JP4365843B2

JP4365843B2 - Method for screening and production of secondary metabolites by mixed culture

Info

Publication number: JP4365843B2
Application number: JP2006238547A
Authority: JP
Inventors: 宏康尾仲; 康弘五十嵐; 保古米
Original assignee: 宏康尾仲
Priority date: 2006-09-04
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2026-09-04
Also published as: JP2008054637A

Description

本発明は、混合培養による二次代謝産物のスクリーニング方法及び製造方法に関する。特に本発明は、ツカムレラ(Tsukamurella)属微生物またはツカムレラ(Tsukamurella)属に類する属の微生物との混合培養を用いる二次代謝産物、特に、抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤のスクリーニング方法及び製造方法に関する。さらに本発明は、前記混合培養を用いて得られる二次代謝産物を含有する培養物に関する。 The present invention relates to a screening method and a production method for secondary metabolites by mixed culture. In particular, the present invention, Tsukamurella (Tsukamurella) genus microorganism or Tsukamurella (Tsukamurella) secondary metabolites using a mixed culture of microorganisms of the genus similar to the genus, in particular, antibacterial antibiotics, anticancer antibiotics, antiparasitic agents Or it is related with the screening method and manufacturing method of an enzyme inhibitor. Furthermore, this invention relates to the culture containing the secondary metabolite obtained using the said mixed culture.

微生物培養において、純粋培養はコッホ以来の基本的概念とされている。抗生物質スクリーニングにおいても、純粋培養された菌株からこれまでに多くの有用物質が発見されている。 In microbial culture, pure culture has been a basic concept since Koch. In antibiotic screening, many useful substances have been discovered so far from purely cultured strains.

自然環境下での微生物は、外部の様々な環境要因の影響を受けて生育するため、純粋培養状態で自然環境下と全く同一の生育を再現することは困難である。医薬品をはじめ、天然物からの抗生物質スクリーニングには、純粋分離された菌株を使用するのが一般的である。しかしながら、自然界に於いては、様々な環境要因が抗生物質の生産に影響を与えているため、純粋培養ではスクリーニング菌株の抗生物質生産能力を全て引き出すことは難しい。この点から抗生物質生産においても純粋培養が個々の菌株の物質生産能力を完全に引き出しているとは考え難く、培養法の工夫は重要である。(非特許文献1及び2)
Bibb M, The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolorA3(2).Microbiology. 1996 142:1335-44 田中晴雄、土屋友房編、微生物薬品化学改訂第４版、P325-326 南江堂 Since microorganisms in a natural environment grow under the influence of various external environmental factors, it is difficult to reproduce exactly the same growth in a pure culture state as in a natural environment. For antibiotic screening from natural products such as pharmaceuticals, it is common to use a purely isolated strain. However, in the natural world, various environmental factors affect the production of antibiotics, so it is difficult to extract all the antibiotic production capacity of the screening strain in pure culture. From this point of view, it is difficult to think that pure culture completely brings out the substance production ability of individual strains in the production of antibiotics. (Non-Patent Documents 1 and 2)
Bibb M, The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolorA3 (2) .Microbiology. 1996 142: 1335-44 Tanaka Haruo, Tsuchiya Yubo, 4th edition of microbial chemical chemistry, P325-326 Nanedo

そこで本発明の目的は、スクリーニング菌株の新たな二次代謝産物生産能力を引き出し得る、新たな培養方法を用いた、二次代謝産物のスクリーニング方法及び製造方法を提供することにある。特に本発明は、新規な抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤等の新規な二次代謝産物のスクリーニング方法及び製造方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a secondary metabolite screening method and production method using a new culture method that can draw out the ability of the screening strain to produce a new secondary metabolite. In particular, an object of the present invention is to provide a method for screening and producing a novel secondary metabolite such as a novel antibacterial antibiotic, anticancer antibiotic, antiparasitic agent or enzyme inhibitor.

さらに本発明は、前記新たな培養方法を用いて得られる二次代謝産物を含有する新規な培養物を提供することを目的とする。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a novel culture containing a secondary metabolite obtained using the new culture method.

本発明者らはツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)またはその類縁菌と様々な放線菌との混合培養をすることにより、純粋培養では生産しない新規化合物を生産する現象を発見し、本発明を完成した。 The present inventors discovered the phenomenon of producing a novel compound that cannot be produced by pure culture by performing mixed culture of Tsukamurella pulmonis or its related bacteria and various actinomycetes, and completed the present invention. .

［１］ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の被検菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することを含む二次代謝産物のスクリーニング方法。
［２］ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物である、［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)TP-B0596株である、［２］に記載のスクリーニング方法。
［４］被検菌が放線菌または糸状菌である［１］〜［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［５］放線菌が、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、アクチノバチュラム（Actinobaculum）、アクチノマイセス（Actinomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アースロバクター（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、アグロマイセス（Agromyces）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、アクチノマデュラ（Actinomadura）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスポリア（Kineosporia）及びサーモビスポラ（Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌である［４］に記載のスクリーニング方法。
［６］糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）、アルテルナリア（Alteｒnaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ボーベリア（Beauveria）、ボトリティス（Botorytis）カララ（Chalara）、セルコスポラ（Cercospora）、セファロスフォリウム（Cephalosporium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コクシジオイデス（Coccidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルブラリア（Curvularia）、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）、カニングハメラ（Cunninghamella）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコッカム（Epicoccum）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、フザリウム（Fusarium）、ジオトリカム（Geotrichum）、グリオクラディウム（Gliocladium）、グラフィウム（Graphium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）、イサリア（Isaria）、メタルヒジウム（Metarhizium）、モニリア（Monilia）、モルティレラ（Mortierella）、ムコール（Mucor）、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピリキュラリア（Pyricularia）、フィアロマイセス（Phialomyces）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、スポロスリクス（Sporopthrix）、トリコヒートン（Trichophyton）、トリコデルマ（Trichocderma）及びトリコセシウム（Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかの属に属する糸状菌である［４］に記載のスクリーニング方法。
［７］二次代謝産物が抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤である［１］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８］前記ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物及び被検菌株がいずれも生菌体として共存した状態で培養することを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［９］ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に生産される二次代謝産物を採取することを特徴とする二次代謝産物の製造方法。
［１０］ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物である、［９］に記載の二次代謝産物の製造方法。
［１１］ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株である、［１０］に記載の二次代謝産物の製造方法。
［１２］放線菌が、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、アクチノバチュラム（Actinobaculum）、アクチノマイセス（Actinomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アースロバクター（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、アグロマイセス（Agromyces）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、アクチノマデュラ（Actinomadura）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスポリア（Kineosporia）及びサーモビスポラ（Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌である［１０］または［１１］に記載の二次代謝産物の製造方法。
［１３］糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）、アルテルナリア（Alteｒnaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ボーベリア（Beauveria）、ボトリティス（Botorytis）カララ（Chalara）、セルコスポラ（Cercospora）、セファロスフォリウム（Cephalosporium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コクシジオイデス（Coccidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルブラリア（Curvularia）、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）、カニングハメラ（Cunninghamella）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコッカム（Epicoccum）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、フザリウム（Fusarium）、ジオトリカム（Geotrichum）、グリオクラディウム（Gliocladium）、グラフィウム（Graphium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）、イサリア（Isaria）、メタルヒジウム（Metarhizium）、モニリア（Monilia）、モルティレラ（Mortierella）、ムコール（Mucor）、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピリキュラリア（Pyricularia）、フィアロマイセス（Phialomyces）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、スポロスリクス（Sporopthrix）、トリコヒートン（Trichophyton）、トリコデルマ（Trichocderma）及びトリコセシウム（Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかの属に属する糸状菌である［１０］または［１１］に記載の二次代謝産物の製造方法。
［１４］二次代謝産物が抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤である［９］〜［１３］のいずれかに記載の二次代謝産物の製造方法。
［１５］前記ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物及び放線菌または糸状菌がいずれも生菌体として共存した状態で培養することを特徴とする［９］〜［１４］のいずれかに記載の二次代謝産物の製造方法。
［１６］ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物を蓄積させた培養物。 [1] including mixing and culturing at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one test bacterium, and confirming that a secondary metabolite is contained in the culture solution. A screening method for secondary metabolites.
[2] Tsukamurella (Tsukamurella) microorganism belonging to the genus is a microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis), the screening method according to [1].
[ 3 ] The screening method according to [ 2 ], wherein the microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis is Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain.
[ 4 ] The screening method according to any one of [1] to [ 3 ], wherein the test bacteria are actinomycetes or filamentous fungi.
[ 5 ] Actinomycetes are Cryptobacterium, Rubrobacter, Actinobaculum, Actinomyces, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium ), Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Cryptosporangium, Micrococcus, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas ( Cellulomonas, Microbacterium, Agromyces, Cryobacterium, Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium, Nocarde Nocardioides, Pseudonocardia, Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Actinokineospora (Streptomyces), Kitasatospora, Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinoma cus (Actinomad) ), A screening method according to [ 4 ], which is an actinomycete belonging to any genus selected from the group consisting of Kineosporia and Thermobisspora.
[ 6 ] The filamentous fungi are Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Botorytis Chalara, Cercospora, Cephalosporium, Chrysosporium, Coccidioides, Cryptococcus, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella (D) (Epicoccum), Eupenicillium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyalendendron (Hyalodendron), Isaria, Metalrhizium, Monilia, Mortierella, Mucor, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Penicillium ), Phialomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichophyton, and Trichothecium, a filamentous fungus belonging to any genus selected from the group consisting of Trichothecium [ 4 ] The screening method according to [ 4 ].
[ 7 ] The screening method according to any one of [1] to [ 6 ], wherein the secondary metabolite is an antibacterial antibiotic, an anticancer antibiotic, an antiparasitic substance, or an enzyme inhibitor.
[ 8 ] The screening method according to any one of [1] to [ 7 ], wherein the microorganism and the test strain belonging to the genus Tsukamurella co-exist in the state of coexisting as viable cells.
[ 9 ] It is characterized in that at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one actinomycete or filamentous fungus are mixed and cultured, and secondary metabolites produced in the culture solution are collected. To produce a secondary metabolite.
[10] Tsukamurella (Tsukamurella) microorganism belonging to the genus is a microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis), method for producing secondary metabolites of [9].
[ 11 ] The method for producing a secondary metabolite according to [ 10 ], wherein the microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis is Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain.
[ 12 ] Actinomycetes are Cryptobacterium, Rubrobacter, Actinobaculum, Actinomyces, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium ), Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Cryptosporangium, Micrococcus, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas ( Cellulomonas, Microbacterium, Agromyces, Cryobacterium, Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium, Nocar Nocardioides, Pseudonocardia, Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Actinokineospora (Streptomyces), Kitasatospora, Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinoma cus (Actinomad) ), A method for producing a secondary metabolite according to [ 10] or [11 ], which is an actinomycete belonging to any genus selected from the group consisting of Kineosporia and Thermobisspora.
[ 13 ] The filamentous fungi are Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Botorytis Chalara, Cercospora, Cephalosporium, Chrysosporium, Coccidioides, Cryptococcus, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella (D) (Epicoccum), Eupenicillium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyalendrosdr Hyalodendron, Isaria, Metalrhizium, Monilia, Mortierella, Mucor, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Penicillium Threads belonging to any genus selected from the group consisting of Pyricularia), Phialomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichophyton, and Trichothecium The method for producing a secondary metabolite according to [ 10] or [11 ], which is a fungus.
[ 14 ] The method for producing a secondary metabolite according to any one of [ 9] to [13 ], wherein the secondary metabolite is an antibacterial antibiotic, an anticancer antibiotic, an antiparasitic substance, or an enzyme inhibitor.
[ 15 ] The microorganism according to any one of [ 9] to [14 ], wherein the microorganism and actinomycetes or filamentous fungi belonging to the genus Tsukamurella coexist as living cells. Method for producing secondary metabolites.
[ 16 ] A culture in which at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one actinomycete or filamentous fungus are mixed and cultured, and a secondary metabolite is accumulated in the culture solution.

本発明によれば、純粋培養では産生が確認されなかった、新規な抗生物質等の二次代謝産物をスクリーニングし、あるいは製造することができる。さらに、本発明によれば、新規な抗生物質等の二次代謝産物を含む培養物を提供することもできる。 According to the present invention, secondary metabolites such as novel antibiotics whose production was not confirmed in pure culture can be screened or produced. Furthermore, according to the present invention, a culture containing a secondary metabolite such as a novel antibiotic can also be provided.

[スクリーニング方法]
本発明の二次代謝産物のスクリーニング方法は、16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の被検菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することを含む。 [Screening method]
The secondary metabolite screening method of the present invention comprises at least one microorganism belonging to a coryneform bacterium in which the base sequence of the 16S rRNA gene has a homology of 95% or more with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and at least one target. This includes mixing and culturing the test bacteria and confirming whether the secondary metabolite is contained in the culture solution.

配列表の配列番号１記載の塩基配列は、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株の16SrRNA遺伝子の塩基配列である。この塩基配列の決定については後述する。TP-B0596株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに2006年8月15日付で寄託され、NITE P-257の寄託番号が付与されている。 The base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the base sequence of the 16S rRNA gene of Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain. The determination of this base sequence will be described later. TP-B0596 was deposited on August 15, 2006 at the Patent Microorganism Deposit Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation, and assigned the deposit number of NITE P-257.

本発明のスクリーニング方法では、16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する少なくとも1種の微生物を用いる。16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌であれば、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株と同等の効果が得られることは実施例において具体的に示す通りである。上記塩基配列の相同性は、好ましくは98％以上である。 In the screening method of the present invention, at least one microorganism belonging to a coryneform bacterium in which the base sequence of the 16S rRNA gene shows 95% or more homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is used. If the 16S rRNA gene base sequence is a coryneform bacterium with a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, it is possible to obtain the same effect as the Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain. As specifically shown in the examples. The homology of the base sequence is preferably 98% or more.

本発明のスクリーニング方法に用いられる16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する微生物は、共存する微生物の二次代謝産物産生を誘導する能力をもつ微生物である。 A microorganism belonging to a coryneform bacterium whose base sequence of the 16S rRNA gene used in the screening method of the present invention has a homology of 95% or more with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 induces the production of secondary metabolites of the coexisting microorganism. It is a microorganism with ability.

さらに、本発明のスクリーニング方法に用いられる16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する微生物は、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の色素産生を誘導する能力をもつ微生物であることができる。 Furthermore, microorganisms belonging to coryneform bacteria in which the base sequence of the 16S rRNA gene used in the screening method of the present invention has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 are Streptomyces lividans. It can be a microorganism that has the ability to induce pigment production.

実施例において詳述するように、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株はストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の赤色色素生産を誘導する菌株として発見された。ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)と様々な属の菌との混合液体培養を行ったところ、顕著な赤色色素生産を誘導する組み合わせは、検討した範囲では、TP-B0596株だけであり、本菌株に特異的な性質であることが明らかになった。そこで、TP-B0596株と97株の放線菌との混合培養を行い、培養抽出物の抗菌アッセイを行ったところ、放線菌単独培養では検出できない抗菌物質を生産する例が10例、単独培養よりも抗菌物質生産が増大する例が3例見出された。この内ニラの茎から分離した放線菌S-522株との混合培養で生産が確認された抗生物質は新規構造を有しており、アルキベマイシン（Alchivemycin）と命名したという経緯がある。従って、本発明に用いられるコリネ型細菌に属する微生物は、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の色素産生を誘導する能力をもつ微生物であることができる。 As detailed in the Examples, the strain Tsukamurella pulmonis TP-B0596 was discovered as a strain that induces red pigment production in Streptomyces lividans. When mixed liquid culture of Streptomyces lividans and bacteria of various genera was performed, the only combination that induces significant red pigment production was TP-B0596 strain to the extent examined, It became clear that this was a property specific to the strain. Therefore, when TP-B0596 and 97 actinomycetes were mixed and cultured, and the antibacterial assay of the culture extract was conducted, 10 cases of producing antibacterial substances that could not be detected by actinomycetes alone culture, Three cases of increased production of antibacterial substances were also found. Among them, the antibiotic that has been confirmed to be produced by mixed culture with actinomycetes S-522 isolated from leek stems has a novel structure and is named Alchivemycin. Therefore, the microorganism belonging to the coryneform bacterium used in the present invention can be a microorganism having the ability to induce pigment production of Streptomyces lividans.

コリネ型細菌は、アミノ酸生産などの分野で使用されるグラム陽性細菌であり、人体に無害で世界で最も広く使用されている工業的有用細菌である。本発明において用いられるコリネ型細菌は、典型的には、ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物、例えば、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) に属する微生物であることができる。しかし、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) に属する微生物以外のツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物や、ツカムレラ(Tsukamurella)属以外に属する微生物であっても、16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌であれば使用できる。 Coryneform bacteria are Gram-positive bacteria used in fields such as amino acid production, and are industrially useful bacteria that are harmless to the human body and are most widely used in the world. The coryneform bacterium used in the present invention can typically be a microorganism belonging to the genus Tsukamurella , for example, a microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis. However, microorganisms and belonging to non-microbial Tsukamurella (Tsukamurella) genus belonging to Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis), Tsukamurella (Tsukamurella) Even a microorganism belonging to other genera, the base sequence of 16SrRNA gene of SEQ ID NO: 1, wherein the base Any coryneform bacterium showing 95% or more homology with the sequence can be used.

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物と混合培養される被検菌は、二次代謝産物を産生することが期待される菌であれば、特に制限はない。被検菌としては、例えば、放線菌及び糸状菌を挙げることができる。 The test bacteria to be mixed and cultured with microorganisms belonging to the genus Tsukamurella are not particularly limited as long as they are expected to produce secondary metabolites. Examples of test bacteria include actinomycetes and filamentous fungi.

放線菌としては、例えば、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、アクチノバチュラム（Actinobaculum）、アクチノマイセス（Actinomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アースロバクター（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、アグロマイセス（Agromyces）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、アクチノマデュラ（Actinomadura）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスポリア（Kineosporia）及びサーモビスポラ（Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌を挙げることができる。 As actinomycetes, for example, Cryptobacterium, Rubrobacter, Actinobaculum, Actinomyces, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium ), Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Cryptosporangium, Micrococcus, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas ( Cellulomonas, Microbacterium, Agromyces, Cryobacterium, Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium, Nocardioides, Pseudonocardia, Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Actinokineospora (Streptomyces), Kitasatospora, Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinoma cus (Actinomad) ), Actinomycetes belonging to any genus selected from the group consisting of Kineosporia and Thermobisspora.

糸状菌としては、例えば、アクレモニウム（Acremonium）、アルテルナリア（Alteｒnaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ボーベリア（Beauveria）、ボトリティス（Botorytis）カララ（Chalara）、セルコスポラ（Cercospora）、セファロスフォリウム（Cephalosporium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コクシジオイデス（Coccidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルブラリア（Curvularia）、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）、カニングハメラ（Cunninghamella）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコッカム（Epicoccum）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、フザリウム（Fusarium）、ジオトリカム（Geotrichum）、グリオクラディウム（Gliocladium）、グラフィウム（Graphium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）、イサリア（Isaria）、メタルヒジウム（Metarhizium）、モニリア（Monilia）、モルティレラ（Mortierella）、ムコール（Mucor）、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピリキュラリア（Pyricularia）、フィアロマイセス（Phialomyces）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、スポロスリクス（Sporopthrix）、トリコヒートン（Trichophyton）、トリコデルマ（Trichocderma）及びトリコセシウム（Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかの属に属する糸状菌を挙げることができる。 Examples of the filamentous fungi include Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Botorytis, Chalara, Cercospora, and Cephalosporium. , Chrysosporium, Coccidioides, Cryptococcus, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella, rein Epicoccum, Eupenicillium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyaro Hyalodendron, Isaria, Metalrhizium, Monilia, Mortierella, Mucor, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Penicillium Threads belonging to any genus selected from the group consisting of Pyricularia), Phialomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichophyton, and Trichothecium There can be mentioned fungi.

二次代謝産物は、例えば、抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤であることができる。 The secondary metabolite can be, for example, an antibacterial antibiotic, an anticancer antibiotic, an antiparasitic substance or an enzyme inhibitor.

混合培養は、前記コリネ型細菌に属する微生物と被検菌を混合して行う。コリネ型細菌に属する微生物及び被検菌は、いずれも単独であっても、あるいは2種以上であってもよい。混合培養の方法や条件は、コリネ型細菌に属する微生物及び被検菌の性質を考慮して適宜決定できる。温度、pH、培地栄養源、培養時間は、単独に被検菌を培養した場合と同様の条件で行うことができる。コリネ型細菌と被検菌との混合割合については、同量ずつであることが好ましいが、被検菌の生産能力を誘導する点を考慮すると被検菌の菌数を多くしてもよい。 The mixed culture is performed by mixing a microorganism belonging to the coryneform bacterium and a test bacterium. The microorganism belonging to the coryneform bacterium and the test bacterium may be used alone or in combination of two or more. The mixed culture method and conditions can be appropriately determined in consideration of the properties of the microorganism belonging to the coryneform bacterium and the test bacterium. The temperature, pH, medium nutrient source, and culture time can be determined under the same conditions as when the test bacteria are cultured alone. The mixing ratio of the coryneform bacterium and the test bacterium is preferably the same amount, but in consideration of inducing the production ability of the test bacterium, the number of the test bacterium may be increased.

前記コリネ型細菌及び被検菌株は、いずれも生菌体として共存した状態で培養することが好ましい。いずれも生菌体として共存した状態で培養することで、被検菌による二次代謝産物の産生を容易に行わせることができる。いずれも生菌体として共存した状態で培養することをここでは混合培養と定義する。実施例に示した産生方法はいずれの場合も前記コリネ型細菌を生菌の状態で混合培養している。死菌体や菌体抽出物の添加など、生菌体ではない状態での接触や、透析膜などによって両生菌体の接触を物理的に制限すると、被検菌は二次代謝産物の産生を行わない場合があるため、生菌体同士を混合培養することが好ましい。尚、生菌体とは、培養終了後の混合培養液より菌株が平板分離できる菌体を意味する。 It is preferable that the coryneform bacterium and the test strain are cultured in the state of coexisting as viable cells. In both cases, the secondary metabolite can be easily produced by the test bacterium by culturing in the state of coexisting as viable cells. In this case, culturing in the state of coexisting as viable cells is defined as mixed culture. In any case, the production methods shown in the Examples are mixed culture of the coryneform bacteria in a live state. If the contact of the amphibian cells is physically restricted by contact with non-viable cells, such as addition of dead cells or cell extracts, or dialysis membrane, the test bacteria will not produce secondary metabolites. Since it may not be performed, it is preferable to mix and culture viable cells. In addition, a living microbial cell means the microbial cell which a strain can plate-separate from the mixed culture solution after completion | finish of culture | cultivation.

培養液中に二次代謝産物が含まれているかの確認は、二次代謝産物の種類に応じて、公知の方法を用いて行うことができる。 Whether a secondary metabolite is contained in the culture solution can be confirmed using a known method according to the type of the secondary metabolite.

［製造方法］
本発明の二次代謝産物の製造方法は、16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に産生される二次代謝産物を採取することを特徴とする。 [Production method]
The method for producing a secondary metabolite of the present invention comprises at least one microorganism belonging to a coryneform bacterium in which the base sequence of the 16S rRNA gene has a homology of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and at least one ray. It is characterized by mixing and culturing fungi or filamentous fungi, and collecting secondary metabolites produced in the culture solution.

ここで使用されるコリネ型細菌に属する微生物及び放線菌または糸状菌は、上記スクリーニング方法で説明したものと同様である。但し、放線菌または糸状菌は、上記スクリーニング方法で二次代謝産物を生産することが確認された菌であることが適当である。 The microorganisms and actinomycetes or filamentous fungi belonging to the coryneform bacterium used here are the same as those described in the above screening method. However, actinomycetes or filamentous fungi are suitably bacteria that have been confirmed to produce secondary metabolites by the above screening method.

培養方法及び条件も、上記スクリーニング方法で説明したものと同様であるが、所望の二次代謝産物の産生量が多くなるように最適化して行われることが好ましい。培養は、所定量の二次代謝産物が産生され、培養液に蓄積された時点で終了し、培養液から二次代謝産物を採取する。二次代謝産物の採取方法は、二次代謝産物の種類に応じて、公知の方法から適宜選択することができる。 The culture method and conditions are the same as those described in the above screening method, but it is preferable that the culture method and conditions are optimized so as to increase the production amount of the desired secondary metabolite. The culture is terminated when a predetermined amount of secondary metabolite is produced and accumulated in the culture solution, and the secondary metabolite is collected from the culture solution. The method for collecting secondary metabolites can be appropriately selected from known methods according to the type of secondary metabolite.

上記培養においては、コリネ型細菌及び放線菌または糸状菌は、いずれも生菌体として共存した状態で培養することが好ましい。いずれも生菌体として共存した状態で培養することで、コリネ型細菌が放線菌または糸状菌を刺激し、放線菌または糸状菌の二次代謝生産が開始される。コリネ型細菌が生菌体でなければ、放線菌または糸状菌の二次代謝生産誘導を示さない場合がある。尚、生菌体の定義は、前述の通りである。 In the above culture, it is preferable that the coryneform bacteria and actinomycetes or filamentous fungi are cultured in the state of coexisting as viable cells. In both cases, culturing in the state of coexisting as viable cells causes coryneform bacteria to stimulate actinomycetes or filamentous fungi, and secondary metabolic production of actinomycetes or filamentous fungi is started. If coryneform bacteria are not viable cells, they may not show induction of secondary metabolic production of actinomycetes or filamentous fungi. The definition of viable cells is as described above.

［培養物］
本発明は、16SrRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の塩基配列と95％以上の相同性を示すコリネ型細菌に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物を蓄積させた培養物も包含する。この培養物は、上記本発明の製造方法において、所定量の二次代謝産物が産生され、培養液に蓄積された時点で培養を終了して得られる培養液であることができる。あるいは、この培養液をさらに処理や加工したものであることもできる。この培養物は、二次代謝産物を含有しており、そのままあるいはさらに処理や加工を施して、二次代謝産物含有物として利用することができる。 [Culture]
In the present invention, at least one microorganism belonging to a coryneform bacterium having a base sequence of 16S rRNA gene having 95% or more homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and at least one actinomycete or filamentous fungus are mixed. A culture obtained by culturing and accumulating secondary metabolites in the culture solution is also included. This culture can be a culture solution obtained by terminating the culture when a predetermined amount of secondary metabolite is produced and accumulated in the culture solution in the production method of the present invention. Alternatively, this culture solution can be further processed or processed. This culture contains a secondary metabolite, and can be used as a secondary metabolite-containing product as it is or after further treatment or processing.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

参考例
ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株の分離と同定
ニュートリエントブロース軟寒天にストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans) TK23株の胞子約1００万個を混ぜ、ベネットグルコース培地上に重層する。さらにその軟寒天の上に被検菌をエーゼで接種し、３０℃で培養する。２〜３日後にストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)が一面に生育した際、被検菌を中心として、赤色色素が誘導されている菌株を得る。被検菌には自然環境より分離した８２菌株を使用し、赤色色素を誘導したツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株を得た。 Reference Example Isolation and identification of TP-B0596 strain Tsukamurella pulmonis TP-B0596 Mix approximately 10 million spores of Streptomyces lividans TK23 with Nutrient broth soft agar and layer on Bennett glucose medium . Furthermore, the test bacteria are inoculated on the soft agar with ase and cultured at 30 ° C. When 2 to 3 days later, Streptomyces lividans grows all over, a strain is obtained in which the red pigment is induced, centering on the test bacteria. For the test bacteria, 82 strains isolated from the natural environment were used to obtain a red pigment-derived Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain.

図1に、上記で得られた赤色色素を誘導したツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株の電子顕微鏡写真(左)及びツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株を用いた場合(Tp菌入)と用いなかった場合(Tp菌無)の培養物の写真(右)を示す。 1, Tsukamurella pulmonis derived red pigment obtained above (Tsukamurella pulmonis) TP-B0596 strain electron micrograph (left) and Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis) when using the TP-B0596 strain (Tp Photographs (right) of cultures with and without bacteria (without Tp bacteria) are shown.

ニュートリエントブロース軟寒天
0.8 ％ Nutrient Broth(Difco)、0.5 ％寒天末 Nutrient broth soft agar
0.8% Nutrient Broth (Difco), 0.5% agar powder

ベネットグルコース培地
0.1 ％酵母抽出物、0.1 ％肉エキス(エルリッヒ)、0.2 ％ NZ Amine TypeA、1 ％グルコース、2 ％寒天、pH 7.2 Bennett glucose medium
0.1% yeast extract, 0.1% meat extract (Ellrich), 0.2% NZ Amine TypeA, 1% glucose, 2% agar, pH 7.2

上記で得られたTP-B0596株の菌学的性質を以下に示す。
培養温度３０℃〜３７℃
桿菌（0.8 x 2.0〜3.0 mm）
グラム陽性
胞子形成能無し
運動性無し The mycological properties of the TP-B0596 strain obtained above are shown below.
Culture temperature 30 ° C-37 ° C
Neisseria gonorrhoeae (0.8 x 2.0 to 3.0 mm)
No Gram-positive spore formation ability No motility

TP-B0596株の16S rRNA遺伝子の塩基配列は、以下のプライマーを用いて常法により決定し、その配列は、配列表の配列番号1に示す通りである。
・プライマーの配列（下記9種類のプライマーを使用）
9F 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG (配列番号2)
339F 5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG (配列番号3)
515F 5'-GTGCCAGCAGCCGCGGT (配列番号4)
785F 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTC (配列番号5)
1099F 5'-GCAACGAGCGCAACCC (配列番号6)
1541R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC (配列番号7)
1115R 5'-AGGGTTGCGCTCGTTG (配列番号8)
802R 5'-TACCAGGGTATCTAATCC (配列番号9)
536R 5'-GTATTACCGCGGCTGCTG (配列番号10) The base sequence of 16S rRNA gene of TP-B0596 strain was determined by a conventional method using the following primers, and the sequence is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
・ Primer sequence (use 9 types of primers below)
9F 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO: 2)
339F 5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG (SEQ ID NO: 3)
515F 5'-GTGCCAGCAGCCGCGGT (SEQ ID NO: 4)
785F 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTC (SEQ ID NO: 5)
1099F 5'-GCAACGAGCGCAACCC (SEQ ID NO: 6)
1541R 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC (SEQ ID NO: 7)
1115R 5'-AGGGTTGCGCTCGTTG (SEQ ID NO: 8)
802R 5'-TACCAGGGTATCTAATCC (SEQ ID NO: 9)
536R 5'-GTATTACCGCGGCTGCTG (SEQ ID NO: 10)

TP-B0596株の16S rRNA遺伝子の塩基配列は、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)の標準株DSM 44142の配列と100％の相同性を有する。 Nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of TP-B0596 strain, has the sequence 100% homology of standard strains DSM forty-four thousand one hundred and forty-two of Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis).

実施例1
混合培養を用いた抗生物質スクリーニング方法
自然環境から分離した放線菌をV-22液体培地で３０℃３日間培養した。一方、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株をV-22液体培地で３０℃、１日間培養した。培養液をそれぞれ3 ％、1 ％づつA-3M培地に植菌し、３０℃で５〜１０日間培養した。培養液を等量のブタノールで抽出し、抗菌アッセイ用サンプルとした。 Example 1
Antibiotic Screening Method Using Mixed Culture Actinomycetes isolated from the natural environment were cultured in a V-22 liquid medium at 30 ° C. for 3 days. On the other hand, Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain was cultured in a V-22 liquid medium at 30 ° C. for 1 day. The culture solutions were inoculated into 3% and 1% A-3M media, respectively, and cultured at 30 ° C. for 5 to 10 days. The culture solution was extracted with an equal amount of butanol to obtain a sample for antibacterial assay.

抗菌アッセイは被検菌として大腸菌(Escherichia coli)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の６菌株を用い、10 mmのペーパーディスクにサンプルを染みこませ、培地上に静置し、抗菌阻止円の大きさで抗菌活性を判定した。結果を表1に示す。 Antibacterial assays include Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Saccharomyces cerevisiae, and Saccharomyces cerevisiae. Using 6 strains of Candida albicans, the sample was soaked in a 10 mm paper disc, left on the medium, and the antibacterial activity was judged by the size of the antibacterial inhibition circle. The results are shown in Table 1.

V-22液体培地
0.1 ％澱粉、0.5 ％グルコース、0.3 ％ NZ-case、0.2 ％酵母抽出物、0.5 ％トリペプトン、0.1 ％ K₂HPO₄、0.5 ％ MgSO₄・7H₂O、0.3 ％ CaCO₃、pH 7.0
A-3M培地
0.5 ％グルコース、0.2 ％グリセロール、0.2 ％澱粉、1.5 ％ファーマメディア（Pharmamedia）、0.3 ％酵母抽出物、0.1 ％ HP-20 (脱気したあとpH調整後に混合した)、pH 7.0 V-22 liquid medium
0.1% starch, 0.5% glucose, 0.3% NZ-case, 0.2 % yeast extract, 0.5% _{_{tripeptone, 0.1% K 2 HPO 4,}} 0.5% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.3% CaCO 3, pH 7.0
A-3M medium
0.5% glucose, 0.2% glycerol, 0.2% starch, 1.5% Pharmamedia, 0.3% yeast extract, 0.1% HP-20 (degassed and mixed after pH adjustment), pH 7.0

数字は抗菌阻止円の直径をmm単位で表したものである。数字の大きい方が多量の抗菌物質を産生していることを意味する。上記表1中、Tp有無の欄の+はツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株との混合培養、-は単独培養を意味する。表1に示す結果から、単独の培養では、抗菌成分を産生しない菌体であっても、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株と混合培養することで、抗菌成分を産生することがあることが分かる。尚、表中、単独培養時よりも活性が上がった組み合わせ及び新しく活性が検出された組み合わせの数値を太字で表示する。 The numbers represent the diameter of the antibacterial inhibition circle in mm. The larger number means that more antibacterial substances are produced. In Table 1 above, + in the Tp presence / absence column means mixed culture with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain, and-means single culture. From the results shown in Table 1, even when cells that do not produce antibacterial components are cultured alone, antibacterial components may be produced by mixing and culturing with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain. I understand that. In the table, the numerical values of the combinations in which the activity is higher than that in the single culture and the combinations in which the new activity is detected are displayed in bold.

実施例2
混合培養を用いた抗生物質スクリーニング方法（放線菌）
ツカムレラ・パウロメタボラ(Tsukamurella paurometabola) NBRC 16120をNo.702液体培地で30℃、2日間振とう培養した。また、ツカムレラ・ウラチスラビエンシス(Tsukamurella wratislaviensis )JCM 9689、ツカムレラ・ストランドジェルデイ(Tsukamurella strandjordii )JCM 11487、ツカムレラ・スプマエ(Tsukamurella spumae) JCM 12608及びツカムレラ・シュードスプマエ(Tsukamurella pseudospumae )JCM 13375を使用した場合、ISP-2液体培地で28℃、3日間振とう培養した。いずれかの培養液1％と凍結保存されている自然環境分離放線菌の培養液1％をC液体培地に植菌し、28℃で4日間振とう培養した。培養液をブタノールで抽出し、抗菌アッセイ用サンプルとした。
Example 2
Antibiotic screening method using mixed culture (actinomycetes)
Tsukamurella paurometabola NBRC 16120 was cultured with shaking in No. 702 liquid medium at 30 ° C. for 2 days. In addition, Tsukamurella wratislaviensis JCM 9689, Tsukamurella strandjordii JCM 11487, Tsukamurella spumae JCM 12608 and Tsukamurella pseudospumae (13 Then, the cells were cultured with shaking in ISP-2 liquid medium at 28 ° C. for 3 days. Either 1% of the culture solution and 1% of the culture solution of the natural environment isolated actinomycetes that had been cryopreserved were inoculated into a C liquid medium, and cultured with shaking at 28 ° C. for 4 days. The culture solution was extracted with butanol and used as a sample for antibacterial assay.

抗菌アッセイは被検菌としてバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の2菌株を用い、8 mmのペーパーディスクにサンプルを染みこませ、培地上に静置し、抗菌阻止円の大きさで抗菌活性を判定した。結果を表3及び4に示す。 The antibacterial assay uses two strains, Bacillus subtilis and Candida albicans, as test bacteria, soak the sample in an 8 mm paper disc, leave it on the medium, and prevent the antibacterial circle. The antibacterial activity was determined by the size. The results are shown in Tables 3 and 4.

No.702液体培地
1 ％ポリペプトン、0.2 ％酵母抽出物、0.1 ％ MgSO₄・7H₂O、pH 7.0
ISP-2液体培地
0.4 ％ Bacto酵母抽出物、1 ％ Bacto 麦芽抽出物、0.4 ％グルコース、pH 7.3
C液体培地
2 ％グルコース、2 ％澱粉2 ％ Soy Pro、0.5％酵母抽出物、0.25 ％ NaCl、0.32 ％ CaCO₃、0.4 ％グルコース、0.2 ％ミネラル溶液 (CuSO₄ 5H₂O、1.25 g、ZnSO₄ 7H₂O、1.25 g、MnCl₂ 4H₂O、1.25 g/500 ml)、pH 7.4 No.702 liquid medium
1% polypeptone, 0.2% yeast _{_{extract, 0.1% MgSO 4 · 7H 2}} O, pH 7.0
ISP-2 liquid medium
0.4% Bacto yeast extract, 1% Bacto malt extract, 0.4% glucose, pH 7.3
C liquid medium
2% glucose, 2% starch 2% Soy Pro, 0.5% yeast extract, 0.25% NaCl, 0.32% CaCO ₃ , 0.4% glucose, 0.2% mineral solution (CuSO ₄ 5H ₂ O, 1.25 g, ZnSO ₄ 7H ₂ O 1.25 g, MnCl ₂ 4H ₂ O, 1.25 g / 500 ml), pH 7.4

なお、上記ツカムレラ（Tsukamurella）属各菌株とTP-B0596株との16S rRNA遺伝子の塩基配列における相同性は以下の通りである（解析ソフトはclustalXを使用）。 In addition, the homology in the base sequence of 16S rRNA gene of each said genus Tsukamurella and TP-B0596 strain is as follows (analysis software uses clustalX).

表3及び4に示す結果から、単独の培養(Tsukamurella無)では、抗菌成分を産生しない菌体であっても、ツカムレラ属の菌と混合培養することで、抗菌成分を産生することがあることが分かる。尚、表中、単独培養時よりも活性が上がった組み合わせ及び新しく活性が検出された組み合わせの数値を太字で表示する。 From the results shown in Tables 3 and 4, in the case of a single culture (Tsukamurella-free), even if it is a cell that does not produce an antibacterial component, it may produce an antibacterial component by culturing with a bacterium belonging to the genus Tucumella I understand. In the table, the numerical values of the combinations in which the activity is higher than that in the single culture and the combinations in which the new activity is detected are displayed in bold.

実施例3
混合培養を用いた抗生物質スクリーニング方法（糸状菌）
自然環境分離糸状菌をF1液体培地で25℃、3日間培養した。一方、ツカムレラ・パウロメタボラ(Tsukamurella paurometabola) NBRC 16120をNo.702液体培地で30℃、2日間振とう培養した。また、ツカムレラ・ウラチスラビエンシス(Tsukamurella wratislaviensis )JCM 9689、ツカムレラ・ストランドジェルデイ(Tsukamurella strandjordii )JCM 11487、ツカムレラ・スプマエ(Tsukamurella spumae) JCM 12608及びツカムレラ・シュードスプマエ(Tsukamurella pseudospumae )JCM 13375を使用した場合、ISP-2液体培地で28℃、3日間振とう培養した。ツカムレラ(Tsukamurella)の培養液1％と自然環境分離糸状菌の培養液1％をF1液体培地に植菌し、25℃で4日間振とう培養する。培養液をブタノールで抽出し、抗菌アッセイ用サンプルとした。 Example 3
Antibiotic screening method using mixed culture (filamentous fungi)
Naturally isolated filamentous fungi were cultured in F1 liquid medium at 25 ° C. for 3 days. Meanwhile, Tsukamurella paurometabola NBRC 16120 was cultured with shaking in No. 702 liquid medium at 30 ° C. for 2 days. In addition, Tsukamurella wratislaviensis JCM 9689, Tsukamurella strandjordii JCM 11487, Tsukamurella spumae JCM 12608 and Tsukamurella pseudospumae (13 Then, the cells were cultured with shaking in ISP-2 liquid medium at 28 ° C. for 3 days. A 1% culture solution of Tsukamurella and 1% culture solution of isolated filamentous fungi are inoculated in F1 liquid medium and cultured with shaking at 25 ° C for 4 days. The culture solution was extracted with butanol and used as a sample for antibacterial assay.

抗菌アッセイは被検菌としてバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の2菌株を用い、8 mmのペーパーディスクにサンプルを染みこませ、培地上に静置し、抗菌阻止円の大きさで抗菌活性を判定した。結果を表5及び6に示す。 The antibacterial assay uses two strains, Bacillus subtilis and Candida albicans, as test bacteria, soak the sample in an 8 mm paper disc, leave it on the medium, and prevent the antibacterial circle. The antibacterial activity was determined by the size. The results are shown in Tables 5 and 6.

F1液体培地
1 ％グルコース、2 ％澱粉、2 ％ Soy Pro、0.1 ％ KH₂PO₄、0.05 ％ MgSO₄ 7H₂O、pH無調製 F1 liquid medium
1% glucose, 2% starch, 2% Soy Pro, 0.1% KH ₂ PO ₄ , 0.05% MgSO ₄ 7H ₂ O, no pH

表5及び6に示す結果から、単独の培養では、抗菌成分を産生しない菌体であっても、ツカムレラ属の菌と混合培養することで、抗菌成分を産生することがあることが分かる。尚、表中、単独培養時よりも活性が上がった組み合わせ及び新しく活性が検出された組み合わせの数値を太字で表示する。 From the results shown in Tables 5 and 6, it can be seen that, even in the case of a single cell culture, even if the microbial cells do not produce an antibacterial component, an antibacterial component may be produced by culturing with a bacterium belonging to the genus Tucumrela. In the table, the numerical values of the combinations in which the activity is higher than that in the single culture and the combinations in which the new activity is detected are displayed in bold.

実施例４
ストレプトマイセス(Streptomyces) sp. S-501株が混合培養により生産するカイニンの単離・精製、構造決定
実施例１において(表1参照)、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）を産生することが確認されたストレプトマイセス(Streptomyces) sp. S-501株を用い、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）の製造を試みた。 Example 4
Isolation and purification of kainin produced by Streptomyces sp. S-501 strain by mixed culture, structure determination In Example 1 (see Table 1), antibacterial components (2) were mixed and cultured with TP-B0596 strain. The production of an antibacterial component (secondary metabolite) was attempted in a mixed culture with TP-B0596 strain using Streptomyces sp. S-501 strain that was confirmed to produce (secondary metabolite).

1）培養
V-22培地にS-501株を接種して、30℃で4日間回転振盪培養し（200rpm）、種母(1)を得た。
V-22培地にツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)TP-B0596株を接種し30℃で1日、回転振盪培養し（200rpm）、種母(2)を得た。
A-3M培地100 mlを含む500 ml容K型フラスコ30本に上記の種母(1)を3 ％(v/v) 、種母(2)を0.3％(v/v)加え、30℃で７日間回転振盪培養した(200rpm)。 1) Culture
V-22 medium was inoculated with S-501 strain, and cultured with shaking at 200 ° C. for 4 days (200 rpm) to obtain seed mother (1).
V-22 medium was inoculated with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain, and cultured at 30 ° C. for 1 day by rotating and shaking (200 rpm) to obtain a seed mother (2).
Add 3% (v / v) of the above-mentioned seed mother (1) and 0.3% (v / v) of seed mother (2) to 30 500 ml K-type flasks containing 100 ml of A-3M medium, and add 30% And cultivated with shaking for 7 days (200 rpm).

2）単離・精製
1)で得た培養液（10L）を遠心（8,000rpm、10分間）分離し、上清部分と菌体部分に分離した。得られた菌体に100％アセトン1.5Lを加え、1時間撹拌した。これを遠心（8,000rmp、10分間）分離し、菌体抽出液と菌体部分に分離した。さらに、この菌体部分に100％アセトン1.5Lを加え、1時間撹拌した。これを遠心（8,000rpm、10分間）分離し、菌体抽出液と菌体部分に分離した。 2) Isolation and purification
The culture solution (10 L) obtained in 1) was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes) and separated into a supernatant portion and a cell portion. To the obtained cells, 1.5 L of 100% acetone was added and stirred for 1 hour. This was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and separated into a cell extract and cell part. Further, 1.5 L of 100% acetone was added to the cell part and stirred for 1 hour. This was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes), and separated into a cell extract and a cell part.

この菌体抽出液中の有機溶媒を減圧下で留去し、得られた濃縮物を上清部分と混合し、吸着樹脂Diaion HP-20（三菱化成製、270×98 mm I.D.）カラムに吸着させ、蒸留水、20％含水アセトン、40％含水アセトン、60％含水アセトン、80％含水アセトン、100％アセトン（それぞれ２L）で溶出した。これらの溶出液のうち、60％含水アセトン、80％含水アセトン及び100％アセトンの溶出液中の有機溶媒を減圧下で留去した後、pH 7.0に調整し、この濃縮物の半量のn-ブタノールで抽出した。このn-ブタノール抽出液を減圧下で濃縮して粗抽出物（3.65g）を得た。
この粗抽出物100mgを分取し、30％含水メタノール 5mlで洗浄し、遠心（3,000rpm、５分間）分離した。その不溶分を減圧下で乾燥した。この操作を30回に分けて行い、S-501株生産物の精製物（2.09g）を得た。 The organic solvent in the microbial cell extract is distilled off under reduced pressure, and the resulting concentrate is mixed with the supernatant and adsorbed onto an adsorption resin Diaion HP-20 (Mitsubishi Kasei, 270 x 98 mm ID) column. And eluted with distilled water, 20% aqueous acetone, 40% aqueous acetone, 60% aqueous acetone, 80% aqueous acetone and 100% acetone (2 L each). Among these eluates, the organic solvents in the eluates of 60% aqueous acetone, 80% aqueous acetone and 100% acetone were distilled off under reduced pressure, and then adjusted to pH 7.0. Extracted with butanol. The n-butanol extract was concentrated under reduced pressure to obtain a crude extract (3.65 g).
100 mg of this crude extract was collected, washed with 5 ml of 30% aqueous methanol, and centrifuged (3,000 rpm, 5 minutes). The insoluble matter was dried under reduced pressure. This operation was performed 30 times to obtain a purified product (2.09 g) of the S-501 strain product.

3）構造解析
S-501株生産物は、LC/MSにより分子量は６１０と推定された。¹H-NMR、¹³C-NMR、各種二次元NMR解析により構造解析を行った。 3) Structural analysis
The molecular weight of the S-501 strain product was estimated to be 610 by LC / MS. Structural analysis was performed by ¹ H-NMR, ¹³ C-NMR, and various two-dimensional NMR analyses.

また、精製物の旋光度を測定し、カイニン（Chainin）の旋光度と比較したところ、精製物の旋光度 [α]²³ _D= -114.9°(c=0.2, MeOH)で、カイニンの文献値 [α]²⁵ _D= -112.2°(c=0.16, MeOH)に良い一致を示した。 In addition, the optical rotation of the purified product was measured and compared with the optical rotation of kainin. The optical rotation of the purified product [α] ²³ _D = -114.9 ° (c = 0.2, MeOH). There was good agreement with [α] ²⁵ _D = -112.2 ° (c = 0.16, MeOH).

以上のことから、ストレプトマイセス(Streptomyces) sp.S-501株が混合培養により生産する抗真菌物質はポリエン系抗生物質でペンタエン化合物のカイニンと同定された。カイニンは1968年にGopalkrishnanらによって報告された物質である[Gopalkrishnan KS, Narasimhachari N, Joshi VB, Thirumalachar MJ. Chainin: a new methylpentaene antibiotic from a species of Chainia. Nature. 1968;218(141):597-598.] Based on the above, the antifungal substance produced by mixed culture by the Streptomyces sp. S-501 strain was identified as a pentaene compound kainin as a polyene antibiotic. Kainin is a substance reported by Gopalkrishnan et al. In 1968 [Gopalkrishnan KS, Narasimhachari N, Joshi VB, Thirumalachar MJ. Chainin: a new methylpentaene antibiotic from a species of Chainia. Nature. 1968; 218 (141): 597- 598.]

実施例5
ストレプトマイセス(Streptomyces)sp. S-522株が混合培養により生産するアルキベマイシン A（Alchivemycin A）の単離・精製、構造決定
実施例１において(表1参照)、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）を産生することが確認されたストレプトマイセス(Streptomyces) sp. S-522株を用い、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）の製造を試みた。 Example 5
Isolation and purification of archivemycin A (Alchivemycin A) produced by Streptomyces sp. S-522 by mixed culture, structure determination In Example 1 (see Table 1), TP-B0596 Using Streptomyces sp. S-522, which was confirmed to produce antibacterial components (secondary metabolites) in mixed culture, antibacterial components (secondary metabolites) in mixed culture with TP-B0596 strain ) Was attempted.

1）培養
V-22培地にS-522株を接種して、30℃で4日間回転振盪培養し（200rpm）、種母(1)を得た。
V-22培地にツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis ) TP-B0596株を接種し30℃で1日間回転振盪培養し（200rpm）、種母(2)を得た。
A-3M培地100 mlを含む500 ml容K型フラスコ３０本に上記の種母(1)を3 ％(v/v) 、種母(2)を0.3％(v/v)加え、30℃で７日間回転振盪培養した(200rpm)。 1) Culture
The V-22 medium was inoculated with the S-522 strain and cultivated at 30 ° C. for 4 days with shaking and shaking (200 rpm) to obtain a seed mother (1).
The V-22 medium was inoculated with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day (200 rpm) to obtain a seed mother (2).
Add 3% (v / v) of the above-mentioned seed mother (1) and 0.3% (v / v) of seed mother (2) to 30 500 ml K-type flasks containing 100 ml of A-3M medium, and add 30% And cultivated with shaking for 7 days (200 rpm).

S-522株をツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis ) TP-B0596株とを混合培養して得られた培養物とS-522株を単独培養した場合の培養物の液体クロマトグラムを図2に示す。混合培養の場合のみ、後述するアルキベマイシンAのピークが見られる。 FIG. 2 shows a liquid chromatogram of a culture obtained by mixing and culturing S-522 strain with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain and S-522 strain alone. Only in the case of mixed culture, the peak of alkivemycin A described later is observed.

2）単離・精製
1)で得た培養液(3.0L)に半量のｎ-ブタノールを加え1時間攪拌抽出し、ｎ-ブタノール層を取り出した。得られたｎ-ブタノール層を減圧下で濃縮して粗抽出物(8g)を得た。粗抽出物をシリカゲルカラム(関東化学製、シリカゲル60N、63〜210 nm、220 x 40 mm I.D.)に吸着させ、クロロホルム／メタノール(20:1〜0:1)で溶出した。各溶出画分は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析し、クロロホルム／メタノール（4:1）と（2:1）の画分を集め、これを減圧下で溶媒を留去し、さらに半量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮し、濃縮物を適量のDMSOに溶解して逆層型ODS結合シリカゲルカラム(YMC製、ODS-A、250×55 mm I.D.)に吸着させ、アセトニトリル／0.15％リン酸二水素カリウム液(pH 3.5)(8:2〜2:8)で溶出した。アセトニトリル／0.15％リン酸二水素カリウム液(pH 3.5) (8:2)の画分を集め、溶媒を減圧下で留去した後、半量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮し、さらに半量の酢酸エチルで抽出し、S-522株生産物の精製物 (25 mg)を得た。 2) Isolation and purification
A half amount of n-butanol was added to the culture solution (3.0 L) obtained in 1), followed by stirring and extraction for 1 hour, and the n-butanol layer was taken out. The obtained n-butanol layer was concentrated under reduced pressure to obtain a crude extract (8 g). The crude extract was adsorbed on a silica gel column (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc., silica gel 60N, 63 to 210 nm, 220 × 40 mm ID) and eluted with chloroform / methanol (20: 1 to 0: 1). Each eluted fraction was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), and chloroform / methanol (4: 1) and (2: 1) fractions were collected, and the solvent was distilled off under reduced pressure. Extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure, and the concentrate was dissolved in an appropriate amount of DMSO and adsorbed on a reverse layer type ODS-bonded silica gel column (YMC, ODS-A, 250 × 55 mm ID), acetonitrile / 0.15 Elution was performed with a potassium dihydrogen phosphate solution (pH 3.5) (8: 2 to 2: 8). Fractions of acetonitrile / 0.15% potassium dihydrogen phosphate solution (pH 3.5) (8: 2) were collected, and the solvent was distilled off under reduced pressure, followed by extraction with half of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure, and further extracted with half of ethyl acetate to obtain a purified product (25 mg) of the S-522 strain product.

3）構造解析
S-522株生産物の高分解能FABMS解析を行い、found 648.3754 [M+H]+, calcd 648.3745 (for C₃₅H₅₄O₁₀N)の値を得た。また¹H-NMR、¹³C-NMR、各種二次元NMR解析により構造解析を行った。 3) Structural analysis
High resolution FABMS analysis of the S-522 strain product was performed, and the value of found 648.3754 [M + H] +, calcd 648.3745 (for C ₃₅ H ₅₄ O ₁₀ N) was obtained. The structure was analyzed by ¹ H-NMR, ¹³ C-NMR, and various two-dimensional NMR analyses.

構造解析の結果、新規化合物であったために、アルキベマイシン Aと命名した。なお、アルキベマイシン Aは、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)に対してMIC 0.06μg/mlの非常に強い抗菌活性を有していた。 As a result of structural analysis, it was a novel compound, so it was named alkivemycin A. Alkibemycin A had a very strong antibacterial activity of MIC 0.06 μg / ml against Micrococcus luteus.

実施例6
ストレプトマイセス(Streptomyces)sp. S-558株が混合培養により生産する抗生物質Antibiotic A 33853の単離・精製、構造決定
実施例１において(表1参照)、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）を産生することが確認されたストレプトマイセス(Streptomyces)sp. S-558株を用い、TP-B0596株との混合培養で抗菌成分（二次代謝産物）の製造を試みた。 Example 6
Isolation and purification of the antibiotic Antibiotic A 33853 produced by mixed culture of Streptomyces sp. S-558, structure determination In Example 1 (see Table 1), mixed culture with TP-B0596 Production of antibacterial components (secondary metabolites) by mixing culture with TP-B0596 strain using Streptomyces sp. S-558 strain confirmed to produce antibacterial components (secondary metabolites) Tried.

1）培養
V-22培地にS-558株を接種して、30℃で4日間回転振盪培養した（200rpm）、種母(1)を得た。
V-22培地にツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株を接種し30℃で1日間回転振盪培養（200rpm）、種母(2)を得た。
A-3M培地100 mlを含む500 ml容K型フラスコ３０本に上記の種母(1)を3 ％(v/v) 、種母(2)を0.3％(v/v)加え、30℃で6日間回転振盪培養した(200rpm)。 1) Culture
The V-22 medium was inoculated with the S-558 strain and cultured with rotation and shaking at 30 ° C. for 4 days (200 rpm) to obtain a seed mother (1).
A V-22 medium was inoculated with Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain, and cultured at 30 ° C. for 1 day with agitation (200 rpm) to obtain a seed mother (2).
Add 3% (v / v) of the above-mentioned seed mother (1) and 0.3% (v / v) of seed mother (2) to 30 500 ml K-type flasks containing 100 ml of A-3M medium, and add 30% And cultivated with shaking for 6 days (200 rpm).

2）単離・精製
1)で得た培養液(30L)に半量のｎ-ブタノールを加え1時間攪拌抽出し、ｎ-ブタノール層を取り出した。得られたｎ-ブタノール層を減圧下で濃縮して粗抽出物(42g)を得た。粗抽出物をシリカゲルカラム(関東化学製、シリカゲル60N、63〜210 nm、220 x 40 mm I.D.)に吸着させ、クロロホルム／メタノール(20:1〜0:1)で溶出した。クロロホルム／メタノール（4:1）の画分を集め、その溶媒を減圧下で留去し、さらに半量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮し、濃縮物を適量のDMSOに溶解して逆層型ODS結合シリカゲルカラム(YMC製、ODS-A、250×55 mm I.D.)に吸着させ、アセトニトリル／0.15％リン酸二水素カリウム液(pH 3.5)(8:2〜2:8)で溶出した。アセトニトリル／0.15％リン酸二水素カリウム液(pH 3.5)（6:4）の画分を集め、溶媒を減圧下で留去した後、半量の酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮して粗精製物を得た。得られた粗精製物をDMSOに溶解しHPLC( Nacalai tesque製、COSMOSIL、10×2 mm)を利用して分取した。各溶出画分の溶媒を減圧下で留去した後、半量の酢酸エチルで抽出し、薄い黄色粉末のS-558株生産物の精製物(2.9 mg)を得た。 2) Isolation and purification
A half amount of n-butanol was added to the culture solution (30 L) obtained in 1), followed by stirring and extraction for 1 hour, and the n-butanol layer was taken out. The obtained n-butanol layer was concentrated under reduced pressure to obtain a crude extract (42 g). The crude extract was adsorbed on a silica gel column (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc., silica gel 60N, 63 to 210 nm, 220 × 40 mm ID) and eluted with chloroform / methanol (20: 1 to 0: 1). Chloroform / methanol (4: 1) fractions were collected and the solvent was removed under reduced pressure and extracted with half of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure, and the concentrate was dissolved in an appropriate amount of DMSO and adsorbed on a reverse layer type ODS-bonded silica gel column (YMC, ODS-A, 250 × 55 mm ID), acetonitrile / 0.15 Elution was performed with a potassium dihydrogen phosphate solution (pH 3.5) (8: 2 to 2: 8). Fractions of acetonitrile / 0.15% potassium dihydrogen phosphate solution (pH 3.5) (6: 4) were collected, and the solvent was distilled off under reduced pressure, followed by extraction with half of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was concentrated under reduced pressure to obtain a crude product. The obtained crude product was dissolved in DMSO and fractionated using HPLC (manufactured by Nacalai tesque, COSMOSIL, 10 × 2 mm). The solvent of each elution fraction was distilled off under reduced pressure, followed by extraction with a half amount of ethyl acetate to obtain a purified product (2.9 mg) of a light yellow powder S-558 strain product.

3）構造解析
S-558株生産物はLC/MSにより分子量は372と推定された。¹H-NMR、¹³C-NMR、各種二次元NMR解析により構造解析を行い、ストレプトマイセス(Streptomyces) sp.S-558株が混合培養により生産する物質は、組成式がC₂₀H₁₃N₃O₆であるAntibiotic A 33853であると同定した。Antibiotic A 33853は1984年にK. H. Michelらによって報告された物質である。[Michel KH, Boeck LD, Hoehn MM, Jones ND, Chaney MO. The discovery, fermentation, isolation, and structure of antibiotic A33853 and its tetraacetyl derivative. J Antibiot (Tokyo). 1984 37(5):441-5.] 3) Structural analysis
The molecular weight of the S-558 product was estimated to be 372 by LC / MS. ^The structure produced by Streptomyces sp. S-558 by mixed culture after structural analysis by ¹ H-NMR, ¹³ C-NMR, and various two-dimensional NMR analysis has a composition formula of C ₂₀ H ₁₃ N _It was identified as ₃ O ₆ Antibiotic A 33853. Antibiotic A 33853 was reported in 1984 by KH Michel et al. [Michel KH, Boeck LD, Hoehn MM, Jones ND, Chaney MO. The discovery, fermentation, isolation, and structure of antibiotic A33853 and its tetraacetyl derivative. J Antibiot (Tokyo). 1984 37 (5): 441-5.]

この物質は、ストレプトマイセス(Streptomyces) sp. NRRL 12068株より単離され、サルモネラ・チフォサ(Salmonella typhosa)やその他の病原性細菌に抗菌活性があることが報告されている。 This substance has been isolated from Streptomyces sp. NRRL 12068 strain and has been reported to have antibacterial activity against Salmonella typhosa and other pathogenic bacteria.

本発明は、抗生物質等の生理活性物質のスクリーニングおよび製造に有用である。 The present invention is useful for screening and production of physiologically active substances such as antibiotics.

参考例で得られた赤色色素を誘導したツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株の電子顕微鏡写真(左)及びツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株を用いた場合(Tp菌入)と用いなかった場合(Tp菌無)の培養物の写真(右)を示す。An electron micrograph (left) of the tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain derived from the red pigment obtained in the reference example and when using the tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain (with Tp bacteria) The photograph (right) of the culture when not used (without Tp bacteria) is shown. 実施例５で得られた培養物の高速液体クロマトグラム。The high performance liquid chromatogram of the culture obtained in Example 5.

Claims

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の被検菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物が含まれているかを確認することを含む二次代謝産物のスクリーニング方法。 A secondary metabolite that includes culturing a mixture of at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one test bacterium, and confirming that the secondary metabolite is contained in the culture solution. Screening method.

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物である、請求項１に記載のスクリーニング方法。 Tsukamurella (Tsukamurella) microorganism belonging to the genus is a microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis), screening method of claim 1.

ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)TP-B0596株である、請求項２に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 2 , wherein the microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis is Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain.

被検菌が放線菌または糸状菌である請求項1〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the test bacteria are actinomycetes or filamentous fungi.

放線菌が、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、アクチノバチュラム（Actinobaculum）、アクチノマイセス（Actinomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アースロバクター（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、アグロマイセス（Agromyces）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、アクチノマデュラ（Actinomadura）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスポリア（Kineosporia）及びサーモビスポラ（Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌である請求項４に記載のスクリーニング方法。 Actinomycetes are Cryptobacterium, Rubrobacter, Actinobaculum, Actinomyces, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Cryptosporangium, Micrococcus, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Agromyces, Cryobacterium, Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium, Nocardioide (Nocardioides), Pseudonocardia, Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Actinokineospora Streptomyces, Kitasatospora, Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinomadoccus, Actinomadoccus The screening method according to claim 4 , which is an actinomycete belonging to any genus selected from the group consisting of: Kineosporia and Thermobisspora.

糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）、アルテルナリア（Alteｒnaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ボーベリア（Beauveria）、ボトリティス（Botorytis）カララ（Chalara）、セルコスポラ（Cercospora）、セファロスフォリウム（Cephalosporium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コクシジオイデス（Coccidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルブラリア（Curvularia）、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）、カニングハメラ（Cunninghamella）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコッカム（Epicoccum）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、フザリウム（Fusarium）、ジオトリカム（Geotrichum）、グリオクラディウム（Gliocladium）、グラフィウム（Graphium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）、イサリア（Isaria）、メタルヒジウム（Metarhizium）、モニリア（Monilia）、モルティレラ（Mortierella）、ムコール（Mucor）、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピリキュラリア（Pyricularia）、フィアロマイセス（Phialomyces）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、スポロスリクス（Sporopthrix）、トリコヒートン（Trichophyton）、トリコデルマ（Trichocderma）及びトリコセシウム（Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかの属に属する糸状菌である請求項４に記載のスクリーニング方法。 Filamentous fungi are Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Botorytis Chalara, Cercospora, Cephalosporium, Chrysosporium (Chrysosporium), Coccidioides, Cryptococcus, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella, Cunninghamella, Drec , Eupenicillium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyalodendron dron, Isaria, Metalrhizium, Monilia, Mortierella, Mucor, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia (yr) A filamentous fungus belonging to any genus selected from the group consisting of: Phialomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichophyton, and Trichothecium The screening method according to claim 4 .

二次代謝産物が抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤である請求項1〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to any one of claims 1 to 6 , wherein the secondary metabolite is an antibacterial antibiotic, an anticancer antibiotic, an antiparasitic substance or an enzyme inhibitor.

前記ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物及び被検菌株がいずれも生菌体として共存した状態で培養することを特徴とする請求項1〜７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the microorganism and the test strain belonging to the genus Tsukamurella co-exist in the state of coexisting as living cells.

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に生産される二次代謝産物を採取することを特徴とする二次代謝産物の製造方法。 A secondary metabolite produced by mixing and cultivating at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one actinomycete or filamentous fungus, and collecting a secondary metabolite produced in the culture solution Metabolite production method.

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis)に属する微生物である、請求項９に記載の二次代謝産物の製造方法。 Tsukamurella (Tsukamurella) microorganism belonging to the genus is a microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis (Tsukamurella pulmonis), manufacturing method of the secondary metabolite of claim 9.

ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) に属する微生物が、ツカムレラ・プルモニス(Tsukamurella pulmonis) TP-B0596株である、請求項１０に記載の二次代謝産物の製造方法。 The method for producing a secondary metabolite according to claim 10 , wherein the microorganism belonging to Tsukamurella pulmonis is Tsukamurella pulmonis TP-B0596 strain.

放線菌が、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、アクチノバチュラム（Actinobaculum）、アクチノマイセス（Actinomyces）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルディア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アースロバクター（Arthrobacter）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、アグロマイセス（Agromyces）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、シュードノカルディア（Pseudonocardia）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、アクチノマデュラ（Actinomadura）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスポリア（Kineosporia）及びサーモビスポラ（Thermobispora）からなる群より選択されるいずれかの属に属する放線菌である請求項１０または１１に記載の二次代謝産物の製造方法。 Actinomycetes are Cryptobacterium, Rubrobacter, Actinobaculum, Actinomyces, Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Microsphaera, Cryptosporangium, Micrococcus, Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Agromyces, Cryobacterium, Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium, Nocardioide (Nocardioides), Pseudonocardia, Actinobispora, Amycolatopsis, Saccharomonospora, Actinosynnema, Actinokineospora, Actinokineospora Streptomyces, Kitasatospora, Streptosporangium, Microbispora, Microtetraspora, Nonomuraea, Nocardiopsis, Actinomadoccus, Actinomadoccus The method for producing a secondary metabolite according to claim 10 or 11 , which is an actinomycete belonging to any genus selected from the group consisting of: Kineosporia and Thermobisspora.

糸状菌がアクレモニウム（Acremonium）、アルテルナリア（Alteｒnaria）、アスペルギルス（Aspergillus）、ボーベリア（Beauveria）、ボトリティス（Botorytis）カララ（Chalara）、セルコスポラ（Cercospora）、セファロスフォリウム（Cephalosporium）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、コクシジオイデス（Coccidioides）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クルブラリア（Curvularia）、シリンドロカルポン（Cylindrocarpon）、シリンドロクラディウム（Cylindrocladium）、カニングハメラ（Cunninghamella）、ドレクスレラ（Drechslera）、エピコッカム（Epicoccum）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、フザリウム（Fusarium）、ジオトリカム（Geotrichum）、グリオクラディウム（Gliocladium）、グラフィウム（Graphium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）、ヒアロデンドロン（Hyalodendron）、イサリア（Isaria）、メタルヒジウム（Metarhizium）、モニリア（Monilia）、モルティレラ（Mortierella）、ムコール（Mucor）、ノデュリオスポリウム（Nodulisporium）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピリキュラリア（Pyricularia）、フィアロマイセス（Phialomyces）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、スポロスリクス（Sporopthrix）、トリコヒートン（Trichophyton）、トリコデルマ（Trichocderma）及びトリコセシウム（Trichothecium）からなる群より選択されるいずれかの属に属する糸状菌である請求項１０または１１に記載の二次代謝産物の製造方法。 Filamentous fungi are Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Beauveria, Botorytis Chalara, Cercospora, Cephalosporium, Chrysosporium (Chrysosporium), Coccidioides, Cryptococcus, Curvularia, Cylindrocarpon, Cylindrocladium, Cunninghamella, Cunninghamella, Drec , Eupenicillium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Graphium, Helminthosporium, Hyalodendron dron, Isaria, Metalrhizium, Monilia, Mortierella, Mucor, Nodulisporium, Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia (yr) A filamentous fungus belonging to any genus selected from the group consisting of: Phialomyces, Rhizoctonia, Sporopthrix, Trichophyton, Trichophyton, and Trichothecium The method for producing a secondary metabolite according to claim 10 or 11 .

二次代謝産物が抗菌性抗生物質、制癌性抗生物質、抗寄生虫物質または酵素阻害剤である請求項９〜１３のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。 The method for producing a secondary metabolite according to any one of claims 9 to 13 , wherein the secondary metabolite is an antibacterial antibiotic, an anticancer antibiotic, an antiparasitic substance or an enzyme inhibitor.

前記ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する微生物及び放線菌または糸状菌がいずれも生菌体として共存した状態で培養することを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の二次代謝産物の製造方法。 The secondary metabolite according to any one of claims 9 to 14 , wherein said microorganism is cultured in a state in which both microorganisms belonging to the genus Tsukamurella and actinomycetes or filamentous fungi coexist as living cells. Manufacturing method.

ツカムレラ(Tsukamurella)属に属する少なくとも1種の微生物及び少なくとも１種の放線菌または糸状菌を混合して培養し、培養液中に二次代謝産物を蓄積させた培養物。 A culture in which at least one microorganism belonging to the genus Tsukamurella and at least one actinomycete or filamentous fungus are mixed and cultured, and a secondary metabolite is accumulated in the culture solution.