JP4378472B2 - Neisseria gonorrhoeae daoC gene - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼｄａｏＣ遺伝子及びその利用に関するものである。更に詳細には、本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼー：Aspergillus oryzae）より新規に単離したＤ−アミノ酸オキシダーゼｄａｏＣ遺伝子を用いて、新規酵素であるＤ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣを大量に生産させ、Ｄ−アミノ酸測定試薬など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に生体内の蛋白を構成するアミノ酸はＬ−アミノ酸で構築されているが、一部の特別な分子においてＤ−アミノ酸を含むことが知られている。このＤ−アミノ酸およびこれを含有する生体高分子は、様々な特殊な機能を持つことが知られており、生体中のアミノ酸の検出や含有量の測定は臨床検査として非常に重要な項目である。例えば、近年、血中のＤ−アミノ酸の測定値が腎不全の指標となる可能性が示され、（例えば、非特許文献１、２、３参照）、腎機能の評価項目としてＤ−アミノ酸が加えられている。
【０００３】
このＤ−アミノ酸の定量は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いた酵素法による測定が広く検討されている（例えば、非特許文献４参照）。本法の特徴は、▲１▼Ｄ−アミノ酸を特異的に酸化する酵素であるため、Ｌ−アミノ酸には全く反応しない、▲２▼オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素をペルオキシダーゼとの共役反応により容易に発色反応として検出できる、などである。しかしながら、豚膵臓のＤ−アミノ酸オキシダーゼのように、酵素の安定性や生産量について課題が残されており、臨床検査用試薬として完成された技術にまでは達していない。
【０００４】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生物としては、セファロスポリウム・ポトロニイ、トリゴノプシス・バリアビリス、グリオクラディウム属、シュードモナス属、ロドトルラ・グルチニス等の報告がある。しかしながら、これらの微生物から生産される酵素は、生産性や安定性などが解決されず、実用化に至っていない。また細菌由来の場合は、真核生物での発現に障害が発生する可能性もある。
【０００５】
一方、近年になってＤ−アミノ酸オキシダーゼの産生について遺伝子レベルでの検討も行われるようになり、本発明者らは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列の決定にも成功し、麹菌での発現も確認したところである（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−２５３２４６号公報
【非特許文献１】
「クリニカル・サイエンス（Clinical Science）, 73巻, p.105-108, 1987年
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）」, 614巻, p.7-17, 1993年
【非特許文献３】
「北里医学」、23巻、p.51-62, 1993年
【非特許文献４】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）」, 150巻, p.238-242, 1985年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが解決しようとする課題は、Ｄ−アミノ酸の定量その他様々な産業に利用可能なＤ−アミノ酸オキシダーゼの有用性に鑑み、本発明者らが先に開発するのに成功した組換えＤ−アミノ酸オキシダーゼ（特開２００２−２５３２４６）とは別の新規なＤ−アミノ酸オキシダーゼを効率よく生産させることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
糸状菌の中でも、特にアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae：黄麹菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国のＦＤＡ（食品医薬局）によりＧＲＡＳ（Generally Recognized as Safe）にリストアップされている安全な遺伝子源である。
従って、通常の菌由来の遺伝子を食品などに利用する際に必要な慢性毒性検査等の安全審査において、通常の菌由来の遺伝子の場合には約１０億円要するのに対して、上記のＧＲＡＳグレードである遺伝子の場合にはその約３分の１程度の経費で済むし、更に、該審査に要する時間もより短いというメリットがある。
このように、糸状菌、特に麹菌は、安全性及び経済性の点から極めて利用価値の高い遺伝子の宝庫と言える。
【０００９】
従って、これら菌のゲノムＤＮＡ情報を明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明らかにすることによって、バイオテクノロジーを利用した物質生産等のような、食品産業において安全な遺伝子資源の有効な活用法を提供するとともに、農薬及び医薬分野における各種遺伝子スクリーニングの為の有用な情報を提供することが出来る。
更に、近縁種であるアスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus) 、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)等のように穀物汚染菌、ヒト感染菌のゲノム情報を解析する有用なツールともなり得るものである。
【００１０】
本発明者らは、上記観点にたち、麹菌の一種であるアスペルギルス・オリゼのゲノム解析を行い、遂にそれに成功し、更にそれらの塩基配列の決定及び各種機能等の決定にも成功し、これらの成果を先に特許出願したところである（先の出願：特願２００１−４０３２６１）。
【００１１】
そして今回、更に、本発明者らは、上記した先の出願に記載された配列番号に示される塩基配列情報に基づき、実際に遺伝子組換え手段を用いてトランスフォーマントを作成し、その産生物を得て、更に詳細に該遺伝子の配列およびその機能を検証した。その検証の結果、先の出願において配列番号３６８９７で示される遺伝子配列情報にしたがって単離した遺伝子がＤ−アミノ酸オキシダーゼを発現するという具体的な機能、有用性を有するという新規事実をはじめて確認した。
【００１２】
すなわち、この発明は、先の出願において配列番号３６８９７に示される塩基情報を使用して、Aｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ中に、これと相同性を有する遺伝子を単離し、この遺伝子を導入した宿主が、配列番号３６８９７号についての説明中に示されるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質を現に産生することを確認したことに基づくものである。
具体的には、上記配列番号３６８９７号に示される塩基配列情報を解析し、その結果、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼに相同性を示した予測遺伝子を見出した。これをｄａｏＣと命名した。
【００１３】
次に、このｄａｏＣ遺伝子の機能を調べるため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｄａｏＣ遺伝子のｃＤＮＡを取得するため、ｄａｏＣ遺伝子の発現様式を調べた。具体的には、ＤＰＹ液体培養、ＤＰＹ＋Ｄ−アミノ酸添加培養、米麹培養により得られた菌体からＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。その結果、Ｄ−アミノ酸添加培養、米麹培養においてｃＤＮＡの増幅が確認された。とくにＤ−アミノ酸添加培養においてはｃＤＮＡが顕著に増幅された。
【００１４】
このようにして得られたｄａｏＣ ｃＤＮＡ（１．０ｋｂ）を大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、常法に従って形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べて極めて高いＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示した。
従って、我々が単離したｄａｏＣ遺伝子には、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが示された。
【００１５】
本発明は、これら有用新知見に基づいてなされたものであって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子に関するものであり、その態様例は以下に示される。
【００１６】
（態様１） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼタンパク質。
【００１７】
（態様２） 配列番号２の塩基配列で示される、請求項１記載のタンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼタンパク質（ｂ）をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【００１８】
本発明において、上記した特定のアミノ酸配列には、これと実質的に同一のアミノ酸配列も包含されるものである。本発明における特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列と全アミノ酸配列に亘ってアラインメントして比較した場合に、全体の平均で約３０％以上、好ましくは約５０％以上、更に好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上のアミノ酸が同一であるようなアミノ酸配列を意味する。従って、或るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るタンパク質は、該アミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同等の機能を有するものと考えられる。
【００１９】
又、本発明タンパク質における特定のアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同等の機能を有する限りにおいて、好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成るものを意味する。又、タンパク質の「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び／又は外部において示す生物学的機能又は活性を意味する。
【００２０】
上記の特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るタンパク質、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るタンパク質は、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該タンパク質を構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各タンパク質に含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２２】
このように、本発明に係るｄａｏＣ遺伝子は新規なものであって、従来既知のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子、該新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである（以下、単にｄａｏＣ遺伝子ということもあり、その塩基配列（２６４０ｂｐ）を配列表の配列番号２、及び、図面の図３、図４に示す。）
【００２３】
本発明ＤＮＡは、当業者に公知の方法で調製することが出来る。例えば、本明細書において具体的な塩基配列で示される各ＤＮＡは、アスペルギルス・オリゼのゲノムを出発材料として用いて、例えば、ショットガン・クローニング法によって調製することができる。その際、断片化された各染色体ＤＮＡは、その長さ等に応じて、プラスミドベクター又はファージ等の適当なクローニングベクターに連結し、これを用いてエレクトロポレーション法等の適当な方法によって大腸菌等の適当な宿主細胞を形質転換し、該断片化各染色体ＤＮＡをクローニングする為の、クローンライブラリーを調製することができる。
更に、化学分解法（マキサム−ギルバート法）及びジデオキシ法等の公知の方法に従って、かかるクローンライブラリーから得られる断片化各染色体ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００２４】
或は、本明細書に記載された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸配列の情報に基づき、当業者に周知の化学合成、又は、本発明のプライマーを使用したＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。
【００２５】
本発明に係るＤＮＡ源として用いるアスペルギルス・オリゼのゲノムの１例としては、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムを使用することができる。なお、本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８２７３として寄託されている。
【００２６】
本発明において、このようにして単離したｄａｏＣ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又はＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素活性を有するタンパク質にはＤ−アミノ酸オキシダーゼも包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列番号１（図１、図２）に示される。
【００２７】
例えば、ｄａｏＣ遺伝子のコード領域（１．１ｋｂｐ）をベクター（例えば、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ）に挿入して組換えベクターを調製する。このようにして調製した大腸菌発現プラスミドをｐＥＴ２３ｂ−ｄａｏＣと命名し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９１０８として寄託した（図８）。
【００２８】
このようにして調製した大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ｄａｏＣを宿主（例えば大腸菌）に導入して形質転換体を得る。このようにして得た形質転換体をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｔ７−ＤＡＯＣと命名した。本形質転換体を培養したところ、菌体破砕液がきわめて高いＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示すことから、本遺伝子の発現が確認された。
【００２９】
本発明にかかるＤ−アミノ酸オキシダーゼ蛋白は、従来未知のＤ−アミノ酸オキシダーゼと同様に、各種のＤ−アミノ酸をＤ−ケト酸に酸化する作用を有し、以下のようなＤ−アミノ酸をそれぞれ対応するＤ−ケト酸に酸化することができる：Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン等。しかし、そのアミノ酸配列は、従来のものとは相違しているところから、本酵素を新規酵素と同定し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣと命名した。
以下、本発明を以下の実験例によりさらに詳細に説明する。
【００３０】
【実施例１】
ｄａｏＣ遺伝子のクローニング及びｄａｏＣ遺伝子の塩基配列の決定
先の出願に記載したように、麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム解析結果のうち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼに相同性を示した予測遺伝子Ｃｏｎ１６０１＿ｈ＿１２００について妥当性を検討した。本遺伝子はゲノムコンティグ１６０１番の逆鎖上にコードされる、全長３．４ｋｂｐの遺伝子として予測されていた。そのうち１−１０００ｂｐがプロモーター領域、１００１−１０３２ｂｐ、１０９８−１６８４、１７７７−２１８３、２８２８−３１２１ｂｐがコード領域、３１２２−３４２１ｂｐがターミネーター領域、イントロンが３つ含まれていると予測されていた。ゲノム予測ではイントロンが３つ含まれるとされていたが、ｃＤＮＡ配列の解析により、第３イントロンは存在しないことが明らかとなった。
【００３１】
そこで、Ｃｏｎ１６０１＿ｈ＿１２００に含まれる遺伝子をｄａｏＣと命名し、予測される開始コドンを含むプライマー（オリゴＤＮＡ＃１）とｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーにより米麹から得たＲＮＡをテンペレートとしてｃＤＮＡを増幅し、塩基配列の解析を行った。オリゴＤＮＡ＃１の塩基配列を配列番号３（図５）に示す。
【００３２】
その結果、ｄａｏＣ遺伝子は予測と異なり、イントロンを２つしか含まず、そのコーディング領域には３４９アミノ酸がコードされていた。しかし、イントロン部分およびＣＤＳ領域については予測とは異なるものの、ｄａｏＣをコードする遺伝子の塩基配列は先の出願に係る配列番号３６８９７号に示される塩基配列中に一部置換部分を除き全て含まれており、先の出願に係る配列番号３６８９７号に示される遺伝子は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子であることが確認された。
【００３３】
【実施例２】
ｄａｏＣ遺伝子の大腸菌への導入
次に、ｄａｏＣ遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。ｄａｏＣ遺伝子のコード領域（１．１Ｋｂｐ）をｄａｏＣ ｃＤＮＡをテンペレートとして宝酒造株式会社製ＰｙｒｏｂｅｓｔによりオリゴＤＮＡ＃２、オリゴＤＮＡ＃３を用いて増幅した断片を制限酵素ＮｄｅＩで処理し、大腸菌高発現用ベクターｐＥＴ２３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに挿入して、新規組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ｄａｏＣを構築し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９１０８として寄託した。常法にしたがって本組換えベクターを用いて大腸菌の形質転換を行い、得られた新規形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ７−ＤＡＯＣと命名した。
【００３４】
なお上記において、ＰＣＲ用プライマーとして用いたオリゴＤＮＡ＃２及びオリゴＤＮＡ＃３の塩基配列を、それぞれ、配列番号４（図６）および配列番号５（図７）に示す。
【００３５】
上記によって得た形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はｐＥＴ２３ｂで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示した。
【００３６】
従って、我々が単離したｄａｏＣ遺伝子には、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが明らかとなった。このように本発明に係るｄａｏＣ遺伝子は新規なものであって、従来既知のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子、該新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくとも一つを含有する遺伝子、から選ばれる少なくとも一つを指示するものである。
【００３７】
【実施例３】
組換えＤ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣの利用
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反応の反応式を以下に示す。
【００３８】
Ｄ−アミノ酸 ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ → ケト酸 ＋ Ｈ₂Ｏ₂ ＋ ＮＨ₃
【００３９】
反応式から明らかな様に、反応生成物のピルビン酸、過酸化水素またはアンモニアの何れを検出してもＤ−アミノ酸を定量することが出来る。例えば生成した過酸化水素の検出には、比色法、蛍光法、化学発光法、電極法などが知られており、その何れもが使用できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、４−アミノアンチピリンとフェノール、２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン等が利用できる。
【００４０】
蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成させ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用できる。化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとＤ−アミノ酸の検出に必要な前記の試薬成分を含む試薬を調製し、Ｄ−アミノ酸の測定キットとして診断薬等に組み立てることが出来る。
【００４１】
また、このＤ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣを使用すれば、ＤＬ−アミノ酸をラセミ分割して効率よくＬ−アミノ酸を分離、精製、製造することができ、例えば化学合成したラセミ体のアミノ酸からＬ−アミノ酸のみを効率よく得ることができる。
【００４２】
具体的に、ｄａｏＣ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質特異性を検討した結果を示す。
反応溶液組成を以下に示す。
【００４３】
５０ｍＭ Ｄ−アミノ酸
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
０．８６ｍＭ ｏ−ジアニシジン
３０００Ｕ ペルオキシダーゼ
０．５μｇ／ｍｌＤ−アミノ酸オキシダーゼ溶液
【００４４】
室温で５分間反応後、上記反応液１ｍｌに対し、３０％硫酸溶液０．５ｍｌを添加し、５４０ｎｍでの吸光度を測定することにより活性を測定した。得られた結果を、下記表１に示す。
【００４５】

【００４６】
基質特異性を検討した結果、本Ｄ−アミノ酸オキシダーゼはＤ−アスパラギン酸およびＤ−グルタミン酸に対して特異的に反応することがわかった。したがって、これらＤ−アミノ酸の検出、ラセミ分割において非常に効果的であることがわかる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の新規Ｄ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣを大量に生産することがはじめて可能となり、研究用試薬やＤ−アミノ酸測定用の検査薬への応用などＤ−アミノ酸オキシダーゼを産業上広く利用することを可能にするものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【００４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼＤＡＯＣのアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼｄａｏＣ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】オリゴＤＮＡ＃１プライマーを示す。
【図６】オリゴＤＮＡ＃２プライマーを示す。
【図７】オリゴＤＮＡ＃３プライマーを示す。
【図８】大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２３ｂ−ｄａｏＣの構築及びその制限酵素地図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel D-amino acid oxidase daoC gene and use thereof. More specifically, the present invention uses D-amino acid oxidase daoC gene newly isolated from Aspergillus oryzae to produce D-amino acid oxidase DAOC, which is a novel enzyme, in large quantities. -It can be used in various industrial fields such as amino acid measurement reagents.
[0002]
[Prior art]
In general, amino acids constituting in vivo proteins are constructed of L-amino acids, but some special molecules are known to contain D-amino acids. These D-amino acids and biopolymers containing them are known to have various special functions, and detection of amino acids in the living body and measurement of their contents are very important items as clinical tests. . For example, in recent years, it has been shown that the measured value of D-amino acid in blood may serve as an index of renal failure (for example, see Non-Patent Documents 1, 2, and 3). It has been added.
[0003]
For the quantification of D-amino acid, measurement by an enzymatic method using D-amino acid oxidase has been widely studied (for example, see Non-patent Document 4). The features of this method are as follows: (1) It is an enzyme that specifically oxidizes D-amino acids, so it does not react at all with L-amino acids. (2) Hydrogen peroxide produced by oxidase reaction is coupled with peroxidase. It can be easily detected as a color reaction. However, as with porcine pancreatic D-amino acid oxidase, there are still problems with the stability and production of the enzyme, and the technology has not yet been completed as a clinical test reagent.
[0004]
As microorganisms that produce D-amino acid oxidase, there are reports of Cephalosporium potronii, Trigonopsis variabilis, Gliocladium genus, Pseudomonas genus, Rhodotorula glutinis, and the like. However, the enzymes produced from these microorganisms have not been put into practical use because productivity and stability are not solved. In the case of bacterial origin, there is a possibility that the expression in eukaryotes is impaired.
[0005]
On the other hand, the production of D-amino acid oxidase has recently been studied at the gene level, and the present inventors have succeeded in cloning the D-amino acid oxidase gene and succeeding in determining its base sequence. In addition, the expression in Neisseria gonorrhoeae has been confirmed (see, for example, Patent Document 1).
[0006]
[Patent Document 1]
JP 2002-253246 A [Non-patent Document 1]
“Clinical Science, 73, p.105-108, 1987 [Non-Patent Document 2]
“Journal of Chromatography”, 614, p.7-17, 1993 [Non-Patent Document 3]
"Kitasato Medical", Volume 23, p.51-62, 1993 [Non-Patent Document 4]
"Analytical Biochemistry", 150, p.238-242, 1985 [0007]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present inventors is that, in view of the usefulness of D-amino acid oxidase that can be used for various industries such as quantification of D-amino acids, recombination that the inventors have succeeded in developing earlier. This is to efficiently produce a novel D-amino acid oxidase different from D-amino acid oxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-253246).
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Among filamentous fungi, koji molds, particularly including Aspergillus oryzae, have been used for a long time in the brewing industry in Japan, producing sake, miso, soy sauce, mirin, etc., and eaten directly. It is a safe gene source listed in the GRAS (Generally Recognized as Safe) by the US FDA (Food and Drug Administration).
Therefore, in safety reviews such as chronic toxicity tests required when using genes derived from ordinary bacteria in foods, etc., in the case of genes derived from ordinary bacteria, about 1 billion yen is required, whereas the above GRAS In the case of a gene that is a grade, the cost is about one-third of that, and the time required for the examination is shorter.
Thus, filamentous fungi, especially koji molds, can be said to be a treasure trove of genes that are extremely useful in terms of safety and economy.
[0009]
Therefore, by clarifying the genomic DNA information of these bacteria and clarifying the functions of the genes encoded by them, effective use of safe genetic resources in the food industry, such as substance production using biotechnology, etc. In addition to providing a method, it is possible to provide useful information for various genetic screening in the fields of agrochemicals and medicine.
Furthermore, it can be a useful tool for analyzing genome information of grain-contaminated bacteria and human-infected bacteria such as Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus which are related species.
[0010]
Based on the above viewpoints, the present inventors conducted genome analysis of Aspergillus oryzae, which is a type of Neisseria gonorrhoeae, and finally succeeded in it, and further succeeded in determining their base sequence and various functions, etc. A patent application has already been filed for the results (previous application: Japanese Patent Application No. 2001-403261).
[0011]
And this time, the present inventors further created a transformant by actually using genetic recombination means based on the nucleotide sequence information shown in the SEQ ID No. described in the above-mentioned previous application, and obtained the product. The gene sequence and its function were verified in more detail. As a result of the verification, it was confirmed for the first time that the gene isolated according to the gene sequence information represented by SEQ ID NO: 36897 in the previous application has a specific function and utility of expressing D-amino acid oxidase.
[0012]
That is, the present invention uses the base information shown in SEQ ID NO: 36897 in the previous application to isolate a gene having homology therewith in Aspergillus oryzae, and the host into which this gene has been introduced is identified by SEQ ID NO: 36897. This is based on the fact that the protein having D-amino acid oxidase activity shown in the explanation of No. is actually produced.
Specifically, the base sequence information shown in SEQ ID NO: 36897 was analyzed, and as a result, a predicted gene showing homology to D-amino acid oxidase was found. This was named daoC.
[0013]
Next, in order to investigate the function of this daoC gene, introduction of this gene into Escherichia coli was attempted. In order to obtain the cDNA for the daoC gene, the expression pattern of the daoC gene was examined. Specifically, RNA was extracted from cells obtained by DPY liquid culture, DPY + D-amino acid addition culture, and rice bran culture, and cDNA was amplified by reverse transcription PCR. As a result, amplification of cDNA was confirmed in the culture with D-amino acid addition and rice bran culture. In particular, cDNA was significantly amplified in the culture with D-amino acid.
[0014]
The daoC cDNA (1.0 kb) thus obtained was inserted into an Escherichia coli high expression vector pET23b (manufactured by Novagen), and the transformant was cultured according to a conventional method. As a result, the cell disruption solution of the obtained transformant showed extremely high D-amino acid oxidase activity compared to the cell disruption solution of the transformant transformed with pET23b.
Therefore, it was shown that the protein having D-amino acid oxidase activity is encoded in the daoC gene we isolated.
[0015]
The present invention has been made on the basis of these useful new findings, and relates to a protein having D-amino acid oxidase activity and a gene encoding the same. Examples of such embodiments are shown below.
[0016]
(Aspect 1) The following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence having an amino acid deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and a D-amino acid oxidase protein.
[0017]
(Aspect 2) The gene encoding the protein (a) according to claim 1, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or hybridizes with the gene under stringent conditions, and a D-amino acid oxidase protein ( DNA of the gene encoding b).
[0018]
In the present invention, the above-mentioned specific amino acid sequence includes substantially the same amino acid sequence. The amino acid sequence substantially the same as the specific amino acid sequence in the present invention is an average of about 30% or more, preferably about 50%, when the amino acid sequence is aligned and compared over the entire amino acid sequence. More preferably, it means an amino acid sequence in which about 80% or more, particularly preferably about 90% or more of amino acids are identical. Therefore, a protein consisting of an amino acid sequence substantially identical to a certain amino acid sequence is considered to have substantially the same function as a protein consisting of the amino acid sequence.
[0019]
In addition, the amino acid sequence in which a part of the amino acids are deleted, substituted or added in the specific amino acid sequence in the protein of the present invention is preferably as long as it has substantially the same function as the protein comprising the amino acid sequence, It means an amino acid sequence in which about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several amino acids have been deleted, substituted or added, or a combination thereof. The “function” of a protein means a biological function or activity that is exhibited inside and / or outside of a cell (bacteria).
[0020]
A protein consisting of an amino acid sequence substantially the same as the above-mentioned specific amino acid sequence, or a protein consisting of an amino acid sequence in which a part of the amino acids is deleted, substituted or added is, for example, site-directed mutagenesis, gene homology It can be easily prepared by appropriately combining methods well known to those skilled in the art, such as a recombinant method, a primer extension method, and a PCR method.
In this case, in order to have substantially the same function, among the amino acids constituting the protein, homologous amino acids (polar / nonpolar amino acids, hydrophobic / hydrophilic amino acids, positive / negative charged amino acids, aromatics) Substitutive amino acids) are considered as possible substitutions. In order to maintain a substantially equivalent function, it is desirable to retain amino acids in the functional domain included in each protein of the present invention.
[0021]
In the present specification, “under stringent conditions” means that the degree of homology between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95%, on the average on the whole. It means a condition in which a hybrid is specifically formed only between base sequences having high homology as described above. Specifically, for example, the conditions include a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and pH of 6 to 8 at a temperature of 60 to 68 ° C.
Hybridization may be performed by a method known in the art, such as, for example, the method described in Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
[0022]
As described above, the daoC gene according to the present invention is novel and encodes a gene encoding a novel D-amino acid oxidase different from the conventionally known D-amino acid oxidase, and a protein having the novel D-amino acid oxidase activity. And at least one selected from genes containing at least one of these genes (hereinafter sometimes simply referred to as daoC gene, the base sequence (2640 bp) is represented by SEQ ID NO: 2, And shown in FIGS. 3 and 4 of the drawings.)
[0023]
The DNA of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, each DNA represented by a specific base sequence in the present specification can be prepared by, for example, a shotgun cloning method using the Aspergillus oryzae genome as a starting material. At that time, each fragmented chromosomal DNA is linked to an appropriate cloning vector such as a plasmid vector or a phage according to its length and the like, and E. coli or the like is used by an appropriate method such as an electroporation method. A clone library can be prepared for transforming a suitable host cell and cloning the fragmented chromosomal DNA.
Furthermore, the base sequence of each fragmented chromosomal DNA obtained from such a clone library can be determined according to a known method such as a chemical decomposition method (Maxam-Gilbert method) and a dideoxy method.
[0024]
Alternatively, based on the information on the base sequence or amino acid sequence of the DNA of the present invention described in the present specification, it may be prepared by chemical synthesis well known to those skilled in the art or by PCR using the primer of the present invention. I can do it.
[0025]
As an example of the genome of Aspergillus oryzae used as a DNA source according to the present invention, the genome of Aspergillus oryzae RIB40 strain can be used. This strain has been deposited as FERM P-18273 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0026]
In the present invention, the daoC gene isolated as described above is introduced into a host and expressed to produce D-amino acid oxidase or a protein having D-amino acid oxidase enzyme activity. In the present invention, the protein having D-amino acid oxidase enzyme activity includes D-amino acid oxidase, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 and 2).
[0027]
For example, a recombinant vector is prepared by inserting the coding region (1.1 kbp) of the daoC gene into a vector (eg, E. coli high expression vector pET23b). The Escherichia coli expression plasmid prepared in this manner was named pET23b-daoC, and deposited as FERM P-19108 at the Patent Organism Depositary (FIG. 8).
[0028]
The Escherichia coli expression plasmid pET23b-daoC thus prepared is introduced into a host (for example, E. coli) to obtain a transformant. The transformant thus obtained was named Escherichia coli T7-DAOC. When this transformant was cultured, the cell disruption solution showed very high D-amino acid oxidase activity, confirming the expression of this gene.
[0029]
The D-amino acid oxidase protein according to the present invention has the action of oxidizing various D-amino acids to D-keto acids, as in the case of previously unknown D-amino acid oxidases, and corresponds to the following D-amino acids. Can be oxidized to D-keto acid: D-aspartic acid, D-glutamic acid, D-glutamine and the like. However, since the amino acid sequence is different from the conventional one, this enzyme was identified as a novel enzyme and named D-amino acid oxidase DAOC.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following experimental examples.
[0030]
[Example 1]
Cloning of the daoC gene and determination of the base sequence of the daoC gene As described in the previous application, among the genome analysis results distributed by the Neisseria gonorrhoeae genome analysis consortium, it is valid for the predicted gene Con1601_h_1200 that showed homology to D-amino acid oxidase The sex was examined. This gene was predicted as a gene with a total length of 3.4 kbp encoded on the reverse strand of genome contig 1601. Among them, 1-1000 bp was predicted to contain a promoter region, 1001-1032 bp, 1098-1684, 1777-2183, 2828-3121 bp a coding region, 3122-3421 bp a terminator region, and three introns. Genome predictions indicated that three introns were included, but analysis of the cDNA sequence revealed that there was no third intron.
[0031]
Therefore, the gene contained in Con1601_h_1200 is named daoC, and the cDNA obtained using the primer (oligo DNA # 1) containing the predicted start codon and oligo dT primer as a template for RNA obtained from rice bran, Analysis was performed. The base sequence of oligo DNA # 1 is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 5).
[0032]
As a result, unlike the prediction, the daoC gene contained only two introns, and 349 amino acids were encoded in the coding region. However, although the intron portion and the CDS region are different from those predicted, the base sequence of the gene encoding daoC is entirely included in the base sequence shown in SEQ ID NO: 36897 according to the previous application except for a part of substitution. Thus, it was confirmed that the gene represented by SEQ ID NO: 36897 according to the previous application is a D-amino acid oxidase gene.
[0033]
[Example 2]
Introduction of daoC gene into Escherichia coli Next, in order to confirm the function of the daoC gene, introduction of this gene into Escherichia coli was attempted. For the high expression of E. coli, the coding region (1.1 Kbp) of the daoC gene was treated with oligo DNA # 2 and oligo DNA # 3 with Pyrobest from Takara Shuzo Co., Ltd. using daoC cDNA as a template, and treated with restriction enzyme NdeI. It was inserted into the NdeI site of vector pET23b (Novagen) to construct a new recombinant vector pET23b-daoC, which was deposited as FERM P-19108 at the Patent Organism Depositary. Escherichia coli was transformed with this recombinant vector according to a conventional method, and the resulting new transformant was named Escherichia coli T7-DAOC.
[0034]
In the above, the base sequences of oligo DNA # 2 and oligo DNA # 3 used as PCR primers are shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 6) and SEQ ID NO: 5 (FIG. 7), respectively.
[0035]
The transformant obtained as described above was cultured. As a result, the cell disruption solution of the obtained transformant showed extremely high D-amino acid oxidase activity compared to the cell disruption solution of the transformant transformed with pET23b.
[0036]
Therefore, it was revealed that the daoC gene we isolated encoded a protein having D-amino acid oxidase activity. As described above, the daoC gene according to the present invention is novel and encodes a gene encoding a novel D-amino acid oxidase different from the conventionally known D-amino acid oxidase, and a protein having the novel D-amino acid oxidase activity. It indicates at least one selected from a gene and a gene containing at least one of these genes.
[0037]
[Example 3]
Use of Recombinant D-Amino Acid Oxidase DAOC The reaction formula of the reaction catalyzed by D-amino acid oxidase is shown below.
[0038]
D-amino acid + O ₂ + H ₂ O → keto acid + H ₂ O ₂ + NH ₃
[0039]
As is apparent from the reaction formula, D-amino acid can be quantified by detecting any of pyruvic acid, hydrogen peroxide or ammonia in the reaction product. For example, a colorimetric method, a fluorescence method, a chemiluminescence method, an electrode method, and the like are known for detecting the generated hydrogen peroxide, and any of them can be used. In the colorimetric method, a peroxidase substrate is oxidized and colored with hydrogen peroxide using a catalyst such as peroxidase, and the color density is measured with a spectrophotometer. Peroxidase substrates include o-phenylenediamine, 5-aminosalicylic acid, 4-aminoantipyrine and phenol, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), bis [3-bis (4- Chlorophenyl) methyl-4-dimethyl-aminophenyl] amine and the like can be used.
[0040]
In the fluorescence method, a substrate is oxidized with hydrogen peroxide using a catalyst such as peroxidase to generate a fluorescent substance, and the fluorescence intensity is measured with a fluorometer. As a substrate for peroxidase, p-hydroxyphenylacetic acid, p-hydroxyphenylpropionic acid and the like can be used. In the chemiluminescence method, a substrate such as peroxidase is used to oxidize a substrate with hydrogen peroxide to emit light, and the luminescence intensity is measured with a luminometer. As a chemiluminescent substrate, a luminol compound, lucigenin, an allyl oxalate compound, or the like can be used. A reagent containing the above-described reagent components necessary for detection of D-amino acid oxidase and D-amino acid can be prepared and assembled into a diagnostic agent or the like as a D-amino acid measurement kit.
[0041]
In addition, if this D-amino acid oxidase DAOC is used, it is possible to efficiently separate, purify and produce L-amino acids by racemic resolution of DL-amino acids. For example, only L-amino acids from chemically synthesized racemic amino acids. Can be obtained efficiently.
[0042]
The result of having examined the substrate specificity of daoC D-amino acid oxidase specifically is shown.
The reaction solution composition is shown below.
[0043]
50 mM D-amino acid 50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0)
0.86 mM o-dianisidine 3000 U peroxidase 0.5 μg / ml D-amino acid oxidase solution
After reacting at room temperature for 5 minutes, 0.5 ml of 30% sulfuric acid solution was added to 1 ml of the reaction solution, and the activity was measured by measuring the absorbance at 540 nm. The obtained results are shown in Table 1 below.
[0045]

[0046]
As a result of examining the substrate specificity, it was found that the present D-amino acid oxidase specifically reacts with D-aspartic acid and D-glutamic acid. Therefore, it can be seen that these D-amino acids are very effective in detection and racemic resolution.
[0047]
【The invention's effect】
According to the present invention, it becomes possible for the first time to produce a large amount of novel D-amino acid oxidase DAOC of Aspergillus, and D-amino acid oxidase is widely used in industry such as application to research reagents and test reagents for measuring D-amino acids. Is possible. In addition, since the present invention produces the koji mold enzyme by koji mold, the produced enzyme protein is extremely safe and is an epoch-making technology that can be applied to food, pharmaceutical, cosmetics industries and the like.
[0048]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of D-amino acid oxidase DAOC.
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the base sequence of the D-amino acid oxidase daoC gene.
FIG. 4 shows the continuation of the above.
FIG. 5 shows oligo DNA # 1 primer.
FIG. 6 shows oligo DNA # 2 primer.
FIG. 7 shows oligo DNA # 3 primer.
FIG. 8 shows the construction of an E. coli expression plasmid pET23b-daoC and its restriction enzyme map.

Claims (9)

以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質。The following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and a D-amino acid A protein having oxidase activity. 配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡであって、請求項１に記載のタンパク質（ａ）をコードする遺伝子、または、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質（ｂ）をコードする遺伝子。A DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, which is a gene encoding the protein (a) according to claim 1, or hybridizes with the gene under stringent conditions, and D-amino acid oxidase A gene encoding a protein (b) having activity. 請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。A recombinant vector comprising at least a coding region in the DNA of claim 2. 組換えベクターｐＥＴ２３ｂ−ｄａｏＣ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１０８）。Recombinant vector pET23b-daoC (FERM P-19108). 請求項３または４に記載の組換えベクターを導入してなる形質転換体。A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to claim 3 or 4. 請求項５に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼタンパク質を生産する方法。A method for producing a D-amino acid oxidase protein, comprising using the transformant according to claim 5. 請求項１に記載のタンパク質を使用すること、を特徴とするＤ−アミノ酸の測定方法。A method for measuring D-amino acid, comprising using the protein according to claim 1. 請求項１に記載のタンパク質を含有してなること、を特徴とするＤ−アミノ酸測定試薬。A D-amino acid measurement reagent comprising the protein according to claim 1. 請求項１に記載のタンパク質を使用すること、を特徴とするＤＬ−アミノ酸のラセミ分割方法。A method for racemic resolution of DL-amino acids, comprising using the protein according to claim 1.

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