等を行っている。
【００２０】
上記のように、結合特定物質の解析を精度よく行うためには、できる限り多くの量の結合特定物質を回収することが望ましい。しかしながら、従来の全反射減衰を用いたセンサーにおいては、ウェル形状の測定チップを用いて試料を溜めて測定を行う場合であれ、平板上の測定チップ上に流路機構を用いて試料を連続的に供給して測定を行う場合であれ、センシング物質と試料とが接触する面積が小さく、微少な量の特定物質がセンシング物質と結合するのみであるため、十分な量の結合特定物質を回収することが困難であるという問題があった。
【００２１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、センシング物質と結合した結合特定物質の回収量を増加させることのできる全反射減衰を利用したセンサーを提供することを目的とするものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明の全反射減衰を利用したセンサーは、光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロックと、
該誘電体ブロックの一面に形成される第１の薄膜層と、
該第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られる角度で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用したセンサーにおいて、
前記誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層と、
該第２の薄膜層の表面上に配される前記センシング物質とをさらに備えたことを特徴とするものである。
【００２３】
このようなセンサーとしては、金属膜を上記薄膜層として用いる前述の表面プラズモンセンサーや、誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成された光導波層とからなる層を上記薄膜層として用いる前述の漏洩モードセンサー等がある。
【００２４】
上記センサーは、前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えたものであってもよい。
【００２５】
また、上記センサーは、前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えたものであってもよい。
【００２６】
上記第２の薄膜層は、前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されているものであってもよい。
【００２７】
本発明の測定チップは、誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの上面に形成された第１の薄膜層と、該第１の薄膜層上に試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠とを備え、前記全反射減衰を利用したセンサーに用いられる測定チップであって、
前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層が、前記試料保持枠の内壁面に設けられていることを特徴とするものである。
【００２８】
上記測定チップは、前記試料保持枠の内壁面が、前記第１の薄膜層から離れるにつれて側外方に離れる形状に形成されているものであってもよい。
【００２９】
なお、本発明によるセンサーにおいて、光検出手段により前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、全反射減衰の状態を測定する方法としては種々の方法があり、例えば、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる種々の入射角で入射させ、各入射角に対応した位置毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、全反射減衰により発生した暗線の位置（角度）を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよいし、D.V.Noort,K.johansen,C.-F.Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585-588 に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよい。
【００３０】
またP.I.Nikitin,A.N.Grigorenko,A.A.Beloglazov,M.V.Valeiko,A.I.Savchuk,O.A.Savchuk, Surface Plasmon Resonance Interferometry for Micro-Array Biosensing, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.235-238 に記載されているように、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させるとともに、この光ビームの一部を、この光ビームが前記界面に入射する前に分割し、この分割した光ビームを、前記界面で全反射した光ビームと干渉させて、その干渉後の光ビームの強度を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよい。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の全反射減衰を利用したセンサーは、誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質に加え、誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質を備えているため、第１の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質に試料を供給すると共に、第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質にも試料を供給することにより、第１の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質および第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質の両方が、それぞれ試料中の特定物質と結合するため、従来の全反射減衰を利用したセンサーに比べて、多くの結合特定物質が生成され、これらの結合特定物質を回収することにより、結合特定物質の回収量を増加させることができる。
【００３２】
上記センサーが、前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えたものであれば、センシング物質と試料中の特定物質との結合状態を測定する際に、常に新しい試料がセンシング物質上に供給されるため、試料中の特定物質の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。
【００３３】
また、上記センサーが、前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えたものであれば、例えば試料として液体試料を用いる際に、試料保持枠内に入る少量の液体試料を準備するのみで、結合状態の測定を行うことができる。
【００３４】
上記第２の薄膜層が、前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されているものであれば、測定精度を向上するために、例えば温度調整や湿度調整等を行う際に、第１の薄膜層および誘電体ブロックのみに調整を施すことが可能であり、小型の調整手段を用いることができる。
【００３５】
本発明の測定チップは、誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの上面に形成された第１の薄膜層と、該第１の薄膜層上に試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠とを備え、前記全反射減衰を利用したセンサーに用いられる測定チップであって、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層が、前記試料保持枠の内壁面に設けられているものであれば、測定チップのウェル部の底面（第１の薄膜層）および内壁面（第２の薄膜層）の全面にセンシング物質が固定可能であり、この測定チップに試料を供給すれば、底面および内壁面のセンシング物質に特定物質が結合する。このため、センシング物質がウェル部の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００３６】
さらに、試料保持枠の内壁面に、第２の薄膜層が形成されていない場合には、センシング物質も固定されることがない。このため、センシング物質と試料の結合状態を測定する際に、試料保持枠の内壁面において、試料保持枠を形成する透明樹脂等と、試料中の特定物質とが結合してしまう場合がある。このようにして形成された結合特定物質は、本来の解析対象であるセンシング物質と係合する結合特定物質とは異なる場合があり、これらの透明樹脂等と結合した結合特定物質が、センシング物質と結合した結合特定物質に混入して回収された場合には、結合特定物質の解析の信頼性が低下する可能性がある。
【００３７】
また、本来センシング物質と結合する特定物質が、測定チップの内壁の透明樹脂等と多量に結合してしまい、センシング物質との結合量が減少し、結合状態の測定に支障が生じることもある。
【００３８】
本発明の測定チップを用いれば、試料が接触する面にはセンシング物質が固定されているため、本来の解析対象である結合特定物質以外の結合特定物質が形成されるおそれや、多量の特定物質が測定チップの内壁面と結合してしまい、結合状態の測定に支障が生じるおそれがなく、結合状態の測定の信頼度および結合特定物質の解析結果の信頼度が向上する。
【００３９】
また、上記測定チップの試料保持枠の内壁面が、前記第１の薄膜層から離れるにつれて側外方に離れる形状に形成されている場合には、第１の薄膜層および第２の薄膜層の厚みを均一化する効果を得ることもできる。すなわち、金属膜等からなるこの薄膜層は一般に蒸着によって形成されるので、その場合に試料保持枠を上述のような形状としておけば、蒸着に際して蒸着材料が試料保持枠に遮られて薄膜層の厚みが不均一になることを防止可能である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものである。
【００４１】
図１に示す通りこの表面プラズモンセンサーは、使い切りの測定チップ10と、測定用の光ビーム（レーザビーム）20を発生させる半導体レーザ等のレーザ光源21と、入射光学系である集光レンズ22と、光検出器23と、上記レーザ光源21の駆動を制御するとともに、上記光検出器23の出力信号Ｓを受けて後述の処理を行なう信号処理部24と、表示部25とを有している。
【００４２】
測定チップ10は、概略四角錐形状とされた誘電体ブロック11と、この誘電体ブロック11の上面に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる第１の薄膜層としての薄膜層12と、この薄膜層12の上に側方が閉じられた空間を画成する筒状部材からなる試料保持枠13と、この試料保持枠13の内壁面に形成された第２の薄膜層としての薄膜層14とを有している。試料液保持枠13の部分は、その内面が薄膜層12から上方に離れるにつれて側外方に離れるテーパ形状とされている。この試料液保持枠13内のテーパ形状の空間は、試料液15を貯えるウェル部16として機能している。
【００４３】
測定チップ10は、誘電体ブロック11と試料液保持枠13とを、例えば透明樹脂等から一体整形し、蒸着により薄膜層12および薄膜層14を形成したものである。なお本例では、薄膜層12および薄膜層14の上にＤＮＡからなるセンシング物質17が固定され、試料液15の中には種々の蛋白質が含まれている。
【００４４】
集光レンズ22は、光ビーム20を集光して収束光状態で誘電体ブロック11に通し、誘電体ブロック11と薄膜層12との界面12ａに対して種々の入射角が得られるように入射させる。この入射角の範囲は、上記界面12ａにおいて光ビーム20の全反射条件が得られ、かつ、表面プラズモン共鳴が生じ得る角度範囲を含む範囲とされる。
【００４５】
なお光ビーム20は、界面12ａに対してｐ偏光で入射する。そのようにするためには、予めレーザ光源21をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板や偏光板で光ビーム20の偏光の向きを制御してもよい。
【００４６】
光検出器23は、多数の受光素子が１列に配されてなるラインセンサーであり、受光素子の並び方向が図１中の矢印Ｘ方向となるように配されている。信号処理部24は、上記光検出器23の出力信号Ｓを受ける測定手段26を有している。
【００４７】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる試料分析について説明する。まず、測定ユニット10に、試料液15が供給される。信号処理部24からの指令でレーザ光源21が駆動され、そこから発せられた光ビーム20が前述のように収束する状態で、誘電体ブロック11と薄膜層12との界面12ａに入射する。この界面12ａで全反射した光ビーム20は、光検出器23によって検出される。
【００４８】
光ビーム20は、上述の通り収束光状態で誘電体ブロック11に入射するので、上記界面12ａに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム20は界面12ａで全反射し、この反射した光ビーム20には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００４９】
このように光ビーム20が全反射するとき、界面12ａから薄膜層12側にエバネッセント波がしみ出す。そして、光ビーム20が界面12ａに対してある特定の入射角θ_ＳＰで入射した場合は、このエバネッセント波が薄膜層12の表面に励起する表面プラズモンと共鳴するので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。なお図３には、この全反射減衰現象が生じた際の入射角θと反射光強度Ｉとの関係を概略的に示してある。
【００５０】
そこで、測定手段26において、全反射減衰の状態として、光検出器23が出力する出力信号Ｓから各受光素子毎の検出光量を調べ、暗線を検出した受光素子の位置に基づいて上記入射角（全反射減衰角）θ_ＳＰを求める。
【００５１】
本実施形態では薄膜層12上に、試料液15の中の特定物質である蛋白質と結合するセンシング物質17が固定され、蛋白質との結合状態に応じてセンシング物質17の屈折率が変化するので、上記全反射減衰角θ_ＳＰを測定し続けることにより、この結合状態の変化の様子を調べることができる。
【００５２】
すなわち、時間経過とともに、全反射減衰角θ_ＳＰの角度が変化する場合には、試料液15中の蛋白質がセンシング物質17と結合していると判定することができ、全反射減衰角θ_ＳＰの角度に変化が生じない場合には、試料液15中には、センシング物質と結合する蛋白質は存在していないと判定することができる。測定手段26は、以上の原理に基づいて上記結合の有無を判定し、その判定結果が表示部25に表示される。
【００５３】
所定時間経過後に、全反射減衰角θ_ＳＰの角度に変化が生じ、結合が生じているとの判定結果が表示された場合には、測定チップ10を測定位置から取り外し、試料液15を捨て、センシング物質17と結合蛋白質の結合を外す脱離処理を施して、結合蛋白質を回収する。その後この結合蛋白質を解析し、その種類および結合状態等を調べる。
【００５４】
すなわち、本実施形態におけるセンサーでは、測定チップ10のウェル部16の底面および内壁面の全面に薄膜層が形成され、この薄膜層の上にセンシング物質17が固定されているため、従来のウェル部16の底面のみに薄膜層が形成され、その上にセンシング物質が固定されているセンサーに比べ、センシング物質が固定されている面積が広くなる。このセンシング物質17に蛋白質が結合しているため、従来のセンサーより多くの蛋白質がセンシング物質17と結合するので、この結合蛋白質を回収する際には、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００５５】
また、ウェル部16を備えた測定チップ10を用いて測定を行っているため、ウェル部16に入る少量の試料液15を準備するのみで、結合状態の測定を行うことができる。
【００５６】
さらに、例えば試料保持枠13の内壁面に、薄膜層14が形成されていない場合には、センシング物質17も固定されることがない。このため、試料保持枠13の内壁面において、試料保持枠13を形成する透明樹脂と試料液15中の蛋白質が結合してしまう場合がある。このようにして形成された結合蛋白質は、本来の解析対象であるセンシング物質17と係合した結合蛋白質とは異なる場合があり、これらの透明樹脂と結合した蛋白質が、センシング物質17と結合した結合蛋白質に混入して回収された場合には、結合蛋白質の解析の信頼性が低下する可能性がある。本実施の形態においては、試料液15が接触する面には全てセンシング物質17が固定されているため、本来の解析対象である結合蛋白質以外の結合蛋白質が形成されるおそれがなく、結合蛋白質の解析結果の信頼度が一層向上する。
【００５７】
また、試料保持枠13の内壁面に、センシング物質17が固定されていない場合には、本来センシング物質17と結合する結合蛋白質が、内壁面の透明樹脂等と多量に結合してしまい、センシング物質17との結合量が減少してしまい、結合状態の測定に支障が生じることがあるが、測定チップ10を用いれば、試料液15が接触する面には全てセンシング物質17が固定されているため、多量の結合蛋白質が測定チップ10の内壁面と結合してしまい、結合状態の測定に支障が生じることがなく、結合状態の測定の信頼度が向上する。
【００５８】
次に、図３および図４を参照して本発明の第２の実施の形態である表面プラズモンセンサーについて説明する。図３は表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものであり、図４は、この表面プラズモンセンサーに用いられる流路ユニットの上面図および側断面図である。なお、図３においては、図１中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００５９】
図２に示す通りこの表面プラズモンセンサーは、測定チップ30と、測定用の光ビーム（レーザビーム）20を発生させるレーザ光源21と、集光レンズ22と、光検出器23と、信号処理部24と、表示部25と、流路ユニット50とを有している。
【００６０】
測定チップ30は、略四角錐形状とされた透明樹脂等からなる誘電体ブロック31と、この誘電体ブロック31の上面に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる第１の薄膜層としての薄膜層32とを有している。薄膜層32の上には、ＤＮＡからなるセンシング物質33が固定されている。
【００６１】
測定チップ30の上面には、薄膜層32上に流路を形成するための流路ユニット50が取り付けられている。この流路ユニット50は、概略四角形状に形成されている流路ホルダ51に、試料液15を供給するための供給路52および試料液15を排出するための排出路53が取り付けられ、測定チップ30に簡単に着脱することができる。流路ホルダ51には、供給路52の出口と排出路53の入口が開口され、また流路ホルダ51の下面の金属膜12の表面と接する領域に、この供給路52の出口と排出路53の入口を囲むシール部54が設けられている。このため、この流路ユニット50を測定チップ30に取り付けた場合には、薄膜層32およびシール部54によりシールされた測定流路55が形成される。図４に流路ユニット50の上面図および側断面図を示す。なお、シール部54は、流路ホルダ51の上部部分と一体形成されたものであってもよいし、上部部分とは異なる素材により形成され、後付されたものであってもよく、例えばＯリング等を流路ホルダ51の下部部分に取り付けたものであってもよい。
【００６２】
流路ユニット50の供給路52には、ポンプ56が接続され、該ポンプ56には試料液溜部57および脱離液溜部58が接続されている。試料液溜部57には予め複数種類の蛋白質を含む試料液15が準備され、脱離液溜部58には、センシング物質と結合蛋白質の結合を外す、脱離液59が準備されている。ポンプ56は、測定時には、試料液15を供給路52に供給し、また結合蛋白の回収時には脱離液59を供給路52へ供給する。流路ユニット50、ポンプ56および液溜部57が、発明の試料給排手段として機能する。
【００６３】
排出路53には、結合蛋白質生成部60が接続され、結合蛋白質生成部60には、排出口61および結合蛋白質回収部62が接続されている。測定時には、試料液15は結合蛋白質生成部60を経て、排出口61から排出される。また結合蛋白の回収時には、排出口61が閉鎖され、脱離液59は、結合蛋白質生成部60を経て、結合蛋白質回収部62へ送液される。
【００６４】
結合蛋白質生成部60には、誘電体ブロック31を形成する透明樹脂と同等の同盟樹脂から形成される基板63と、該基板63上に形成される第２の薄膜層としての薄膜層64と、該薄膜層64に固定されるセンシング物質65とが設けられている。なお、薄膜層64は、薄膜層32と同一の素材から同様に形成されたものであり、またセンシング物質65も、センシング物質33と同一の素材から同様に固定されたものである。結合蛋白質回収部62は、測定流路55内および結合蛋白質生成部60内でセンシング物質から脱離された結合蛋白質を脱離液59から回収するものである。なお、図３において点線で囲まれている領域は、温調エリア69であり、図示省略した温調手段により常に所定温度に保たれている。
【００６５】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる試料分析について説明する。測定に先立ち、流路ユニット50のシール部54が測定チップ30の薄膜層32に密着するように、流路ユニット50を測定チップ30に取り付ける。ポンプ56を作動させ、液溜部57に準備されている試料液15を流路ユニット50の供給路52を介して測定流路55へ供給する。測定を行っている間は、ポンプ56を作動させ続けるため、試料液15は測定流路55に連続的に供給される。測定流路55はシール部54によりシールされているため、測定流路55に供給された試料液15は順次排出路53、結合蛋白質生成部60および排出口61を通って排出される。
【００６６】
測定流路55内に、試料液15が供給された後、測定を開始する。光ビーム20が収束する状態で、誘電体ブロック11と薄膜層32との界面32ａに入射する。この界面12ａで全反射した光ビーム20は、光検出器23によって検出される。以後の測定方法は、第１の実施の形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
【００６７】
測定開始後、時間経過とともに、全反射減衰角θ_ＳＰの角度が変化する場合には、試料液15中の蛋白質がセンシング物質33と結合していると見なすことができ、全反射減衰角θ_ＳＰの角度に変化が生じない場合には、試料液15中には、センシング物質33と結合する蛋白質は存在していないと見なすことができる。なお、試料液15は継続的に供給されるめ、試料液15中の特定の蛋白質がセンシング物質33と結合している場合には、結合蛋白質生成部60においても同じ蛋白質がセンシング物質65と結合し、結合蛋白質が生成されている。
【００６８】
所定時間経過後に、全反射減衰角θ_ＳＰの角度に変化が生じている場合には、ポンプ56により、試料液15の供給を停止し、代わりに脱離液59の供給を開始する。同時に、排出口61を閉鎖し、排出された脱離液59を結合蛋白質回収部62へ送液する。
【００６９】
測定流路55内および結合蛋白質生成部60内でセンシング物質から脱離された結合蛋白質は、脱離液59とともに、結合蛋白質回収部62へ送られて、結合蛋白質回収部62で回収される。その後この結合蛋白質を解析し、その種類および結合状態等を調べる。
【００７０】
すなわち、本実施の形態では、測定チップ30の薄膜層32に加え、結合蛋白質生成部60の薄膜層64にもセンシング物質が固定され、これらのセンシング物質に蛋白質が結合しているため、センシング物質が測定チップ30の薄膜層32のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００７１】
また、本センサーは、流路ユニット50を測定チップ30へ取り付け、試料液15をセンシング物質33上へ給排しているため、常に新しい試料液15がセンシング物質33上に供給されるため、試料液15中の蛋白質の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。
【００７２】
さらに、本実施の形態においては、薄膜層64が設けられている結合蛋白質生成部60が、測定チップ30から分離されて配置されているため、薄膜層64を温調エリア69の外に設けることができ、温調エリア69の大型化を防止することができる。
【００７３】
次に、図５を参照して本発明の第３の実施形態について説明する。なお、図５においては、図１中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００７４】
この第３の実施の形態の全反射減衰を利用したセンサーは、先に説明した漏洩モードセンサーであり、測定チップ90を用いるように構成されている。この測定チップ90の誘電体ブロック11の上面および試料保持枠13の内壁面にはクラッド層91が形成され、さらにその上には光導波層92が形成されている。また光導波層92の表面上にはセンシング物質17が固定されている。
【００７５】
誘電体ブロック11は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層91は、誘電体ブロック11よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層92は、クラッド層91よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層91の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で36.5ｎｍ、光導波層92の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で700ｎｍ程度とされる。
【００７６】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源21から出射した光ビーム20を誘電体ブロック11を通してクラッド層91に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビーム20が誘電体ブロック11とクラッド層91との界面91ａで全反射するが、クラッド層91を透過して光導波層92に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層92を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層92に取り込まれるので、上記界面91ａで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７７】
光導波層92における導波光の波数は、該光導波層92の上のセンシング物質17の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、センシング物質17の屈折率を測定することができ、試料液15中の蛋白質とセンシング物質17との結合状態を知ることができる。
【００７８】
本実施形態でも、測定チップ90のウェル部16の底面および内壁面の全面にセンシング物質17が固定され、これらのセンシング物質17に蛋白質が結合するため、センシング物質17がウェル部16の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００７９】
次に図６を参照して本発明の第４の実施の形態について説明する。本実施の形態の表面プラズモンセンサーは、上記第１の実施の形態の表面プラズモンセンサーと比べ測定方法を変更したものである。図６は、本実施の形態の表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものであり、本表面プラズモンセンサーの測定位置には、レーザ光源120 とＣＣＤ121 が配設されており、レーザ光源120 とＣＣＤ121 との間には、コリメータレンズ122 、干渉光学系123 、集光レンズ124 およびアパーチャー125 が配設されている。
【００８０】
上記干渉光学系123 は、偏光フィルタ131 、ハーフミラー132 、ハーフミラー133 およびミラー134 により構成されている。さらに、ＣＣＤ121 は測定手段135 に接続されており、測定手段135 は表示部62に接続されている。
【００８１】
以下、本実施の形態の表面プラズモンセンサーにおける測定動作について説明する。レーザ光源120 が駆動されて光ビーム140 が発散光の状態で出射される。この光ビーム140はコリメータレンズ122 により平行光化されて偏光フィルタ131に入射する。偏光フィルタ131 を透過して界面12ａに対してｐ偏光で入射するようにされた光ビーム140 は、ハーフミラー132 により一部がレファレンス光ビーム140Rとして分割され、ハーフミラー132 を透過した残りの光ビーム140Sは界面12ａに入射する。界面12ａで全反射した光ビーム140Sおよびミラー134 で反射したレファレンス光ビーム140Rはハーフミラー133 に入射して合成される。合成された光ビーム140'は集光レンズ124 により集光され、アパーチャー125 を通過してＣＣＤ121 によって検出される。このとき、ＣＣＤ121 で検出される光ビーム140'は、光ビーム140Sとレファレンス光ビーム140Rとの干渉の状態に応じて干渉縞を発生させる。
【００８２】
ここで、試料液15中の蛋白質が薄膜層12の表面に固定されているセンシング物質17と結合するか否かを、試料液15を測定チップ10へ供給後、継続的に測定を行い、ＣＣＤ121 により検出される干渉縞の変化を検出することにより、判定することができる。
【００８３】
すなわち、上記試料液15中の蛋白質とセンシング物質17との結合状態に応じてセンシング物質17の屈折率が変化するため、界面12ａで全反射した光ビーム140Sおよびレファレンス光ビーム140Rがハーフミラー133 により合成される際に、干渉の状態が変化するため、上記干渉縞の変化に応じて結合反応の有無を検出することができる。測定手段135 は、以上の原理に基づいて上記反応の有無を検出し、その結果が表示部25に表示される。
【００８４】
本実施形態でも、測定チップ10のウェル部16の底面および内壁面の全面にセンシング物質17が固定され、これらのセンシング物質17に蛋白質が結合するため、センシング物質17がウェル部16の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００８５】
なお、上記各実施の形態においては、誘電体ブロックが薄膜層とともに、使い切りされる測定チップを構成しているが、誘電体ブロックがチップ化されずに、表面プラズモンセンサー本体に組み込まれる場合であっても、同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【図２】上記表面プラズモンセンサーにおける光ビーム入射角と反射光強度との関係の説明図
【図３】本発明の第２の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーにおける流路ユニットの上面図および側断面図
【図５】本発明の第３の実施の形態による漏洩モードセンサーの側面図
【図６】本発明の第４の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【符号の説明】
10,30,90 測定チップ
11,31 誘電体ブロック
12,14,32,64 薄膜層
12ａ誘電体ブロックと薄膜層との界面
13 試料保持枠
15 試料液
16 ウェル部
17,33 センシング物質
20 光ビーム
21 光源
22 集光レンズ
23 光検出器
24 信号処理部
26 測定手段
50 流路ユニット
51 流路ホルダー
52 供給路
53 排出路
60 結合蛋白質生成部
62 結合蛋白質回収部
69 温調エリア
91 クラッド層
91ａ誘電体ブロックとクラッド層との界面
92 光導波層
120 レーザ光源
121 ＣＣＤ
122 コリメータレンズ
123 干渉光学系
124 集光レンズ
125 アパーチャー
134 ミラー
135 測定手段
140 光ビーム[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor using total reflection attenuation, such as a surface plasmon sensor that analyzes the characteristics of a substance in a sample using generation of surface plasmons, and a measurement chip used for the sensor using the total reflection attenuation. .
[0002]
[Prior art]
In the metal, free electrons collectively vibrate to generate a dense wave called a plasma wave. A quantized version of this dense wave generated on the metal surface is called surface plasmon.
[0003]
Conventionally, various surface plasmon sensors that analyze the characteristics of a substance in a sample by utilizing a phenomenon in which the surface plasmon is excited by light waves have been proposed. Among them, one that uses a system called a Kretschmann arrangement is particularly well known (see, for example, JP-A-6-167443).
[0004]
A surface plasmon sensor using the above system basically includes, for example, a dielectric block formed in a prism shape, a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a sample, and a light source that generates a light beam. An optical system that causes the light beam to be incident on the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the metal film, and a light beam that is totally reflected at the interface And a measuring means for measuring the surface plasmon resonance state, that is, the total reflection attenuation state, based on the detection result of the light detecting means.
[0005]
In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
[0006]
In the surface plasmon sensor having the above-described configuration, the specific incident angle θ is greater than the total reflection angle with respect to the metal film. _SP The evanescent wave having an electric field distribution is generated in the sample in contact with the metal film, and surface plasmons are excited at the interface between the metal film and the sample by the evanescent wave. When the wave number vector of the evanescent wave is equal to the wave number of the surface plasmon and wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of light is transferred to the surface plasmon, so that the entire energy is transferred to the interface between the dielectric block and the metal film. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means.
[0007]
The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
[0008]
Incident angle θ at which this total reflection attenuation (ATR) occurs _SP If the wave number of the surface plasmon is known, the dielectric constant of the sample can be obtained. In other words, the wave number of surface plasmon is K _SP , Ω is the angular frequency of the surface plasmon, c is the speed of light in vacuum, ε _m And ε _s Are the metal and the dielectric constant of the sample, respectively.
[0009]
[Expression 1]

Dielectric constant of sample ε _s Is known, the concentration of the specific substance in the sample can be found based on a predetermined calibration curve or the like, so that the total reflection attenuation angle θ, which is the incident angle at which the reflected light intensity decreases, is eventually obtained. _SP By knowing, it is possible to obtain the characteristics related to the dielectric constant, that is, the refractive index of the sample.
[0010]
In this type of surface plasmon sensor, the total reflection attenuation angle θ _SP In order to measure the light intensity with high accuracy and with a large dynamic range, it is considered to use an arrayed light detection means as disclosed in JP-A-11-326194. The light detecting means is formed by arranging a plurality of light receiving elements in parallel in a predetermined direction, in such a direction that different light receiving elements receive the components of the light beam totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
[0011]
In that case, there is provided a differentiating means for differentiating and outputting the photodetection signal output from each light receiving element of the arrayed light detecting means with respect to the parallel arrangement direction of the light receiving elements, and the differential output from the differentiating means. In many cases, the characteristic relating to the refractive index of the sample is obtained based on the value, particularly the differential value corresponding to the dark line portion.
[0012]
Moreover, as a similar sensor using total reflection attenuation (ATR), for example, a leak mode sensor described in pages 21 to 23 and pages 26 to 27 of “Spectroscopy” Vol. 47 No. 1 (1998) is also available. Are known. This leakage mode sensor is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be brought into contact with a sample. An optical waveguide layer, a light source that generates a light beam, and the light beam are incident on the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. Optical system, light detection means for detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface, and measurement means for measuring the excitation state of the waveguide mode, that is, the state of total reflection attenuation based on the detection result of the light detection means Is provided.
[0013]
In the leaky mode sensor having the above configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle is propagated in the guided mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the sample on the optical waveguide layer, the refractive index of the sample and its related sample characteristics are analyzed by knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs. be able to.
[0014]
The above-described surface plasmon sensor and leakage mode sensor may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer (surface plasmon sensor) In the case of a leakage mode sensor, a sensing substance is fixed on a clad layer and an optical waveguide layer), and various substance solutions (sample liquids) are added onto the sensing substance, and a predetermined time is passed. The above-mentioned differential value is measured every time it passes. If the added substance binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this combination. Therefore, by measuring the differential value every time a predetermined time elapses and measuring whether or not this differential value has changed, it is determined whether the added substance and the sensing substance are combined, that is, the added substance. It is possible to determine whether or not is a specific substance that binds to the sensing substance. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, a compound and a protein, and a gene and a protein.
[0015]
In order to measure the binding state between the analyte and the sensing substance, the total reflection attenuation angle θ _SP There is no need to detect the angle itself. For example, a sample solution is added to the sensing substance, and then the total reflection attenuation angle θ _SP It is also possible to measure the amount of change in angle and measure the coupling state based on the magnitude of the amount of change in angle.
[0016]
In addition, in Japanese Patent Application No. 2001-92666, the present applicant has proposed a sensor that measures the above-described total reflection attenuation state using a well-shaped measurement chip that is easy to use. By using a well-shaped measurement chip, for example, when a liquid sample is used as a sample, the measurement can be performed only by preparing a small amount of liquid sample that enters the measurement chip. Further, by using a table or an array that can hold a plurality of measurement chips, various samples can be easily measured in a short time.
[0017]
On the other hand, as a sensor for measuring the total reflection attenuation state as described above, a sample is continuously supplied to a measurement chip on a flat plate on which a sensing substance is fixed, and measurement is performed. Sensors are known. With this type of sensor, when measuring the binding state between a sensing substance and a specific substance, a new sample is always supplied onto the measurement chip, so the concentration of the analyte in the sample does not change, and the binding state Can be accurately measured. In addition, after the binding state between the sensing substance and the specific substance is measured, if the binding is performed, a buffer solution that does not contain the specific substance is allowed to flow over the measurement chip to which the conjugate is fixed. Thus, the dissociation state between the sensing substance and the specific substance can be measured.
[0018]
[Problems to be solved by the invention]
In a conventional sensor using total reflection attenuation such as a surface plasmon sensor, a binding state or a dissociation state of a sensing substance and a specific substance is mainly measured. However, in recent years, when measuring the binding of a sensing substance such as a compound, gene or protein and a specific substance such as a protein, in addition to analyzing the binding state or dissociation state, the sensing substance and the specific substance once bound (hereinafter referred to as binding) A method of forcibly removing a bond with a specific substance (denoted as a specific substance) using a desorbing solution and analyzing the desorbed bond specific substance is being used. Known combinations of sensing substances and specific substances for such analysis include compounds and proteins, genes and proteins, or proteins and proteins.
[0019]
For example, in an analysis method called protein fishing, a sample solution containing many kinds of proteins is supplied onto a thin film layer on which a sensing substance such as DNA is fixed, and when a binding reaction occurs, the bound protein (hereinafter referred to as binding protein) The protein is described by desorption using a desorption solution or the like and collected, and the binding protein is analyzed to identify the type of protein and analyze the binding state.
[0020]
As described above, in order to accurately analyze the binding specific substance, it is desirable to collect as much of the binding specific substance as possible. However, in a conventional sensor using total reflection attenuation, even when a sample is collected using a well-shaped measurement chip, the sample is continuously collected using a flow path mechanism on the measurement chip on a flat plate. Even if the measurement is performed by supplying to the sensor, the area where the sensing substance and the sample are in contact is small, and only a small amount of the specific substance binds to the sensing substance. There was a problem that it was difficult.
[0021]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a sensor using total reflection attenuation that can increase the recovery amount of a binding specific substance bound to a sensing substance. .
[0022]
[Means for Solving the Problems]
A sensor using total reflection attenuation of the present invention includes a light source that generates a light beam,
A dielectric block transparent to the light beam;
A first thin film layer formed on one surface of the dielectric block;
A sensing substance disposed on the surface of the first thin film layer and bound to a specific substance in the sample;
An optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at an angle at which a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the first thin film layer;
Light detecting means for detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface;
In a sensor using total reflection attenuation, comprising a measuring means for measuring the state of total reflection attenuation based on the detection result of the light detection means,
A second thin film layer formed on a different surface from the one surface of the dielectric block and having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer;
And the sensing substance disposed on the surface of the second thin film layer.
[0023]
Such a sensor includes the above-described surface plasmon sensor using a metal film as the thin film layer, a clad layer formed on one surface of a dielectric block, and an optical waveguide layer formed on the clad layer. There is the above-described leakage mode sensor using a layer as the thin film layer.
[0024]
The sensor may include a sample supply / discharge unit that continuously supplies the sample onto the surface of the first thin film layer and continuously discharges the supplied sample.
[0025]
Further, the sensor may include a sample holding frame that forms a well portion for holding the sample on the upper surface of the first thin film layer.
[0026]
The second thin film layer may be separated from the first thin film layer and the dielectric block.
[0027]
The measurement chip of the present invention includes a dielectric block, a first thin film layer formed on the top surface of the dielectric block, and a sample holding frame that forms a well portion for holding a sample on the first thin film layer. A measurement chip used for a sensor using the total reflection attenuation,
A second thin film layer having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer is provided on the inner wall surface of the sample holding frame.
[0028]
The measurement chip may be formed such that an inner wall surface of the sample holding frame is separated from the first thin film layer toward the outer side.
[0029]
In the sensor according to the present invention, there are various methods for measuring the total reflection attenuation state by detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface by the light detecting means. The incident light is incident at various incident angles at which the total reflection condition is obtained at the interface, the intensity of the light beam totally reflected at the interface is detected at each position corresponding to each incident angle, and the position of the dark line generated by the total reflection attenuation ( Angle) to detect the total reflection attenuation state, DVNoort, K. johansen, C.-F. Mandenius, Porous Gold in Surface Plasmon Resonance Measurement, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.585- As described in 588, a light beam having a plurality of wavelengths is incident at an incident angle at which a total reflection condition is obtained at the interface, and the intensity of the light beam totally reflected at the interface is detected for each wavelength. Detect the degree of total reflection attenuation for each wavelength. Thus, the state of total reflection attenuation may be measured.
[0030]
In addition, as described in PINikitin, ANGrigorenko, AA Beloglazov, MVValeiko, AISavchuk, OASavchuk, Surface Plasmon Resonance Interferometry for Micro-Array Biosensing, EUROSENSORS XIII, 1999, pp.235-238 And a part of the light beam is split before the light beam enters the interface, and the split light beam is caused to interfere with the light beam totally reflected at the interface. Then, the total reflection attenuation state may be measured by detecting the intensity of the light beam after the interference.
[0031]
【The invention's effect】
The sensor using the attenuated total reflection of the present invention is disposed on the surface of the first thin film layer formed on one surface of the dielectric block, and in addition to the sensing substance that binds to the specific substance in the sample, the dielectric block On the surface of the first thin film layer, since the sensing material is provided on the surface of the second thin film layer formed on a surface different from the first surface and having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer. A sensing material disposed on the surface of the first thin film layer by supplying a sample to the sensing material disposed on the surface and also supplying a sample to the sensing material disposed on the surface of the second thin film layer Since both of the sensing substances arranged on the surface of the second thin film layer and the specific substance in the sample respectively bind to each other, a large number of specific substances are generated as compared with the conventional sensor using total reflection attenuation. And these combined By recovering constant material, it is possible to increase the recovery amount of binding specific substance.
[0032]
If the sensor is provided with a sample supply / discharge means for continuously supplying the sample onto the surface of the first thin film layer and continuously discharging the supplied sample, a sensing substance and When measuring the binding state with a specific substance in a sample, a new sample is always supplied onto the sensing substance, so the concentration of the specific substance in the sample does not change, and the binding state can be measured accurately. it can.
[0033]
If the sensor includes a sample holding frame that forms a well portion for holding the sample on the upper surface of the first thin film layer, for example, when a liquid sample is used as the sample, The binding state can be measured simply by preparing a small amount of liquid sample to enter.
[0034]
If the second thin film layer is separated from the first thin film layer and the dielectric block, in order to improve measurement accuracy, for example, when performing temperature adjustment, humidity adjustment, etc. Adjustments can be made only to one thin film layer and dielectric block, and a small adjustment means can be used.
[0035]
The measurement chip of the present invention includes a dielectric block, a first thin film layer formed on the top surface of the dielectric block, and a sample holding frame that forms a well portion for holding a sample on the first thin film layer. And a second thin film layer having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer is provided on the inner wall surface of the sample holding frame. A sensing substance can be fixed to the entire bottom surface (first thin film layer) and inner wall surface (second thin film layer) of the well portion of the measurement chip, and a sample is supplied to the measurement chip. Then, the specific substance is bonded to the sensing substance on the bottom surface and the inner wall surface. For this reason, compared with the case where the sensing substance is fixed only to the bottom surface of the well portion, the amount of the recovered binding protein is increased.
[0036]
Further, when the second thin film layer is not formed on the inner wall surface of the sample holding frame, the sensing substance is not fixed. For this reason, when measuring the binding state of the sensing substance and the sample, the transparent resin or the like forming the sample holding frame may be bonded to the specific substance in the sample on the inner wall surface of the sample holding frame. The binding specific substance formed in this way may be different from the binding specific substance that engages with the sensing substance that is the original analysis target, and the binding specific substance combined with these transparent resins or the like is different from the sensing substance. In the case of being collected by being combined with the bound binding specific substance, the reliability of the analysis of the binding specific substance may be lowered.
[0037]
In addition, the specific substance that originally binds to the sensing substance is bound in a large amount to the transparent resin or the like on the inner wall of the measurement chip, and the amount of binding with the sensing substance is reduced, which may hinder the measurement of the binding state.
[0038]
If the measuring chip of the present invention is used, since the sensing substance is fixed on the surface in contact with the sample, there is a risk that a binding specific substance other than the binding specific substance that is the original analysis target may be formed, or a large amount of the specific substance Is bonded to the inner wall surface of the measuring chip, and there is no possibility that the measurement of the bonding state will be hindered, and the reliability of the measurement of the bonding state and the reliability of the analysis result of the binding specific substance are improved.
[0039]
Further, when the inner wall surface of the sample holding frame of the measuring chip is formed in a shape that is separated outward as the distance from the first thin film layer increases, the first thin film layer and the second thin film layer The effect of making the thickness uniform can also be obtained. That is, since this thin film layer made of a metal film or the like is generally formed by vapor deposition, in this case, if the sample holding frame is shaped as described above, the vapor deposition material is blocked by the sample holding frame during vapor deposition and the thin film layer is formed. It is possible to prevent the thickness from becoming uneven.
[0040]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 shows a side shape of a surface plasmon sensor according to a first embodiment of the present invention.
[0041]
As shown in FIG. 1, the surface plasmon sensor includes a single-use measuring chip 10, a laser light source 21 such as a semiconductor laser that generates a measurement light beam (laser beam) 20, and a condensing lens 22 that is an incident optical system. And a signal processing unit 24 for controlling the driving of the photodetector 23, the laser light source 21, and receiving the output signal S of the photodetector 23, and performing a process described later, and a display unit 25. .
[0042]
The measurement chip 10 includes a dielectric block 11 having a substantially quadrangular pyramid shape, and a thin film layer as a first thin film layer made of, for example, gold, silver, copper, or aluminum, formed on the upper surface of the dielectric block 11. 12, a sample holding frame 13 made of a cylindrical member defining a space closed on the side of the thin film layer 12, and a second thin film layer formed on the inner wall surface of the sample holding frame 13 And a thin film layer 14. The portion of the sample liquid holding frame 13 is tapered so that the inner surface of the sample solution holding frame 13 is separated outward as the film is separated from the thin film layer 12 upward. The tapered space in the sample solution holding frame 13 functions as a well portion 16 for storing the sample solution 15.
[0043]
In the measurement chip 10, the dielectric block 11 and the sample solution holding frame 13 are integrally formed from, for example, a transparent resin, and the thin film layer 12 and the thin film layer 14 are formed by vapor deposition. In this example, a sensing substance 17 made of DNA is fixed on the thin film layer 12 and the thin film layer 14, and the sample solution 15 contains various proteins.
[0044]
The condensing lens 22 condenses the light beam 20 and passes it through the dielectric block 11 in a convergent light state so that various incident angles can be obtained with respect to the interface 12a between the dielectric block 11 and the thin film layer 12. Let The range of the incident angle is a range including an angle range in which the total reflection condition of the light beam 20 is obtained at the interface 12a and surface plasmon resonance can occur.
[0045]
The light beam 20 is incident on the interface 12a as p-polarized light. In order to do so, the laser light source 21 may be disposed in advance so that the polarization direction thereof is a predetermined direction. In addition, the direction of polarization of the light beam 20 may be controlled by a wave plate or a polarizing plate.
[0046]
The photodetector 23 is a line sensor in which a large number of light receiving elements are arranged in a row, and is arranged so that the arrangement direction of the light receiving elements is in the direction of the arrow X in FIG. The signal processing unit 24 has measuring means 26 that receives the output signal S of the photodetector 23.
[0047]
Hereinafter, sample analysis by the surface plasmon sensor having the above-described configuration will be described. First, the sample solution 15 is supplied to the measurement unit 10. The laser light source 21 is driven by a command from the signal processing unit 24, and the light beam 20 emitted from the laser light source 21 enters the interface 12a between the dielectric block 11 and the thin film layer 12 in a state where it converges as described above. The light beam 20 totally reflected by the interface 12a is detected by the photodetector 23.
[0048]
Since the light beam 20 is incident on the dielectric block 11 in the convergent light state as described above, the light beam 20 includes components that are incident on the interface 12a at various incident angles θ. In addition, this incident angle (theta) shall be an angle more than a total reflection angle. Therefore, the light beam 20 is totally reflected at the interface 12a, and the reflected light beam 20 includes components reflected at various reflection angles.
[0049]
Thus, when the light beam 20 is totally reflected, an evanescent wave oozes from the interface 12a to the thin film layer 12 side. Then, the light beam 20 has a certain incident angle θ with respect to the interface 12a. _SP , The evanescent wave resonates with the surface plasmon excited on the surface of the thin film layer 12, so that the reflected light intensity I sharply decreases for this light. FIG. 3 schematically shows the relationship between the incident angle θ and the reflected light intensity I when the total reflection attenuation phenomenon occurs.
[0050]
Therefore, in the measuring means 26, as the state of total reflection attenuation, the detected light quantity for each light receiving element is checked from the output signal S output from the photodetector 23, and the incident angle (based on the position of the light receiving element where the dark line is detected is determined. Total reflection attenuation angle) θ _SP Ask for.
[0051]
In the present embodiment, the sensing substance 17 that binds to the protein that is the specific substance in the sample solution 15 is fixed on the thin film layer 12, and the refractive index of the sensing substance 17 changes according to the binding state with the protein. Total reflection attenuation angle θ _SP The state of the change in the coupling state can be examined by continuing to measure.
[0052]
That is, with time, the total reflection attenuation angle θ _SP Can be determined that the protein in the sample solution 15 is bound to the sensing substance 17, and the total reflection attenuation angle θ _SP If the angle does not change, it can be determined that there is no protein binding to the sensing substance in the sample solution 15. The measuring means 26 determines the presence / absence of the coupling based on the above principle, and the determination result is displayed on the display unit 25.
[0053]
After a predetermined time has elapsed, the total reflection attenuation angle θ _SP If the determination results indicate that binding has occurred, remove the measurement chip 10 from the measurement position, discard the sample solution 15, and remove the binding between the sensing substance 17 and the binding protein. A separation treatment is performed to recover the binding protein. Thereafter, this binding protein is analyzed, and its type and binding state are examined.
[0054]
That is, in the sensor according to the present embodiment, the thin film layer is formed on the entire bottom surface and inner wall surface of the well portion 16 of the measurement chip 10, and the sensing substance 17 is fixed on the thin film layer. Compared to a sensor in which a thin film layer is formed only on the bottom surface of 16 and the sensing material is fixed thereon, the area where the sensing material is fixed becomes wider. Since a protein is bound to the sensing substance 17, a larger amount of protein binds to the sensing substance 17 than in the conventional sensor. Therefore, when the bound protein is recovered, the recovered amount of the bound protein increases.
[0055]
Further, since the measurement is performed using the measurement chip 10 provided with the well portion 16, the binding state can be measured only by preparing a small amount of the sample solution 15 entering the well portion 16.
[0056]
Furthermore, for example, when the thin film layer 14 is not formed on the inner wall surface of the sample holding frame 13, the sensing substance 17 is not fixed. Therefore, on the inner wall surface of the sample holding frame 13, the transparent resin forming the sample holding frame 13 and the protein in the sample solution 15 may be bonded. The binding protein formed in this way may be different from the binding protein engaged with the sensing substance 17 that is the original analysis target, and these proteins bound to the transparent resin bind to the sensing substance 17 When the protein is collected and collected, the reliability of the analysis of the binding protein may be lowered. In the present embodiment, since the sensing substance 17 is fixed to all surfaces that are in contact with the sample solution 15, there is no possibility that a binding protein other than the binding protein that is the original analysis target is formed, and the binding protein The reliability of the analysis result is further improved.
[0057]
In addition, when the sensing substance 17 is not fixed to the inner wall surface of the sample holding frame 13, the binding protein that originally binds to the sensing substance 17 is bound in a large amount with the transparent resin on the inner wall surface, and the sensing substance 17 The amount of binding with 17 may decrease, which may hinder the measurement of the binding state. However, if the measuring chip 10 is used, the sensing substance 17 is fixed to the entire surface where the sample solution 15 contacts. Thus, a large amount of binding protein binds to the inner wall surface of the measuring chip 10, so that the binding state measurement is not hindered, and the reliability of the binding state measurement is improved.
[0058]
Next, a surface plasmon sensor according to a second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 3 shows a side shape of the surface plasmon sensor, and FIG. 4 is a top view and a side sectional view of a flow path unit used in the surface plasmon sensor. In FIG. 3, the same elements as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted unless particularly required.
[0059]
As shown in FIG. 2, the surface plasmon sensor includes a measurement chip 30, a laser light source 21 that generates a measurement light beam (laser beam) 20, a condenser lens 22, a photodetector 23, and a signal processing unit 24. And a display unit 25 and a flow path unit 50.
[0060]
The measurement chip 30 includes a dielectric block 31 made of a transparent resin or the like having a substantially quadrangular pyramid shape, and a first thin film made of, for example, gold, silver, copper, or aluminum formed on the upper surface of the dielectric block 31. And a thin film layer 32 as a layer. A sensing substance 33 made of DNA is fixed on the thin film layer 32.
[0061]
A flow path unit 50 for forming a flow path on the thin film layer 32 is attached to the upper surface of the measurement chip 30. In this flow path unit 50, a supply path 52 for supplying the sample liquid 15 and a discharge path 53 for discharging the sample liquid 15 are attached to a flow path holder 51 formed in a substantially rectangular shape. Easy to attach and detach to 30. The outlet of the supply path 52 and the outlet of the discharge path 53 are opened in the flow path holder 51, and the outlet and discharge path 53 of the supply path 52 are in a region in contact with the surface of the metal film 12 on the lower surface of the flow path holder 51. A seal portion 54 is provided to surround the inlet. Therefore, when the flow path unit 50 is attached to the measurement chip 30, a measurement flow path 55 sealed by the thin film layer 32 and the seal portion 54 is formed. FIG. 4 shows a top view and a side sectional view of the flow path unit 50. The seal portion 54 may be formed integrally with the upper portion of the flow path holder 51, or may be formed of a material different from the upper portion and attached later, for example, O A ring or the like attached to the lower part of the flow path holder 51 may be used.
[0062]
A pump 56 is connected to the supply path 52 of the flow path unit 50, and a sample liquid reservoir 57 and a desorbed liquid reservoir 58 are connected to the pump 56. A sample solution 15 containing a plurality of types of proteins is prepared in advance in the sample solution reservoir 57, and a desorption solution 59 for removing the binding between the sensing substance and the binding protein is prepared in the desorption solution reservoir 58. The pump 56 supplies the sample solution 15 to the supply path 52 at the time of measurement, and supplies the desorbed liquid 59 to the supply path 52 at the time of recovering the binding protein. The flow path unit 50, the pump 56, and the liquid reservoir 57 function as the sample supply / discharge means of the invention.
[0063]
A binding protein generation unit 60 is connected to the discharge path 53, and a discharge port 61 and a binding protein recovery unit 62 are connected to the binding protein generation unit 60. At the time of measurement, the sample solution 15 is discharged from the discharge port 61 through the binding protein generator 60. When collecting the binding protein, the outlet 61 is closed, and the detachment liquid 59 is sent to the binding protein recovery section 62 via the binding protein generation section 60.
[0064]
The binding protein generator 60 includes a substrate 63 formed of an allied resin equivalent to the transparent resin forming the dielectric block 31, a thin film layer 64 as a second thin film layer formed on the substrate 63, A sensing substance 65 fixed to the thin film layer 64 is provided. The thin film layer 64 is formed in the same manner from the same material as the thin film layer 32, and the sensing material 65 is also fixed in the same manner from the same material as the sensing material 33. The binding protein recovery unit 62 recovers the binding protein desorbed from the sensing substance in the measurement channel 55 and the binding protein generation unit 60 from the desorption liquid 59. In FIG. 3, a region surrounded by a dotted line is a temperature adjustment area 69, which is always kept at a predetermined temperature by a temperature adjustment means (not shown).
[0065]
Hereinafter, sample analysis by the surface plasmon sensor having the above-described configuration will be described. Prior to measurement, the flow path unit 50 is attached to the measurement chip 30 such that the seal portion 54 of the flow path unit 50 is in close contact with the thin film layer 32 of the measurement chip 30. The pump 56 is operated to supply the sample solution 15 prepared in the liquid reservoir 57 to the measurement channel 55 via the supply channel 52 of the channel unit 50. During the measurement, the sample liquid 15 is continuously supplied to the measurement channel 55 in order to keep the pump 56 operating. Since the measurement channel 55 is sealed by the seal portion 54, the sample solution 15 supplied to the measurement channel 55 is sequentially discharged through the discharge channel 53, the binding protein generation unit 60, and the discharge port 61.
[0066]
After the sample liquid 15 is supplied into the measurement channel 55, the measurement is started. The light beam 20 is incident on the interface 32a between the dielectric block 11 and the thin film layer 32 in a converged state. The light beam 20 totally reflected by the interface 12a is detected by the photodetector 23. Since the subsequent measurement method is the same as that of the first embodiment, detailed description thereof is omitted.
[0067]
Total reflection attenuation angle θ over time after measurement starts _SP Can be considered that the protein in the sample solution 15 is bound to the sensing substance 33, and the total reflection attenuation angle θ _SP If the angle does not change, it can be considered that the protein binding to the sensing substance 33 does not exist in the sample solution 15. Since the sample solution 15 is continuously supplied, when a specific protein in the sample solution 15 is bound to the sensing substance 33, the same protein is also bound to the sensing substance 65 in the binding protein generation unit 60. And binding protein is produced.
[0068]
After a predetermined time has elapsed, the total reflection attenuation angle θ _SP When the change occurs in the angle, the supply of the sample liquid 15 is stopped by the pump 56, and the supply of the desorption liquid 59 is started instead. At the same time, the discharge port 61 is closed, and the discharged detachment solution 59 is sent to the binding protein recovery unit 62.
[0069]
The binding protein desorbed from the sensing substance in the measurement channel 55 and the binding protein generation unit 60 is sent to the binding protein recovery unit 62 together with the desorption solution 59 and recovered by the binding protein recovery unit 62. Thereafter, this binding protein is analyzed, and its type and binding state are examined.
[0070]
That is, in the present embodiment, since the sensing substance is fixed to the thin film layer 64 of the binding protein generation unit 60 in addition to the thin film layer 32 of the measurement chip 30, and the protein is bound to these sensing substances, the sensing substance As compared with the case where is fixed only to the thin film layer 32 of the measuring chip 30, the amount of recovered binding protein is increased.
[0071]
In addition, since this sensor attaches the flow path unit 50 to the measurement chip 30 and supplies / discharges the sample solution 15 onto / from the sensing substance 33, a new sample solution 15 is always supplied onto the sensing substance 33. The concentration of the protein in the liquid 15 does not change, and the binding state can be measured with high accuracy.
[0072]
Further, in the present embodiment, since the binding protein generation unit 60 provided with the thin film layer 64 is disposed separately from the measurement chip 30, the thin film layer 64 is provided outside the temperature control area 69. Therefore, it is possible to prevent the temperature control area 69 from becoming large.
[0073]
Next, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. In FIG. 5, the same elements as those in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted unless particularly necessary.
[0074]
The sensor using the total reflection attenuation according to the third embodiment is the leakage mode sensor described above, and is configured to use the measurement chip 90. A cladding layer 91 is formed on the upper surface of the dielectric block 11 of the measurement chip 90 and the inner wall surface of the sample holding frame 13, and an optical waveguide layer 92 is further formed thereon. A sensing substance 17 is fixed on the surface of the optical waveguide layer 92.
[0075]
The dielectric block 11 is formed using, for example, an optical glass such as synthetic resin or BK7. On the other hand, the cladding layer 91 is formed in a thin film shape using a dielectric having a lower refractive index than that of the dielectric block 11 or a metal such as gold. The optical waveguide layer 92 is also formed into a thin film using a dielectric having a higher refractive index than that of the cladding layer 91, such as PMMA. The thickness of the clad layer 91 is, for example, 36.5 nm when formed from a gold thin film, and the thickness of the optical waveguide layer 92 is, for example, about 700 nm when formed from PMMA.
[0076]
In the leakage mode sensor having the above configuration, when the light beam 20 emitted from the laser light source 21 is incident on the cladding layer 91 through the dielectric block 11 at an incident angle equal to or greater than the total reflection angle, the light beam 20 is incident on the dielectric block 11. The light having a specific wave number that is totally reflected at the interface 91a between the light and the clad layer 91 but is transmitted through the clad layer 91 and incident on the optical waveguide layer 92 at a specific incident angle propagates through the optical waveguide layer 92 in a waveguide mode. It becomes like this. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer 92, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface 91a is sharply reduced.
[0077]
Since the wave number of guided light in the optical waveguide layer 92 depends on the refractive index of the sensing material 17 on the optical waveguide layer 92, the refractive index of the sensing material 17 can be obtained by knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs. And the binding state between the protein in the sample solution 15 and the sensing substance 17 can be known.
[0078]
Even in this embodiment, the sensing substance 17 is fixed to the bottom surface and the entire inner wall surface of the well part 16 of the measurement chip 90, and the protein binds to these sensing substances 17, so that the sensing substance 17 is only on the bottom surface of the well part 16. Compared with the case of being immobilized, the recovery amount of the binding protein is increased.
[0079]
Next, a fourth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The surface plasmon sensor of the present embodiment is obtained by changing the measurement method as compared with the surface plasmon sensor of the first embodiment. FIG. 6 shows the side shape of the surface plasmon sensor of the present embodiment. A laser light source 120 and a CCD 121 are disposed at the measurement position of the surface plasmon sensor. A collimator lens 122, an interference optical system 123, a condensing lens 124, and an aperture 125 are disposed therebetween.
[0080]
The interference optical system 123 includes a polarizing filter 131, a half mirror 132, a half mirror 133, and a mirror 134. Further, the CCD 121 is connected to the measuring means 135, and the measuring means 135 is connected to the display unit 62.
[0081]
Hereinafter, the measurement operation in the surface plasmon sensor of the present embodiment will be described. The laser light source 120 is driven and the light beam 140 is emitted in a divergent light state. The light beam 140 is collimated by the collimator lens 122 and enters the polarization filter 131. The light beam 140 transmitted through the polarizing filter 131 and incident on the interface 12a as p-polarized light is partly divided by the half mirror 132 as a reference light beam 140R, and the remaining light transmitted through the half mirror 132. The beam 140S is incident on the interface 12a. The light beam 140S totally reflected by the interface 12a and the reference light beam 140R reflected by the mirror 134 are incident on the half mirror 133 and synthesized. The combined light beam 140 ′ is condensed by the condenser lens 124, passes through the aperture 125, and is detected by the CCD 121. At this time, the light beam 140 ′ detected by the CCD 121 generates interference fringes according to the state of interference between the light beam 140S and the reference light beam 140R.
[0082]
Here, whether or not the protein in the sample solution 15 binds to the sensing substance 17 immobilized on the surface of the thin film layer 12 is continuously measured after the sample solution 15 is supplied to the measurement chip 10, and the CCD 121 This can be determined by detecting the change in the interference fringes detected by the above.
[0083]
That is, since the refractive index of the sensing material 17 changes according to the binding state between the protein in the sample solution 15 and the sensing material 17, the light beam 140S and the reference light beam 140R totally reflected at the interface 12a are reflected by the half mirror 133. Since the state of interference changes when they are combined, the presence or absence of a binding reaction can be detected according to the change in the interference fringes. The measuring means 135 detects the presence or absence of the reaction based on the above principle, and the result is displayed on the display unit 25.
[0084]
Also in this embodiment, the sensing substance 17 is fixed to the bottom surface and the entire inner wall surface of the well portion 16 of the measurement chip 10, and the protein binds to the sensing substance 17, so that the sensing substance 17 is only on the bottom surface of the well portion 16. Compared with the case of being immobilized, the recovery amount of the binding protein is increased.
[0085]
In each of the above embodiments, the dielectric block is used together with the thin film layer to constitute a measuring chip that is used up. However, this is a case where the dielectric block is incorporated into the surface plasmon sensor body without being formed into a chip. However, the same effect can be obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a side view of a surface plasmon sensor according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is an explanatory diagram of a relationship between a light beam incident angle and reflected light intensity in the surface plasmon sensor.
FIG. 3 is a side view of a surface plasmon sensor according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a top view and a side sectional view of a flow path unit in the surface plasmon sensor.
FIG. 5 is a side view of a leakage mode sensor according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a side view of a surface plasmon sensor according to a fourth embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
10,30,90 Measuring chip
11,31 Dielectric block
12, 14, 32, 64 Thin film layer
12a Interface between dielectric block and thin film layer
13 Sample holding frame
15 Sample solution
16 well part
17,33 Sensing substances
20 Light beam
21 Light source
22 Condensing lens
23 photodetector
24 Signal processor
26 Measuring means
50 flow path unit
51 Flow path holder
52 Supply channel
53 Discharge channel
60 Binding protein generator
62 Binding protein recovery unit
69 Temperature control area
91 Clad layer
91a Interface between dielectric block and cladding layer
92 Optical waveguide layer
120 Laser light source
121 CCD
122 Collimator lens
123 Interferometric optics
124 condenser lens
125 aperture
134 Mirror
135 Measuring means
140 Light beam

Claims

光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロックと、
該誘電体ブロックの一面に形成される第１の薄膜層と、
該第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られる角度で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態を測定する測定手段と、
前記誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層と、
該第２の薄膜層の表面上に配される前記センシング物質とを備えた全反射減衰を利用したセンサーを用いて、前記センシング物質と前記特定物質との結合の有無を判定し、
前記センシング物質と前記特定物質とが結合していると判定された場合には、前記第1の薄膜層および第２の薄膜層の表面上に配された前記センシング物質と結合した前記特定物質を回収することを特徴とする特定物質の回収方法。A light source that generates a light beam;
A dielectric block transparent to the light beam;
A first thin film layer formed on one surface of the dielectric block;
A sensing substance disposed on the surface of the first thin film layer and bound to a specific substance in the sample;
An optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at an angle at which a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the first thin film layer;
Light detecting means for detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface;
Measurement means for measuring the state of total reflection attenuation based on the detection result of the light detection means;
A second thin film layer formed on a different surface from the one surface of the dielectric block and having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer;
Using a sensor utilizing total reflection attenuation provided on the surface of the second thin film layer and determining whether or not the sensing substance and the specific substance are bonded;
When said sensing substance and the specific substance is determined to be attached, said specific substance bound to the sensing substance disposed on a surface of said first thin film layer and the second thin film layer A method for recovering a specific substance, characterized in that

前記全反射減衰を利用したセンサーが、前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えていることを特徴とする請求項１記載の特定物質の回収方法。The sensor using the total reflection attenuation has a sample supply / discharge means for continuously supplying the sample onto the surface of the first thin film layer and continuously discharging the supplied sample. The method for recovering a specific substance according to claim 1.

前記全反射減衰を利用したセンサーが、前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えていることを特徴とする請求項１記載の特定物質の回収方法。 2. The recovery of a specific substance according to claim 1, wherein the sensor using attenuation of total reflection includes a sample holding frame that forms a well portion for holding the sample on the upper surface of the first thin film layer. Method.

前記第２の薄膜層が前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されていることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の特定物質の回収方法。 The method for recovering a specific substance according to any one of claims 1 to 3, wherein the second thin film layer is separated from the first thin film layer and the dielectric block.

光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロックと、
該誘電体ブロックの一面に形成される第１の薄膜層と、
該第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られる角度で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態を測定する測定手段と、
前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段とを備えてなる全反射減衰を利用したセンサーにおいて、
前記誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層と、
該第２の薄膜層の表面上に配される前記センシング物質と、
前記第1の薄膜層および第２の薄膜層の表面上に配されたセンシング物質と結合した特定物質を回収する特定物質回収部とを備えたことを特徴とする全反射減衰を利用したセンサー。A light source that generates a light beam;
A dielectric block transparent to the light beam;
A first thin film layer formed on one surface of the dielectric block;
A sensing substance disposed on the surface of the first thin film layer and bound to a specific substance in the sample;
An optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at an angle at which a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the first thin film layer;
Light detecting means for detecting the intensity of the light beam totally reflected at the interface;
Measurement means for measuring the state of total reflection attenuation based on the detection result of the light detection means;
In the sensor using total reflection attenuation, comprising a sample supply / discharge means for continuously supplying the sample on the surface of the first thin film layer and continuously discharging the supplied sample,
A second thin film layer formed on a different surface from the one surface of the dielectric block and having substantially the same chemical characteristics as the first thin film layer;
The sensing material disposed on a surface of the second thin film layer;
Sensor utilizing attenuated total reflection, characterized in that a specific substance recovery unit for recovering a specific substance bound to the first thin film layer and the second sensing material disposed on the surface of the thin film layer .

前記第２の薄膜層が前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されていることを特徴とする請求項５記載の全反射減衰を利用したセンサー。 6. The sensor using total reflection attenuation according to claim 5, wherein the second thin film layer is separated from the first thin film layer and the dielectric block.