JP4361276B2

JP4361276B2 - Ａｋｔ活性の阻害物質

Info

Publication number: JP4361276B2
Application number: JP2002580942A
Authority: JP
Inventors: バーネツト，スタンリー・エフ; グラハム，サミユエル・エル; レミイ，デイビツド・シー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-08
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2022-04-08
Also published as: AU2002252614B2; CA2442270A1; EP1379251B1; JP2004525961A; EP1379251A1; CA2442270C; ATE400274T1; WO2002083138A1; DE60227492D1; US20040143117A1; EP1379251A4; US7034026B2

Description

本発明は、イソ型セリン／スレオニンキナーゼ、Ａｋｔ（ＰＫＢとしても知られている）の１つまたは複数の活性の阻害物質である、キナゾリン含有化合物に関する。本発明は、このような化合物を含む薬剤組成物、および癌の治療において本発明の化合物を使用する方法にも関する。

アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、胚の分化、および神経変性疾患、心臓血管病および癌などのさまざまな疾患の病因において、必要な役割を果たす。近年の研究によって、プログラムされた細胞死の調節または実行と関係がある、さまざまな前および抗アポトーシス遺伝子産物が同定されてきている。Ｂｃｌ２またはＢｃｌ−ｘ_Ｌなどの抗アポトーシス遺伝子の発現によって、さまざまな刺激によって誘導されるアポトーシス細胞死が阻害される。他方では、ＢａｘまたはＢａｄなどの前アポトーシス遺伝子の発現によって、プログラムされた細胞死がもたらされる（Ａａｍｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３２２〜１３２６（１９９８））。プログラムされた細胞死の実行は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９などを含めた、カスパーゼ−１関連プロテイナーゼによって仲介される（Ｔｈｏｒｎｅｂｅｒｒｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３１２〜１３１６（１９９８））。

ホスファチジルイノシトール３’−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／ＰＫＢ経路は、細胞の生存／細胞死を調節するためには重要であるようである（Ｋｕｌｉｋ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：１５９５〜１６０６（１９９７）；Ｆｒａｎｋｅ他、Ｃｅｌｌ、８８：４３５〜４３７（１９９７）；Ｋａｕｆｆｍａｎｎ−Ｚｅｈ他、Ｎａｔｕｒｅ３８５：５４４〜５４８（１９９７）ＨｅｍｍｉｎｇｓＳｃｉｅｎｃｅ、２７５：６２８〜６３０（１９９７）；Ｄｕｄｅｋ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：６６１〜６６５（１９９７））。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）およびインシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）などの生存因子は、ＰＩ３Ｋの活性を誘導することによって、さまざまな条件下で細胞の生存を促進する（Ｋｕｌｉｋ他、１９９７、Ｈｅｍｍｉｎｇｓ１９９７）。活性化ＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）−Ｐ３）の生成をもたらし、これは次にセリン／スレオニンキナーゼＡｋｔに結合し、その活性化を促進し、これはプレクストリン相同（ＰＨ）−ドメインを含む（Ｆｒａｎｋｅ他、Ｃｅｌｌ、８１：７２７〜７３６（１９９５）；ＨｅｍｍｉｎｇｓＳｃｉｅｎｃｅ、２７７：５３４（１９９７）；Ｄｏｗｎｗａｒｄ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：２６２〜２６７（１９９８）、Ａｌｅｓｓｉ他、ＥＭＢＯＪ．１５：６５４１〜６５５１（１９９６））。ＰＩ３Ｋの特異的阻害物質または優性ネガティブＡｋｔ／ＰＫＢ突然変異体は、これらの成長因子またはサイトカインの生存促進活性を無効にする。ＰＩ３Ｋの阻害物質（ＬＹ２９４００２またはウォルトマニン）が、上流キナーゼによるＡｋｔ／ＰＫＢの活性化を阻害したことは以前に開示されている。さらに、構成的に活性であるＰＩ３ＫまたはＡｋｔ／ＰＫＢ突然変異体を導入することによって、正常では細胞がアポトーシス細胞死を経る条件下で、細胞の生存が促進される（Ｋｕｌｉｋ他、１９９７、Ｄｕｄｅｋ他、１９９７）。

ヒト腫瘍中のＡｋｔレベルを分析することによって、Ａｋｔ２が相当数の卵巣癌（Ｊ．Ｑ．Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９２６７〜９２７１（１９９２））および膵臓癌（Ｊ．Ｑ．Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３６３６〜３６４１（１９９６））において過剰発現されていることが示された。同様にＡｋｔ３が、乳癌および前立腺癌細胞株中で過剰発現されていることが見出された（Ｎａｋａｔａｎｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１５２８〜２１５３２（１９９９））。

腫瘍抑制物質ＰＴＥＮ、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）−Ｐ３の３’リン酸を特異的に除去するタンパク質および脂質ホスファターゼは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の負の調節物質である（Ｌｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：１９４３〜１９４７（１９９７）、Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ他、Ｃｅｌｌ９５：２９〜３９（１９９８）、Ｓｕｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６１９９〜６２０４（１９９９））。ＰＴＥＮの生殖系列での突然変異は、カウデン病などのヒトの癌症候群の原因である（Ｌｉａｗ他、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１６：６４〜６７（１９９７））。ＰＴＥＮは大部分のヒト腫瘍で欠失しており、機能的ＰＴＥＮを有していない腫瘍細胞株は、高レベルの活性化Ａｋｔを示す（Ｌｉ他、上記、Ｇｕｌｄｂｅｒｇ他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５７：３６６０〜３６６３（１９９７）、Ｒｉｓｉｎｇｅｒ他、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５７：４７３６〜４７３８（１９９７））。

これらの観察結果は、腫瘍発生における細胞の生存またはアポトーシスを調節するために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が重要な役割を果たすことを示している。

セカンドメッセンジャーによって調節されるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの、Ａｋｔ／ＰＫＢサブファミリーの３つのメンバーが同定されており、それぞれＡｋｔ１／ＰＫＢα、Ａｋｔ２／ＰＫＢβ、およびＡｋｔ３／ＰＫＢγと名付けられている。これらのイソ型は、特に触媒ドメインをコードする領域中で相同的である。Ａｋｔ／ＰＫＢは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達に応答して生じる、リン酸化事象によって活性化される。ＰＩ３Ｋは膜イノシトールリン脂質をリン酸化し、セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸およびホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸を生じさせ、これらはＡｋｔ／ＰＫＢのＰＨドメインに結合することが示されてきている。Ａｋｔ／ＰＫＢ活性化の現在のモデルは、３’−リン酸化ホスホイノシチドによって膜に酵素を漸増させることを提案しており、この場合、上流キナーゼによるＡｋｔ／ＰＫＢの調節部位のリン酸化が起こる（Ｂ．Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：６２８〜６３０（１９９７）；Ｂ．Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：５３４（１９９７）；Ｊ．Ｄｏｗｎｗａｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：６７３〜６７４（１９９８））。

Ａｋｔ１／ＰＫＢαのリン酸化は２箇所の調節部位、触媒ドメイン活性化ループ中のＴｈｒ^３０８、およびカルボキシ末端近くのＳｅｒ^４７３で起こる（Ｄ．Ｒ．Ａｌｅｓｓｉ他、ＥＭＢＯＪ．１５：６５４１〜６５５１（１９９６）およびＲ．Ｍｅｉｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０４９１〜３０４９７（１９９７））。同等の調節リン酸化部位が、Ａｋｔ２／ＰＫＢβおよびＡｋｔ３／ＰＫＢγ中に存在する。活性化ループ部位でＡｋｔ／ＰＫＢをリン酸化する上流キナーゼはクローニングされ、３’−リン酸化ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）と名付けられている。ＰＤＫ１はＡｋｔ／ＰＫＢだけでなく、ｐ７０リボソームＳ６キナーゼ、ｐ９０ＲＳＫ、血清およびグルココルチコイド調節キナーゼ（ＳＧＫ）、およびタンパク質キナーゼＣもリン酸化する。カルボキシ末端近くのＡｋｔ／ＰＫＢの調節部位をリン酸化する上流キナーゼは、これまで同定されていないが、近年の報告によって、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ−１）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ、または自己リン酸化に関する役割が示されている。

Ａｋｔの活性化および活性の阻害は、ＬＹ２９４００２およびウォルトマニンなどの阻害物質を用いて、ＰＩ３Ｋを阻害することによって達成することができる。しかしながら、ＰＩ３Ｋを阻害することによって、３つのＡｋｔイソ酵素すべてのみならず、チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーなどの、ＰｄｔＩｎｓ（３，４，５）−Ｐ３に依存する他のＰＨドメイン含有シグナル伝達分子にも、無差別に影響を及ぼす可能性がある。さらに、ＰＩ３Ｋと無関係な増殖シグナルによって、Ａｋｔを活性化させることができることが開示されている。

あるいは、上流キナーゼＰＤＫ１の活性を害することによって、Ａｋｔの活性を阻害することができる。特異的なＰＤＫ１阻害物質は、開示されていない。さらに、ＰＤＫ１を阻害することによって、典型的なＰＫＣイソ型、ＳＧＫ、およびＳ６キナーゼなどの、その活性がＰＤＫ１に依存する多数のタンパク質キナーゼの、阻害がもたらされると思われる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：４３９〜４４８（２０００））。

本発明の目的は、Ａｋｔ／ＰＫＢの阻害物質である新規な化合物を提供することである。

それを含む薬剤組成物を提供することも、本発明の目的である。

このようなＡｋｔ／ＰＫＢ活性の阻害物質を投与することを含む、癌を治療する方法を提供することも、本発明の目的である。

本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ活性を阻害する、２，３−ジフェニルキノキサリン部分を含む化合物を提供する。詳細には、開示した化合物は、１つまたは２つのＡｋｔ／ＰＫＢイソ型を選択的に阻害する。本発明は、このような阻害化合物を含む組成物、および癌の治療を必要とする患者に化合物を投与することによって、Ａｋｔ／ＰＫＢ活性を阻害する方法も提供する。

本発明の化合物は、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの活性の阻害において有用である。本発明の第一の実施形態において、Ａｋｔ活性の阻害物質は式Ａによって示され、または薬剤として許容されるその塩またはその立体異性体である。

上式中、Ｒ^１はアミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜６アルキルアミノ、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキル、ジ（Ｃ_１〜６アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキルアミノ、ジ−Ｃ_３〜７シクロアルキルアミノ、−Ｃ_３〜７シクロアルキルアミノ、Ｎ−ピロリジニル−Ｃ_１〜６アルキル、Ｎ−ピペリジニル−Ｃ_１〜６アルキル、ピペリジニルまたはピロリジニルを独立に表し、
Ｒ^２は水素、アミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜６アルキルアミノ、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜６アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを独立に表し、
ｒは１〜３であり、
ｓは１〜３である。

別の実施形態において、本発明の阻害物質は式Ａ−Ｉによって示され、または薬剤として許容されるその塩である。

上式中、Ｒ^１はアミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜６アルキルアミノ、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜６アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを独立に表す。

本発明の具体的な化合物としては、
２−［４−（２−アミノプロプ−２−イル）フェニル］−３−フェニルキノキサリン

または薬剤として許容されるその塩が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「Ｃ_１〜６アルキル」という表現はメチルおよびエチル基、および直鎖または分枝鎖プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル基を含む。個々のアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチルおよび２，２−ジメチルプロピルである。「Ｃ_１〜６アルコキシ」などの誘導的表現は、然るべく解釈すべきである。

本明細書で使用するとき、「Ｃ_１〜４アルキル」という表現はメチルおよびエチル基、および直鎖または分枝鎖プロピルおよびブチル基を含む。個々のアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、およびｔｅｒｔ−ブチルである。「Ｃ_１〜４アルコキシ」などの誘導的表現は、然るべく解釈すべきである。

典型的なＣ_３〜７シクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルがある。

本明細書で使用するとき、「Ｃ_３〜７シクロアルキル（Ｃ_１〜６）アルキル」という表現は、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチルおよびシクロヘキシルメチルを含む。

Ｒ^１がピロリジンまたはピペリジンであるとき、分子の残り部分への結合は、ピロリジンまたはピペリジンの窒素原子を介したものであるか、あるいはピロリジンまたはピペリジンの炭素原子の１つを介したものであってよい。

本明細書で使用するとき、「ハロゲン」という語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素、特にフッ素または塩素を含む。

特定の実施形態では、Ｒ^１はアミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜４アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜４アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを表す。

特定の実施形態では、Ｒ^２は水素を表す。

薬に使用するために、式Ｉの化合物の塩は、薬剤として許容される塩である。しかしながら、他の塩も本発明による化合物または薬剤として許容されるその塩の調製において有用であろう。本発明の化合物の薬剤として許容される適切な塩は、たとえば本発明による化合物の溶液と、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬剤として許容される酸の溶液を混合させることによって形成することができる、酸添加型の塩を含む。さらに、本発明の化合物が酸性成分を保有している場合、薬剤として許容されるその適切な塩は、アルカリ金属塩、たとえばナトリウムまたはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、たとえばカルシウムまたはマグネシウム塩、および適切な有機リガンドと共に形成される塩、たとえば第四級アンモニウム塩を含んでよい。

本発明は、前述の式Ｉの化合物のプロドラッグをその範囲内に含む。一般にこのようなプロドラッグは、必要とされる式Ｉの化合物にｉｎｖｉｖｏで容易に転換可能である、式Ｉの化合物の官能的誘導体であろう。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製に関する従来の手順は、たとえばＤｅｓｉｇｎｏｆＰｒｏｄｒｕｇｓ、ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５中に記載されている。

本発明による化合物が少なくとも１つの非対称中心を有する場合、これらの化合物はしたがって鏡像異性体として存在することができる。本発明による化合物が２つ以上の非対称中心を有する場合、これらはさらにジアステレオ異性体として存在することができる。このような異性体および任意の比率のその混合物はすべて、本発明の範囲内に包含されることを理解されたい。

本発明の化合物は、Ａｋｔの活性の阻害物質であり、したがって癌、特にＡｋｔおよび／またはＧＳＫ３の活性の異常と関連がある癌の治療において有用である。このような癌には、卵巣癌、膵臓癌および乳癌があるが、これらだけには限られない。

本発明の一実施形態では、本発明の化合物は、その阻害効果がＰＨドメインに依存する選択的阻害物質である。この実施形態では、本発明の化合物は、ｉｎｖｉｔｒｏでの阻害活性の低下を示すか、あるいはＰＨドメインが欠けている切断型Ａｋｔタンパク質に対してはｉｎｖｉｔｒｏでの阻害活性は示さない。

本発明の他の実施形態では、本発明の化合物は、その阻害効果がＰＨドメインとキナーゼドメインの間のタンパク質の領域に依存する、選択的阻害物質である（Ｋｏｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１６：５２６〜５３４（１９９５）、図２を参照のこと）。この領域はヒンジ領域と呼ばれるものである。この実施形態では、本発明の化合物は、ｉｎｖｉｔｒｏでの阻害活性の低下を示すか、あるいはＰＨドメインおよびヒンジ領域が欠けている切断型Ａｋｔタンパク質に対してはｉｎｖｉｔｒｏでの阻害活性を示さない。

ＰＨドメイン、ヒンジ領域、またはこの両方に依存する、このような阻害物質によって、特定の利点が与えられる。なぜなら、３つのＡｋｔイソ型中のＰＨドメインおよびヒンジ領域は、タンパク質の残り部分に存在する配列相同性、特にキナーゼドメイン（触媒ドメインおよびＡＴＰ結合コンセンサス配列を含む）中で見られる相同性を欠いているからである。したがって、本明細書に記載した化合物などの、いくつかの阻害化合物は、Ａｋｔの１つまたは２つのイソ型に選択的であるだけでなく、弱い阻害物質でもあり、あるいはそのキナーゼドメインがＡｋｔ／ＰＫＢイソ型のキナーゼドメインといくらかの配列相同性を共有している、ＰＫＡおよびＰＫＣなどの他のキナーゼを阻害することができないことが観察される。ＰＫＡおよびＰＫＣは、ＰＨドメインが欠けている。

他の実施形態では、本発明の化合物は、Ａｋｔ１の選択的阻害物質、Ａｋｔ２の選択的阻害物質、およびＡｋｔ１とＡｋｔ２両方の選択的阻害物質の群から選択される。

他の実施形態では、本発明の化合物は、Ａｋｔ１の選択的阻害物質、Ａｋｔ２の選択的阻害物質、Ａｋｔ３の選択的阻害物質、および３つのＡｋｔイソ型の２つの選択的阻害物質の群から選択される。

他の実施形態では、本発明の化合物は、３つすべてのＡｋｔイソ型の選択的阻害物質であるが、改変されてＰＨドメイン、ヒンジ領域、またはＰＨドメインとヒンジ領域の両方が欠失している、１つ、２つまたはすべての、このようなＡｋｔイソ型の阻害物質ではない。

さらに本発明は、薬剤として有効な量の本発明の化合物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、Ａｋｔ活性を阻害する方法を対象とする。

本発明の化合物は、標準的な薬剤の慣習に従って、哺乳動物、好ましくはヒトに、単独で、あるいは好ましくは薬剤として許容される担体、薬剤組成物中の賦形剤または希釈剤と組み合わせて、投与することができる。本発明の化合物は、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下、直腸および局所的投与経路を含めて、経口的または非経口的に投与することができる。

活性成分を含む薬剤組成物は、経口的使用に適した形、たとえば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬質または軟質カプセル、またはシロップまたはエリキシルなどであってよい。経口的使用を目的とする組成物は、薬剤組成物の製造の分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬剤として上質で美味である調製物を与えるために、甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤からなる群から選択される、１つまたは複数の作用物質を含んでよい。錠剤を製造するのに適した無毒の薬剤として許容される賦形剤と混合された活性成分を、錠剤は含む。これらの賦形剤は、たとえば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、顆粒剤および崩壊剤、たとえば微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ、またはアルギン酸、結合剤、たとえば澱粉、ゼラチン、ポリビニル−ピロリドンまたはアカシア、および潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってよい。錠剤はコーティングされていなくてよく、あるいは錠剤を知られている技法によってコーティングして薬剤の不快な味を隠すことができ、あるいは胃腸管中での崩壊および吸収を遅らせ、これによって長期の持続的作用がもたらすことができる。たとえば、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなどの水溶性の味覚封鎖物質、またはエチルセルロース、酢酸酪酸セルロースなどの遅延時間物質を使用することができる。

経口的に使用するための調合物は、活性成分が不活性である固形希釈剤、たとえば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合された硬質ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分がポリエチレングリコールまたは油性媒質、たとえばピーナッツ油、液状パラフィン、またはオリーブ油などの水溶性の担体と混合された軟質ゼラチンカプセルとして存在してもよい。

水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤と混合された、活性物質を含む。このような賦形剤は、懸濁剤、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムである。分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、たとえばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖の脂肪族アルコールの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレン−オキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルの縮合生成物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなど、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分エステルの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい。水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤、たとえばエチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤、および１つまたは複数の甘味剤、スクロース、サッカリンまたはアスパルテームなども含んでよい。

油性懸濁液は、活性成分を植物油、たとえばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油に、あるいは液状パラフィンなどの鉱油に懸濁させることによって調合することができる。油性懸濁液は、増粘剤、たとえばビーズワックス、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含んでよい。前述の甘味剤などの甘味剤、香味剤を加えて、美味である経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、ブチルヒドロキシアニソールまたはα−トコフェロールなどの抗酸化剤を加えることによって保存することができる。

水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末または顆粒に、水を加えることによって、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の防腐剤と混合された、活性成分が与えられる。適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、既に前述したものによって例示される。追加的な賦形剤、たとえば甘味剤、香味剤および着色剤も存在してよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を加えることによって保存することができる。

本発明の薬剤組成物は、水中油型エマルジョンの形であってもよい。油相は植物油、たとえばオリーブ油またはラッカセイ油、または鉱油、たとえば液状パラフィン、またはこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は天然に存在するホスファチド、たとえば大豆レシチン、および脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されたエステルまたは部分エステル、たとえばソルビタンモノオレアート、および前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい。エマルジョンは、甘味剤、香味剤、防腐剤および抗酸化剤も含んでよい。

シロップまたはエリキシルは、甘味剤、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースを用いて調合することができる。このような調合物は、緩和剤、防腐剤、香味剤および着色剤、および抗酸化剤も含んでよい。

薬剤組成物は、滅菌された注射可能な水溶液の形であってよい。使用することができる適切な媒体および溶媒には、水、リンガー溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。

滅菌された注射可能な調製物は、滅菌された注射可能な水中油型マイクロエマルジョンであってもよく、この場合は活性成分が油相中に溶けている。たとえば活性成分を、大豆油とレシチンの混合物中に最初に溶かすことができる。次いで油性溶液を水とグリセロールの混合物中に導入し、これを処理してマイクロエマルジョンを形成させる。

注射可能な溶液またはマイクロエマルジョンは、局所的な大量注射によって患者の血液流中に導入することができる。あるいは、本発明の化合物の一定循環濃度を維持するような方法で、溶液またはマイクロエマルジョンを投与することが、有利である可能性がある。このような一定濃度を維持するためには、連続的な静脈内送達用デバイスを使用することができる。このようなデバイスの一例は、ＤｅｌｔｅｃＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）モデル５４００静脈内用ポンプである。

薬剤組成物は、筋肉内および皮下に投与するために、滅菌された注射可能な水性または油脂性懸濁液の形であってよい。この懸濁液は、前述した適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、知られている技術に従って調合することができる。滅菌された注射可能な調製物は、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒に溶けた滅菌された注射可能な溶液または懸濁液、たとえば１，３−ブタンジオールに溶けた溶液などであってもよい。さらに、滅菌された固定油は、溶媒または懸濁媒質として従来使用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含めた、任意の刺激性のない固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能な物質の調製において用途が見出されている。

式Ａの化合物を、薬剤を直腸に投与するために、座薬の形で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で溶けて薬剤を放出させる適切な非炎症性の賦形剤と、薬剤を混合することによって調製することができる。このような物質にはココアバター、グリセリンゼラチン、硬化植物油、さまざまな分子量のポリエチレングリコールとポリエチレングリコールの脂肪酸エステルの混合物がある。

局所的に使用するために、式Ａの化合物を含む、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などを使用する。（本出願の目的のために、局所的な施用物はうがい薬およびうがい剤を含むものとする。）
本発明の化合物は、適切な鼻腔内用媒体および送達具を局所的に使用することによって鼻腔内用の形で、あるいは当業者によく知られている形の皮膚パッチを使用し経皮的経路によって、投与することができる。経皮的な送達系の形で投与するためには、当然ながら、薬の投与は薬の処方中は断続的ではなく連続的なものであろう。

本明細書で使用するように、「組成物」という語は、特定の成分を特定の量含む生成物、および特定の量の特定の成分の組合せから直接的または間接的に生じる、任意の生成物を包含することを目的とするものである。

本化合物を、治療される状態に対するその特定の有用性に関して選択される、他のよく知られている治療剤と同時に投与することもできる。たとえば、知られている抗癌剤および細胞毒性剤と組み合わせた、本発明の化合物は有用であろう。同様に、神経線維腫症、再狭窄（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）、腎のう胞、デルタ肝炎および関連ウイルスの感染、および真菌感染の治療および予防において有効である作用物質と組み合わせた、本発明の化合物は有用であろう。細胞増殖を開始させる核シグナルの細胞表面の増殖因子受容体と関連があるシグナル経路の一部分の他の阻害物質と組み合わせた、本発明の組成物も有用であろう。したがって、本発明の化合物は、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼのタンパク質基質の拮抗阻害物質、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼの活性のファルネシルピロリン酸の拮抗阻害物質を含めた、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼの阻害物質、および／またはゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼの阻害物質と組み合わせて使用することができる。本発明の組成物を、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼの選択的阻害物質、またはファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼの選択的阻害物質である化合物と、同時に投与することもできる。本発明の組成物を、Ｒａｆアンタゴニスト活性を有する化合物と組み合わせて、投与することもできる。

本発明の化合物を、治療されている状態に対するその特定の有用性に関して選択される、他のよく知られている癌治療剤と同時に投与することもできる。治療剤のこのような組合せに含まれるのは、抗腫瘍薬との組合せである。本発明の組成物および組合せを、放射線療法および手術を含めた、癌および／または腫瘍を治療する他の方法に関して、使用することができることも理解される。

抗腫瘍薬の例には一般に、微小管安定化剤（パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）としても知られる）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）としても知られる）、またはこれらの誘導体など）、アルキル化剤、代謝拮抗剤、エピドフィロトキシン、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害物質、プロカルバジン、ミトキサントロン、白金配位錯体、生物学的応答改変剤および増殖阻害物質、ホルモン／抗ホルモン治療剤、および造血増殖因子がある。

抗腫瘍薬の例示的なクラスには、たとえばアントラサイクリン系薬剤、ビンカ薬剤、マイトマイシン類、ブレオマイシン類、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン類、エポチロン類、ディスコデルモリド、プテリジン系薬剤、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）類およびポドフィロトキシン類がある。これらのクラスの特に有用なメンバーには、たとえばドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポド−フィロトキシン誘導体、たとえばエトポシド、エトポシドホスフェートまたはテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデスチン、ロイロジン、パクリタキセルなどがある。他の有用な抗腫瘍薬には、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、ゲムシチビン（ｇｅｍｃｉｔｉｂｉｎｅ）、イフォサミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキセート、トリメトレキセート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、アラ−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロンおよびインターロイキンがある。

さらに、本発明の組成物は、放射線増感剤としても有用であり得る。たとえば、表面に施されるビームからあるいはわずかな放射性の源を移植することによって送達されるｘ線またはガンマ線を含めた放射線療法は、癌を治療する本化合物と組み合わせて使用してもよい。

一定用量として調合する場合、このような組合せ生成物は、以下に記載した用量範囲内の本発明の組合せ、および他の薬剤として活性がある作用物質を、その承認された用量範囲内で使用する。あるいは本発明の組合せは、複合型の組合せ調合物が不適切であるとき、知られている薬剤として許容される作用物質と共に順次に使用することができる。

参照によって本明細書に組み込んだ、１９９８年４月６日に出願された米国特許第０９／０５５，４８７号に記載されたように、本発明の組成物は、癌を治療するために、インテグリンのアンタゴニストと組み合わせても有用であり得る。

本明細書で使用するように、インテグリンのアンタゴニストという語は、血管形成の調節、腫瘍細胞の増殖および侵襲と関連がある、インテグリンの生理的リガンドの結合を選択的に相殺、阻害、すなわち打ち消す化合物のことを指す。特にこの語は、αｖβ３インテグリンの生理的リガンドの結合を選択的に相殺、阻害、すなわち打ち消す、αｖβ５インテグリンの生理的リガンドの結合を選択的に相殺、阻害、すなわち打ち消す、αｖβ３インテグリンとαｖβ５インテグリンの両方の生理的リガンドの結合を相殺、阻害、すなわち打ち消す、あるいは毛細血管の内皮細胞で発現される特定のインテグリンの活性を相殺、阻害、すなわち打ち消す化合物のことを指す。この語は、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１およびα６β４インテグリンのアンタゴニストのことも指す。この語は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１およびα６β４インテグリンの任意の組合せのアンタゴニストのことも指す。本発明の化合物は、アンギオスタチンおよびエンンドスタチンだけには限られないがこれらを含めた、血管形成を阻害する他の作用物質と共に有用である可能性があり、これによって腫瘍細胞の増殖および侵襲を阻害する。

本発明の組成物がヒト被験者に投与されるとき、１日の用量は通常は処方する医師によって決定され、一般にその用量は個々の患者の年齢、体重、応答性、および患者の症状の重度に応じて変わる。

１つの例示的な適用例では、適量である１つまたは２つのＡｋｔ／ＰＫＢイソ型の阻害物質を、癌の治療を受ける哺乳動物に投与する。１日当たり約０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜約６０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／体重１ｋｇ〜約４０ｍｇ／体重１ｋｇの量の、阻害物質を投与する。本発明の組成物を含む具体的な治療用量は、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇの、１つまたは２つのＡｋｔ／ＰＫＢイソ型の阻害物質を含む。この用量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの、１つまたは２つのＡｋｔ／ＰＫＢイソ型の阻害物質を含むことが好ましい。

示した特許、公開および係属特許出願はすべて、参照によってここに組み込んである。

化学的性質の記載、および以下の実施例において使用する略語は、以下の通りである：
Ａｃ２Ｏ無水酢酸；
Ｂｏｃｔ−ブトキシカルボニル；
ＤＢＵ１，８−ジアザバイシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エン；
ＨＲＰセイヨウワサビペルオキシダーゼ；
ＮＦＤＭ無脂肪乾燥乳
文献中で知ることができ、あるいは実験手順において例示することができる、本発明の化合物を生成させるために使用する反応、さらにエステル加水分解、保護基の開裂などの他の標準的な操作をスキーム１に示す。スキーム中に示す置換基ＲおよびＲ^ａは、置換基Ｒ^１およびＲ^２を表す。しかしながら、それらの環への結合場所は単なる例示的なものであり、制限を意味するものではない。

これらの反応を連続的な順序で実施して本発明の化合物を与えることができ、あるいはこれらの反応を使用して、スキーム中に記載したアルキル化反応によって後に結合する断片を合成することができる。

スキーム１の概要：
必要な中間体が市販されている場合もあり、あるいは文献の手順に従ってこれらを調製することができる。スキーム１に示すように、適切に置換されたフェニルアセチリドをヨウ化銅と反応させて、対応する銅アセチリドＩを形成することができる。次いで中間体Ｉを適切に置換された求電子性フェニル成分と反応させて、非対称に置換されたジフェニルアセチレンＩＩを得ることができる。ＮＢＳとの反応、次に加水分解によって、置換ベンジルＩＩＩが得られ、次いでこれを１，２−フェニルジアミンに結合させて、本発明の化合物を得る。さまざまな置換および非置換ベンジルは、商業的に得ることもできる。

（実施例）
与えられた実施例は、本発明のさらなる理解を助長することを目的とする。使用した個々の物質、種および条件は、本発明をさらに例示することを目的とするものであり、その妥当な範囲を制限することを目的とするものではない。

２−［４−（２−アミノプロプ−２−イル）フェニル］−３−フェニルキノキサリン（化合物１）の調製

ステップ１：エチル４−ヨード安息香酸の調製
２１．０ｇの４−ヨード安息香酸、１００ｍｌの無水ＥｔＯＨ、および６ｍｌの濃硫酸の混合物を、攪拌しながら６日間還流させた。この時間の終わりに、沸騰によって反応混合物を濃縮し、さらに４ｍｌの濃硫酸を加えた。次いで混合物をさらに１１日間還流させ、その後混合物を冷却し、５０ｇの氷および１５０ｍｌのＥｔ_２Ｏを加えた。相を分離させ、水性層をＥｔ_２Ｏを用いて抽出した。一体にした有機相を水、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、さらに水で洗浄した。次いで有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空下で濃縮して、透明で茶色がかった液体として表題の化合物を得た。

ステップ２：α，α−ジメチル−４−ヨードベンジルアルコールの調製
２．７６ｇのエチル４−ヨード安息香酸（ステップ１に記載したように調製したもの）を、１０ｍｌの無水Ｅｔ_２Ｏに溶かした冷却（氷／Ｈ_２Ｏ）溶液に、２６．５ｍｌの１．５２ＭＣＨ_３ＭｇＢｒ／Ｅｔ_２Ｏ溶液を５分間かけて加えた。混合物を氷浴温度で２．５時間攪拌し、次いで６ｍｌのＨ_２Ｏをゆっくりと加えることによって急冷した。反応混合物を濾過し、固形残留物をエーテルですすいだ。一体にした濾過物をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空下で濃縮して、透明で黄色がかった液体として表題の化合物を得た。

ステップ３：α，α−ジメチル−４−ヨード−Ｎ−ホルムアミド−ベンジルアミンの調製
１９ｍｌの氷酢酸を、スラリーが形成されるまで氷浴中で冷却した。４．１８ｇのシアン化ナトリウムを３０分間かけて加えた。１０．３ｍｌの濃硫酸を９５ｍｌの氷酢酸に溶かした冷却（氷／Ｈ_２Ｏ）溶液を、シアン化物溶液に１５分間かけて加えた。氷浴を除去し、１９．９２ｇのα，α−ジメチル−４−ヨードベンジルアルコール（ステップ２に記載したように調製したもの）を、１０分間かけて加えた。生成した白い懸濁液を９０分攪拌した。一晩室温で放置した。反応混合物を氷上に注ぎ、水およびエーテルを加えた。この混合物を固体Ｎａ_２ＣＯ_３を用いて中和した。

ステップ４：銅（Ｉ）フェニルアセチリドの調製
１０．７ｇのフェニルアセチレンを５００ｍｌの無水エタノールに溶かした溶液に、２０ｇのヨウ化銅を２５０ｍｌの濃縮ＮＨ_４ＯＨに溶かした溶液および１００ｍｌの水を加えた。溶液を３０分攪拌し、次いで濾過した。回収した固体を水、９５％エタノール水溶液、次いでエーテルで洗浄した。次いで固体を回収し、真空下で乾燥させて、鮮やかな黄色の固体として表題の化合物を得た。

ステップ５：１−［４−（２−ホルムアミドプロプ−２−イル）フェニル］−２−フェニルアセチレンの調製
ステップ３に記載したヨードフェニル化合物１１．８３ｇ、銅（Ｉ）フェニルアセチリド６．７４ｇ、および乾燥ピリジン１６５ｍｌの混合物を、１２０℃で７２時間攪拌した。次いでこの反応混合物を冷却し、混合物を約３００ｇの氷および水上に注ぎ、激しく攪拌した。次いで混合物を１：１ベンゼン：ジエチルエーテルを用いて抽出した。有機溶液を３Ｎ塩酸で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過および濃縮し、ベンゼン／シクロヘキサンから再結晶化させた固体を得て、表題の化合物を得た。

ステップ６：４−（２−ホルムアミドプロプ−２−イル）−ベンジルの調製
ステップ５からの１−［４−（２−ホルムアミドプロプ−２−イル）フェニル］−２−フェニルアセチレン（４．８１ｇ）を、３０ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに溶かした。Ｎ−ブロモスクシンアミド（ＮＢＳ）（５．６５ｇ）を加え、反応混合物を室温で９６時間攪拌した。このときに５００ｍｇのＮＢＳを加え、反応混合物をさらに２４時間攪拌した。次いで反応混合物を水上に注ぎ、水性混合物をベンゼンを用いて抽出した。一体にした有機相を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。次いで有機スラリーを濾過し、真空中で濃縮して表題の化合物を得た。

ステップ７：４−（２−アミノプロプ−２−イル）−ベンジルの調製
ステップ６からの４−（２−ホルムアミドプロプ−２−イル）−ベンジル（６．１７ｇ）を、１００ｍｌの氷酢酸、８４ｍｌの水、および６ｍｌの濃縮ＨＣｌに溶かした。この混合物を還流において３時間攪拌し、次いで真空下において６０℃で溶媒を除去した。残留物を遊離塩基形に転換させ、有機溶媒を用いて抽出し、水で洗浄し、乾燥させ濃縮して、表題の化合物を油として得た。

ステップ８：２−［４−（２−アミノプロプ−２−イル）フェニル］−３−フェニルキナゾリンの調製
ステップ７からの４−（２−アミノプロプ−２−イル）−ベンジル１．０ｇ、ｏ−フェニレンジアミン０．４０６ｇ、氷酢酸２５ｍｌ、水１５ｍｌの混合物を４．５時間還流させた。次いで混合物を、室温で一晩放置した。次いで溶媒の大部分を真空下で除去し、残留物を３０ｍｌの水中に取り出し、５０ｍｌの６ＮＮａＯＨ水溶液を加えた。沈殿したゴムをクロロホルムを用いて抽出した。有機溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空下で濃縮した。

残留物をクロロホルムに再溶解させ、エタノール性ＨＣｌを加え、塩酸塩を沈殿させた。この塩をｉ−ＰｒＯＨから再結晶化させて、表題の化合物を塩酸塩−ｉ−ＰｒＯＨ溶媒和物（薄黄色のプレート）として得た。融点２６９℃〜２７１℃（２５０℃で溶解／再凝固）。

２，３−ビス（４−アミノフェニル）−キノキサリン（化合物２）の調製

ステップ１：メソ（ｄ，ｌ）ヒドロベンゾインの調製
９７．０ｇのベンジルを１リットルの９５％ＥｔＯＨに懸濁させたスラリーに、２０ｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えた。１０分攪拌した後、混合物を１リットルの水で希釈し、混合物を活性炭を用いて処理した。次いで混合物をスーパーセルを介して濾過し、濾過物を加熱し、若干濁るまでさらに２リットルの水で希釈した。次いで混合物を０〜５℃に冷却し、生成した結晶を回収し、冷水で洗浄した。次いで結晶を、真空中で乾燥させた。

ステップ２：４，４’−ジニトロベンジルの調製
１５０ｍｌの発煙硝酸を−１０℃に冷却し、２５ｇのヒドロベンゾイン（ステップ１に記載したように調製したもの）を、温度−１０℃と−５℃の間に保ちながらをゆっくりと少しずつ加えた。反応混合物をさらに２時間０℃に保った。７０ｍｌの水を加え、混合物を３０分間還流させ、次いで５００ｇの砕いた氷上に注いだ。残留物をデカンテーションによって混合物から分離し、次いで残留物を５００ｍｌの水と共に沸騰させた。水層は除去した。

残りのゴムを沸騰アセトン中に溶かし、その溶液を脱色炭素で処理し、濾過した。次いで濾過物を−５℃に冷却し、生成した結晶を回収し、冷たいアセトンで洗浄し、真空中で乾燥させた。結晶性である表題の化合物のさらなる塊を、母液の残留物の再結晶化から得た。

ステップ２：４，４’−ジアミノベンジルの調製
３．８ｇの４，４’−ジニトロベンジルを、ＥｔＯＨ中に溶けた３．８ｇの１０％ルテニウム担持炭素を用いて水素下で還元した。混合物をスーパーセルを介して濾過し、濾過物を真空下で濃縮して乾燥させた。水に５０％変性エタノールを溶かしたものに残留物を溶かし、Ｄａｒｃｏで処理し、濾過した。濾過物を０℃に冷却し、生成した結晶を回収し、水に５０％変性エタノールを溶かしたもので洗浄した。次いで結晶を加熱ランプの下で乾燥させ、黄色い粉末として表題の化合物を得た。

ステップ３：２，３−ビス（４−アミノフェニル）−キノキサリンの調製
１．０ｇ（４．１７ｍｍｏｌｅ）の４，４’−ジアミノベンジルおよび０．４５ｇのｏ−フェニレンジアミンを２５０ｍｌの氷酢酸に溶かした混合物を、５０℃で１５分加熱し、次いで室温で１６時間攪拌した。次いで混合物を８０℃に加熱し、ゆっくりと冷却した。溶媒を真空下で除去し、残留物をエタノールに再溶解させ、真空下で除去した。

固体残留物を沸騰アセトンから再結晶化させ、固体を回収した。母液からの残留物は９５％ＥｔＯＨから再結晶化させ、生成した結晶をアセトン結晶化からの結晶と合わせ、１：１無水ＥｔＯＨ：９５％ＥｔＯＨからすべてを再結晶化させて、結晶性物質を得た。この結晶を真空下において１１０℃で５時間乾燥させて、表題の化合物を得た。

ヒトのＡｋｔイソ型およびΔＰＨ−Ａｋｔ１のクローニング
ｐＳ２ｎｅｏベクター（２００１年４月３日にＡＴＣＣにＡＴＣＣとして寄託された）を、以下のように作製した。ｐＲｍＨＡ３ベクター（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１６：１０４３〜１０６１（１９８８）中に記載されたように作製した）をＢｇＩＩを用いて切断し、２７３４ｂｐの断片を単離した。ｐＵＣｈｓｎｅｏベクター（ＥＭＢＯＪ．４：１６７〜１７１（１９８５）中に記載されたように作製した）もＢｇＩＩを用いて切断し、４０２９ｂｐのバンドを単離した。これら２つの単離断片を１つに連結させて、ｐＳ２ｎｅｏ−１という名のベクターを生成した。このプラスミドは、メタロチオニンプロモーターとアルコールデヒドロゲナーゼポリＡ付加部位の間にポリリンカーを含む。これは、熱ショックプロモーターによって働くｎｅｏ耐性遺伝子も有する。ｐＳ２ｎｅｏ−１ベクターは、Ｐｓｐ５ＩＩおよびＢｓｉＷＩを用いて切断した。２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成し、次いでアニール化した（ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１）およびＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧ（配列番号２））。切断したｐＳ２ｎｅｏ−１とアニール化したオリゴヌクレオチドを１つに連結させて、第２のベクターｐＳ２ｎｅｏを生成した。この転換ではＮｏｔＩ部位を加えて、Ｓ２細胞へのトランスフェクションの前に線状化を促進した。

ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのヒトＡｋｔ１遺伝子を、５’プライマー：
５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＳＴＥＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＧ３’（配列番号３）、および３’プライマー：
５’ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣ３’（配列番号４）を使用して、ＰＣＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって増幅させた。５’プライマーは、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含んでいた。３’プライマーは、クローニング目的でＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を含んでいた。生成したＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片としてｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。発現／精製目的で、中央部Ｔタグを、ＰＣＲプライマー：５’ＧＴＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＧ３’（配列番号５）を使用して、完全長Ａｋｔ１遺伝子の５’端に加えた。生成したＰＣＲ産物は、５’ＫｐｎＩ部位および３’ＢａｍＨＩ部位を含んでおり、これらを使用して、昆虫細胞の発現ベクター、ｐＳ２ｎｅｏを含むビオチンタグとインフレームである断片をサブクローニングした。

Ａｋｔ１のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン欠失型（Δａａ４〜１２９、Ａｋｔ１ヒンジ領域の一部分の欠失を含む）の発現のために、ＰＣＲによる欠失体の突然変異誘発を、完全長Ａｋｔ１遺伝子をｐＳ２ｎｅｏベクター中で鋳型として使用して行った。このＰＣＲは、ＫｐｎＩ部位および中央部Ｔタグを５’端に含む欠失体と５’および３’フランキングプライマーを含む、重複内部プライマー：
（５’ＧＡＡＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣΔＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧ３’（配列番号６）、および
５’ＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣΔＧＴＣＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣ）３’（配列番号７）を使用して２ステップで行った。最終ＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＳｍａＩで消化し、ｐＳ２ｎｅｏ完全長Ａｋｔ１ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ切断ベクターに連結させ、クローンの５’端を欠失型に効果的に置き換えた。

ヒトＡｋｔ３遺伝子を、アミノ末端オリゴプライマー：
５’ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＧ３’（配列番号８）、およびカルボキシ末端オリゴプライマー：
５’ＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＧ３’（配列番号９）を使用して、成体の脳のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲによって増幅させた。これらのプライマーは、クローニング目的で５’ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位および３’ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ部位を含んでいた。生成したＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングした。発現／精製目的で、中央部Ｔタグを、ＰＣＲプライマー：５’ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧ３’（配列番号１０）を使用して、完全長Ａｋｔ３クローンの５’端に加えた。生成したＰＣＲ産物は、昆虫細胞の発現ベクター、ｐＳ２ｎｅｏを含むビオチンタグに関してインフレームクローニングが可能である５’ＫｐｎＩ部位を含んでいた。

ヒト胸腺のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのヒトＡｋｔ２遺伝子を、アミノ末端オリゴプライマー：
５’ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号１１）、およびカルボキシ末端オリゴプライマー：
５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧＧＣ３’（配列番号１２）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。これらのプライマーは、クローニング目的で５’ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ／ＢｇｍＨＩ部位を含んでいた。生成したＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。発現／精製目的で、中央部Ｔタグを、ＰＣＲプライマー：５’ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧ３’（配列番号１３）を使用して、完全長Ａｋｔ２の５’端に加えた。生成したＰＣＲ産物は、前に記載したようにｐＳ２ｎｅｏベクターにサブクローニングした。

ヒトのＡｋｔイソ型およびΔＰＨ−Ａｋｔ１の発現
ｐＳ２ｎｅｏ発現ベクター中の、クローニングしたＡｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３およびΔＰＨ−Ａｋｔ１遺伝子を含むＤＮＡを精製し、これを使用して、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳ２細胞（ＡＴＣＣ）をリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。抗生物質（Ｇ４１８、５００μｇ／ｍｌ）耐性細胞の集まりを選択した。細胞を１．０Ｌ容積（〜７．０×１０^６／ｍｌ）に広げ、ビオチンおよびＣｕＳＯ_４を、それぞれ５０μＭおよび５０ｍＭの最終濃度まで加えた。細胞を２７℃で７２時間増殖させ、遠心分離によって採取した。細胞ペーストを必要とするまで−７０℃で凍結させた。

ヒトのＡｋｔイソ型およびΔＰＨ−Ａｋｔ１の精製
実施例１３に記載した１リットルのＳ２細胞からの細胞ペーストを、５０ｍｌの１％ＣＨＡＰＳを緩衝液Ａ：（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、０．２ｍＭＡＥＢＳＦ、１０μｇ／ｍｌのベンズアミジン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、それぞれアプロチニンおよびペプスタチン、１０％グリセロールおよび１ｍＭＤＴＴ）に溶かしたものを用いて、音波処理によって溶かした。可溶性分画を、９ｍｇ／ｍｌの抗中央Ｔモノクローナル抗体を充填したＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ高速（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で精製し、７５μＭのＥＹＭＰＭＥ（配列番号１４）ペプチドを２５％グリセロールを含む緩衝液Ａに溶かしたものを用いて溶出させた。Ａｋｔ／ＰＫＢ含有分画を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質純度を評価した。精製したタンパク質は、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄプロトコルを使用して定量化した。精製したタンパク質を液体窒素で急速冷凍し、−７０℃で保存した。

キナーゼアッセイ
ここでの手順は、ヒトの組み換え活性Ａｋｔ／ＰＢＫイソ型またはＡｋｔ／ＰＢＫ突然変異体による、ビオチン化ＧＳＫ３由来ペプチドのリン酸化を測定する、キナーゼアッセイを記載するものである。^３３Ｐ標識ビオチン化産物を、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｃｏａｔｅｄＦｌａｓｈｐｌａｔｅｓ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）またはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＭｅｍｂｒａｎｅＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、捕獲および検出することができる。あるいは、２つの追加的なリシン残基を有するＧＳＫ３由来ペプチドを基質として使用し、ＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅＭｅｍｂｒａｎｅＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅｓ（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して後に捕獲した。

物質：
活性のあるヒトＡｋｔ：以下の活性のあるヒトＡｋｔイソ型を、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイで使用した：活性のあるヒトＡｋｔ１（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１４〜２７６、１５μｇ／３７μｌ（６．７６μＭ）から得たもの）または組み換え脂質活性化Ａｋｔ１（実施例５に記載したように調製したもの）、Ａｋｔ２（実施例５に記載したように調製したもの）、Ａｋｔ３（実施例５に記載したように調製したもの）、およびΔＰＨ−Ａｋｔ１（実施例５に記載したように調製したもの）。

Ａｋｔ特異的ペプチド基質：ＧＳＫ３α（Ｓ２１）ペプチド番号３９２８、ビオチン−ＣＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ（配列番号１５）、ＦＷ＝１５１７．８（ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓから得たもの）、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｌａｓｈｐｌａｔｅまたはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅ検出用。

ＧＳＫ３α（Ｓ２１）ペプチド番号Ｇ８０６１３、ＫＫＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ（配列番号１４）、ＦＷ＝１５４７．８（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓから得たもの）、Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｆｉｌｔｅｒｐｌａｔｅ検出用。

標準アッセイ溶液：
Ａ．１０×アッセイ緩衝液：５００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５
１％ＰＥＧ
１ｍＭＥＤＴＡ
１ｍＭＥＧＴＡ
２０ｍＭ β−グリセロールリン酸
Ｂ．活性Ａｋｔ（５００ｎＭ）：希釈液（１×アッセイ緩衝液、１０％グリセロール、０．１％β−メルカプトエタノール、１．０μＭミクロシスチンＬＲおよび１．０ｍＭのＥＤＴＡ）を、３７μｌの活性のあるＡｋｔイソ型（６．７６μＭ）を含むバイアルに加えた。各分量を液体窒素中で急速冷凍し、−７０℃で保存した。
Ｃ．１ｍＭのＡｋｔ特異的ペプチド基質を５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１ｍＭＤＴＴに溶かしたもの。
Ｄ．１００ｍＭＤＴＴを脱イオン水に溶かしたもの。
Ｅ．１００×ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ（ＰＩＣ）：１ｍｇ／ｍｌのベンズアミジン、０．５ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、０．５ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５ｍｇ／ｍｌのアプロチニン。
Ｆ．３ｍＭＡＴＰ、２００ｍＭＭｇＣｌ_２をＨ_２Ｏに溶かしたもの、ｐＨ７．９。
Ｇ．５０％（ｖ／ｖ）グリセロール。
Ｈ．１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水に溶かしたもの、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３。
Ｉ．１２５ｍＭＥＤＴＡ。
Ｊ．０．７５％（ｗｔ／ｖ）リン酸。
Ｋ．２．５Ｍ塩化カリウム
Ｌ．ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）、２５ｍＭＴｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（ＢｕｐＨＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅＰａｃｋ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２８３７６）。

ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｌａｓｈＰｌａｔｅアッセイに関する手順：
ステップ１：
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶かした溶液１μｌを、２０μｌの２×基質溶液（２０ｕＭＧＳＫ３ペプチド、３００μＭＡＴＰ、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０μＣｉ／ｍｌ［γ^３３Ｐ］ＡＴＰ、１×アッセイ緩衝液、５％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ、１×ＰＩＣ、０．１％ＢＳＡおよび１００ｍＭＫＣｌ）に加えた。１９μｌの２×酵素溶液（６．４ｎＭ活性Ａｋｔ／ＰＫＢ、１×アッセイ緩衝液、５％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ、１×ＰＩＣおよび０．１％ＢＳＡ）を加えることによって、リン酸化反応を開始させた。次いで反応混合物を、室温で４５分間培養した。

ステップ２：
１２５ｍＭのＥＤＴＡ１７０μｌを加えることによって、反応を停止させた。停止させた反応の混合物２００μｌを、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｌａｓｈｐｌａｔｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＭＰ１０３）に移した。このプレートを、プレート攪拌器上で１０分以上室温で培養した。それぞれのウェルの中味を吸引し、ウェル当たり２００μｌのＴＢＳで２回ウェルをすすいだ。次いでウェル当たり２００μｌのＴＢＳで５分間、３回ウェルを洗浄し、洗浄ステップ中プラットフォーム型の攪拌器上で、プレートを室温で培養した。

プレートを密封テープで覆い、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して適切な設定で、Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ中の［^３３Ｐ］の数を計数した。

ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅアッセイに関する手順：
ステップ１：
前述のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｌａｓｈＰｌａｔｅアッセイのステップ１に記載した酵素反応を行った。

ステップ２：
２０μｌの７．５Ｍ塩酸グアニジンを加えることによって、反応を停止させた。停止させた反応の混合物５０μｌを、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｆｉｌｔｅｒｐｌａｔｅ（ＳＡＭ^２（商標）ＢｉｏｔｉｎＣａｐｔｕｅｒＰｌａｔｅＰｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ７５４２）に移し、真空をかける前に反応混合物を、フィルター上で１〜２分間培養した。

次いでプレートを、真空マニホルドを使用して以下のように洗浄した：１）４×２００μｌ／ウェルの２ＭＮａＣｌ、２）６×２００μｌ／ウェルの２ＭＮａＣｌ、および１％Ｈ_３ＰＯ_４、３）２×２００μｌ／ウェルの脱イオン水、および４）２×１００μｌ／ウェルの９５％エタノール。次いでシンチラントを加える前に、膜を完全に空気乾燥させた。

プレートの底部を白いバッキングテープで密封し、３０μｌ／ウェルのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０（ＰａｃｋａｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号６０１３６２１）を加えた。プレートの上部を透明な密封テープで密封し、次いでプレートを、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して適切な設定で、液体シンチラントを用いて［^３３Ｐ］を計数した。

ＰｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅＦｉｌｔｅｒＰｌａｔｅアッセイに関する手順：
ステップ１：
ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＦｌａｓｈＰｌａｔｅアッセイ（前述）のステップ１に記載したように、ビオチン−ＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧの代わりにＫＫＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ（配列番号１６）を基質として使用して、酵素反応を行った。

ステップ２：
２０μｌの０．７５％Ｈ_３ＰＯ_４を加えることによって、反応を停止させた。停止させた反応の混合物５０μｌを、フィルタープレート（ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ（商標）、ＷｈａｔｍａｎＰ８１ＳｔｒｏｎｇＣａｔｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅｒ、ＷｈｉｔｅＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ９６ＷｅｌｌＰｌａｔｅｓ、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ、カタログ番号７７００〜３３１２）に移し、真空をかける前に反応混合物を、フィルター上で１〜２分間培養した。

次いでプレートを、真空マニホルドを使用して以下のように洗浄した：１）９×２００μｌ／ウェルの０．７５％Ｈ_３ＰＯ_４、および２）２×２００μｌ／ウェルの脱イオン水。プレートの底部を白いバッキングテープで密封し、３０μｌ／ウェルのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０を加えた。プレートの上部を透明な密封テープで密封し、プレートをＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して適切な設定で、液体シンチラントを用いて［^３３Ｐ］を計数した。

ＰＫＡアッセイ
それぞれ個々のＰＫＡアッセイは、以下の成分からなる：
１）５×ＰＫＡアッセイ緩衝液（２００ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１００ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＥＤＴＡ）１０μｌ
２）水に希釈したＫｅｍｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）の５０μＭストック１０μｌ
３）^３３Ｐ−ＡＴＰ（１．０μｌの^３３Ｐ−ＡＴＰ［１０ｍＣｉ／ｍｌ］を非標識ＡＴＰの５０μＭストック２００μｌに希釈することによって調製したもの）１０μｌ
４）適切な溶媒調節用希釈液または阻害物質希釈液１０μｌ
５）０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに希釈したＰＫＡ触媒サブユニット（ＵＢＩカタログ番号１４〜１１４）の７０ｎＭストック１０μｌ
最終アッセイ濃度はＴｒｉｓｐＨ７．５は４０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２は２０ｍＭ、２−メルカプトエタノールは１ｍＭ、ＥＤＴＡは０．１ｍＭ、Ｋｅｍｐｔｉｄｅは１０μＭ、^３３Ｐ−ＡＴＰは１０μＭ、ＰＫＡは１４ｎＭ、およびＢＳＡは０．１ｍｇ／ｍｌであった。

９６ディープウェルのアッセイプレートにおいてアッセイを組み立てた。成分番号３および番号４を予め混合させ、別のチューブ中で、成分番号１、番号２、および番号５を等量含む混合物を調製した。成分番号１、番号２、および番号５の混合物３０μｌを、^３３Ｐ−ＡＴＰおよび阻害物質を含むウェルに加えることによって、アッセイ反応を開始させた。アッセイウェル中の液体を混合させ、アッセイの反応混合物を室温で２０分間培養した。５０μｌの１００ｍＭＥＤＴＡおよび１００ｍＭピロリン酸ナトリウムを加え、混合することによって、反応を停止させた。

酵素反応の生成物（リン酸化Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）を、ｐ８１リン酸セルロース９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して定量化した。ｐ８１フィルタープレートのそれぞれのウェルに、７５ｍＭのリン酸を充填した。ウェルを吸引し、７５ｍＭのリン酸１７０μｌをそれぞれのウェルに加えた。停止させたＰＫＡ反応の混合物それぞれからの、３０〜４０μｌのアリコートを、リン酸を含むフィルタープレート上の対応するウェルに加えた。ペプチドをフィルター上で捕え、その後真空をかけた。ウェルに７５ｍＭのリン酸を充填し、その後吸引することによって、フィルターを５回洗浄した。最後の洗浄の後に、フィルターを空気乾燥させた。３０μｌのシンチレーション流体をそれぞれのウェルに加え、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）上でフィルターを計数した。

ＰＫＣアッセイ
それぞれのＰＫＣアッセイは、以下の成分からなる：
１）１０×ＰＫＣ同時活性緩衝液（２．５ｍＭＥＧＴＡ、４ｍＭＣａＣｌ_２）５μｌ
２）５×ＰＫＣ活性緩衝液（１．６ｍｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、０．１６ｍｇ／ｍｌのジアシルグリセロール、１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５０ｍＭＭｇＣｌ、５ｍＭ２−メルカプトエタノール）１０μｌ
３）^３３Ｐ−ＡＴＰ（１．０μｌの^３３Ｐ−ＡＴＰ［１０ｍＣｉ／ｍｌ］を非標識ＡＴＰの１００μＭストック１００μｌに希釈することによって調製したもの）５μｌ
４）水に希釈したミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、ＵＢＩ）の３５０μｇ／ｍｌのストック１０μｌ
５）適切な溶媒調節用希釈液または阻害物質希釈液１０μｌ
６）０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡに希釈したＰＫＣの５０ｎｇ／ｍｌのストック（ＵＢＩカタログ番号１４〜１１５からのイソ型の混合物）１０μｌ
最終アッセイ濃度は以下の通り：ＥＧＴＡは０．２５ｍＭ、ＣａＣｌは０．４ｍＭ、ＴｒｉｓｐＨ７．５は２０ｍＭ、ＭｇＣｌは１０ｍＭ、２−メルカプトエタノールは１ｍＭ、ホスファチジルセリンは０．３２ｍｇ／ｍｌ、ジアシルグリセロールは０．０３２ｍｇ／ｍｌ、３３Ｐ−ＡＴＰは１０μＭ、ＭＢＰは７０μｇ／ｍｌ、ＰＫＣは１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＳＡは０．１ｍｇ／ｍｌであった。

９６ディープウェルのアッセイプレートにおいてアッセイを行った。それぞれのアッセイウェルにおいて、１０μｌの溶媒調節用希釈液または適切な阻害物質希釈液と、５μｌの^３３Ｐ−ＡＴＰ（成分番号５および番号３）を予め混合させた。別のチューブ中で、成分番号１、番号２、番号４および番号６を等量含む混合物を調製した。成分番号１、番号２、番号４および番号６の混合物３５μｌを、^３３Ｐ−ＡＴＰおよび阻害物質を含むウェルに加えることによって、アッセイ反応を開始させた。アッセイウェル中の液体を完全に混合させ、アッセイの反応混合物を室温で２０分間培養した。１００ｍＭＥＤＴＡ（５０μｌ）および１００ｍＭピロリン酸ナトリウム（５０μｌ）を加え、混合することによって、反応を停止させた。９６ウェルのフィルタープレート中のＰＶＤＦ膜上のリン酸化したＭＢＰを回収し、シンチレーション計数によって定量化した。

前に記載したアッセイにおける、実施例１〜１１に記載した化合物の試験からの結果を、表１に示す：

Ａｋｔ／ＰＫＢの阻害を判定するための細胞系アッセイ
細胞（たとえば活性化Ａｋｔ／ＰＫＢを含むＬｎＣａＰまたはＰＴＥＮ^{（−／−）}腫瘍細胞株）を、１００ｍＭの皿中で平板培養した。細胞が約７０〜８０％融合したとき、細胞に５ｍｌの新鮮な培地を再度与え、試験化合物を溶液に加えた。対照は未処理細胞、賦形剤処理細胞、およびそれぞれ２０μＭまたは２００ｎＭのＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ）またはウォルトマニン（Ｓｉｇｍａ）で処理した細胞を含んでいた。細胞を２時間培養し、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、破壊し遠心管に移した。細胞をペレット状にし、ＰＢＳで再度洗浄した。最後に、細胞ペレットを、溶解用緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、１４０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ β−グリセロールリン酸、１０ｍＭＮａＦ、０．５ｍｍＮａＶＯ_４、１μＭミクロシスチン、および１×ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ）に再懸濁させ、１５分間氷上に置き、おだやかに攪拌して細胞を溶かした。溶解物をＢｅｃｋｍａｎｔａｂｌｅｔｏｐ超遠心分離機において、１００，０００×ｇで４℃において２０分間回転させた。上澄みタンパク質は、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄプロトコル（ＢｉｏＲａｄ）によって定量化し、必要となるまで−７０℃で保存した。

タンパク質は、透明な溶解物から以下のように免疫沈降（ＩＰ）させた：Ａｋｔ１／ＰＫＢαに関しては、溶解物をＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−７１２６（Ｄ−１７）をＮＥＴＮ（１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０）に溶かしたものと混合させ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／ＧＡｇａｒｏｓｅ（ＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−２００３）を加えた。Ａｋｔ２／ＰＫＢβに関しては、溶解物をＮＥＴＮ中で抗Ａｋｔ−２アガロース（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｋｏｇｙ番号１６−１７４）と混合させ、Ａｋｔ３／ＰＫＢγに関しては、溶解物をＮＥＴＮ中で抗Ａｋｔ−３アガロース（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｋｏｇｙ番号１６−１７５）と混合させた。免疫沈降物を４℃で一晩培養し、洗浄しＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。

ウエスタンブロットを使用して、特異的抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：Ａｎｔｉ−ＴｏｔａｌＡｋｔ（カタログ番号９２７２）、Ａｎｔｉ−ＰｈｏｐｈｏＡｋｔＳｅｒｉｎｅ４７３（カタログ番号９２７１）、およびＡｎｔｉ−ＰｈｏｓｐｈｏＡｋｔＴｈｒｅｏｎｉｎｅ３０８（カタログ番号９２７５）を使用し、Ａｋｔ、ｐＴｈｒ３０８Ａｋｔ、ｐＳｅｒ４７３Ａｋｔ、およびＡｋｔの下流標的すべてを分析した。ＰＢＳ＋０．５％無脂肪乾燥乳（ＮＦＤＭ）中に希釈した適切な一次抗体と共に、４℃で一晩培養した後、ブロットを洗浄し、ＰＢＳ＋０．５％ＮＦＤＭ中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体と共に、室温で１時間培養した。タンパク質はＥＣＬＲｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＲＰＮ２１３４）を用いて検出した。

ヘレグリン刺激型のＡｋｔ活性化
ＭＣＦ７細胞（ＰＴＥＮ^{（＋／＋）}であるヒト乳癌系）を、１００ｍＭプレート当たり細胞１×１０^６個で平板培養した。細胞が約７０〜８０％融合したとき、細胞に５ｍｌの血清を含まない培地を再度与え、一晩培養した。翌朝、化合物を加え、細胞を１〜２時間培養し、３０分かけてヘレグリンを加え（Ａｋｔの活性化を誘導するために）、前に記載したように細胞を分析した。

腫瘍増殖の阻害
癌細胞の増殖の阻害物質としてのｉｎｖｉｖｏでの有効性は、当分野でよく知られているいくつかのプロトコルによって確認することができる。

ＰＩ３Ｋ経路（ＬｎＣａＰ、ＰＣ３、Ｃ３３ａ、ＯＶＣＡＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８など）の自由化を示すヒト腫瘍細胞株を、８〜１２週齢のメスのヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の左脇腹に第０日に皮下注射する。マウスを賦形剤、化合物または組合せ処理したグループにランダムに割り当てる。毎日の皮下投与は第１日に開始し、実験の期間中続ける。あるいは、阻害物質、試験化合物は連続注入ポンプによって投与することができる。化合物、化合物の組合せまたは賦形剤は、合計容量０．１ｍｌで送達させる。賦形剤処理した動物すべてが直径０．５〜１．０ｃｍの病巣を示すとき、典型的には細胞を注射した４〜５．５週間後に、腫瘍を切除し重量を量る。それぞれの細胞株に関して、それぞれの処理グループの腫瘍の平均重量を計算する。

配列表

Claims

式Ａ：

［上式中、Ｒ^１は、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜 ₄アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜 ₄アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを独立に表し、
Ｒ^２は水素、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜 ₄アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜 ₄アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを独立に表し、
ｒは１〜３であり、
ｓは１〜３である。］
の化合物または薬剤として許容されるその塩、もしくはその立体異性体。
式Ａ−Ｉ：

［上式中、Ｒ^１は、アミノ−Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜 ₄アルキルアミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルまたはジ（Ｃ_１〜 ₄アルキル）アミノ−（Ｃ_１〜６）アルキルを独立に表す。］
の化合物または薬剤として許容されるその塩である、請求項１に記載の化合物。
２−［４−（２−アミノプロプ−２−イル）フェニル］−３−フェニルキノキサリン

である、請求項１に記載の化合物または薬剤として許容されるその塩。
薬剤担体と、該薬剤担体中に分散している治療上有効量の請求項１に記載の化合物と、を含む薬剤組成物。
薬剤担体と、該薬剤担体中に分散している治療上有効量の請求項３に記載の化合物と、を含む薬剤組成物。
哺乳動物においてＡｋｔの１つ以上のイソ型を選択的に阻害するための、請求項４に記載の薬剤組成物。
哺乳動物においてＡｋｔの１つ以上のイソ型を選択的に阻害するための、請求項５に記載の薬剤組成物。
哺乳動物において癌を治療するための、請求項４に記載の薬剤組成物。
哺乳動物において癌を治療するための、請求項５に記載の薬剤組成物。
請求項１に記載の化合物と薬剤として許容される担体とを組み合わせることによって作製された、薬剤組成物。
請求項１に記載の化合物と薬剤として許容される担体とを組み合わせることを含む、薬剤組成物を作製するための方法。