JP4387108B2

JP4387108B2 - Stock microglia

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Publication number: JP4387108B2
Application number: JP2003000679A
Authority: JP
Inventors: 誠澤田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2018-03-05
Also published as: JP2003259864A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、継代培養の可能な株化ミクログリア、その分離方法、及び、その医薬用キャリアーとしての用途に関する。
さらに、本発明は、外来遺伝子又は薬物を導入したミクログリア、その導入法、及び、それを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経系に関する遺伝性の疾患は非常に多く、単一の酵素が欠損するために発症するもの、あるいは未だに原因不明のものなど様々である。これらの疾患に対しては、多くは補充療法により対処されているのが現状である。
一方、脳への選択的物資移送システムについては、国内外で多数研究されており、動物個体レベルでの脳内への遺伝子導入については向神経性をもったウイルスを用いたアデノウイルスベクター法が考案され、神経細胞特異的に遺伝子を導入できるシステムが知られている（Kozarsky，K.F and Wilson，J.M.，Curr．Opin．Genet．Dev．3，499-503，1993）。また、レトロウイルスベクターを用いる方法も考案され、肝細砲や血液細胞などに導入することが成功している（Mullingan，R．C．Science 260，926-932．1993）。
【０００３】
しかしながら、脳には血液脳関門（Blood Brain Barrier）が存在するため、補充療法を行ったり有効な薬物を導入することが困難であり、また、末梢から物質（例えば抗癌剤やＤＮＡなど）を投与しても脳に特異的に導入することができない。従って、従来は手術によって物質を脳に直接注入する以外に方法がなかった。
一方、手術などの侵害的な手技を伴わない方法としてリポソームを利用する方法があり、リポソームの構成要素を変えることによって脳に比較的入りやすいものが国内のグループによって開発された。しかし、この方法でも脳への取り込みは注入量の１％程度で、脳に特異的であるとはいえない。
このように、脳には血液脳関門が存在するため、末梢からの物質や細胞の浸潤がほとんどなく、薬物や遺伝子導入が困難である。実際に正常脳ではＴ細胞やマクロファージなどの免疫細胞の浸潤はほとんどみられない。
【０００４】
ミクログリアは、マクロファージ様の性質を持つ中枢神経系細胞であり、炎症反応やウイルス感染において免疫担当細胞として働いたり、細胞を取り除く貧食細胞として働くほか、中枢神経系サイトカインネットワークの中心的役割を果たす細胞である（Sawada，M．et al.，lnt．J．Dev．Neurosci.， 13，253-264，1995）。また、最近では学習や記憶といった高次の脳機能の発現にも不可欠であることが示され、脳に特異的な役割を持った特殊化した細胞であると考えられている。現在までのところミクログリアの起源は周産期に脳内に侵入した単球が特殊化して分化すると考えられていた。
また、ミクログリアは、脳細胞の一次培養により得ることができるが、一次培養をするためには使用する度に脳を摘出して精製する必要があり、しかも通常２週間前後の期間が必要とされるため、操作が煩雑である、また、培養下で増殖させることが困難であり、継代することがほとんどできないことから、一次培養ミクログリアに遺伝子を導入し、それを発現させることは極めて困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
脳に特異的なマクロファージと考えられているミクログリアについて、高純度精製のミクログリアを得ることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは脳に特異的なマクロファージと考えられているミクログリアを研究する過程で高純度精製のミクログリアを得ることに成功した。
すなわち、本発明は、継代培養が可能なミクログリア、詳細には、以下の性質を有する株化ミクログリアに関する。
（ａ）形態：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子存在下においてマクロファージ様又は球状の形態、及び該因子非存在下において脳内に存在する分枝状ミクログリアに類似した分枝状の形態の両者又はいずれか一方の形態を有する。
（ｂ）機能的特徴：脳に特異的親和性を有する。また、強い貧食能を有する。
（ｃ）細胞増殖性：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に依存的に増殖する。
【０００７】
また、本発明は、サイトカイン、好ましくはコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、より好ましくは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下に、好ましくはさらにＩＬ−３及び／又は精製アストロサイトの存在下に、ミクログリア細胞から継代培養が可能な株化ミクログリアを分離する方法に関する。
【０００８】
さらに、本発明者らは脳に対する親和性や浸潤できるか否かについてマクロファージとミクログリアが決定的に異なることを見い出した。さらに、両者を識別できる方法で染色してその分布を調べたところ、ミクログリアが発生の早い段階から脳内に存在することを見い出した。したがって、ミクログリアは骨髄で分化成熟する単球由来ではなく、脳に特異的な親和性を持った細胞群が発生の初期に脳内に侵入し、脳の形態形成や記憶学習といった高次機能まで調節するようになると考えられる。
そこで、本発明者らは単離したマクロファージとミクログリアをラット末梢動脈に注入して脳への選択的配向性があるかどうかについて比較した結果、蛍光色素を用いて標識したミクログリアを注入した場合には脳には多くの蛍光細胞が見られたが、肝臓にはわずかしか見られなかった。これに対しマクロファージを注入した場合には正常脳にはほとんど蛍光細胞が見られないが肝臓には多くの蛍光細胞が見られた。
【０００９】
つぎに、本発明者らが確立したミクログリアの細胞株にｌａｃＺ発現ベクターを導入したものをラット血流中に注入して脳に選択的に遺伝子を発現させることができるかどうかを検討したところ、ｌａｃＺ発現細胞を注入したラット脳切片でβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の活性が検出できた。以上の結果からミクログリアはマクロファージとは異なり脳に特異的な親和性をもった細胞であること、この親和性を利用すれば末梢血流中から特定物質や遺伝子を脳に特異的に導入できることがわかった。
【００１０】
すなわち、本発明は前記ミクログリアからなる脳に特異的な親和性を有する医薬キャリアー（担体）に関する。
また、本発明は、遺伝子又は薬物が導入された前記株化ミクログリアに関する。
また、本発明は、遺伝子または薬物が導入された前記ミクログリア、及び、製薬上の担体とからなる医薬組成物、特に脳疾患治療剤である医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、外来遺伝子、及び、蛍光蛋白質、好ましくはクラゲ由来の蛍光蛋白質を発現する遺伝子を用いて、ミクログリアに遺伝子を導入することからなる、外来遺伝子が導入されたミクログリアのスクリーニング方法及び製造方法に関する。本発明のこの方法におけるミクログリアとしては、従来のミクログリアを使用することもできるが、本発明の前記した株化ミクログリアを使用することが好ましい。
また、本発明は前記医薬組成物を用いて脳に特異的に薬物または遺伝子を送達させてなる脳疾患の治療方法に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の株化ミクログリアは、マウス又はラットの脳細胞を一次培養してミクログリアを精製し、さらにこの精製ミクログリアから、本発明の株化ミクログリアクローンを以下の手法により分離することができる。また、本発明の株化ミクログリアは取扱いが容易でしかも脳に親和性を有するため、株化ミクログリアに遺伝子又は薬物を導入し、末梢血管に注入することにより脳内に特異的に遺伝子を発現させ、また薬物を送達させることができる。
【００１２】
本発明の株化ミクログリアの製造法をさらに詳細に説明する。
（１）ミクログリアの精製
まず、採取されたマウス又はラット脳の脳膜を剥離し、ピペット又はナイロンメッシュ等を用いて単細胞に分離する。マウス及びラットは新生のものが好ましい。マウスとしては、例えばＣ５７ＢＬ６、Ｃ３Ｈ、ＩＣＲ、Ｂａ１ｂ／ｃ等が挙げられ、ラットとしては例えばフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、ウィスター（Ｗｉｓｔｅｒ）、ＳＤ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
得られた細胞を通常の動物細胞用培養培地（１０％ＦＣＳ、又はＣＳを含むＥＭＥＭ等）にまき１０〜１４日培養する。なお、３〜４日毎に培地を交換する。
次に、得られた培養細胞から株化するための細胞を選別する。
ここで、ミクログリアにはタイプＩとタイプＩＩと呼ばれるものがあり、タイプＩは、一次培養物を機械的に刺激する（ピペットで培地を吹き付ける、培養皿を揺する等）ことによって培養皿から剥がれて浮遊する細胞である。一方、タイプＩＩは前記機械的刺激によっては浮遊しない細胞（付着細胞）である。本発明のミクログリアはタイプＩＩに属するものであるため、以下のようにして精製ミクログリアを選別することができる。
上記機械的刺激によって浮遊しない付着細胞をさらにトリプシン−ＥＤＴＡ処理して単細胞にした後、何ら処理されていないプラスチックディッシュ（ノン・コートプラスチック皿という）に播いて付着させる。一般に、培養皿は正電荷を持つように薬物で処理されているが、付着細胞を得るにはその処理がされていないディッシュを使用する必要があるためである。３７℃で１時間ＣＯ2インキュベーターで加温後、機械的刺激を与えて培地中に浮遊する細胞を取り除いた後、皿に接着したまま増殖できる細胞をラバーポリスマン等で回収し、同様の操作をさらに２回繰り返して得られる細胞を、株化のための精製ミクログリアとして得ることができる。以上のようにして得られた精製ミクログリアは、十分な純度を有するが、さらに精製純度を上げるため、セルソーター等を用いてもよい。
【００１４】
（２）株化ミクログリアの分離
（１）のようにして得られた精製ミクログリアから、本発明の継代培養が可能な株化ミクログリアを分離するためには、前記精製ミクログリアをサイトカイン、好ましくはコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、より好ましくは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下に培養し、これをクローン化して行うことができる。培養の際に存在させるサイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦを単独で使用してもよいが、ＧＭ−ＣＳＦにさらにＩＬ−３及び／又は精製アストロサイト由来の上清を存在させてもよい。使用するサイトカインは、天然のものでも、遺伝子組み換え型のものであってもよい。より詳細には、例えば、次のようにして行うことができる。
【００１５】
１０ｃｍ程度のシャーレに播いて遺伝子組換え型顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ−ＣＳＦ）存在下で７〜１０日培養する。培養後細胞を回収し、ｒＧＭ−ＣＳＦの存在下で、いわゆる限界希釈法によりさらに細胞を４〜１０週間培養する。そして、テストプレート１ウェルあたり１個のコロニーを形成した細胞をラバーポリスマンで遊離することによりクローン化したものを選別、分離し、最終的に株化ミクログリアを得る。
【００１６】
このようにして得られた株化ミクログリアは以下の性質を有するものである。
（ａ）形態蛍光色素染色を行い蛍光顕微鏡下で、又は無染色のまま位相差顕微鏡下で形態を観察した結果、ｒＧＭ−ＣＳＦの存在下においてマクロファージ様若しくは球状の形態、又はｒＧＭ−ＣＳＦの非存在下において脳内に存在する分枝状ミクログリアに類似した分枝状の形態を有する。あるいは上記の両形態を有する。
（ｂ）機能的特徴本発明の株化ミクログリアをマウスの動脈に投与すると脳に特異的に移行することから、脳に特異的親和性を有する。また、リポ多糖でミクログリアを刺激するとインターロイキン−１（ＩＬ−１）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）を産生する。また、インターフェロンγで刺激するとＩＬ−５を産生する。この性質は、ＩＦＮ−γでＩＬ−５を発現しないマクロファージと相違するものである。また、蛍光色素の取り込みを指標として貧食能の試験を行った結果、本発明の細胞株は、強い貧食能を有する。本発明の株化ミクログリアは、アストロサイトよりも数百〜数千倍もの貧食能を有するものである。
（ｃ）細胞増殖性培地からｒＧＭ−ＣＳＦを除去する実験を行うと増殖がみられなくなることから、本発明の株化ミクログリアはＧＭ−ＣＳＦ依存的に増殖するものである。
本発明の株化ミクログリアの形態、特徴を第１〜４図に具体例で例示する。
【００１７】
（３）株化ミクログリアへの遺伝子の導入
本発明の株化ミクログリアに遺伝子を導入することは、遺伝子を脳に特異的に発現させるうえで重要である。目的とする遺伝子は、公知のクローニング手法により得ることができ、また、市販のものを使用することも可能であり、遺伝子の種類に特に限定されない。
【００１８】
例えば、遺伝子を株化ミクログリアに高率に導入する手法としてＤＯＴＡＰ（ベーリンガー−マンハイム社製）を用いる方法がある。すなわち、ＤＯＴＡＰを含む遺伝子導入用培地中で株化ミクログリアを目的遺伝子とともに培養する方法がある。培養は、ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で１６〜２４時間培養したのち、ミクログリア培養用培地でｒＧＭ−ＣＳＦとともにさらに３０〜７２時間、好ましくは４８時間培養する。
なお、遺伝子をミクログリアに導入する方法としては、上記手法のほかに、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等の公知手法を用いることもできる。
【００１９】
ところで、導入遺伝子の安定発現株を分離する公知の方法で最も一般的に用いられる方法は、薬物耐性遺伝子を目的遺伝子と同時に細胞に導入して発現させ、染色体ＤＮＡに取り込まれてその発現が安定的恒常的発現を行うようになった細胞以外を薬物処理により死にいたらしめ培養中から排除して分離する方法である。
このスクリーニング方法をミクログリアに適用した場合、安定的恒常的発現を行うようになったミクログリアが死細胞を認識して強い貧食能を発現し、同時に活性化されて増殖能を失うことがある。このために、本発明の好ましい遺伝子の導入法としては、薬物耐性遺伝子の代わりに蛍光蛋白質、好ましくはミズクラゲ由来のグリーン・フルロオレセント・プロテイン（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ））を高等動物に発現できるように改変された発現ベクターを用いて、目的細胞を蛍光強度の差で安定的恒常的発現を行うミクログリアを分離する方法が挙げられる。
【００２０】
遺伝子が導入された細胞が脳に達したか否かの確認、及び遺伝子の発現の確認は、導入細胞をあらかじめ貧食細胞に特異的な蛍光色素で染色しておき、脳を摘出後凍結し、約８ミクロン厚の切片を作製し、蛍光顕微鏡下で蛍光をもつ細胞を同定するか、切片を、導入する遺伝子の基質により活性染色することにより行われる。
また、上記確認は磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、ポジトロン・エミッション・トモグラフィー（ＰＥＴ）等により行うこともできる。例えば、ＭＲＩ用造影剤等を取り込ませた細胞を動物に注入してその動向を観察することもできる。これらの方法によれば、動物を殺すことなく非侵襲的かつ簡単に観察することができる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１：株化ミクログリアクローンの分離
（１）ミクログリアの単離
新生マウス（Ｃ５７ＢＬ６、ｏｐ／ｏｐ）及び新生ラット（Ｆｉｓｈｅｒ）の脳を摘出し、氷冷したミクログリア培養培地（Ｍｉ培地という：Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ、１０％ウシ血清、０．２％グルコース及び５μｇ／ｍｌウシインシュリンを含む）中で脳膜を剥離した。パスツールピペット又はナイロンメッシュで細胞を単細胞化し、上記Ｍｉ培地中で細胞を培養した。マウス脳については２０ｍｌのＭｉ培地あたり脳１個分の細胞を、ラット脳については４０ｍｌのＭｉ培地あたり脳１個分の細胞をそれぞれ１０ｃｍの培養皿２枚、１０ｃｍの培養皿４枚中で培養した。培養は、ＣＯ2インキュベーター内（５％ＣＯ2、９５％空気の条件）で、３７℃で１０〜１４日行った。なお、培地は３〜４日毎に交換した。明位相差像を示す細胞（phase-bright round cell; ＰＢＲＣ）が出現した段階で、機械的振盪によりＰＢＲＣを除去した後、２００Ｕ／ｍｌトリプシン−０．０２％ＥＤＴＡで細胞をはがし、非コートプラスチック皿中、３７℃で３０分インキュベートした。非コートプラスチック皿に接着した細胞をＭｉ培地で２回洗浄し、細胞を剥離させて回収した。同様の処理をさらに２回繰り返し、精製ミクログリアを得た。
【００２３】
（２）クローンの分離
上記(１)で得られた精製ミクログリア細胞を、１０ｃｍシャーレに１×１０^５個播種し、ｒＧＭ−ＣＳＦ（ジーンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社製）存在下Ｍｉ培地で７日間培養した。細胞を回収した後計数し、限界希釈法によりクローンを分離した。すなわち、９６穴プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）社製）の各ウェルに、０．５個／ウェルの細胞濃度（１００μｌ中）で播種し、２ｎｇ／ｍｌのマウス遺伝子組換え型ＧＭ−ＣＳＦ（ジーンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社製）存在下で約３週間培養した。各ウェルについてクローン化の有無を確認し、目的のクローンを分離した。その結果、マウス脳由来のものについては５種類（Ｒａ２、ＧＭＩ−Ｍ６−１、ＧＭＩ−Ｍ６−３、ＧＭＩ−Ｍ５−２、ＧＭＩ−ＭＦ１１）、ラット脳由来のものについては１種類（ＧＭＩ−Ｒ１）の株化ミクログリアが得られた。このうち、株化ミクログリアＲａ２及びＧＭＩ−Ｒ１は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、Ｒａ２については「ｍｏｕｓｅｍｉｃｒｏｇｌｉａＲａ２」と称し、ＦＥＲＭＢＰ−７０６１として、ＧＭＩ−Ｒ１については「ｒａｔｍｉｃｒｏｇｌｉａＧＭＩ−Ｒ１」と称し、ＦＥＲＭＢＰ−７０６２としてそれぞれ寄託されている。
【００２４】
得られたクローンについてその性質を検討した。
（ａ）形態ＧＭＩ−Ｒ１をｒＧＭ−ＣＳＦ存在下及び非存在下で培養し、位相差顕微鏡で観察した結果、ｒＧＭ−ＣＳＦ存在下ではマクロファージ様ないし球状を呈し（第１図Ａ）、ｒＧＭ−ＣＳＦ非存在下では分枝状を示した（第１図Ｂ）。
【００２５】
（ｂ−１）機能的特徴（脳親和性）
本発明の株化ミクログリアＧＭＩ−ＲＩをプラスチックシャーレに付着させた状態にし、貧食細胞染色液（ＤｉｌｕｅｎｔＢ．：ザイナクシス（Ｚｙｎａｘｉｓ）社製）で調製した蛍光色素ＰＫＨ２６（ザイナクシス（Ｚｙｎａｘｉｓ）社製）と１０％血清とを１：１で混合して上記シャーレに加え、３７℃で１５分蛍光染色した(Ishihara，S.，Sawada，M．et al.，Exp，Neurol,．124，219-230，1993)。
細胞を回収し、２×１０6個を５週齢の同系（Ｆｉｓｈｅｒ）ラット腋下動脈に注入した。注入して４８時間後並びに１、２及び３週間後にラットの各臓器を摘出し、ＯＣＴ（ティシュー・テック（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）社）溶液中で凍結した。
ミクログリアＧＭＩ−Ｒ１、及び比較として同系ラット（フィッシャー）の腹腔を冷ＰＢＳで洗浄することにより単離したマクロファージを、貧食細胞に特異的な蛍光色素で標織し、ラット腋下動脈に注入し、その組織配向性について組織切片を作製して検討した。
その結果、本発明の株化ミクログリアを注入した場合は正常脳に多くの蛍光細胞が見られたのに対し（第２図Ａ）、肝臓には見られなかった（第２図Ｂ）。一方、マクロファージを注入した場合は、正常脳にはほとんど蛍光細胞が見られなかったのに対し（第２図Ｃ）、肝臓には多くの蛍光細胞が見られた（第２図Ｄ）。
従って、本発明の株化ミクログリアは、脳特異的な親和性を有するものであった。
【００２６】
（ｂ−２）機能的特徴（ＩＬ−１及びＩＬ−６産生能）
Ｒａ２細胞を１×１０^６個を６ｃｍ培養皿に播き、リポポリ多糖で１２時間刺激をしたもの、及び無刺激のものからＲＮｅａｓｙ（クィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）により総ＲＮＡを抽出し、そのうち２μｇを用いて逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いて混合ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをテンプレートにして、以下の配列を有するＩＬ−１特異的合成プライマー及びＩＬ−６特異的合成プライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＩＬ−１特異的合成プライマー（Sawada et al.，lnt．J．Dev．Neurosci．13，253-264，1995）:
センス鎖：５’−ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT−３’（配列番号２）
ＩＬ−６特異的合成ブライマー（Sawada et al.，Brain Res．583，296-299，1992）：
センス鎖：５’−ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC−３’（配列番号４）
ＰＣＲは、５５℃を１分、７２℃を２分及び９４℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った（ＨＹＢＡＩＤのＯｍｎｉｇｅｎｅを使用）。ＰＣＲ後、増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけて遺伝子の発現を調べたその結果、リポ多糖によりＲａ２はＩＬ−１及びＩＬ−６発現を増大することがわかった（第３図、“ＬＰＳ”のレーン）。なお、第３図において、Ｍは分子量マーカー、ｃｏｎｔは対照（無刺激）を表す。
また、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１及びＩＬ−６が産生されていることが確認された。さらに、本発明の株化ミクログリアのリポ多糖刺激後の培養上清を、ＩＬ−６依存的に増殖するＭＨ６０細胞又はＩＬ−１依存的に増殖するＤ１０細胞に添加培養して、ＭＨ６０細胞及びＤ１０細胞の増殖の有無を検討した。
その結果、いずれの細胞も、リポ多糖刺激をした本発明株化ミクログリアの培養上清存在下において増殖することがわかった。
【００２７】
（ｃ）細胞増殖性
５×１０^４個のＧＭＩ−ＲＩ細胞を９６穴テストプレートに播き、２μｇ／ｍｌのｒＧＭ−ＣＳＦを１０００倍、５０００倍及び１００００倍希釈となるようにそれぞれ添加して４日間培養し、ＭＴＴアッセイを行った。対照としてヒトＭ−ＣＳＦ（ミドリ十字）４００ｕ／ｍｌを１０００倍希釈したもの、又はＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）０．１ｍｇ／ｍｌを１０００倍若しくは５０００倍希釈したものを用いた（第４図Ａ）。
一方、ｒＧＭ−ＣＳＦを５０００倍希釈したものと、各１００ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−３、ＩＬ−４及びＩＬ−６（いずれもジーンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社）との比較試験を行った。各試薬をそれぞれ添加して２日後及び４日後のＭＴＴアッセイを行った（第４図Ｂ）。
その結果、ＧＭＩ−Ｒ１はｒＧＭ−ＣＳＦに依存して増殖することがわかった
【００２８】
実施例２：本発明のミクログリアへの遺伝子の導入
大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子発現ベクターｐｔｋβ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））とＤＯＴＡＰリピッド（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））とを混合し、終濃度１μｇ／ｍｌとした。これを血清を含む培地に混合して調製し、本発明の株化ミクログリアに添加して１６時間処理した。対照として、遺伝子を導入しない株化ミクログリア、及び、実施例１と同様にして得られたマクロファージを用いた。
次に、通常の培地（ＥＭＥＭ：１０％ＦＣＳを含む）でさらに４８時間培養し、実施例１（ｂ−１）に記載の蛍光染色を行い、遺伝子が脳に移行し、発現するか否かの検討を行った。すなわち、成熟ラット（２５０〜３００ｇ）をネンブタール麻酔下、左腋下動脈を露出させ、止血処理後カニューレを挿入して１〜２×１０^６個の細胞を注入した。注入後切開部を縫合し、ラットを回復させた。
次に、細胞注入後４８時間でラットの脳を摘出し、連続した約８μｍの３枚の凍結切片を作製し、それぞれ蛍光顕微鏡による観察を行った。また、β−ガラクトシダーゼの活性染色及び活性の定量については以下のように行った。
上記３枚の切片のうちの１枚を０．５％グルタールアルデヒドで固定し、Ｌｉｍらの方法(BioTechniques 7，576-579，1989)でＸｇａｌを基質として活性染色した。活性の定量は、切片１枚を１００μｌの溶解バッファーで超音波破砕によりホモゲナイズし、市販のキット（GalactoLight; Boehringer-Manheim）を用いて測定した。
その結果、本発明の株化ミクログリアに遺伝子を導入した場合は、ラット脳の切片からｌａｃＺ陽性細胞の存在が確認できた（第５図）。また、β−ガラクトシダーゼ活性を化学発光法で定量した結果、大腸菌由来遺伝子ｌａｃＺ発現ベクターを導入した株化ミクログリアを注入したラット脳切片において、遺伝子を導入しないものよりはるかに高い活性が検出された（第６図）。
【００２９】
実施例３：本発明のミクログリアへの化学物質の導入及び脳への特異的導入
実施例１で使用した蛍光色素ＰＫＨ２６はダイリューエントＢ（ｄｉｌｕｅｎｔＢ）中で顆粒を作る。この顆粒を本発明のミクログリア細胞株は特異的に取り込んで細胞内に保持し、脳に移行するので、蛍光素ＰＫＨ２６を化学物質（抗癌剤）のモデルとして使用した。
その結果、本発明の株化ミクログリアを注入した場合は、正常脳に多くの蛍光細胞が見られたのに対し、肝臓には見られなかった。従って、本発明のミクログリアは化学物資（薬物）を脳特異的に運ぶといえる。
【００３０】
実施例４：ＧＦＰを用いた遺伝子導入法
１×１０6個のＧＭＩ−Ｒ１細胞をシャーレにまきこみ、１６時間後にＧＦＰ発現ベクターｐＥＧＦＰ１０μｇ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ）社製）を遺伝子導入用培地に添加しこの培地に交換してＣＯ2インキュベーター中で細胞を３７℃で２４時間培養した後、ミクログリア用の培地でｒＧＭ−ＣＳＦとともにさらに７日間培養した。
７日間培養した後、細胞を浮遊させ蛍光活性化細胞分画装置(fluorescent activated cell sorter，ＦＡＣＳ，ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で蛍光強度が遺伝子非導入細胞の１００倍以上の細胞を分画して濃集し、さらにミクログリア用の培地でｒＧＭ−ＣＳＦとともに培養を継続した。
同様の操作を７日毎にさらに２回繰り返し、ほぼ９０％以上の細胞が１００倍程度の蛍光を持つ分画に回収できたので、これを細胞限界希釈法で１細胞／ウェルの割合でＴＰ９６テストプレートにまきこみミクログリア用の培地でｒＧＭ−ＣＳＦとともにさらに培養した。これによって導入遺伝子ｐＥＧＦＰを安定的恒常的に発現するようになったミクログリアを分離することができた。
いかにこの方法で分離できたか細胞のＦＡＣＳ分析結果の一例を図に示す。第７図は遺伝子が導入されていていない細胞のＦＡＣＳ分析の結果であり、第８図はＧＦＰ導入細胞のＦＡＣＳ分析の結果である。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、脳に特異的な親和性を有する株化ミクログリアが提供される。
本発明の株化ミクログリアは、脳内に遺伝子を導入するためのキャリアー（担体）としてのみならず、薬物などの化学物質を脳特異的に導入するためのキャリアー（担体）としても有用である。
【００３２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の株化ミクログリアの形態を示す写真（生物の形態）である。
【図２】本発明の株化ミクログリアとマクロファージとの組織特異性の違いを示す写真である（生物の形態）。
【図３】リポ多糖刺激によるサイトカインの発現を示す電気泳動写真である。
【図４】本発明の株化ミクログリアのＧＭ−ＣＳＦ依存的増殖を示す図である。
【図５】ラット脳内における遺伝子の発現を示す写真である（生物の形態）。
【図６】ラット脳内における遺伝子の発現を示す図である。
【図７】遺伝子が導入されていていない細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
【図８】ＧＦＰ導入細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to established microglia that can be subcultured, a method for separating the same, and its use as a pharmaceutical carrier.
Furthermore, the present invention relates to microglia into which a foreign gene or drug has been introduced, a method for introducing the same, and a pharmaceutical composition containing the microglia.
[0002]
[Prior art]
There are numerous hereditary diseases related to the nervous system, such as those that develop due to the lack of a single enzyme, or those that still have unknown causes. Currently, many of these diseases are addressed by replacement therapy.
On the other hand, many researches have been conducted on the selective transport system to the brain at home and abroad, and the adenoviral vector method using a neurotropic virus is used for gene transfer into the brain at the individual animal level. A system that can be devised and can introduce a gene in a nerve cell-specific manner is known (Kozarsky, KF and Wilson, JM, Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 499-503, 1993). In addition, a method using a retroviral vector has been devised, and it has been successfully introduced into liver tubules and blood cells (Mullingan, RC Science 260, 926-932.1993).
[0003]
However, the blood brain barrier (Blood Brain Barrier) exists in the brain, so it is difficult to perform replacement therapy and introduce effective drugs, and substances (such as anticancer drugs and DNA) are administered from the periphery. However, it cannot be specifically introduced into the brain. Therefore, conventionally, there was no method other than injecting the substance directly into the brain by surgery.
On the other hand, there is a method using a liposome as a method that does not involve an invasive procedure such as an operation, and a group that is relatively easy to enter the brain by changing the components of the liposome has been developed by a domestic group. However, even with this method, uptake into the brain is about 1% of the injected amount, and it cannot be said that it is specific to the brain.
Thus, since the blood-brain barrier exists in the brain, there is almost no infiltration of substances and cells from the periphery, making it difficult to introduce drugs and genes. Actually, infiltration of immune cells such as T cells and macrophages is hardly observed in the normal brain.
[0004]
Microglia are central nervous system cells that have macrophage-like properties. They function as immunocytes in inflammatory reactions and viral infections, as phagocytic cells that remove cells, and play a central role in the central nervous system cytokine network. Cells (Sawada, M. et al., Lnt. J. Dev. Neurosci., 13, 253-264, 1995). Recently, it has been shown to be essential for the expression of higher brain functions such as learning and memory, and is considered to be a specialized cell with a specific role in the brain. So far, the origin of microglia was thought to be specialized and differentiated monocytes that entered the brain during the perinatal period.
Microglia can be obtained by primary culture of brain cells, but for primary culture, it is necessary to remove and purify the brain each time it is used, and usually a period of about 2 weeks is required. Therefore, it is very difficult to introduce the gene into the primary culture microglia and to express it because the operation is complicated and it is difficult to grow in culture and can hardly be passaged. is there.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The purpose of the present invention is to obtain highly purified microglia that are considered to be macrophages specific to the brain.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have succeeded in obtaining highly purified microglia in the course of studying microglia considered to be macrophages specific to the brain.
That is, the present invention relates to microglia that can be subcultured, and specifically, to established microglia having the following properties.
(A) Morphology: both or any of a macrophage-like or globular morphology in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and a branched morphology similar to the branched microglia present in the brain in the absence of the factor It has one of these forms.
(B) Functional characteristics: specific affinity for the brain. Moreover, it has a strong phagocytic ability.
(C) Cell proliferative: Proliferates dependent on granulocyte-macrophage colony stimulating factor.
[0007]
The present invention also relates to the presence of cytokines, preferably colony stimulating factor (CSF), more preferably granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), preferably further IL-3 and / or purified astrocytes. The present invention relates to a method for separating established microglia that can be subcultured from microglia cells.
[0008]
Furthermore, the present inventors have found that macrophages and microglia differ decisively in their affinity to the brain and whether they can infiltrate. Furthermore, when the distribution was examined by staining with a method capable of discriminating both, it was found that microglia was present in the brain from an early stage of development. Therefore, microglia are not derived from monocytes that differentiate and mature in the bone marrow, but a group of cells with specific affinity for the brain enters the brain at an early stage of development, up to higher-level functions such as brain morphogenesis and memory learning. It seems to adjust.
Therefore, the present inventors injected isolated macrophages and microglia into rat peripheral arteries and compared them for selective orientation to the brain. As a result, when microglia labeled with a fluorescent dye was injected, There were many fluorescent cells in the brain, but only a few in the liver. In contrast, when macrophages were injected, few fluorescent cells were found in the normal brain, but many fluorescent cells were seen in the liver.
[0009]
Next, it was examined whether or not the gene introduced into the rat bloodstream by introducing the lacZ expression vector into the microglia cell line established by the present inventors can be selectively expressed in the brain. The activity of β-galactosidase was detected in rat brain slices injected with lacZ-expressing cells. These results indicate that microglia are cells with specific affinity for the brain, unlike macrophages, and that this affinity can be used to introduce specific substances and genes specifically into the brain from the peripheral bloodstream. all right.
[0010]
That is, the present invention relates to a pharmaceutical carrier having a specific affinity for the brain composed of the microglia.
The present invention also relates to the established microglia introduced with a gene or a drug.
The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the microglia into which a gene or a drug has been introduced and a pharmaceutical carrier, particularly a pharmaceutical composition that is a therapeutic agent for brain diseases.
Furthermore, the present invention relates to a screening method for microglia into which a foreign gene is introduced, comprising introducing the gene into microglia using a foreign gene and a gene expressing a fluorescent protein, preferably a fluorescent protein derived from jellyfish. It relates to a manufacturing method. As the microglia in this method of the present invention, conventional microglia can be used, but it is preferable to use the above-mentioned established microglia of the present invention.
The present invention also relates to a method for treating a brain disease, wherein a drug or gene is specifically delivered to the brain using the pharmaceutical composition.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The established microglia of the present invention is obtained by first culturing mouse or rat brain cells to purify the microglia, and further, from the purified microglia, the established microglia clone of the present invention can be isolated by the following method. In addition, since the established microglia of the present invention is easy to handle and has an affinity for the brain, a gene or a drug is introduced into the established microglia and injected into peripheral blood vessels to specifically express the gene in the brain. , And can also deliver drugs.
[0012]
The production method of the established microglia of the present invention will be described in more detail.
(1) Purification of microglia
First, the brain membrane of the collected mouse or rat brain is peeled off and separated into single cells using a pipette, nylon mesh or the like. Mice and rats are preferably newborn. Examples of the mouse include C57BL6, C3H, ICR, and Ba1b / c, and examples of the rat include, but are not limited to, Fisher, Wister, SD, and the like.
[0013]
The obtained cells are seeded in a normal animal cell culture medium (such as 10% FCS or EMEM containing CS) for 10 to 14 days. The medium is changed every 3 to 4 days.
Next, cells to be established are selected from the obtained cultured cells.
Here, there are types of microglia called type I and type II, which are peeled off from the culture dish by mechanically stimulating the primary culture (spraying the medium with a pipette, shaking the culture dish, etc.). It is a floating cell. On the other hand, type II is a cell (adherent cell) that does not float by the mechanical stimulation. Since the microglia of the present invention belongs to type II, purified microglia can be selected as follows.
The adherent cells that do not float by the mechanical stimulation are further treated with trypsin-EDTA to make single cells, and then seeded and attached to a plastic dish (called non-coated plastic dish) that has not been treated at all. This is because the culture dish is generally treated with a drug so as to have a positive charge, but in order to obtain adherent cells, it is necessary to use a dish that has not been treated. After heating in a CO2 incubator at 37 ° C for 1 hour, mechanically stimulated to remove cells floating in the medium, collect cells that can grow while adhering to the dish with a rubber policeman, etc. Cells obtained by repeated twice can be obtained as purified microglia for cell line establishment. The purified microglia obtained as described above has sufficient purity, but a cell sorter or the like may be used to further increase the purification purity.
[0014]
(2) Isolation of established microglia
In order to separate the established microglia capable of being subcultured from the purified microglia obtained as described in (1) above, the purified microglia is preferably a cytokine, preferably a colony stimulating factor (CSF), more preferably Can be performed by culturing in the presence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and cloning it. GM-CSF may be used alone as a cytokine to be present during culture, but IL-3 and / or a supernatant derived from purified astrocytes may further be present in GM-CSF. The cytokine used may be natural or genetically modified. More specifically, for example, it can be performed as follows.
[0015]
It is seeded in a petri dish of about 10 cm and cultured for 7 to 10 days in the presence of a recombinant granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rGM-CSF). After the cultivation, the cells are collected, and further cultured for 4 to 10 weeks by the so-called limiting dilution method in the presence of rGM-CSF. Then, the cells that formed one colony per well of the test plate are separated and separated by releasing them with a rubber policeman, and finally the established microglia is obtained.
[0016]
The established microglia thus obtained has the following properties.
(A) Morphology As a result of fluorescing dye staining and observing the morphology under a fluorescence microscope or under a phase contrast microscope without staining, macrophage-like or spherical morphology in the presence of rGM-CSF, or non-rGM-CSF In the presence, it has a branched morphology similar to the branched microglia present in the brain. Or it has both said forms.
(B) Functional characteristics When the established microglia of the present invention is administered to the artery of a mouse, it migrates specifically to the brain, and thus has specific affinity for the brain. Moreover, when microglia is stimulated with lipopolysaccharide, interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6) are produced. In addition, IL-5 is produced when stimulated with interferon γ. This property is different from macrophages that do not express IL-5 with IFN-γ. In addition, as a result of testing for phagocytosis using the uptake of fluorescent dye as an index, the cell line of the present invention has strong phagocytosis. The established microglia of the present invention has a phagocytic ability several hundred to several thousand times that of astrocytes.
(C) Cell Proliferation Since an experiment in which rGM-CSF is removed from the culture medium is conducted, no growth is observed. Therefore, the established microglia of the present invention grows in a GM-CSF-dependent manner.
The form and characteristics of the established microglia of the present invention are illustrated by specific examples in FIGS.
[0017]
(3) Introduction of genes into established microglia
Introducing a gene into the established microglia of the present invention is important for specifically expressing the gene in the brain. The target gene can be obtained by a known cloning technique, and a commercially available one can also be used, and the type of gene is not particularly limited.
[0018]
For example, there is a method using DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim) as a technique for introducing genes into established microglia at a high rate. That is, there is a method of culturing the established microglia together with the target gene in a gene introduction medium containing DOTAP. The culture is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 16 to 24 hours, and then cultured in a microglia culture medium together with rGM-CSF for 30 to 72 hours, preferably 48 hours.
As a method for introducing a gene into microglia, in addition to the above method, a known method such as a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a lipofection method, an electroporation method, or a particle gun method can be used.
[0019]
By the way, the most commonly used method for isolating a stable expression strain of a transgene is to introduce a drug resistance gene into a cell at the same time as the gene of interest and to express it. This is a method in which cells other than cells that have undergone static constitutive expression are killed by drug treatment and removed from the culture and separated.
When this screening method is applied to microglia, the microglia which has come to perform stable and constitutive expression may recognize dead cells and express strong phagocytic activity, and at the same time, may be activated to lose its proliferative ability. For this reason, as a preferable gene introduction method of the present invention, fluorescent protein, preferably green fluorescent protein (GFP) derived from moon jellyfish is expressed in higher animals instead of drug resistance gene. A method of separating microglia that stably and constantly expresses the target cell with a difference in fluorescence intensity using an expression vector modified in such a manner is mentioned.
[0020]
To confirm whether the cell into which the gene has been introduced has reached the brain, and to confirm the expression of the gene, the introduced cell is previously stained with a fluorescent dye specific for phagocytic cells, and the brain is removed and frozen. This is done by preparing a section approximately 8 microns thick and identifying cells having fluorescence under a fluorescence microscope, or by staining the section with a substrate of a gene to be introduced.
The confirmation can also be performed by magnetic resonance imaging (MRI), positron emission tomography (PET), or the like. For example, it is possible to inject an animal into which an MRI contrast agent or the like has been taken up and to observe its trend. According to these methods, it is possible to observe noninvasively and easily without killing the animal.
[0021]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0022]
Example 1: Isolation of established microglia clones
(1) Isolation of microglia
Brains of newborn mice (C57BL6, op / op) and newborn rats (Fisher) were removed and ice-cooled microglia culture medium (referred to as Mi medium: Eagle's MEM, 10% bovine serum, 0.2% glucose and 5 μg / ml) The brain membrane was peeled in (containing bovine insulin). Cells were made into single cells with a Pasteur pipette or nylon mesh, and the cells were cultured in the above Mi medium. For the mouse brain, cells for one brain per 20 ml of Mi medium, and for the rat brain, cells for one brain per 40 ml of Mi medium were cultured in two 10 cm culture dishes and four 10 cm culture dishes, respectively. did. Cultivation was carried out at 37 ° C. for 10 to 14 days in a CO 2 incubator (5% CO 2 and 95% air conditions). The medium was changed every 3 to 4 days. At the stage when cells showing a bright phase contrast image (phase-bright round cell; PBRC) appeared, PBRC was removed by mechanical shaking, and then the cells were peeled off with 200 U / ml trypsin-0.02% EDTA. Incubated for 30 minutes at 37 ° C. in the dish. The cells adhering to the uncoated plastic dish were washed twice with Mi medium, and the cells were detached and collected. The same treatment was further repeated twice to obtain purified microglia.
[0023]
(2) Isolation of clones
The purified microglial cells obtained in (1) above are placed in a 10 cm petri dish at 1 × 10 ⁵ Each of the cells was inoculated and cultured in a Mi medium in the presence of rGM-CSF (Genzyme) for 7 days. The cells were collected and counted, and clones were isolated by limiting dilution. That is, each well of a 96-well plate (manufactured by Falcon) was seeded at a cell concentration of 0.5 cells / well (in 100 μl), and 2 ng / ml of mouse recombinant GM-CSF (Genzyme ( In the presence of Genzyme), the cells were cultured for about 3 weeks. The presence or absence of cloning was confirmed for each well, and the target clone was isolated. As a result, 5 types (Ra2, GMI-M6-1, GMI-M6-3, GMI-M5-2, GMI-MF11) were derived from mouse brain, and 1 type (GMI-) was derived from rat brain. R1) of established microglia was obtained. Of these, the established microglia Ra2 and GMI-R1 are referred to by the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Biotechnology Institute of Technology, and Ra2 is referred to as “mouse microglia Ra2,” FERM BP-7061 GMI-R1 is referred to as “rat microglia GMI-R1”, FERM BP-7062 Are deposited respectively.
[0024]
The properties of the obtained clones were examined.
(A) Morphology GMI-R1 was cultured in the presence and absence of rGM-CSF and observed with a phase-contrast microscope. As a result, it appeared macrophage-like or spherical in the presence of rGM-CSF (FIG. 1A). In the absence of CSF, it was branched (FIG. 1B).
[0025]
(B-1) Functional features (brain affinity)
Fluorescent dye PKH26 (manufactured by Zynaxis) prepared by attaching the established microglia GMI-RI of the present invention to a plastic petri dish and prepared with a phagocytic cell staining solution (Diluent B .: manufactured by Zynaxis) And 10% serum were mixed at a ratio of 1: 1 and added to the petri dish, followed by fluorescence staining at 37 ° C. for 15 minutes (Ishihara, S., Sawada, M. et al., Exp, Neurol,. 124, 219-230). , 1993).
Cells were harvested and 2 × 10 6 cells were injected into the 5 week old Fisher rat arm. Forty-eight hours after injection and 1, 2 and 3 weeks later, each organ of the rat was removed and frozen in an OCT (Tissue Tek) solution.
Microglia GMI-R1 and, for comparison, macrophages isolated by washing the peritoneal cavity of a syngeneic rat (Fisher) with cold PBS are textured with a fluorescent dye specific for phagocytic cells, and injected into the rat inferior artery The tissue orientation was examined by preparing tissue sections.
As a result, when the established microglia of the present invention was injected, many fluorescent cells were observed in the normal brain (FIG. 2A), but not in the liver (FIG. 2B). On the other hand, when macrophages were injected, few fluorescent cells were found in the normal brain (FIG. 2C), whereas many fluorescent cells were seen in the liver (FIG. 2D).
Therefore, the established microglia of the present invention had brain-specific affinity.
[0026]
(B-2) Functional characteristics (IL-1 and IL-6 production ability)
Ra2 cells 1 × 10 ⁶ The total RNA was extracted by RNeasy (Qiagen) from those that had been sown on a 6 cm culture dish and stimulated with lipopolypolysaccharide for 12 hours, and those that had not been stimulated, 2 μg of which was used for reverse transcriptase (BRL). ) Was used to obtain mixed cDNA. Using this cDNA as a template, PCR was performed using an IL-1 specific synthetic primer and an IL-6 specific synthetic primer having the following sequences.
IL-1 specific synthetic primer (Sawada et al., Lnt. J. Dev. Neurosci. 13, 253-264, 1995):
Sense strand: 5′-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
Antisense strand: 5′-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
IL-6 specific synthetic blimmer (Sawada et al., Brain Res. 583, 296-299, 1992):
Sense strand: 5′-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
Antisense strand: 5′-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
PCR was carried out for 30 cycles (one reaction of 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes and 94 ° C for 1 minute) (using HYBAID Omnigene). After PCR, the amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis to examine gene expression. As a result, it was found that Ra2 increased IL-1 and IL-6 expression by lipopolysaccharide (FIG. 3, “LPS” lane). ). In FIG. 3, M represents a molecular weight marker, and cont represents a control (no stimulation).
Moreover, it was confirmed that IL-1 and IL-6 were produced by ELISA. Further, the culture supernatant after stimulation of lipopolysaccharide of the established microglia of the present invention was added to and cultured in MH60 cells that proliferate in an IL-6-dependent manner or D10 cells that proliferate in an IL-1-dependent manner. The presence or absence of cell proliferation was examined.
As a result, it was found that all the cells proliferated in the presence of the culture supernatant of the microglia strain of the present invention stimulated with lipopolysaccharide.
[0027]
(C) Cell proliferation
5 × 10 ⁴ Each GMI-RI cell was seeded in a 96-well test plate, and 2 μg / ml of rGM-CSF was added at 1000-fold, 5000-fold and 10000-fold dilutions, respectively, and cultured for 4 days, and MTT assay was performed. As a control, human M-CSF (green cross) 400 u / ml diluted 1000 times or PMA (phorbol myristate acetate) 0.1 mg / ml diluted 1000 times or 5000 times was used (FIG. 4). A).
On the other hand, a comparison test was performed between the one in which rGM-CSF was diluted 5000 times and 100 u / ml each of mouse IL-3, IL-4, and IL-6 (all of which were Genezyme). MTT assay was performed 2 days and 4 days after the addition of each reagent (FIG. 4B).
As a result, it was found that GMI-R1 proliferates depending on rGM-CSF.
[0028]
Example 2: Introduction of gene into microglia of the present invention
E. coli-derived lacZ gene expression vector ptkβ (Clonetech) and DOTAP lipid (Boehringer-Mannheim) were mixed to a final concentration of 1 μg / ml. This was prepared by mixing with a medium containing serum, added to the established microglia of the present invention, and treated for 16 hours. As controls, established microglia without gene transfer and macrophages obtained in the same manner as in Example 1 were used.
Next, it is further cultured for 48 hours in a normal medium (EMEM: containing 10% FCS), and then the fluorescent staining described in Example 1 (b-1) is performed to determine whether the gene is transferred to the brain and expressed. Was examined. That is, a mature rat (250-300 g) was exposed to Nembutal under anesthesia, the left arm was exposed, and a cannula was inserted after hemostasis. ⁶ Cells were injected. After the injection, the incision was sutured to recover the rat.
Next, 48 hours after cell injection, the brain of the rat was excised, three continuous frozen sections of about 8 μm were prepared, and each was observed with a fluorescence microscope. Further, β-galactosidase activity staining and activity quantification were performed as follows.
One of the three sections was fixed with 0.5% glutaraldehyde, and was stained with Xgal as a substrate by the method of Lim et al. (BioTechniques 7, 576-579, 1989). The activity was quantified by homogenizing one slice with 100 μl of lysis buffer by sonication and using a commercially available kit (GalactoLight; Boehringer-Manheim).
As a result, when the gene was introduced into the established microglia of the present invention, the presence of lacZ positive cells could be confirmed from a slice of rat brain (FIG. 5). In addition, as a result of quantifying β-galactosidase activity by chemiluminescence, a much higher activity was detected in a rat brain section injected with established microglia introduced with the E. coli-derived gene lacZ expression vector than that without gene introduction ( FIG. 6).
[0029]
Example 3: Introduction of chemical substances into the microglia of the present invention and specific introduction into the brain
The fluorescent dye PKH26 used in Example 1 forms granules in diluent B. The granules were specifically taken up by the microglia cell line of the present invention, retained in the cells, and migrated to the brain. Therefore, the fluorophore PKH26 was used as a model of a chemical substance (anticancer agent).
As a result, when the established microglia of the present invention was injected, many fluorescent cells were observed in the normal brain, but not in the liver. Therefore, it can be said that the microglia of the present invention carries chemical substances (drugs) in a brain-specific manner.
[0030]
Example 4: Gene transfer method using GFP
1 × 10 6 GMI-R1 cells are seeded in a petri dish, and after 16 hours, 10 μg of GFP expression vector pEGFP (Clontech) is added to the gene transfer medium and replaced with this medium, and the cells are replaced in a CO 2 incubator. After culturing at 24 ° C. for 24 hours, the cells were further cultured for 7 days with rGM-CSF in a microglia medium.
After culturing for 7 days, the cells are suspended and the fluorescence intensity is 100 times or more that of non-gene-introduced cells using a fluorescence activated cell sorter (FACS, FACS Calibur manufactured by Becton-Dickinson). The cells were fractionated and concentrated, and further cultured with rGM-CSF in a medium for microglia.
The same operation was repeated two more times every 7 days, and almost 90% of the cells were recovered in a fraction with a fluorescence of about 100 times. This was measured at a rate of 1 cell / well by the cell limiting dilution method. The plate was further cultured with rGM-CSF in a medium for microglia. As a result, it was possible to isolate the microglia that stably and constitutively expressed the transgene pEGFP.
An example of the FACS analysis result of the cells is shown in the figure how they can be separated by this method. FIG. 7 shows the results of FACS analysis of cells into which no gene was introduced, and FIG. 8 shows the results of FACS analysis of GFP-introduced cells.
[0031]
【The invention's effect】
According to the present invention, established microglia having specific affinity for the brain is provided.
The established microglia of the present invention is useful not only as a carrier (carrier) for introducing a gene into the brain but also as a carrier (carrier) for specifically introducing a chemical substance such as a drug into the brain.
[0032]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph (organism form) showing the morphology of a established microglia of the present invention.
FIG. 2 is a photograph showing the difference in tissue specificity between the established microglia of the present invention and macrophages (form of organism).
FIG. 3 is an electrophoretogram showing cytokine expression by lipopolysaccharide stimulation.
FIG. 4 is a diagram showing GM-CSF-dependent proliferation of the established microglia of the present invention.
FIG. 5 is a photograph showing gene expression in the rat brain (form of organism).
FIG. 6 shows gene expression in the rat brain.
FIG. 7 is a diagram showing the results of FACS analysis of cells into which genes have not been introduced.
FIG. 8 shows the results of FACS analysis of GFP-introduced cells.

Claims

血管に投与すると脳に特異的に移行する性質を有し、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に依存的に増殖する受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０６１又はＦＥＲＭＢＰ−７０６２で寄託されている株化ミクログリア。 An established strain of microglia deposited under accession number FERM BP-7061 or FERM BP-7062 that has the property of specifically transferring to the brain when administered to blood vessels and grows dependently on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.

遺伝子又は薬物が導入された請求項１に記載の株化ミクログリア。 The established microglia according to claim 1, wherein a gene or a drug is introduced.

請求項１に記載の株化ミクログリアに、外来遺伝子及び蛍光蛋白質を発現する遺伝子を導入し、蛍光蛋白質により遺伝子導入ミクログリアをスクリーニングする方法。 A method for introducing a foreign gene and a gene expressing a fluorescent protein into the established microglia according to claim 1, and screening the introduced microglia with the fluorescent protein.

蛍光蛋白質を発現する遺伝子がクラゲ由来のものである請求項３に記載の方法。The method according to claim 3 , wherein the gene expressing the fluorescent protein is derived from a jellyfish.