JP4366087B2

JP4366087B2 - Method for detecting matrix proteinase-2

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Publication number: JP4366087B2
Application number: JP2003023426A
Authority: JP
Inventors: 一郎平原
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: JP2004229584A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の指標物質の検出方法、または腹膜炎、病状等の診断、判定、鑑別もしくは腹膜機能の判定に利用できる指標物質の検出方法に関する。詳しくは、腹腔排液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）を、ゼラチン分解活性を指標としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）と区別して簡便かつ安価に検出する方法、および非細菌性腹膜炎を、細菌性腹膜炎と区別して早期に判定するのに用いることができる検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、金属イオン依存性の細胞外マトリックス分解酵素であり、生体内では発生、分化、血管新生、創傷治癒、生殖、組織のリモデリング等に関与していることが知られている。また、癌細胞の基底膜への浸潤、転移や増殖能、炎症性細胞の組織への浸潤や遊走等、病理学的、生理学的な組織の破壊を伴う様々な疾患にも関与している。ヒトＭＭＰは、現在までに約２０種類の分子が同定されており、１）活性中心に亜鉛イオン（Ｚｎ²⁺）を有し、補酵素としてカルシウムイオン（Ｃａ²⁺) を必要とする、２）前駆体酵素として産生、分泌され、細胞外で各種のＭＭＰ活性化酵素によって切断され、ＭＭＰの活性化が起こる。また、３）ＭＭＰは生体内の細胞外マトリックスを分解するが、４）その酵素活性はＴＩＭＰ（tissue inhibitor of metalloproteinase ）、マリマスタット等により特異的に阻害される。そして、５）各ＭＭＰの一次構造は高い相同性を有するが、基質特異性の違いはこの一次構造のわずかな相違による高次構造の違いに依存する、と言われている。
【０００３】
ＭＭＰは、基質特異性の違いにより、コラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロメライシン群、ＭＴ−ＭＭＰ群、その他のサブファミリーに分類される。コラゲナーゼ群のＭＭＰは、一般的なプロテイナーゼでは分解されない間質系コラーゲンの初期分解を行う。ゼラチナーゼ群のＭＭＰは、コラーゲン群のＭＭＰによって初期分解したコラーゲン断片の更なる分解や、マクロファージや顆粒球等の炎症性細胞や繊維芽細胞の組織への浸潤や遊走、さらには血管新生等における基底膜の分解に関与している。ストロメライシン群のＭＭＰは、他の前駆体ＭＭＰを切断して活性化ＭＭＰにするだけでなく、プロテオグリカンのコア蛋白質やエラスチン等の様々な細胞外マトリックスの分解に関与している。
【０００４】
腹膜炎は、腹腔内に非自己の物質である異物が侵入したり、腹腔内への透析液等の注液による刺激で引き起こされる非細菌性腹膜炎と、ブドウ球菌や緑膿菌等の細菌による細菌性腹膜炎に分類される。非細菌性腹膜炎においては、腹膜の著しい肥厚およびＭＭＰ−２活性の上昇を特徴とし、細菌性腹膜炎においてはＭＭＰ−９濃度の急上昇等、分子生物学的に異なる現象があることが知られている（例えば、特許文献１参照) 。しかし、この二種類の腹膜炎の症状は、腹痛、発熱、嘔吐、食欲不振、下痢等、いずれも共通しており、発症初期に腹部の触診等の臨床的診断により判定することは、専門家であっても極めて困難であった。
【０００５】
非細菌性腹膜炎の治療方法としては、早期に発見できれば初期療法としてステロイド剤が有効である。しかし、一般にステロイド剤は免疫力を著しく低下させるため、細菌性腹膜炎患者への誤投与は避けるべきである。また、非細菌性腹膜炎患者への抗生剤の誤投与は、抗生剤の不必要な使用や抗生物質耐性菌の発生につながり、臨床医学的に好ましくない結果をもたらす。このような流れの中で、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎を、臨床的検査により正確に判定する必要性が高まっていた。そのような判定手段の一つとして、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎の分子生物学的現象の相違、すなわち腹腔排液中におけるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性を検出する方法が試みられている。腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）および被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）等の非細菌性腹膜炎の場合は、腹腔排液中のＭＭＰ−２の濃度が高いもののＭＭＰ−９の濃度は極めて低い。一方、細菌性腹膜炎の場合は、腹腔排液中のＭＭＰ−９は高濃度に存在するが、ＭＭＰ−２の濃度はそれ程高くない。この現象を利用して、前記先願技術（特許文献１）および特開２００１−２９２７９７号公報の方法により、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を特異的に検出し分ける方法が提唱されている（特許文献１、２参照) 。しかし、いずれの判別法も、操作手順が煩雑で時間がかかるとともに、特殊な分析機器や熟練した技術を必要とする。そこで、腹腔排液中のＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して簡便かつ安価に検出する方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−１７１４６８号公報
【特許文献２】
特開２００１−２９２７９７号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腹膜炎、腹膜炎の病状等の診断、判定、もしくは腹膜機能の判定に非常に有効な指標物質の検出方法を提供することである。詳しくは、腹腔排液中のＭＭＰ−２とＭＭＰ−９を、ゼラチン分解活性を指標として、簡便かつ安価に区別して検出する方法、およびその検出方法を用いることにより、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して早期に判定するのに好適な検出方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてＭＭＰ−９と区別して検知することを特徴とする検出方法を提供する。
【０００９】
腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標としてＭＭＰ−９と区別して検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法を提供する。
【００１０】
腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法を提供する。
【００１１】
前記非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎のどちらか一方を、他方と区別して鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して検知することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１２】
自覚症状が出ていない段階で、前記非細菌性腹膜炎を鑑別するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１３】
腹膜透析における腹膜機能を判定するのに用いることができる、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２を、ゼラチン分解活性を指標として検知することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を好適な実施例に基づいて詳細に説明する。本発明は、生物個体（以下、個体と表記する）内から採取した試料中の指標物質であるＭＭＰを、個体外において生化学的方法を用い、簡便かつ安価に検出することを特徴とする（以下、本発明の検出方法と記す) 。
【００１５】
本発明の検出方法は、ＭＭＰを検出できる物質を、ＭＭＰを含んだ試料に接触させることにより行うことを特徴とする。ＭＭＰを検出できる物質は、支持体に結合させた状態で使用することもできる。ここで、ＭＭＰを検出できる物質とは、ＭＭＰの基質、ＭＭＰと反応する物質、ＭＭＰの分解、修飾、多量体化等の形状変化によって生じた物質と反応する物質またはそれぞれの反応後の生成物に反応する物質等、広くＭＭＰを検出することができる物質のことで、ＭＭＰそのものと反応する物質だけに限定されない。
【００１６】
ＭＭＰを検出できる物質は支持体に支持されていることが好ましい。ＭＭＰを検出できる物質を結合させる支持体としては、本発明の検出方法を実施するにあたり、検出反応を阻害しない範囲で広く公知のものを使用することができる。具体的には、鉄、アルミニウム、銅、チタン等の金属またはその化合物；ホウ素、ケイ素、炭素、カルシウム等の非金属またはその化合物；上記金属または非金属を含有した合金またはその化合物；ナイロン、綿、ポリエステル、レーヨン、ポリアミド等の繊維；フィルム、ガラス、ゴム、樹脂、紙等が挙げられる。これらの支持体は、１種単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。ＭＭＰを検出できる物質の支持体への結合様式としては、共有結合、疎水結合、水素結合、分子間力等、種々の物質間または物体間に作用するエネルギーを利用した結合方法を用いることができる。
また、ＭＭＰを検出することができる物質そのものを、前記物体として使用することも可能である。
【００１７】
前記物体と試料とを接触させる方法としては、広く公知の方法を使用することができる。具体的には、流動性のない試料中に前記物体の全体または一部を一時的または定常的に浸す方法、物体の全体または一部に試料を滴下する方法、流動性のある試料中に物体を一時的に入れるまたは定置させる方法、物体を試料が揮発した雰囲気下に置く方法等である。物体の一部に試料を接触させる場合は、物体の１ヶ所に限らず２ヶ所以上と試料を接触させることができる。この場合、試料は同一のものであっても、それぞれ異なる由来の試料であっても良い。これらの方法の中でも好ましくは、前記物体の全体または一部を試料に浸す方法、物体上に試料を滴下する方法である。試料と物体上のＭＭＰを検出する物質とが効率的に反応し、検出の必要な試料の量を少なくできるからである。
【００１８】
本発明で試料を採取する個体とは、自立的および／または寄生的生活形態を持つ広く個体全般のことを指し、ヒト、サル、ラットなど哺乳動物や実験動物に限られない。具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、ブタ等の哺乳動物；メダカ、フナ等の魚類；カエル（オタマジャクシ）、イモリ、アシナシイモリ等の両生類；ハト、インコ、オウム、カナリア、ニワトリ等の鳥類；その他爬虫類等を含めた脊椎動物、無脊椎動物、植物等が挙げられる。これらの個体の中でも、ヒト等の哺乳動物や実験動物が好ましい。より好ましくは、透析を行っているヒト等の疾患を有する哺乳動物である。
【００１９】
上記のような個体から採取された試料は、本発明の特性に合致するものであれば、特に制限なく用いることができる。また、試料の採取場所、採取方法、液体、個体等の試料の形態についても、特に制限はない。本発明に用いることができる試料として具体的には、透析排液、腹水等の腹腔排液；肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝臓癌、膵臓癌、口腔癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌等の悪性腫瘍または良性腫瘍由来の細胞抽出液；肺、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、腎臓、膵臓、***等の疾患が疑われていない器官由来の試料；胸水、血液、リンパ液、唾液、関節液等である。これらの中でも、治療、手術、検査目的で採取された試料が好ましい。そのような試料は、必然的に得られることから、個体に新たな苦痛等を与えなくてもすむからである。より好ましくは、透析等により得られる腹腔排液；胸水である。腹腔内膜または胸腔内膜は、ＭＭＰ−２が多量に含まれているので、本発明を実施するのに必要な試料の量が少なくてすむ。
【００２０】
本発明の検出方法で使用される試料の温度は、検査対象とするＭＭＰが、好適に検出できる温度であることが好ましい。極端に高温であるとＭＭＰが熱エネルギーによって分解されたり、変性を受けてしまい、極端に低温であるとＭＭＰと検査試薬との反応性が悪くなるからである。試料を採取したときの試料の温度が試料中のＭＭＰを測定するのに好ましくない範囲にある場合は、適当な加温器を用いて試料の温度を好適な範囲にすることもできる。具体的には、ＭＭＰはタンパク質であるので０〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは試料中のＭＭＰの活性が測定の目的に反映される温度範囲である３０〜４０℃である。至適温度をもつＭＭＰについては、その温度で測定を行うこともできる。
【００２１】
試料のｐＨは、ＭＭＰがｐＨによる変性、分解等を受けない範囲であればよい。好ましくは、ＭＭＰを検出するにあたり、検出試験系で使用される他の試薬、物質等に大きな影響を与えないｐＨである。具体的にはｐＨ３〜９、好ましくは、ｐＨ５〜８である。
【００２２】
本発明の検出方法は、個体から採取した試料に対して、広く適用することができる。特に、試料を採取した個体内で、検出対象であるＭＭＰの変化がある条件が好適である。一例として、上記疾患の一つである腹膜炎発症時のＭＭＰの検出が挙げられる。腹膜炎とは、腹膜の炎症等のことで、医学的な定義と同義である。また、腹膜機能の低下とは、腹膜透析において腹膜平衡試験におけるＤ／Ｄ０グルコース値や透析排液量などが低下する状態のことであり、一般に腹膜透析の臨床医学において用いられている定義と同義である。
【００２３】
ＭＭＰのゼラチナーゼ活性を解析するためには、特異的基質が必要である。このようなゼラチナーゼ活性を測定するための基質としては、ゼラチナーゼが基質として認識し、認識した物質を分解することができるものであれば、広く公知のものを使用できる。このような基質として具体的には、ゼラチンそのものだけでなく、化学合成されたゼラチナーゼ合成基質やラベルされたゼラチン等の人工物やゼラチナーゼが認識するのと同じ認識部位を持つ天然物である。好ましくは、これらの基質を使用してゼラチナーゼを用いて酵素活性を調べたとき、ゼラチナーゼのＫｍ値が小さい基質である。ゼラチナーゼが、これらの基質をより効率よく認識し、酵素反応が極めて早く進行すると共に、検出に要する時間が短くなるからである。本明細書では、ゼラチナーゼの基質となるすべての物質をゼラチン群と表記することがある。
【００２４】
ここでゼラチン群とは、ゼラチンそのものだけでなく、上記のような方法で得られたゼラチナーゼの基質になるすべての物質を指す。本発明の検出方法においては広く公知のゼラチン群を使用することができる。また、ゼラチン群は架橋されたものでもよく、その架橋度は、本発明の検出方法に用いたときに、ＭＭＰによる分解で後に詳述の染料等による着色で、分解したゼラチン群と分解していないゼラチン群が判別できる範囲であれば良い。そのようなゼラチン群の中でも、動物の皮、腱、骨、軟骨、筋膜、しっぽ等、コラーゲンを含有する物質を熱湯で長時間処理し、コラーゲン分子間の塩類結合や水素結合の少なくとも一部が開裂した結果、非可逆的に水溶性タンパク質に変化したものが好ましい。より好ましくは、概ね分子量１０万以上で温水中ではゾルの状態だが、室温ではゲルとなるものである。このようなゼラチンであれば、ゼラチナーゼによって分解された時、その変化が視覚的に観察でき、特殊な機器を使用しなくともゼラチナーゼの活性を測定できるからである。
【００２５】
本発明の検出方法に使用されるゼラチン群は、検出に適した形状に加工して用いることができる。ここで加工とは具体的に、ゼラチン群の塊状物質を薄層にスライスしたり、フィルム、ガラスや樹脂等の支持体上に薄層コートしたり、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル中に混合する等、一般に認識される意味での加工である。検出に適した形状に加工された基質であるゼラチン群を、本明細書では基質フォームと表記することがある。このようなゼラチン群を加工する場合は、フィルム、ガラスや樹脂等の支持体上に薄層コートする方法が好ましい。本発明の検出方法では、試料中に上述の基質フォームの全体または一部を接触させることから、試料中での基質フォームの安定性が重要で、支持体が非水溶性であれば、水溶液中で十分な安定性を得られるからである。また、易崩壊性の支持体に薄層コートする方法も好ましい。易崩壊性であれば、基質フォームを試料中に完全に浸し、検出に要する時間経過後、試料中に溶解させることにより廃棄が容易に行えるからである。
【００２６】
本発明の検出方法においては、染料着色、蛍光修飾等の着色を行うことによって、簡便にＭＭＰを検出することができる。前記基質フォームを使用する場合には、ＭＭＰの染料着色、蛍光修飾による検出は、ゼラチン分解反応の前に、あらかじめ前記基質フォームを着色しておくことも、ＭＭＰによるゼラチン群の分解反応を行った後、または分解反応と同時に行うこともできる。また、着色はゼラチン分解反応の前、反応と平行して、反応後の３つのうち、任意の少なくとも１回以上行うことができる。
このようなゼラチン分解活性を観察するためには、ゼラチン分解反応を行った後に、ゼラチン群が分解された部分が上記の染料等によって染色されなくなる場合だけでなく、逆にゼラチン群が分解された部分が上記の染料等によって染まる場合を含む。さらに、ゼラチン群の分解された部分と分解されなかった部分が、異なる染料により染色される場合も含む。
【００２７】
このような目的に用いられる染料、顔料および／または蛍光試薬は、広く公知のものを使用することができる。具体的には、アゾ染料、アゾメチン染料、インドアニリン染料、ベンゾキノン染料、ナフトキノン染料、アントラキノン染料、ジフェニルメタン染料、トリフェニルメタン染料、キサンテン染料、アクリジン染料、アジン染料、アリザリン染料、オキサジン染料、チアジン染料、チアゾール染料、メチン染料、オキソノール染料、メロシアニン染料、シアニン染料、アリーリデン染料、スチリル染料、スチルベン染料、フタロシアニン染料、ペリノン染料、ピラゾロン染料、インジゴ染料、インジゴイド染料、チオインジゴ染料、キノリン染料、ニトロ染料、ニトロソ染料、硫化染料などを挙げることができる。これらの中でも、工業的に比較的大量に生産されているためコストも低く、フィルム、ガラス板等に塗布して使用したときに、他に特殊な検出機器等がなくとも視覚的に標的物質の存在、活性、消失等を分析できるものが好ましい。これらの染料、顔料または蛍光試薬は、１種単独でも２種以上を併用して使用することもできる。
【００２８】
以下に、腹腔排液を試料として用いた本発明の好適な実施形態を一例にして、本発明を具体的に述べていく。発明者が鋭意研究を行った結果、ゼラチンザイモグラフィーの解析から、非細菌性腹膜炎の腹腔排液中のゼラチン分解活性は、活性型ＭＭＰ−２によるものであることが明らかとなった。特開２０００−１７１４６８号公報で公知であるように、非細菌性腹膜炎においてＭＭＰ−２は高濃度で存在するが、ＭＭＰ−９は極めて低濃度である。しかし、図２の結果が示すように、後に詳述する非細菌性腹膜炎の実験動物モデルであるグルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群とも、コントロール群と比較して前駆体ＭＭＰ−２，活性型ＭＭＰ−２の濃度が上昇している。腹腔排液のような溶液状態では、前駆体プロテイナーゼは活性を有さないので、溶液中のＭＭＰ−２の活性は活性型ＭＭＰ−２に依存すると考えられる。また、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は、コントロール群と比較してグルコン酸クロルヘキシジン投与群では検出されず、タルク投与群でのみ前駆体ＭＭＰ−９が検出されるに止まる。したがって、前駆体ＭＭＰ−９がゼラチン分解活性を有さないことに加えて、活性型ＭＭＰ−９はほとんど存在しないことから、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は極めて低いと考えられる。全体として、腹腔排液中のゼラチン分解活性は、活性型ＭＭＰ−２に支配される。
【００２９】
発明者はさらに鋭意研究した結果、ゼラチンザイモグラフィーから、細菌性腹膜炎の透析排液には、前駆体ＭＭＰ−９、前駆体ＭＭＰ−２が含まれることが明らかとなった。特開２０００−１７１４６８号公報で公知の通り、細菌性腹膜炎においてはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９とも高濃度に存在する。図３の結果が示す通り、コントロール群と比較して細菌性腹膜炎の透析排液では、前駆体ＭＭＰ−２の顕著な変化はなく、活性型ＭＭＰ−２は検出されない。したがって、ＭＭＰ−２全体のゼラチン分解活性は極めて低いことがわかる。同様に、ＭＭＰ−９を前駆体および活性型に分けて考えると、前駆体ＭＭＰ−９はコントロール群と比較して顕著に増加しているが、活性型ＭＭＰ−９は検出されない。したがって、全体として、透析排液中のゼラチン分解活性は、極めて低いと考えられる。
【００３０】
本発明の検出方法により、腹腔排液中に含まれるＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を、ＭＭＰ−９のゼラチン分解活性を検出しないことにより検出することができる。前記の通り、非細菌性腹膜炎モデルの腹腔排液から採取された検体中には、活性型ＭＭＰ−２が存在するため、ゼラチン分解活性を示すと推測され、図４の結果が示すようにゼラチン分解活性が認められる。一方、細菌性腹膜炎の透析排液中には、前記ゼラチンザイモグラフィーの解析結果より前駆体ＭＭＰ−９が存在するが、活性型ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は検出限界以下である。図４の結果が示すように、細菌性腹膜炎の透析排液ではゼラチン分解活性は観察されない。故に腹腔排液の試料を用い、本発明の検出方法を行ってゼラチン分解活性が認められると、それは活性型ＭＭＰ−２、すなわちＭＭＰ−２によるものであると判断できる。つまり、腹腔排液については、ＭＭＰ−９と区別してＭＭＰ−２を検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法に従って、腹腔排液中のゼラチン分解活性を解析することにより、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎の合併症を判定することができる。腹腔排液から得られた試料について、本発明の検出方法を行いゼラチン分解活性が認められた場合、このゼラチン分解活性はＭＭＰ−２に由来するものと推測されるので、試料を採取した個体は非細菌性腹膜炎を発症していると判定できる。即ち、本発明は、ＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標として非細菌性腹膜炎発症の判定に有効な検出方法を提供することができる。
【００３２】
本発明の検出方法を、個体からの腹腔排液を試料として用いることにより、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して判別するのに、有効な検出方法を提供することができる。前記の通り、非細菌性腹膜炎においては、ＭＭＰ−２の中でも活性型ＭＭＰ−２がゼラチン分解活性を示す。したがって、腹腔排液から得られた試料について、本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定することにより、ゼラチン分解活性が認められれば非細菌性腹膜炎を発症していることを判定できる。一方、細菌性腹膜炎においては、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のゼラチン分解活性は、本発明の検出方法では検知されない。したがって、非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎の、どちらかであることが不明の腹膜炎を発症した個体から採取した腹腔排液について、本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定しゼラチン分解活性が認められれば、個体は非細菌性腹膜炎を発症していると判別することができる。逆に、ゼラチン分解活性が認められない腹膜炎の場合は、個体は細菌性腹膜炎を発症していると判別することができる。つまり、本発明の検出方法は、腹膜炎を発症した個体について、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎のどちらか一方の腹膜炎を、他方の腹膜炎と区別して判定するのに必要な検出方法を提供できる。
【００３３】
腹膜炎を発症していない個体または腹膜透析などを行っている個体から採取した腹腔排液について、本発明の検出方法を適用しゼラチン分解活性を測定することで、具体的な腹膜炎の症状が現れていない段階でも、腹膜炎を検知できる検査方法を提供することができる。本発明の検出方法の対象であるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、腹痛、発熱、嘔吐等の腹膜炎の具体的症状に先立ち、腹膜排液中の濃度が増加または活性化される分子である。したがって、これにより、具体的な腹膜炎等の症状が現れていない段階でも、腹膜炎が起こる可能性が高いと予測できる。
【００３４】
本発明の検出方法には、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９に特異的に作用する阻害剤を使用することにより、ＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別して、より正確に非細菌性腹膜炎を判定するために用いることができる検出方法を実施することができる。本発明の検出方法によるゼラチン分解活性が、他のゼラチナーゼでなくＭＭＰ−２によることが、より明確となるからである。このような目的に使用されるＭＭＰ特異的な阻害剤により、本発明の検出方法のゼラチン分解活性が、どのＭＭＰによるものであるかがより明確になり、非細菌性腹膜炎発症の診断をさらに確度高く行うことができるからである。
【００３５】
本発明の検出方法は、ＭＭＰ−２の基質であるゼラチン群を支持体に結合させた基質フォームを試薬として含有した試薬一式（キット）を用いて行えば、さらに容易に実施することもできる。試薬一式（キット）は、ゼラチン分解活性を測定するために広く用いられる公知の試薬を含有していても、バット、シャーレ、エッペンドルフチューブ等の他の器具が付属していてもよい。具体的に試薬としては、ゼラチン群、支持体、基質フォーム、試料希釈用緩衝液、ゼラチン分解活性測定用緩衝液、染料・顔料・蛍光含有試薬、染色用緩衝液、脱染用試薬、ポジティブコントロール用試薬、ネガティブコントロール用試薬、蒸留水等が挙げられる。これらの試薬は試薬一式（キット）の中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。試薬一式（キット）中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明を実施するについて可能な範囲であればよい。また、試薬一式（キット）には、好適なゼラチン分解活性測定条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、基質フォームのみであってもよい。
【００３６】
【実施例】
以下に、具体的実施例を詳細に示すが、本発明はこれらの実施例に限られない。また、実施例において使用した試薬の濃度「％」は、特に明示のない限り試薬の体積に対する質量パーセント、すなわちＷ／Ｖ％で表記した。
【００３７】
本発明者は、ＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標とした非細菌性腹膜炎の簡便な判定法の開発を目的として、非細菌性腹膜炎の実験動物モデル系の作製を試みた。ヒトの腎臓機能障害の治療法の１つとして腹膜透析を行うと、前述の通り、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等、腹膜肥厚を伴いうる様々な非細菌性腹膜炎等の合併症を引き起こす。しかし、これらの非細菌性腹膜炎の原因は、可塑剤、粒子状物質等の異物の腹膜への侵襲、腹膜透析液による腹腔内ｐＨの急激な変化、腹膜洗浄液の腹膜への浸潤等、非常に多岐に及ぶ。また、実験動物モデル系はあくまで非ヒトの実験系であるため、本発明ではすでに確立された二種類の実験動物モデル系を、非細菌性腹膜炎のモデル系として使用することにした。
【００３８】
第１の実験動物モデル系では、ラットに対し消毒剤であるグルコン酸クロルヘキシジンをアルコールに溶解した溶液を、腹腔内に注射器で直接投与して非細菌性腹膜炎を発症させるモデル系である。この実験動物モデル系は、腹膜に直接化学的刺激を与えることで、腹膜肥厚および腹膜機能の低下を引き起こす。
【００３９】
第２の実験動物モデル系は、ラットに対し異物であるタルク（ケイ酸マグネシウムの三斜晶系結晶）を生理食塩水に懸濁し、注射器を用いて腹腔に直接投与することにより、非細菌性腹膜炎に相当する炎症を引き起こすモデル系である。この実験動物モデル系では、腹膜の線維性肥厚、腹膜機能の低下、腹膜癒着までいたる比較的重症の非細菌性腹膜炎のモデル系である。
【００４０】
第１および第２の実験動物モデル系で使用したのは、ＳＰＦ／ＶＡＰのラット（Ｃｒｊ：（ＳＤ）ＩＧＳ、８週齢、オス）である。本発明で使用したラットは、給餌および給水を十分行い飢餓状態にせず、飼育する衛生環境にも十分注意した。また、ラットは細菌感染などによる細菌性腹膜炎等の疾患が発症しないように留意した。
【００４１】
実験で使用したグルコン酸クロルヘキシジン溶液は、１５％エタノール水溶液（Ｖ／Ｖ％蒸留水）中で、グルコン酸クロルヘキシジンの濃度が０．１％となるように無菌的に調製した。この溶液をラットの腹腔に注射器を用いて、無菌的に３ｍｌずつ投与し、これを１日に１回で、３週間継続して行った。投与は、ラットにエーテル麻酔をかけた状態で行い、極力ラットに肉体的、精神的苦痛を与えないように配慮した。
【００４２】
実験で使用したタルク溶液は、１ｇの粉末タルクを１５ｍｌの生理食塩水で懸濁した後、高圧蒸気滅菌を２０分間行った。このようにして用意したタルク溶液を、ラットの腹腔に注射器を用いて、無菌的に一回に１５ｍｌ投与した。一回の投与後は６日間休息を与え、このサイクルを１回とすると、３サイクル行った。投与はラットにエーテル麻酔をかけた状態で行い、ラットに肉体的、精神的苦痛を与えないように配慮し、投与自体に伴う副反応を極力抑えた。
【００４３】
コントロール群としては、生理食塩水（ペリトリックＰ２５０、テルモ社製）のみを投与したものを設定した。投与スケジュールは、グルコン酸クロルヘキシジン投与群と同様の条件で行い、毎日１回１５ｍｌずつ投与した。
【００４４】
コントロール群、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群のいずれも、各群に使用するラットは４匹（ｎ＝４）とし、最初の投与から２２日目に、下記の腹膜平衡試験を行った。本実施例では、腹膜平衡試験実施時に試料となる腹腔排液の無菌試験を行い、好気性細菌、嫌気性細菌、真菌が感染していないことを確認した。
【００４５】
腹膜機能は、腹膜におけるグルコースの透過性、すなわちＤ／Ｄ０グルコース値で評価した。Ｄ／Ｄ０グルコース値を算出するための腹膜平衡試験は以下のようにして行った。ラットの体重当たり５０ｍｌ／ｋｇの２．５％グルコース含有透析溶液（ペリトリックＰ２５０、テルモ社製）を、注射器を使用して消毒したラットの腹部に注液した。注液直後、腹腔から０．５ｍｌを回収し、回収液中のグルコース濃度（Ｄ０％）を測定した。次に、透析溶液の注液９０分後、ラットの腹腔に注射針を指して腹腔内の溶液を採取し、採取した溶液のグルコース濃度（Ｄ％）を測定した。そして、このグルコース濃度Ｄを、注液直後の腹腔排液中のグルコース濃度（Ｄ０＝２．５％）で除して、Ｄ／Ｄ０グルコース値を算出する。なお、グルコース濃度は、ムロターゼ酵素法により測定した。この結果を下記図１に示す。
【００４６】
図１の結果が示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群では、コントロール群と比較して著しくＤ／Ｄ０グルコース値が小さく、腹膜機能が低下していることが明らかとなった。
【００４７】
図１において、投与９０分後に得られた腹腔排液について、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の存在を調べるためにザイモグラフィー法による解析を行った。ザイモグラフィーの基質としては、ゼラチンを用い、腹腔排液中でゼラチナーゼ活性をもつ酵素の存在、およびその活性化レベルの検索を行った。腹腔排液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液（０．０９ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／３％ＳＤＳ／１０％グリセリン／ブロモフェノールブルー、サンプルバッファー）で１６倍に希釈した。次に、１４％ゼラチンを含有した０．１％ＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミドゲルに、１レーンにつき４μｌをアプライし電気泳動を行った。電気泳動で用いる電気泳動用緩衝液は、０．１９Ｍグリシン／０．００１％ＳＤＳ／０．０２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）（ランニングバッファー）の組成のものを使用した。１００Ｖの定電圧（ＣｏｎｓｔａｎｔＶｏｌｔａｇｅ）で４時間電気泳動を行った後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．１Ｍ塩化ナトリウム／２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（リナチュレーションバッファー）の溶液に泳動済みのゲルを浸し、卓上振盪器で４５回転／分の速度で１．５時間振盪し、ゲル中のＭＭＰのリナチュレーションを行った。この処理により、ゲル中の前駆体ＭＭＰ−２および前駆体ＭＭＰ−９が、それぞれ強制的に活性型に転換する。次に、ゲルの表面を蒸留水で３回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（リアクションバッファー）に浸し、３７℃で１８時間反応させた。ゼラチン分解反応終了後、ゲルの表面を蒸留水で３回洗浄し、クマシー染色を行った。染色液としては、１．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０／４５％エタノール／１０％酢酸水溶液を用い、この染色液中にゲルを浸し、ゆっくりと２０分間振盪した。染色終了後、過剰の染色液を除去するために、２５％エタノール／８％酢酸水溶液中にゲルを浸して脱染し、最後に蒸留水でゲルを洗浄した。
【００４８】
前記のとおりに行ったゼラチンザイモグラフィーの結果を図２に示す。電気泳動により指標物質が分離され、ゼラチナーゼ活性をもつ指標物質は、その固有の位置に、クマシー染色により染色されない透明なバンドとして同定された。図２の結果が示すように、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群から調製した腹腔排液中には、コントロール群と比較して前駆体ＭＭＰ−２が高濃度に含まれ、活性型ＭＭＰ−２も若干検出された。一方、ＭＭＰ−９は、タルク投与群の一部で前駆体が確認できるものの、その濃度は極めて低く、また、活性型ＭＭＰ−９については検出できなかった。グルコン酸クロルヘキシジン投与群では、ＭＭＰ−９は前駆体および活性型とも検出できなかった。以上の結果から、非細菌性腹膜炎モデルのラットから採取した腹腔排液中には、ゼラチナーゼ活性を持つ酵素のうち、少量ではあるが活性型ＭＭＰ−２が存在し、ＭＭＰ−９の活性型は検出されなかった。
【００４９】
細菌性腹膜炎での指標物質およびその変化を調べるために、以下の実験を行った。まず、ヒトの腹膜透析に伴う細菌性腹膜炎と同様に、実験動物に腹膜透析を行い、細菌性腹膜炎が発症した個体について解析した。細菌性腹膜炎の発症のコントロール群は、腹膜透析を実施して腹膜炎を発症しなかった個体を用いた。
【００５０】
実験動物としてＳＰＦ／ＶＡＰのラット（Ｃｒｊ：（ＳＤ）ＩＧＳ、６週齢、オス）を選択した。本発明で使用したラットは、給餌および給水を十分行い飢餓状態にせず、飼育する衛生環境にも十分注意した。また、ラットは１匹ずつ個別に飼育し、腹膜透析以外の原因による細菌性腹膜炎やそれ以外の疾患が発症しないように留意した。
【００５１】
ラットにエーテル麻酔を行った後、腹部の体毛を剃ってイソジン（明治製菓製）消毒し、透析溶液を注排液するためのシリコンカテーテルを移植した。このカテーテルを使用して、１日１回ラットの体重当たり５０ｍｌ／ｋｇの透析溶液（ペリトリック１３５、テルモ社製）を注排液し、透析排液については継続的に細菌試験と光学顕微鏡観察による顆粒球の細胞計数を行った。腹膜透析を連日行った結果、透析開始１０日目の透析排液中で、顆粒球が著しく増加していることが判明した。このときの細菌試験の結果から、透析排液中にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが同定されたため、この細菌が原因である細菌性腹膜炎と判断した。
【００５２】
細菌性腹膜炎発症時の透析排液について、前記のとおり、ゼラチンザイモグラフィーを行った結果を図３に示した。この透析排液中には、高濃度の前駆体ＭＭＰ−９が含まれているが、活性型ＭＭＰ−９は検出限界以下であった。一方、非細菌性腹膜炎発症時に顕著に増加していたＭＭＰ−２は、細菌性腹膜炎では前駆体は若干濃度が上昇しているものの、活性型は検出されなかった。したがって、細菌性腹膜炎を誘発した透析排液中では、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９の活性型は極めて少ないため、全体としてゼラチン分解活性が低いことが示唆された。
【００５３】
上記のようにして得られた、非細菌性腹膜炎の動物実験モデル系であるグルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の腹腔排液と、細菌性腹膜炎の発症時の透析排液について、本発明の検出方法によりゼラチナーゼ活性を測定した。その結果を図４に示す。コントロール群としては、非細菌性腹膜炎を発症させたときに使用したものを用いた。むらなく均一に薄層塗布したゼラチン薄層コ−トフィルムを、２ｍｍ×５０ｍｍの大きさに切断し、実験で使用するゼラチン薄層コートフィルム片にする。前記の各透析排液を、ピペットマンを使用してエッペンドルフチューブに２００μｌ分注する。そして、このチューブの中に、上述のゼラチン薄層コートフィルム片の先端が溶液に触れる形で浸し、３７℃で３０時間反応させた。所定時間経過後、ゼラチン薄層コートフィルム片をチューブから取り出し、ＢｉｅｂｒｉｃｈＳｃａｌｅｔ染色液（０．２％ＢｉｅｂｒｉｃｈＳｃａｌｅｔ／２．５％トリクロロ酢酸／５０％エタノール）に４分間浸した後、蒸留水中に５分間浸して、余分な色素を除去した。
【００５４】
本発明の検出方法によるゼラチン分解活性の測定結果を、図４に示す。グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群においては、ゼラチン薄層コートフィルム片が腹腔排液に浸っていた先端領域の染色抜けが観察される。したがって、先に行ったゼラチンザイモグラフィーによる解析結果から、ＭＭＰ−２が含有されていた。一方、図４の結果が示すように、細菌性腹膜炎を発症したラットから採取した透析排液中では染色抜けが起こらず、本発明の検出方法で検出されるゼラチン分解活性を持つ酵素は、検出限界レベル以下であった。また、コントロール群のフィルム片では染色抜けが観察されなかった。
【００５５】
本発明の検出方法によりゼラチン分解活性を測定することにより、腹腔排液中のＭＭＰ−２をＭＭＰ−９と区別することができ、非細菌性腹膜炎と細菌性腹膜炎を区別して判別することができる。これは、非細菌性腹膜炎時は活性型および前駆体ＭＭＰ−２が増加し、細菌性腹膜炎時は前駆体ＭＭＰ−９のみが増加したことによる。図４の結果が示すように、非細菌性腹膜炎の２つの実験動物モデルを用いて得られた腹腔排液のゼラチン分解活性を、本発明の検出方法で測定すると、高いゼラチン分解活性が観察される。しかし、細菌性腹膜炎を発症したラットから得られた透析排液では、ゼラチン分解活性は極めて低く、検出限界以下であった。したがって、例えば、本発明の検出方法を用いて、腹膜透析を行っている患者から採取した透析排液のゼラチン分解活性を測定し、ゼラチン分解活性が観察されたときには、腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、ＳＥＰ、ＥＰＳ等の非細菌性腹膜炎を併発していることが判定される。逆に、ゼラチン分解活性が観察されなければ、全く腹膜炎を併発していないまたは細菌性腹膜炎を併発している、のどちらかであると判断される。すなわち、非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して鑑別できる。一方、腹膜機能の低下をＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を指標として判定することができる。
【００５６】
腹膜透析は、わが国で認可されてから１５年以上も経過するが、透析患者の多くが血液透析を選択しており、腹膜透析を行っている患者は全体の５％に満たない。その理由として、上述の腹膜透析に伴う合併症発症などが挙げられるが、本発明の検出方法の指標物質としてＭＭＰ−２を適用することで、非細菌性腹膜炎等の合併症を早期に発見できる事に加えて、細菌性腹膜炎との判別がきわめて容易に行え、仮に合併症を併発したとき、または併発する恐れが高いときに、正確な診断の予備的判定として用いることができる。また、逆に腹膜炎を診断されている場合には、非細菌性腹膜炎であるか細菌性腹膜炎であるかを、正確に判定することができ、治療の方針が的確に立てられる効果がある。さらに、腹膜透析は血液透析と異なり、患者の自宅や職場等、病院以外の場所でも比較的簡便に行えることから、通院の頻度を減らすことができ、患者のＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）向上に貢献できる利点を持っている。本発明の検出方法で合併症早期発見の技術を確立することにより、これらの利点を持つ腹膜透析の普及を促進し、患者のＱＯＬをさらに向上させることができる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の検出方法は、操作手順が簡便で特殊な分析機器などを用いずに、迅速に操作を行うことができる。また、高価な試薬や特殊機器を使用しないので、一検体あたり非常に安価で、かつ病院や研究所等場所を選ばず、熟練した技術を持っていなくても簡便に検査ができる。腹膜透析患者の透析排液を検体として使用することで、早期に非細菌性腹膜炎等の合併症を発見でき、確実な治療方針を提供し、患者のＱＯＬの向上に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルを使用した時の、腹膜平衡試験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルを使用した時に回収された、腹腔排液中のゼラチナーゼをゼラチンザイモグラフィー法により解析した結果を示す染色像である。
【図３】図３は、細菌性腹膜炎を発症させたラットから回収された透析排液について、ゼラチナーゼのゼラチンザイモグラフィー法による解析を行った染色像である。
【図４】図４は、グルコン酸クロルヘキシジン投与群およびタルク投与群の２つの非細菌性腹膜炎実験動物モデルから回収された腹腔排液および細菌性腹膜炎を発症させたラットから回収された透析排液について、本発明の検出方法によりゼラチン薄層コートフィルム片を使用してゼラチン分解活性を解析した結果を示す染色像である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting an indicator substance in a sample, or a method for detecting an indicator substance that can be used for diagnosis, determination, differentiation, or determination of peritoneal function, such as peritonitis and medical conditions. Specifically, a method for detecting matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in peritoneal drainage easily and inexpensively by distinguishing it from matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) using gelatinolytic activity as an index, and non-bacteria The present invention relates to a detection method that can be used for early determination of bacterial peritonitis in distinction from bacterial peritonitis.
[0002]
[Prior art]
Matrix metalloproteinase (MMP) is an extracellular matrix degrading enzyme dependent on metal ions, and is known to be involved in development, differentiation, angiogenesis, wound healing, reproduction, tissue remodeling, etc. in vivo. ing. In addition, it is also involved in various diseases associated with pathological and physiological tissue destruction such as invasion of cancer cells into the basement membrane, metastasis and proliferation ability, infiltration and migration of inflammatory cells into tissues. About 20 types of human MMP have been identified so far. 1) Zinc ion (Zn) at the active center ²⁺ ) And calcium ion (Ca) as a coenzyme ²⁺ 2) Produced and secreted as a precursor enzyme, cleaved by various MMP activating enzymes outside the cell, and MMP activation occurs. 3) MMP degrades the extracellular matrix in the living body. 4) Its enzyme activity is specifically inhibited by TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase), marimastat, and the like. And 5) The primary structure of each MMP has high homology, but it is said that the difference in substrate specificity depends on the difference in the higher order structure due to the slight difference in the primary structure.
[0003]
MMPs are classified into a collagenase group, a gelatinase group, a stromelysin group, an MT-MMP group, and other subfamilies according to differences in substrate specificity. Collagenase MMPs undergo initial degradation of interstitial collagen that is not degraded by common proteinases. Gelatinase group MMPs are used for further degradation of collagen fragments initially degraded by collagen group MMPs, infiltration and migration of inflammatory cells such as macrophages and granulocytes and fibroblasts, and for angiogenesis. It is involved in membrane degradation. The stromelysin group of MMPs not only cleaves other precursor MMPs into activated MMPs, but is involved in the degradation of various extracellular matrices such as proteoglycan core protein and elastin.
[0004]
Peritonitis is a non-bacterial peritonitis caused by the invasion of a foreign substance that is a non-self substance into the abdominal cavity, or a bacterium such as staphylococci or Pseudomonas aeruginosa Classified as peritonitis. It is known that nonbacterial peritonitis is characterized by marked thickening of the peritoneum and increased MMP-2 activity, and bacterial peritonitis is known to have different molecular biological phenomena such as a rapid increase in MMP-9 concentration. (For example, refer to Patent Document 1). However, these two types of symptoms of peritonitis are common in abdominal pain, fever, vomiting, loss of appetite, diarrhea, etc., and it is an expert to judge by clinical diagnosis such as palpation of the abdomen at the beginning of onset. Even so, it was extremely difficult.
[0005]
As a method for treating nonbacterial peritonitis, a steroid agent is effective as an initial therapy if it can be detected early. However, in general, steroids significantly reduce immunity, so misadministration to patients with bacterial peritonitis should be avoided. In addition, misadministration of antibiotics to patients with nonbacterial peritonitis leads to unnecessary use of antibiotics and the development of antibiotic-resistant bacteria, resulting in clinically undesirable results. In such a trend, there has been a growing need to accurately determine non-bacterial peritonitis and bacterial peritonitis by clinical examination. As one of such determination means, a method for detecting the difference in molecular biological phenomena between non-bacterial peritonitis and bacterial peritonitis, that is, the activity of MMP-2 and MMP-9 in peritoneal drainage has been attempted. Yes. In the case of nonbacterial peritonitis such as peritoneal sclerosis, sclerosing peritonitis, sclerosing encapsulating peritonitis (SEP) and encapsulating peritoneal sclerosis (EPS), although the concentration of MMP-2 in the peritoneal drainage is high The concentration of MMP-9 is very low. On the other hand, in the case of bacterial peritonitis, MMP-9 in the peritoneal drainage is present at a high concentration, but the concentration of MMP-2 is not so high. By utilizing this phenomenon, a method for specifically detecting and separating MMP-2 and MMP-9 has been proposed (Patent Document 1) and the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-292797. References 1 and 2). However, any of the discrimination methods requires complicated analysis procedures and time, and requires special analytical instruments and skilled techniques. Therefore, there has been a demand for a method for easily and inexpensively detecting MMP-2 in peritoneal drainage from MMP-9.
[0006]
[Patent Document 1]
JP 2000-171468 A
[Patent Document 2]
JP 2001-292797 A
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for detecting an indicator substance that is very effective in the diagnosis, determination, or determination of peritoneal function of peritonitis or peritonitis. Specifically, MMP-2 and MMP-9 in peritoneal drainage are detected by distinguishing easily and inexpensively using gelatinolytic activity as an index, and by using the detection method, nonbacterial peritonitis is bacterial. To provide a detection method suitable for early determination as distinguished from peritonitis.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Provided is a detection method characterized in that MMP-2 is detected separately from MMP-9 using gelatinolytic activity as an index.
[0009]
The detection method according to claim 1, wherein MMP-2 contained in the peritoneal drainage is detected separately from MMP-9 using gelatinolytic activity as an index.
[0010]
MMP-2 contained in peritoneal drainage, which can be used to differentiate nonbacterial peritonitis such as peritoneal sclerosis, sclerosing peritonitis, SEP, EPS, etc., is characterized by detecting gelatin degradation activity as an index A detection method according to claim 1 or 2 is provided.
[0011]
MMP-2 contained in peritoneal drainage can be detected separately from MMP-9, which can be used to distinguish one of the nonbacterial peritonitis and bacterial peritonitis from the other. The detection method according to any one of claims 1 to 3 is provided.
[0012]
The MMP-2 contained in the peritoneal drainage, which can be used to distinguish the non-bacterial peritonitis in a stage where no subjective symptoms are present, is detected using gelatinolytic activity as an index. Item 5. A detection method according to any one of Items 1 to 4.
[0013]
6. MMP-2 contained in peritoneal drainage, which can be used to determine peritoneal function in peritoneal dialysis, is detected using gelatinolytic activity as an index. Provide a detection method.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on preferred embodiments. The present invention is characterized in that MMP, which is an indicator substance in a sample collected from within a living individual (hereinafter referred to as an individual), is detected easily and inexpensively using a biochemical method outside the individual ( Hereinafter, this is referred to as the detection method of the present invention).
[0015]
The detection method of the present invention is characterized in that a substance capable of detecting MMP is brought into contact with a sample containing MMP. A substance capable of detecting MMP can also be used in a state bound to a support. Here, the substance capable of detecting MMP is an MMP substrate, a substance that reacts with MMP, a substance that reacts with a substance caused by a shape change such as decomposition, modification, or multimerization of MMP, or a product after each reaction. It is a substance that can detect MMP widely, such as a substance that reacts with the MMP, and is not limited to a substance that reacts with the MMP itself.
[0016]
The substance capable of detecting MMP is preferably supported on a support. As a support to which a substance capable of detecting MMP is bound, widely known ones can be used as long as they do not inhibit the detection reaction in carrying out the detection method of the present invention. Specifically, a metal such as iron, aluminum, copper, titanium, or a compound thereof; a nonmetal such as boron, silicon, carbon, or calcium; or a compound thereof; an alloy containing the metal or a nonmetal or a compound thereof; nylon, cotton , Polyester, rayon, polyamide, etc .; film, glass, rubber, resin, paper and the like. These supports may be used alone or in combination of two or more. As a mode of binding of a substance capable of detecting MMP to a support, a binding method using energy acting between various substances or objects such as covalent bond, hydrophobic bond, hydrogen bond, intermolecular force, etc. can be used. .
In addition, a substance that can detect MMP itself can be used as the object.
[0017]
A widely known method can be used as a method of bringing the object into contact with the sample. Specifically, a method in which all or a part of the object is temporarily or constantly immersed in a non-flowable sample, a method in which a sample is dropped on the whole or a part of the object, an object in a fluid sample For example, a method for temporarily placing or placing a sample, or a method for placing an object in an atmosphere in which a sample is volatilized. When the sample is brought into contact with a part of the object, the sample can be brought into contact with not only one place of the object but also two or more places. In this case, the samples may be the same or different from each other. Among these methods, the method of immersing all or part of the object in the sample and the method of dropping the sample on the object are preferable. This is because the sample and the substance that detects MMP on the object react efficiently, and the amount of the sample that needs to be detected can be reduced.
[0018]
The individual from which the sample is collected in the present invention refers to a wide variety of individuals having independent and / or parasitic lifestyles, and is not limited to mammals such as humans, monkeys, and rats, or laboratory animals. Specifically, mammals such as humans, monkeys, rats, mice, dogs, rabbits, guinea pigs, hamsters, cats, and pigs; fishes such as medaka and crucifers; amphibians such as frogs (tadpoles), newts, pinniped newts; pigeons, Examples include birds such as parakeets, parrots, canaries and chickens; vertebrates including reptiles, invertebrates, and plants. Among these individuals, mammals such as humans and laboratory animals are preferable. More preferably, it is a mammal having a disease such as a human undergoing dialysis.
[0019]
A sample collected from the individual as described above can be used without particular limitation as long as it matches the characteristics of the present invention. Moreover, there is no restriction | limiting in particular also about the sample collection places, collection methods, and forms of samples, such as a liquid and a solid. Specific examples of samples that can be used in the present invention include dialysis drainage, peritoneal drainage such as ascites; lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, liver cancer, pancreas Cell extracts derived from malignant or benign tumors such as cancer, oral cancer, prostate cancer, kidney cancer, and bladder cancer; diseases such as lung, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, liver, kidney, pancreas, and breast are suspected Non-organ-derived samples; pleural effusion, blood, lymph, saliva, joint fluid, etc. Among these, a sample collected for the purpose of treatment, surgery, and examination is preferable. This is because such a sample is inevitably obtained, and it is not necessary to give new pain to the individual. More preferably, it is peritoneal drainage obtained by dialysis or the like; pleural effusion. Since the abdominal cavity or pleural cavity contains a large amount of MMP-2, the amount of sample required to carry out the present invention can be reduced.
[0020]
The temperature of the sample used in the detection method of the present invention is preferably a temperature that can be suitably detected by the MMP to be inspected. This is because the MMP is decomposed by heat energy or undergoes denaturation when the temperature is extremely high, and the reactivity between the MMP and the test reagent is deteriorated when the temperature is extremely low. If the temperature of the sample when the sample is collected is in an unpreferable range for measuring MMP in the sample, the temperature of the sample can be adjusted to a suitable range using an appropriate warmer. Specifically, since MMP is a protein, it is 0 to 60 ° C., preferably 10 to 50 ° C., more preferably 30 to 40 ° C., which is a temperature range in which the activity of MMP in the sample is reflected for the purpose of measurement. . For the MMP having the optimum temperature, the measurement can be performed at that temperature.
[0021]
The pH of the sample may be in a range where the MMP is not subject to denaturation, decomposition, etc. due to pH. Preferably, the pH is such that it does not significantly affect other reagents, substances, etc. used in the detection test system when detecting MMP. Specifically, it is pH 3-9, preferably pH 5-8.
[0022]
The detection method of the present invention can be widely applied to samples collected from individuals. In particular, a condition in which there is a change in the detection target MMP within the individual from which the sample is collected is preferable. As an example, detection of MMP at the onset of peritonitis, which is one of the above diseases, can be mentioned. Peritonitis is inflammation of the peritoneum and the like, and is synonymous with medical definition. In addition, the decrease in peritoneal function is a state in which the D / D0 glucose value, the amount of dialysis drainage, and the like in the peritoneal equilibrium test decrease in peritoneal dialysis, and is synonymous with the definition generally used in clinical medicine of peritoneal dialysis It is.
[0023]
In order to analyze the gelatinase activity of MMP, a specific substrate is required. As a substrate for measuring such gelatinase activity, a widely known substrate can be used as long as gelatinase can recognize the substrate and decompose the recognized substance. Specifically, such a substrate is not only gelatin itself, but also a chemically synthesized gelatinase synthetic substrate, an artificial product such as labeled gelatin, or a natural product having the same recognition site as gelatinase recognizes. Preferably, when the enzyme activity is examined with gelatinase using these substrates, the substrate has a low Km value for gelatinase. This is because gelatinase recognizes these substrates more efficiently, the enzymatic reaction proceeds very quickly, and the time required for detection is shortened. In the present specification, all substances that are substrates for gelatinase may be referred to as gelatin groups.
[0024]
Here, the gelatin group refers not only to gelatin itself, but also to all substances that are substrates for gelatinase obtained by the method described above. In the detection method of the present invention, widely known gelatin groups can be used. The gelatin group may be cross-linked, and the degree of cross-linking is decomposed with the decomposed gelatin group after being decomposed by MMP and colored by a dye described in detail later when used in the detection method of the present invention. It may be within a range in which no gelatin group can be identified. Among such gelatin groups, a substance containing collagen, such as animal skin, tendon, bone, cartilage, fascia, and tail, is treated with hot water for a long time, and at least a part of salt bonds and hydrogen bonds between collagen molecules. As a result of cleaving, it is irreversibly changed to a water-soluble protein. More preferably, it has a molecular weight of 100,000 or more and is in a sol state in warm water but becomes a gel at room temperature. This is because such gelatin can be visually observed when it is decomposed by gelatinase, and the activity of gelatinase can be measured without using a special instrument.
[0025]
The gelatin group used in the detection method of the present invention can be processed into a shape suitable for detection. Here, specifically, processing refers to slicing a block of gelatin group into a thin layer, coating a thin layer on a support such as a film, glass or resin, or mixing it into an agarose gel or polyacrylamide gel. , Processing in a generally recognized sense. A group of gelatin that is a substrate processed into a shape suitable for detection may be referred to as a substrate foam in this specification. In the case of processing such a gelatin group, a method of coating a thin layer on a support such as a film, glass or resin is preferred. In the detection method of the present invention, the whole or a part of the above-mentioned substrate foam is brought into contact with the sample. Therefore, the stability of the substrate foam in the sample is important. If the support is insoluble in water, This is because sufficient stability can be obtained. Also preferred is a method of thinly coating a readily disintegratable support. This is because if it is easily disintegrable, the substrate foam can be easily discarded by immersing the substrate foam completely in the sample and dissolving it in the sample after the time required for detection.
[0026]
In the detection method of the present invention, MMP can be easily detected by coloring such as dye coloring and fluorescent modification. When the substrate foam is used, MMP dye coloring and detection by fluorescence modification may be performed by coloring the substrate foam in advance before the gelatin decomposition reaction, or by decomposing the gelatin group using MMP. It can also be carried out later or simultaneously with the decomposition reaction. Further, the coloring can be performed at least one or more times before and after the gelatin decomposition reaction, among the three after the reaction, in parallel with the reaction.
In order to observe such gelatin degradation activity, not only the portion where the gelatin group was degraded after the gelatin degradation reaction was not stained with the above-mentioned dyes, but also the gelatin group was degraded. Including the case where the portion is dyed by the above-described dye or the like. Furthermore, it includes the case where the decomposed portion and the undecomposed portion of the gelatin group are dyed with different dyes.
[0027]
Widely known dyes, pigments and / or fluorescent reagents used for such purposes can be used. Specifically, azo dye, azomethine dye, indoaniline dye, benzoquinone dye, naphthoquinone dye, anthraquinone dye, diphenylmethane dye, triphenylmethane dye, xanthene dye, acridine dye, azine dye, alizarin dye, oxazine dye, thiazine dye, Thiazole dye, methine dye, oxonol dye, merocyanine dye, cyanine dye, arylidene dye, styryl dye, stilbene dye, phthalocyanine dye, perinone dye, pyrazolone dye, indigo dye, indigoid dye, thioindigo dye, quinoline dye, nitro dye, nitroso dye And sulfur dyes. Among these, since it is produced in a relatively large amount industrially, the cost is low, and when it is applied to a film, a glass plate, etc., the target substance can be visually detected without any other special detection equipment. Those capable of analyzing the presence, activity, disappearance and the like are preferred. These dyes, pigments or fluorescent reagents can be used alone or in combination of two or more.
[0028]
Hereinafter, the present invention will be specifically described by taking a preferred embodiment of the present invention using abdominal cavity drainage as a sample as an example. As a result of the inventor's earnest research, gelatin zymography analysis revealed that the gelatin degradation activity in the peritoneal drainage of nonbacterial peritonitis is due to active MMP-2. As is known from JP 2000-171468, MMP-2 is present in high concentrations in non-bacterial peritonitis, but MMP-9 is in very low concentrations. However, as shown in the results of FIG. 2, both the chlorhexidine gluconate administration group and the talc administration group, which are experimental animal models of nonbacterial peritonitis described in detail later, are precursor MMP-2, active type compared to the control group. The concentration of MMP-2 is increasing. In a solution state such as peritoneal drainage, Precursor proteinase has no activity Therefore, it is considered that the activity of MMP-2 in the solution depends on active MMP-2. Also, the gelatinolytic activity of MMP-9 was not detected in the chlorhexidine gluconate administration group compared to the control group, but only in the talc administration group The precursor MMP-9 is detected Stop on. Therefore, in addition to the fact that the precursor MMP-9 has no gelatinolytic activity, there is almost no active MMP-9, so it is considered that the gelatinolytic activity of MMP-9 is extremely low. Overall, the gelatinolytic activity in peritoneal drainage is governed by active MMP-2.
[0029]
As a result of further intensive studies by the inventors, gelatin zymography revealed that the dialysis drainage of bacterial peritonitis contains precursor MMP-9 and precursor MMP-2. As known in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-171468, in bacterial peritonitis, both MMP-2 and MMP-9 are present at high concentrations. As shown in the results of FIG. 3, there is no significant change in the precursor MMP-2 in the dialysate drainage of bacterial peritonitis compared to the control group, and active MMP-2 is not detected. Therefore, it can be seen that the entire gelatin degradation activity of MMP-2 is extremely low. Similarly, when MMP-9 is divided into a precursor and an active form, the precursor MMP-9 is remarkably increased as compared with the control group, but the active MMP-9 is not detected. Therefore, overall, the gelatinolytic activity in dialysis effluent is considered to be very low.
[0030]
By the detection method of the present invention, the gelatinolytic activity of MMP-2 contained in the peritoneal drainage can be detected by not detecting the gelatinolytic activity of MMP-9. As described above, in the sample collected from the peritoneal drainage of the non-bacterial peritonitis model, since active MMP-2 is present, it is presumed to show gelatinolytic activity. As shown in the results of FIG. Degradation activity is observed. On the other hand, the precursor MMP-9 is present in the dialysis drainage of bacterial peritonitis from the analysis result of the gelatin zymography, but the active MMP-2 and MMP-9 are below the detection limit. As the results in FIG. 4 show, no gelatinolytic activity is observed in the dialysis drainage of bacterial peritonitis. Therefore, when gelatin degradation activity is recognized by performing the detection method of the present invention using a sample of peritoneal drainage, it can be determined that it is due to active MMP-2, that is, MMP-2. That is, for the peritoneal drainage, MMP-2 can be detected separately from MMP-9.
[0031]
By analyzing the gelatinolytic activity in the peritoneal drainage according to the detection method of the present invention, complications of nonbacterial peritonitis such as peritoneal sclerosis, sclerosing peritonitis, SEP, EPS, etc. Can be judged . When the sample obtained from the peritoneal drainage is subjected to the detection method of the present invention and gelatinolytic activity is observed, it is presumed that this gelatinolytic activity is derived from MMP-2. It can be determined that nonbacterial peritonitis has developed. That is, the present invention can provide an effective detection method for determining the onset of nonbacterial peritonitis using the gelatinolytic activity of MMP-2 as an index.
[0032]
By using the peritoneal drainage from an individual as a sample, the detection method of the present invention can provide an effective detection method for distinguishing nonbacterial peritonitis from bacterial peritonitis. As described above, in nonbacterial peritonitis, active MMP-2 exhibits gelatinolytic activity among MMP-2. Therefore, by measuring the gelatinolytic activity of the sample obtained from the peritoneal drainage by the detection method of the present invention, it can be determined that nonbacterial peritonitis has developed if the gelatinolytic activity is observed. On the other hand, in bacterial peritonitis, the gelatinolytic activity of MMP-2 and MMP-9 is not detected by the detection method of the present invention. Therefore, for the peritoneal effluent collected from an individual who developed peritonitis that was not known to be either non-bacterial peritonitis or bacterial peritonitis, the gelatinolytic activity was determined by measuring the gelatinolytic activity using the detection method of the present invention. If so, it can be determined that the individual has developed non-bacterial peritonitis. On the contrary, in the case of peritonitis in which gelatinolytic activity is not observed, it can be determined that the individual has developed bacterial peritonitis. That is, the detection method of the present invention can provide a detection method necessary for distinguishing one peritonitis of non-bacterial peritonitis and bacterial peritonitis from the other peritonitis for an individual who has developed peritonitis.
[0033]
By applying the detection method of the present invention to the peritoneal fluid collected from an individual who has not developed peritonitis or an individual undergoing peritoneal dialysis, a specific symptom of peritonitis has appeared by measuring the gelatinolytic activity. It is possible to provide an inspection method capable of detecting peritonitis even at a stage where there is not. MMP-2 and MMP-9, which are targets of the detection method of the present invention, are molecules whose concentration in the peritoneal drainage is increased or activated prior to specific symptoms of peritonitis such as abdominal pain, fever, and vomiting. Therefore, it can be predicted that there is a high possibility that peritonitis will occur even when specific symptoms such as peritonitis do not appear.
[0034]
In the detection method of the present invention, by using an inhibitor that specifically acts on MMP-2 and / or MMP-9, MMP-2 is distinguished from MMP-9, and non-bacterial peritonitis is more accurately detected. Detection methods that can be used to determine can be implemented. This is because it becomes clearer that the gelatinolytic activity by the detection method of the present invention is not by other gelatinase but by MMP-2. The MMP-specific inhibitor used for this purpose makes it clearer which MMP the gelatinolytic activity of the detection method of the present invention is, and further improves the diagnosis of the development of nonbacterial peritonitis. It is because it can be performed high.
[0035]
The detection method of the present invention can be more easily carried out by using a set of reagents (kit) containing as a reagent a substrate foam in which a gelatin group, which is a substrate for MMP-2, is bound to a support. The reagent set (kit) may contain a known reagent widely used for measuring gelatinolytic activity, or may be attached with other instruments such as a vat, petri dish, and Eppendorf tube. Specific reagents include gelatin group, support, substrate foam, sample dilution buffer, gelatin degradation activity measurement buffer, dye / pigment / fluorescence-containing reagent, staining buffer, decontamination reagent, positive control Reagent, negative control reagent, distilled water and the like. These reagents may be provided separately in a reagent set (kit), or may be provided in the form of a mixture of two or more reagents. The concentration of each reagent in the reagent kit (kit) is not particularly limited, and may be within a possible range for carrying out the present invention. The reagent kit (kit) may be further attached with information such as suitable gelatinolytic activity measurement conditions, or may be only the substrate foam.
[0036]
【Example】
Specific examples are shown in detail below, but the present invention is not limited to these examples. Further, the concentration “%” of the reagent used in the examples is expressed in mass percent with respect to the volume of the reagent, that is, W / V% unless otherwise specified.
[0037]
The present inventor attempted to create an experimental animal model system for nonbacterial peritonitis for the purpose of developing a simple determination method for nonbacterial peritonitis using the gelatinolytic activity of MMP-2 as an index. When peritoneal dialysis is performed as one of the treatment methods for human renal dysfunction, as described above, various complications such as peritoneal sclerosis, sclerosing peritonitis, SEP, EPS, and various nonbacterial peritonitis that may accompany peritoneal thickening cause. However, the causes of these non-bacterial peritonitis are such as invasion of foreign substances such as plasticizers and particulate matter into the peritoneum, rapid changes in intraperitoneal pH due to peritoneal dialysis solution, infiltration of peritoneal lavage fluid into the peritoneum, etc. Wide range. In addition, since the experimental animal model system is a non-human experimental system, two experimental animal model systems already established in the present invention are used as a model system for non-bacterial peritonitis.
[0038]
The first experimental animal model system is a model system in which nonbacterial peritonitis is developed by directly administering a solution prepared by dissolving chlorhexidine gluconate, which is a disinfectant, in alcohol to a rat into the abdominal cavity with a syringe. This experimental animal model system causes peritoneal thickening and decreased peritoneal function by direct chemical stimulation of the peritoneum.
[0039]
In the second experimental animal model system, talc (a triclinic crystal of magnesium silicate), which is a foreign substance, is suspended in physiological saline and administered directly to the abdominal cavity using a syringe. This model system causes inflammation corresponding to peritonitis. This experimental animal model system is a model system for relatively severe non-bacterial peritonitis ranging from peritoneal fibrosis, decreased peritoneal function, and peritoneal adhesions.
[0040]
The SPF / VAP rat (Crj: (SD) IGS, 8 weeks old, male) was used in the first and second experimental animal model systems. The rats used in the present invention were sufficiently fed and watered, not starved, and paid careful attention to the hygienic environment in which they were raised. Rats were also careful not to develop diseases such as bacterial peritonitis due to bacterial infection.
[0041]
The chlorhexidine gluconate solution used in the experiment was prepared aseptically in a 15% aqueous ethanol solution (V / V% distilled water) so that the concentration of chlorhexidine gluconate was 0.1%. This solution was aseptically administered 3 ml at a time using a syringe into the abdominal cavity of a rat, and this was performed once a day for 3 weeks. The administration was performed in a state where the rats were anesthetized with ether, and consideration was given so as not to give physical and mental pain to the rats as much as possible.
[0042]
In the talc solution used in the experiment, 1 g of powdered talc was suspended in 15 ml of physiological saline, and then autoclaved for 20 minutes. The prepared talc solution was aseptically administered 15 ml at a time into the abdominal cavity of a rat using a syringe. After a single administration, rest was given for 6 days, and this cycle was taken once, and 3 cycles were performed. The administration was carried out in a state in which the rats were anesthetized with ether, and care was taken not to give physical or mental pain to the rats, and side reactions associated with the administration were suppressed as much as possible.
[0043]
As a control group, a group administered only with physiological saline (Peritric P250, Terumo) was set. The administration schedule was performed under the same conditions as in the chlorhexidine gluconate administration group, and 15 ml was administered once daily.
[0044]
In each of the control group, the chlorhexidine gluconate administration group, and the talc administration group, 4 rats (n = 4) were used in each group, and the following peritoneal equilibrium test was performed on the 22nd day from the first administration. In this example, a sterility test was performed on the peritoneal drainage sample as a sample during the peritoneal equilibrium test, and it was confirmed that aerobic bacteria, anaerobic bacteria, and fungi were not infected.
[0045]
Peritoneal function was evaluated by glucose permeability in the peritoneum, that is, D / D0 glucose value. The peritoneal equilibrium test for calculating the D / D0 glucose value was performed as follows. Dialysis solution containing 2.5% glucose at 50 ml / kg body weight of the rat (Peritrick P250, manufactured by Terumo) was injected into the abdomen of the disinfected rat using a syringe. Immediately after the injection, 0.5 ml was collected from the abdominal cavity and the glucose concentration (D0%) in the collected solution was measured. Next, 90 minutes after injection of the dialysis solution, the intraperitoneal solution was collected by pointing an injection needle into the abdominal cavity of the rat, and the glucose concentration (D%) of the collected solution was measured. Then, the D / D0 glucose value is calculated by dividing the glucose concentration D by the glucose concentration (D0 = 2.5%) in the peritoneal drainage immediately after the injection. The glucose concentration was measured by the mulotase enzyme method. The results are shown in FIG.
[0046]
As shown in the results of FIG. 1, it was revealed that the chlorhexidine gluconate administration group and the talc administration group had a significantly lower D / D0 glucose value and decreased peritoneal function compared to the control group.
[0047]
In FIG. 1, the peritoneal drainage obtained 90 minutes after administration was analyzed by a zymography method in order to examine the presence of MMP-2 and MMP-9. Gelatin was used as a zymography substrate, and the presence of an enzyme having gelatinase activity in the peritoneal drainage and its activation level were searched. The peritoneal drainage was diluted 16-fold with SDS-PAGE sample buffer (0.09 M Tris-HCl (pH 6.8) / 3% SDS / 10% glycerin / bromophenol blue, sample buffer). Next, electrophoresis was carried out by applying 4 μl per lane to a 0.1% SDS / 10% polyacrylamide gel containing 14% gelatin. The electrophoresis buffer used in the electrophoresis had a composition of 0.19 M glycine / 0.001% SDS / 0.025 M Tris-HCl (pH 8.3) (running buffer). Electrophoresis was performed for 4 hours at a constant voltage of 100 V (Constant Voltage), followed by electrophoresis into a solution of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) /0.1 M sodium chloride / 2.5% Triton X-100 (linaturation buffer). The spent gel was soaked and shaken for 1.5 hours on a table shaker at a speed of 45 rotations / minute, and the renaturation of MMP in the gel was performed. By this treatment, the precursor MMP-2 and the precursor MMP-9 in the gel are forcibly converted into active forms, respectively. Next, the surface of the gel was washed with distilled water three times, immersed in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM calcium chloride solution (reaction buffer), and reacted at 37 ° C. for 18 hours. After completion of the gelatin decomposition reaction, the surface of the gel was washed three times with distilled water and stained with Coomassie. As the staining solution, 1.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 / 45% ethanol / 10% acetic acid aqueous solution was used. The gel was immersed in this staining solution, and gently shaken for 20 minutes. After completion of the staining, the gel was immersed in a 25% ethanol / 8% acetic acid aqueous solution to remove excess staining solution, and finally the gel was washed with distilled water.
[0048]
The results of gelatin zymography performed as described above are shown in FIG. The indicator substance was separated by electrophoresis, and the indicator substance having gelatinase activity was identified as a transparent band not stained by Coomassie staining at its unique position. As shown in the results of FIG. 2, the peritoneal drainage prepared from the chlorhexidine gluconate administration group and the talc administration group contained a higher concentration of precursor MMP-2 than the control group, and active MMP- 2 was also slightly detected. On the other hand, although the precursor of MMP-9 could be confirmed in a part of the talc administration group, its concentration was extremely low, and active MMP-9 could not be detected. In the chlorhexidine gluconate administration group, neither MMP-9 nor the active form could be detected. From the above results, in the peritoneal drainage collected from the rat of non-bacterial peritonitis model, active MMP-2 is present in a small amount among enzymes having gelatinase activity, and the active form of MMP-9 is Not detected.
[0049]
In order to investigate the indicator substance and its change in bacterial peritonitis, the following experiment was conducted. First, as with bacterial peritonitis associated with human peritoneal dialysis, peritoneal dialysis was performed on experimental animals, and individuals who developed bacterial peritonitis were analyzed. As a control group for the development of bacterial peritonitis, individuals who did not develop peritonitis after peritoneal dialysis were used.
[0050]
SPF / VAP rats (Crj: (SD) IGS, 6 weeks old, male) were selected as experimental animals. The rats used in the present invention were sufficiently fed and watered, not starved, and paid careful attention to the hygienic environment in which they were raised. Rats were individually bred to ensure that bacterial peritonitis and other diseases caused by causes other than peritoneal dialysis did not occur.
[0051]
After anesthetizing the rats with ether anesthesia, the abdominal body hair was shaved and disinfected with isodine (manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.), and a silicone catheter for injecting and draining dialysis solution was implanted. Using this catheter, 50 ml / kg of dialysis solution (Peritric 135, Terumo) per body weight of the rat is poured and drained once a day. The cell count of granulocytes by was performed. As a result of daily peritoneal dialysis, it was found that granulocytes were remarkably increased in the dialysis drainage on the 10th day from the start of dialysis. From the results of the bacterial test at this time, Pseudomonas maltophilia was identified in the dialysis effluent, and thus it was determined that the bacterial peritonitis was caused by this bacterium.
[0052]
As described above, the results of gelatin zymography of the dialysis drainage at the onset of bacterial peritonitis are shown in FIG. This dialysis drainage contained a high concentration of precursor MMP-9, but active MMP-9 was below the detection limit. On the other hand, the active form of MMP-2, which was markedly increased at the onset of nonbacterial peritonitis, was slightly detected in bacterial peritonitis, although the precursor concentration was slightly increased. Therefore, since the active forms of MMP-2 and MMP-9 are very small in the dialysis drainage that induced bacterial peritonitis, it was suggested that the gelatinolytic activity as a whole was low.
[0053]
Regarding the peritoneal drainage of the chlorhexidine gluconate administration group and the talc administration group, which are animal experimental model systems of nonbacterial peritonitis, and dialysis drainage at the onset of bacterial peritonitis obtained as described above, Gelatinase activity was measured by the detection method. The result is shown in FIG. As a control group, the one used when nonbacterial peritonitis was developed was used. A gelatin thin coat film coated uniformly and uniformly is cut into a size of 2 mm × 50 mm to obtain a gelatin thin layer coated film piece used in the experiment. Dispense 200 μl of each dialysis drainage into an Eppendorf tube using a Pipetman. Then, the tube was immersed in such a manner that the tip of the gelatin thin layer coat film piece was in contact with the solution, and reacted at 37 ° C. for 30 hours. After a predetermined period of time, the gelatin thin layer coated film piece was taken out from the tube, immersed in Biebrich Scale staining solution (0.2% Biebrich Scale / 2.5% trichloroacetic acid / 50% ethanol) for 4 minutes, and then 5% in distilled water. Excess dye was removed by soaking for a minute.
[0054]
The measurement result of gelatinolytic activity by the detection method of the present invention is shown in FIG. In the chlorhexidine gluconate administration group and the talc administration group, staining loss is observed in the tip region where the gelatin thin film coat film piece is immersed in the peritoneal drainage. Therefore, MMP-2 was contained from the analysis result by gelatin zymography performed previously. On the other hand, as shown in the results of FIG. 4, in the dialysis drainage collected from the rat that developed bacterial peritonitis, the omission of staining did not occur, and the enzyme having gelatinolytic activity detected by the detection method of the present invention was detected. It was below the limit level. Further, no omission of staining was observed in the film pieces of the control group.
[0055]
By measuring gelatinolytic activity by the detection method of the present invention, MMP-2 in peritoneal drainage can be distinguished from MMP-9, and nonbacterial peritonitis and bacterial peritonitis can be distinguished and distinguished. . This is because active and precursor MMP-2 increased during non-bacterial peritonitis, and only precursor MMP-9 increased during bacterial peritonitis. As shown in the results of FIG. 4, when the gelatinolytic activity of the peritoneal drainage obtained using two experimental animal models of nonbacterial peritonitis was measured by the detection method of the present invention, high gelatinolytic activity was observed. The However, dialysis drainage obtained from rats with bacterial peritonitis had very low gelatinolytic activity, which was below the detection limit. Thus, for example, when the gelatinolytic activity of dialysis drainage collected from a patient undergoing peritoneal dialysis is measured using the detection method of the present invention and gelatinolytic activity is observed, peritoneal sclerosis, sclerosing peritonitis It is determined that non-bacterial peritonitis such as SEP and EPS is occurring. Conversely, if no gelatinolytic activity is observed, it is determined that either no peritonitis is associated or bacterial peritonitis is associated. That is, nonbacterial peritonitis can be distinguished from bacterial peritonitis. On the other hand, the decrease in peritoneal function can be determined using the gelatinolytic activity of MMP-2 as an index.
[0056]
Although peritoneal dialysis has been approved for more than 15 years in Japan, many dialysis patients have chosen hemodialysis, and less than 5% of the patients undergo peritoneal dialysis. The reason for this is the onset of complications associated with the above-mentioned peritoneal dialysis. Complications such as nonbacterial peritonitis can be detected early by applying MMP-2 as an indicator substance for the detection method of the present invention. In addition, discrimination from bacterial peritonitis can be performed very easily, and can be used as a preliminary judgment for accurate diagnosis when complications are complications or when there is a high risk of complications. Conversely, when peritonitis is diagnosed, it is possible to accurately determine whether it is non-bacterial peritonitis or bacterial peritonitis, and there is an effect that a treatment policy can be accurately established. In addition, peritoneal dialysis, unlike hemodialysis, can be performed relatively easily in places other than the hospital, such as the patient's home or workplace, thereby reducing the frequency of hospital visits and improving the patient's quality of life (QOL). Has the advantage of being able to contribute to. By establishing a technique for early detection of complications using the detection method of the present invention, the spread of peritoneal dialysis having these advantages can be promoted, and the patient's QOL can be further improved.
[0057]
【The invention's effect】
The detection method of the present invention has a simple operation procedure and can be operated quickly without using a special analytical instrument. In addition, since expensive reagents and special equipment are not used, it is very inexpensive per sample, and it is possible to easily test even without skilled skills regardless of the location such as a hospital or laboratory. By using the dialysis drainage of a peritoneal dialysis patient as a sample, complications such as non-bacterial peritonitis can be discovered at an early stage, a reliable treatment policy can be provided, and the patient's QOL can be improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the results of a peritoneal equilibrium test when using two non-bacterial peritonitis experimental animal models of a chlorhexidine gluconate administration group and a talc administration group.
[Fig. 2] Fig. 2 shows the result of gelatin zymography analysis of gelatinase in the peritoneal drainage collected when using two non-bacterial peritonitis experimental animal models of chlorhexidine gluconate administration group and talc administration group. It is the dyeing | staining image which shows.
FIG. 3 is a stained image obtained by analyzing gelatinase by a gelatin zymography method on dialysis drainage collected from rats with bacterial peritonitis.
FIG. 4 shows peritoneal drainage recovered from two non-bacterial peritonitis experimental animal models of chlorhexidine gluconate administration group and talc administration group, and dialysis drainage recovered from a rat that developed bacterial peritonitis. Is a stained image showing the result of analyzing the gelatinolytic activity using a gelatin thin layer coated film piece by the detection method of the present invention.

Claims

採取された腹腔排液である試料に含まれる活性型マトリックスメタロプロテイナーゼ−２を該試料のゼラチナーゼ活性を指標として検出し、かつ前駆体マトリックスメタロプロテイナーゼ−２を検出しない、活性型マトリックスメタロプロテイナーゼ−２の検出方法。 Active matrix metalloproteinase-2, which detects active matrix metalloproteinase-2 contained in a sample of the collected peritoneal drainage using the gelatinase activity of the sample as an index and does not detect precursor matrix metalloproteinase-2 Detection method.

腹膜硬化症、硬化性腹膜炎、硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）、被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）等の非細菌性腹膜炎を細菌性腹膜炎と区別して検出するのに用いることができる、請求項１に記載の検出方法。Can be used to detect and distinguish nonbacterial peritonitis such as peritonitis, sclerosing peritonitis, sclerosing capsular peritonitis (SEP), capsular peritonitis (EPS), etc. Item 2. The detection method according to Item 1 .

前記非細菌性腹膜炎または細菌性腹膜炎のどちらか一方を、他方と区別して検出するのに用いることができる、請求項２に記載の検出方法。The detection method according to claim 2 , which can be used to detect one of the non-bacterial peritonitis and the bacterial peritonitis separately from the other.

自覚症状が出ていない段階で、前記非細菌性腹膜炎を検出するのに用いることができる、請求項２または３に記載の検出方法。The detection method according to claim 2 or 3 , which can be used to detect the non-bacterial peritonitis when no subjective symptoms are present.

腹膜透析における腹膜機能を判定するのに用いることができる、請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。The detection method according to any one of claims 1 to 4 , which can be used to determine peritoneal function in peritoneal dialysis.

ゼラチナーゼの基質となる物質を支持体上に薄層コートした基質フォームを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法に用いるキット。 The kit used for the detection method according to any one of claims 1 to 5 , comprising a substrate foam in which a substance serving as a substrate for gelatinase is coated on a support in a thin layer.

前記基質フォームがあらかじめ着色されている、請求項６に記載のキット。The kit according to claim 6 , wherein the substrate foam is pre-colored.

前記基質フォームを染色するための試薬をさらに含む、請求項６または７に記載のキット。The kit according to claim 6 or 7 , further comprising a reagent for staining the substrate foam.