JP4357738B2 - システインリッチなレセプターであるｔｒａｉｎ - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、ＴＮＦファミリーにおける新規のレセプターに関する。新規のレセプターが同定された。本明細書において、これをＴＲＡＩＮという。
【０００２】
ＴＮＦレセプターファミリーは、リガンドとその特異的なレセプターとの対からなり、これらはＴＮＦファミリーリガンドおよびＴＮＦファミリーレセプターという（ＢａｚｚｏｎｉおよびＢｅｕｔｌｅｒ、１９９６）。このファミリーは、免疫系およびおそらく他の非免疫系の調節に関与する。この調節はしばしば、ＴＮＦファミリーシグナル伝達が、ＴＮＦによって最もよく類型化された多数の下流の事象をもたらし得るような「マスタースイッチ」のレベルにある。ＴＮＦは、外来侵襲に対する生物の一般的な防御的炎症性反応を開始し得、これは細胞輸送に関する接着分子の表示の変化、特定のコンパートメントへ特定の細胞を移行させるためのケモカイン産生、および種々のエフェクター細胞のプライミングを含む。それだけで、これらの経路の調節は臨床的な可能性を有する。
【０００３】
ＴＮＦレセプターファミリーは、通常、細胞外ドメイン、膜通過型ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインからなる、関連するタンパク質の集合である。この細胞外ドメインは２〜６コピーの固くジスルフィド結合したドメインから形成され、そしてシステイン残基の独特な配置に基づいて認識される。各々のレセプターは、対応するリガンドに結合するが、一つのリガンドがいくつかのレセプターを共有し得る。いくつかの場合には、代替的ＲＮＡスプライシングによって、膜貫通領域および細胞内ドメインを欠くレセプターの可溶型が天然に存在することは明白である。さらに、天然には、これらのレセプターの短縮型が存在し、そして可溶性阻害性形態が、直接的で、生物学的な調節的な役割を有し得る。明らかに、ウイルスは、その宿主生物においてＴＮＦ活性を阻害するためのこのような戦略を用いてきた（Ｓｍｉｔｈ、１９９４）。これらのレセプターは、細胞分化、細胞死および細胞生存シグナルを含む、多数の事象をシグナル伝達し得る。細胞死のシグナル伝達はしばしばプロテアーゼのカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）カスケード（例えばＦａｓレセプターあるいはＴＮＦレセプター）への比較的直接的な連結を介して誘発される。このクラスのほとんどのレセプターはまた、ＮＦＫＢ制御の事象も活性化し得る。
【０００４】
レセプターのＴＮＦファミリーにおいて新生の主題は、シグナルを伝達する細胞内ドメインを伴う完全長レセプター、および分泌されるかまたは細胞内シグナル伝達を欠くかのいずれかである代替形態の両方の性質による使用である。これらの後者の形態は、リガンドシグナル伝達を阻害し得、これゆえに生物学的応答を減弱し得る。この現象にはいくつかの例がある。まず、ＴＮＦレセプターｐ７５は、膜からの選択的切断後に容易に分泌され、次いで、ＴＮＦの活動をブロックするように働く。この系がＴＮＦ活性を緩衝するように自然に発達して来たようである。第二の例は、ＴＲＡＩＬレセプター（１−３）をコードする４つの別々の遺伝子が存在するＴＲＩＡＬ−ＴＲＡＩＬレセプター系によって提供される。これらのＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の２つは、細胞内ドメインを有し、そしてシグナルを伝達する。第三のレセプター（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）は細胞内ドメインを有するが、このドメインはＲ１およびＲ２にみられる要素すべては有さない。例えば、このドメインは、細胞死シグナルを伝達し得るドメインを欠く。最後に、第四のレセプターＴＲＡＩＬ−Ｒ３がある。これは実質的に可溶型であるが、糖脂質結合によって結合されたままである。これゆえに、このレセプターはリガンドに結合し得るが、シグナルを伝達し得ない。すなわち、これは実質的にはデコイのレセプターである。第三の例はオステオプロテジェリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（ＯＰＧ）系によって提供される。ここで、ＯＰＧレセプターは膜貫通ドメインを欠き、そして培地中に分泌される（４−６）。このレセプターは、おそらく、ＲＡＮＫ−Ｌと称されるリガンドに結合することによって破骨細胞分化を誘発するに必要なシグナル伝達をブロックし得る。ここで記載したＴＲＡＩＮ系は、簡易版が分泌され得るという点でＯＰＧパラダイムに似ている。この簡易版は、天然のＴＲＡＩＮ−Ｌ（現在未知）の完全長ＴＲＡＩＮへの結合を阻害し、そしてシグナルを誘発する。
【０００５】
このレセプターは、免疫グロブリン融合タンパク質への容易な変換を介した生物学的経路を解明するための強力なツールである。これらの２量体の可溶性レセプター形態は、分泌型リガンドまたは表面結合型リガンドのいずれかによって媒介される事象の良好なインヒビターである。これらのリガンドへの結合により、これらは、そのリガンドがシグナルを伝達し得る細胞関連レセプターと相互作用することを妨害する。これらのレセプター−Ｉｇ融合タンパク質は、実験上の意味で有用なだけでなく、これらは、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇの場合、ＯＫＴ３投与を伴って、炎症性腸疾患、リウマチ性動脈炎および急性の臨床症候群を処置するのに首尾良く用いられてきた（Ｅａｓｏｎら，１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎら，ｖａｎ Ｄｕｌｌｅｍｅｎら，１９９５）。ＴＮＦファミリーレセプターを介するシグナル伝達によって媒介される多くの事象の操作が、免疫を背景とした疾患および免疫系の関与に起因する病理的後遺症を有する広い範囲のヒトの疾患の処置において広範な適用を有することが予測され得る。最近記載されたレセプターの可溶性の形態であるオステオプロテジェリンは、骨量減少を防止し得る。それゆえ、ＴＮＦファミリーレセプターシグナル伝達により制御される事象のコントロールは必ずしも免疫系の調節に限定されない。このレセプターに対する抗体は、リガンド結合をブロックし得る。それゆえに、この抗体はまた、臨床適用を有し得る。このような抗体はしばしば、非常に長期間作用性であり、そして血中半減期が短い可溶性レセプターＩｇ融合タンパク質より優れた点を有し得る。
【０００６】
レセプター介在性経路の阻害は、これらのレセプターの最も利用される治療適用を示すが、元来は、これは臨床上見込みを示したＴＮＦレセプターの活性化であった（Ａｇｇａｒｗａｌ およびＮａｔａｒａｊａｎ、１９９６）。ＴＮＦレセプターの活性化は標的細胞において細胞死を誘発し得る。これゆえに、腫瘍への適用は魅力的であった。そして、今も魅力的である（Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら，１９９６）。このレセプターは、そのリガンド（すなわち天然の経路）またはレセプターを架橋し得るいくつかの抗体（これは強力なアゴニストでもある）のいずれかの投与により活性化され得る。抗体は腫瘍学において利点がある。なぜなら、抗体は、血中で長期間存在し得るがそのリガンドは通常、血中での寿命が短いからである。ため腫瘍学において抗体は利点がある。これらのレセプターの多くは、腫瘍においてより選択的に発現されるか、または、これらは腫瘍において細胞死、もしくは腫瘍分化のみをシグナル伝達し得るので、アゴニスト抗体は癌の処置において良好な武器であり得る。同様に多くの陽性の免疫学的事象がＴＮＦファミリーレセプターにおいて媒介される（例えば、宿主炎症反応、抗体産生など）。それゆえに、アゴニスト性抗体は、他の非腫瘍学的適用において有益な効果を有し得る。
【０００７】
逆説的に、腫瘍の処置において、経路の阻害は臨床的な利点を有し得る。例えば、Ｆａｓリガンドはいくつかの腫瘍により発現され、そしてこの発現はＦａｓ陽性リンパ球の死をもたらし得、これによって腫瘍が免疫系から逃れる能力を容易にする。このような場合では、Ｆａｓ系の阻害において、免疫系がいまや利用が可能である他の方法において腫瘍と反応することを可能にし得る（Ｇｒｅｅｎ および Ｗａｒｅ、１９９７）。
【０００８】
このレセプターはまた、対応するリガンドを発見するのにも有用である。なぜなら、このレセプターは、発現クローニング技術におけるそのリガンドのプローブとしても役立ち得るからである（Ｓｍｉｔｈら、１９９３）。同様に、レセプターおよびリガンドは、インビトロ結合アッセイを形成し得、これは阻害物質の同定を可能にする。このような物質は、その経路の新規のインヒビターの基礎を形成し得る。
【０００９】
（Ａ．定義）
本明細書において使用される「相同の」とは、比較される分子の配列の間の配列相同性をいう。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められる場合（例えば、もし２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められる場合、その分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列に共有された合致もしくは相同な位置の数を、比較した位置の数で割り、１００倍した関数である。例えば、２つの配列において１０の位置の６が合致、または相同である場合、その２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有する。一般的に、比較は、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列されるときになされる。
【００１０】
本明細書で使用されるポリペプチドの「精製調製物」あるいは「実質的に純粋な調製物」とは、天然に存在する、他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくはそのポリペプチドはまた、そのポリペプチドを精製するために用いられる他の物質（例えば、抗体、マトリクスなど）、と分離されている。
【００１１】
本明細書において使用される「形質転換された宿主」とは、そのゲノムまたは宿主所有の配列（すなわち、エピソームエレメントをコードするレセプター）に導入された、安定に組み込まれた配列（すなわち、ＴＲＡＩＮ配列）を伴う任意の宿主も包含することを意味する。
【００１２】
本明細書において使用される「処置」とは、あらゆる治療処置を含む（例えば、治療剤あるいは治療物質（例えば、薬物）の投与）。
【００１３】
「実質的に純粋な核酸」（例えば、実質的に純粋なＤＮＡ）とは、以下の一方または両方の核酸である：（１）その核酸が由来する生物の、天然に存在するゲノムにおいて直接連続する（すなわち、一方が５’末端でそして一方が３’末端）配列（例えば、コード配列）の一方またはその両方と直接は連続しない；あるいは（２）その核酸が由来する生物において、存在する核酸に伴う核酸配列を実質的に含有しないもの。この用語には、例えば、ベクター（例えば、自己複製プラスミドまたはウイルス）に組み込まれたか、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他のＤＮＡに非依存性の別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されたｃＤＮＡ、またはゲノム遺伝子ＤＮＡフラグメント）が包含される。実質的に純粋なＤＮＡはまた、ＴＲＡＩＮをコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡを含む。
【００１４】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に使用され得る。
【００１５】
本明細書で用いる「生物学的に活性な」とは、インビボあるいはインビトロ活性を有することを意味し、これは直接的あるいは間接的に実行され得る。ＴＲＡＩＮの生物学的に活性なフラグメントは、例えば、レセプターの活性部位と７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有し得る。本明細書においてレセプターに関する同一性または相同性は、配列番号３におけるＴＲＡＩＮ残基と同一である候補配列中において、アミノ酸残基の一致するパーセンテージと規定する。
【００１６】
本発明の実施は、他に言及しない限り、細胞生物学、組織培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような技術は、文献に記載されている。
【００１７】
請求される本発明は、ＴＲＡＩＮ−Ｒと称する新規なレセプターに関する。このマウスＴＲＡＩＮ−Ｒのアミノ酸配列は、配列番号１（短型）および配列番号２（長型）に示される。ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの完全長アミノ酸配列は配列番号３および図１に示される。図１に示すように、タンパク質長は４１７アミノ酸である。推定シグナル配列は、残基１〜２５に存在する。成熟Ｎ末端は、アミノ酸残基２６であり、細胞外ドメインは残基２６〜１７３にあり、膜貫通ドメインは残基１７４〜１９０にあり、そして細胞質ドメインは、１９１〜４１７残基にあると考えられる。１０５残基に潜在的なＮ結合型グルコシル化部位が存在する。
【００１８】
配列番号４は、λｇｔ１０ ｃＤＮＡ（ＧＪ１５６）のサブクローンからのヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの分泌形態のカルボキシ末端の３０アミノ酸のアミノ酸配列を示す。このペプチド配列は、図１で示された複合タンパク質のアミノ酸残基１２１〜１４９と同一である３０のアミノ酸を特徴とし、そしてマウス短型ＴＲＡＩＮ−Ｒ（分泌型タンパク質）のＣ末端の１２１〜１５０アミノ酸と同一である。配列番号９は、別にクローン化されたエキソンに基づくヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの短い分泌型形態全体およびマウス短型との比較のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
図２は、ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒ（４１７アミノ酸）の最初の２１４アミノ酸とマウスＴＲＡＩＮ−Ｒ長（２１４アミノ酸）との比較を示す。図に示すように、この２つの配列は約８１．８％の同一性を有する。
【００２０】
本発明のＴＲＡＩＮレセプターは、哺乳動物の組織から単離され得、そして均質に精製され得るか、あるいは、膜結合ＴＲＡＩＮ−Ｒを含む細胞から単離され得、そして均質に精製し得る。細胞の増殖および細胞抽出物の単離のための方法は、種々の細胞タイプおよび増殖、単離方法と同様に、当該分野において周知である。一般に、任意のＴＲＡＩＮ−Ｒが、このタンパク質を発現する任意の細胞または組織から、ｃＤＮＡプローブを用いること、ｍＲＮＡを単離すること、およびｍＲＮＡをｃＤＮＡへの転写することで単離され得る。その後、このタンパク質は、ウイルス、プラスミド、コスミドまたは他の発現ベクターのような発現ベクターに、ｃＤＮＡを挿入すること、その発現ベクターを細胞に挿入すること、および得られた細胞を増殖することによって産生し得る。次いで、ＴＲＡＩＮ−Ｒは、その培地あるいは細胞抽出物から当該分野で周知の方法によって単離し得る。当業者は、容易にベクターおよび細胞株を変更し得、そしてなお請求される本発明のレセプターを獲得し得る。あるいは、ＴＲＡＩＮレセプターは、配列番号１、２、３、あるいは４に示された配列を用いて化学的に合成し得る。
【００２１】
マウスのＴＲＡＩＮ−Ｒは脳および肺において最も高値で、そして肝臓、骨格筋、および腎臓において低いレベルで発現すると考えられる。ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの発現パターンは、これまでに試験された、（偏在する）すべての組織および細胞株で低レベルの発現が検出され、そして有意に高い発現が心臓、前立腺、卵巣、精巣、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、甲状腺、および副腎腺において検出された点で異なる。
【００２２】
マウスＴＲＡＩＮ−Ｒは、配列番号１に示したように天然の可溶型として天然に存在し得る。ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒは、配列番号４および図３に示すようにカルボキシ配列を有する天然の可溶型として存在し得る。この可溶性タンパク質は、完全長ＴＲＡＩＮ−Ｒによってシグナル伝達を阻害するはずである。
【００２３】
本発明はまた、マウス（短型および長型の両方）およびヒトＴＲＡＩＮレセプター（完全長およびカルボキシ末端）をコードするＤＮＡ配列も包含する。これらＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５、６、７および８に示されている。配列番号７のヒトＴＲＡＩＮ−Ｒ配列は、５’ＵＴＲ、完全なコード領域、停止コドンおよびいくつかの３’ＵＴＲを含む。図１は、ＧＪ１５９およびＧＪ１５８の複合配列に由来するヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの核酸配列を示す。図１に示すように、ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒは、２１８５のヌクレオチド配列長、コード領域１７９〜１４２９、および１４３０〜１４３２の停止コドンを有する。
【００２４】
配列番号８のヒトＴＲＡＩＮ−Ｒ配列は、イントロン配列、ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの分泌型のカルボキシ末端３０アミノ酸をコードするエキソン、停止コドンおよび３’ＵＴＲを含む。図３に示すように、このイントロンは、残基１〜３５０に存在し、コード領域は３５２から４４１に存在し、停止コドンは４４２〜４４４に存在し、そして３’ＵＴＲは４４５〜７９１に存在すると考えられる。
【００２５】
他の実施態様では、本発明は、そのリガンドのレセプター結合ドメインのＣ末端をコードするＤＮＡ配列と少なくとも５０％の相同性を有し、そして請求される本発明のＤＮＡまたはそのフラグメントにハイブリダイズし、そして配列番号１、２、３、または４に示す配列を有するＴＲＡＩＮレセプターをコードする配列に関する。
【００２６】
ある実施態様において、本発明はさらに、その配列が発現制御配列に作動可能に連結されているＴＲＡＩＮレセプターをコードするＤＮＡ配列に関する。請求された発明においては、任意の適切な発現制御配列が有用であり、そして当業者により容易に選択され得る。
【００２７】
本発明はまた、ＴＲＡＩＮレセプターまたはそのフラグメントをコードする配列を含む組換えＤＮＡ、ならびにＴＲＡＩＮ−Ｒ配列をそれらのゲノムに安定に導入された宿主、またはエピソームエレメントを有する宿主も企図する。任意の適切な宿主が本発明において用いられ得、そして当業者により過当な実験を行うことなく容易に選択され得る。
【００２８】
特定の実施態様において、請求される本発明は、組換えＴＲＡＩＮ−Ｒを包含する。当業者は、このような組換えレセプターを容易に単離し得、それにより実質的に純粋な組換えＴＲＡＩＮ−Ｒポリペプチドを提供する。本発明の単離されたレセプターは、他の天然、または内因性起源の混在物質を実質的に含まず、そして産生過程のタンパク質混入残滓を約１０〜１５重量％未満含有する。
【００２９】
本発明の範囲内の哺乳動物のレセプターには、霊長類、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびブタのＴＲＡＩＮ−Ｒが含まれるが、それらに限定されない。哺乳動物のレセプターはまた、ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒ由来の一本鎖ｃＤＮＡを用いた種間交差ハイブリダイゼーションにより獲得し得る。本発明のＤＮＡ配列は他の哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーからレセプターｃＤＮＡを分離するハイブリダイゼーションプローブとして用い得る。
【００３０】
本発明の範囲内におけるレセプターの誘導体は、また生物学的活性を保持する、配列番号１、２、３および４のタンパク質の種々の構造形態を含有する。例えば、レセプタータンパク質は、酸性塩または塩基性塩の形態であり得、または中性の形態であり得る。個々のアミノ酸残基はまた、酸化あるいは還元により改変され得る。
【００３１】
レセプター誘導体は、また免疫原、レセプターを用いたイムノアッセイの試薬、またはＴＲＡＩＮリガンドの親和性精製手段のための結合剤としても用い得る。
【００３２】
本発明は、またネイティブパターンのグリコシル化を伴うまたは伴わないＴＲＡＩＮ−Ｒを包含する。当業者は、レセプターにおけるのグリコシル化パターンは、個々に用いられる発現系に依存して変化し得ることを理解する。例えば、代表的に、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌における発現は、非グリコシル化分子を生じる。ＴＲＡＩＮ−Ｒ誘導体はレセプターまたはそれらのサブユニットの変異によっても獲得し得る。本明細書にいう変異体とは、請求される本発明のレセプターと相同であるが、欠失、挿入、および置換に起因してネイティブ配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３３】
本発明のレセプタータンパク質の生物学的に等価なアナログは、例えば、残基、または配列の種々の置換を行うこと、あるいは生物学的活性に不要な残基または配列の末端または内部残基の欠失により構築し得る。例えば、しばしばシステイン残基は、再生の際に不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために欠失または他のアミノ酸と置換し得る。変異誘発への他のアプローチには、例えば、選択された発現系において発現を強調する改変が包含される。
【００３４】
本発明の可溶性レセプターは、可溶型に結合した膜から変化したサブユニットを含み得る。従って可溶性ペプチドは、そのポリペプチドを短縮化して例えば、細胞質末端および／または膜貫通領域を取り除くことにより産生し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、欠失により不活化し得、または親水性アミノ酸残基で膜貫通ドメインを含有する通常疎水性のアミノ酸残基を置換することにより不活化し得る。どちらの場合も、実質的に親水性の両親媒性プロフィールを生じ、これは、脂質親和性を減じ、そして水溶性を改善する。膜貫通ドメインの欠失は、親水性アミノ酸残基置換より好ましい。なぜなら、これは潜在的な免疫原性エピトープの持ちこみを回避するからである。本発明の可溶性レセプターは、Ｎ末端において任意の数の周知のリーダー配列を含有し得る。このような配列は、真核生物系において、分泌経路に、このペプチドが発現され、そして標的化されることを可能にする。
【００３５】
本明細書における発明は、請求される本発明のレセプターに対して指向されるアゴニスト、およびアンタゴニストのような薬物を提供する。本発明の特定の実施態様では、薬は、ＴＲＡＩＮレセプターのシグナル伝達を阻害するＴＲＡＩＮ−Ｒに対して指向される抗体を含有するブロック剤を含む。好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体である。同様に、請求する本発明はＴＲＡＩＮ経路においてアゴニストとして働く抗体および他の薬物を含有する。
【００３６】
阻害性抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ抗体および他のレセプターブロック剤は、１以上の薬剤がＴＲＡＩＮ−Ｒもしくはそれに対するリガンドに結合する能力、あるいは細胞に対するＴＲＡＩＮ−Ｒシグナル伝達の効果を阻害する能力のいずれかを検出するスクリーニング方法を用いて同定され得る。
【００３７】
当業者は、リガンド−レセプター結合の強さを測定し、そして推定ＴＲＡＩＮレセプターブロック剤を用いる競合アッセイを実施するために使用され得る多数のアッセイに関する知識を有する。レセプターとリガンドとの間の結合の強さは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくは放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）を用いて測定され得る。特異的結合はまた、抗体抗原複合体を蛍光標識することおよび蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）を実施することにより、あるいは他のこのような免疫検出方法を実施することにより測定され得る。これらはすべて、当該分野で周知の技術である。
【００３８】
レセプターリガンド相互作用を測定するためのこれらまたは他の技術のいずれかを用いて、当業者は、ブロック剤が、単独でまたは他の薬剤との組み合わせで、そのレセプター分子へのリガンドの結合を阻害する能力を評価し得る。このようなアッセイはまた、このような薬剤のブロック剤もしくは誘導体（すなわち、融合物、キメラ、変異体もしくは化学改変された形態）を試験するために使用されて、レセプター活性化をブロックする薬剤の能力を最適化し得る
１つの実施態様において、本発明のレセプターブロック剤は、可溶性ＴＲＡＩＮレセプター分子を含む。本明細書における、配列情報および当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＴＲＡＩＮレセプターのリガンド結合ドメインをコードする機能的フラグメントは、ベクターにクローニングされ得、そして可溶性レセプター分子を産生するために適切な宿主において発現され得る。本明細書に記載されるアッセイに従ってリガンド結合についてネイティブＴＲＡＩＮレセプターと競合し得る可溶性ＴＲＡＩＮレセプター分子は、ＴＲＡＩＮレセプターブロック剤として選択され得る。
【００３９】
本明細書において示されるものから選択されるアミノ酸配列を含む可溶性ＴＲＡＩＮレセプターは、１以上の異種タンパク質ドメイン（「融合ドメイン」）に結合されて、レセプター融合タンパク質のインビボ安定性を増加させ得るか、またはその生物学的活性または局在化を調節し得る。
【００４０】
好ましくは、安定な血漿タンパク質（これは、代表的には、哺乳動物の循環中で２０時間を越える半減期を有する）を使用して、レセプター融合タンパク質を構築する。このような血漿タンパク質は、イムノグロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンを含むがこれらに限定されない。可溶性レセプターを特定の細胞または組織型に標的化し得る配列もまた、このレセプターのリガンド結合ドメインに結合されて、特異的に局在化する可溶性レセプター融合タンパク質を作製し得る。
【００４１】
ＴＲＡＩＮレセプターのリガンド結合ドメインを含む、ＴＲＡＩＮレセプターの細胞外領域のすべてまたは機能的フラグメントを、イムノグロブリン定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメイン）に融合し得る。可溶性レセプター−ＩｇＧ融合タンパク質は、一般的な免疫学的試薬であり、そしてそれらの構築のための方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号を参照のこと）。
【００４２】
機能的ＴＲＡＩＮ−Ｒのリガンド結合ドメインは、ＩｇＧ１以外のイムノグロブリンクラスまたはサブクラスに由来するイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに融合され得る。異なるＩｇクラスまたはサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、多様な二次エフェクター機能を活性化し得る。活性化は、Ｆｃドメインが同族のＦｃレセプターに結合するときに生じる。二次エフェクター機能としては、補体系の活性化能、胎盤の横断能、および種種の微生物タンパク質への結合能が挙げられる。イムノグロブリンの異なるクラスおよびサブクラスの特性は当該分野において記載されている。
【００４３】
補体系の活性化は、炎症を媒介する酵素反応のカスケードを開始する。補体系の生成物は、種々の機能（細菌への結合、エンドサイトーシス、細胞食作用、細胞傷害性、遊離ラジカル産生および免疫複合体の可溶化を含む）を有する。
【００４４】
補体酵素カスケードは、抗原結合ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ抗体のＦｃドメインによって活性化され得る。ＩｇＧ２のＦｃドメインは、あまり有効でないようである。そして、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＦｃドメインは、補体活性化には無効である。従って、その関連する二次エフェクター機能が、レセプター融合タンパク質を用いて処置される特定の免疫応答もしくは疾患について所望されるか否かに基づいてＦｃドメインを選択し得る。
【００４５】
ＴＲＡＩＮリガンドを有する標的細胞を害するかまたは殺傷することが有利である場合、例えば、融合タンパク質を作製するために特に活性なＦｃドメイン（ＩｇＧ１）を選択し得る。あるいは、補体系を誘発することなく細胞にＴＲＡＩＮレセプター−Ｆｃ融合体を標的化することが所望される場合、不活性なＩｇＧ４ Ｆｃドメインが選択され得る。
【００４６】
Ｆｃレセプターへの結合および補体活性化を減少または除去するＦｃドメインにおける変異は、当該分野で記載されている。これらまたは他の変異は、単独でまたは組み合わせて用いられて、ＴＲＡＩＮレセプター−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用されるＦｃドメインの活性化を最適化し得る。
【００４７】
当業者は、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質の接合点を形成する異なるアミノ酸残基が、可溶性ＴＲＡＩＮレセプター融合タンパク質の構造、安定性、および最終的な生物学的活性を変化し得ることを理解する。１以上のアミノ酸が選択されたＴＲＡＩＮレセプターフラグメントのＣ末端に付加されて、選択された融合ドメインを接続点で改変し得る。
【００４８】
ＴＲＡＩＮレセプター融合タンパク質のＮ末端はまた、選択されたＴＲＡＩＮレセプターＤＮＡフラグメントが、組換え発現ベクターへの挿入のためにその５’末端で切断される位置を変更することによって変化させ得る。ＴＲＡＩＮレセプター融合タンパク質の各々の安定性および活性は、本明細書において記載されるブロック剤を選択するための慣用的な実験論およびアッセイを用いて試験および最適化され得る。
【００４９】
本明細書において示されるように、細胞外ドメイン内のＴＲＡＩＮレセプターの結合ドメイン配列を用いて、アミノ酸配列改変体はまた、それらのリガンドについて可溶性ＴＲＡＩＮレセプター分子の親和性を改変するように構築され得る。本発明の可溶性分子は、結合について内因性レセプターと競合し得る。リガンド結合についてネイティブレセプターと競合し得る、ＴＲＡＩＮレセプターのリガンド結合ドメインを含む任意の可溶性分子は、本発明の範囲内に入るレセプターブロック剤であることが想定される。
【００５０】
本発明の他の実施態様において、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＮレセプターに対して指向される抗体（抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ ａｂ）は、レセプターブロック剤として機能する。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そしてＴＲＡＩＮ−Ｒのシグナル伝達、それらのバイオアベイラビリティー、安定性または他の所望の形質をブロックするそれらの能力を最適化するように改変され得る。
【００５１】
ＴＲＡＩＮ−Ｒに対して指向されるポリクローナル抗体血清は、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスのような動物に、フロイントのアジュバント中のＴＲＡＩＮ−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を皮下注射すること、次いで、不完全フロイント中で、腹腔内または皮下での追加の注射によって従来の技術を用いて、調製される。次いで、ＴＲＡＩＮレセプターに対して指向される所望の抗体を含むポリクローナル抗体は、従来の免疫学的手順によってスクリーニングされ得る。
【００５２】
抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ ａｂの種々の形態はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。例えば、「キメラ」抗体は、動物の抗体からの抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結されるように構築され得る。キメラ抗体は、ヒト臨床処置において使用される場合、動物の抗体によって誘発された、観察された免疫学的応答を減少する。
【００５３】
さらに、ＴＲＡＩＮ−Ｒを認識し得る組換え「ヒト化」抗体が合成され得る。ヒト抗体は、ほとんど、特異的な抗原結合を担う領域が挿入されたヒトＩｇＧ配列を含むキメラである（例えば、ＷＯ９４／０４６７９）。動物は、所望の抗原で免疫され、その対応する抗体が単離され、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の部分が取り出される。次いで、動物に由来する抗原結合領域は、その抗原結合領域が除去されたヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングされる。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種（種間の）配列の使用を最小限にし、そして処置されるその哺乳動物における免疫応答をあまり誘発しないようである。
【００５４】
組換え抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ抗体の異なるクラスの構築もまた、抗Ｒ可変ドメインおよび異なるクラスのイムノグロブリンから単離されたヒト定常ドメインを含むキメラまたはヒト化抗体を作製することによって達成され得る。例えば、抗原結合部位の結合価が増加した抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ ＩｇＭ抗体は、ヒトμ鎖定常領域を有するベクターへ抗原結合部位をクローニングすることによって組換え産生され得る。
【００５５】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、その抗原結合部位の近傍のアミノ酸残基を変更することによってそれらの抗原との、組換え抗体の結合親和性を変更し得る。ヒト化交代の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発によって増加され得る。
【００５６】
標的化組織型または特定の意図される処置スケジュールに依存して、そのレセプターに対する抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ抗体の親和性を増加または減少させることが所望され得る。例えば、半予防的な処置のために、その経路を介してシグナル伝達する能力が減少した抗レセプター抗体の定常レベルを用いて、患者を処置することが有利であり得る。同様に、そのレセプターに対する親和性が増加した阻害性抗ＴＲＡＩＮ−Ｒ抗体は、短時間の処置について有利であり得る。
【００５７】
本発明は、さらに他の実施態様において、有効量のＴＲＡＩＮ−Ｒブロック剤または活性化剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を包含する。本発明の組成物を、有効用量で投与して、取り組まれる特定の臨床状態を処置する。所定の適用について好ましい薬学的処方物および治療有効用量レジメンの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度および処置に対する患者の寛容度の考慮条件を考慮して充分当業者の範囲内である。約１ｍｇ／ｋｇの可溶性ＴＲＡＩＮ−Ｒの用量が処置投薬量を最適化するための適切な出発点であると予測される。
【００５８】
治療有効用量の決定はまた、ブロック剤または活性化剤の濃度を測定するインビトロ実験を実施することによって評価され得る。本明細書において記載した結合アッセイは、当該分野で公知の他のアッセイと同様に有用である。
【００５９】
本発明の可溶性の活性化剤またはブロック剤の投与は、単独または組み合わせで（単離および精製された形態、それらの塩、またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体を含む）、免疫抑制活性を示す薬剤の投与の、従来受容されている態様のいずれかを用いて達成され得る。
【００６０】
（実施例）
（可溶性レセプター形態の生成）
ヒトにおける使用のためのレセプターインヒビターを形成するために、細胞外ドメインのヒトレセプターｃＤＮＡ配列が必要である。マウス形態が公知である場合、ヒトｃＤＮＡライブラリーを、マウスｃＤＮＡ配列を用いて容易にスクリーニングし得、そしてそのような操作はこの分野において慣用的に実施される。ヒトｃＤＮＡ配列を用いて、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの非存在下でレセプターの細胞外ドメインをＰＣＲ増幅するようなオリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。代表的に、１つのものは、最後のジスルフィド結合「ＴＮＦドメイン」と膜貫通ドメインとの間のアミノ酸のほとんどを含む。得られた可溶性レセプターの能力を最適化するために、含まれる「ストーク」領域の量を変更し得る。この増幅された一片を操作して、適切な制限部位を含ませて、種々のＣ末端Ｉｇ融合キメラベクターへのクローニングを可能にする。あるいは、終止コドンをその３’末端に挿入し得、そしてＩｇ融合キメラアプローチの使用の補佐なくしてそのレセプターの可溶性形態を作製し得る。得られたベクターは、酵母、昆虫細胞、細菌および哺乳動物細胞を含む生物工学において使用されるほとんどの系において発現され得、そして例は発現のすべてのタイプについて存在する。種々のヒトＦｃドメインを結合して、所望に応じてＦｃＲと補体との相互作用を最適化または消去し得る。あるいは、これらのＦｃドメインの変異形態を使用して、ＦｃＲと補体との相互作用、または特定の利点を有するＦｃドメインへのＮ結合型糖との結合を選択的に除去し得る。
【００６１】
（アゴニスト性またはアンタゴニスト性抗体の生成）
上記に記載の可溶性レセプター形態を従来の方法により用いてマウスを免疫し、そしてモノクローナル抗体を作製し得る。ＥＬＩＳＡ方法により同定された、得られたｍＡｂは、種々のインビトロ細胞アッセイにおいて、可溶性抗体もしくはプラスチックに固定された抗体のいずれかとしてアゴニスト活性についてさらにスクリーニングされ得る。しばしば、ＨＴ２９細胞株の死は、多くのＴＮＦレセプターを介するシグナル伝達に対して感受性である簡便な系である。この株が目的のレセプターを有さない場合、その全長レセプターは、ＨＴ２９株に安定にトランスフェクトされて、今度は細胞傷害性アッセイで作用するようにし得る。あるいは、このような細胞を、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置において使用して、レセプターの活性化が、シグナル伝達事象の指標であるｐＨ変化を誘発し得るか否かを評価し得る。ＴＮＦファミリーレセプターは、このような形式において良好にシグナル伝達し、そしてこの方法は、そのレセプターによって惹起される実際の生物学的事象を知ることを必要としない。アゴニスト性ｍＡｂは、臨床用途のために、「ヒト化」される。この手順もまた使用して、アンタゴニスト性ｍＡｂを規定し得る。このようなｍＡｂは、アゴニスト活性の欠如およびＥＬＩＳＡ、古典的結合技術またはＢＩＡｃｏｒｅ技術によってモニターされるレセプター−リガンドの相互作用を阻害する能力によって規定される。最後に、アゴニスト抗体に対する応答における種々の細胞によるケモカイン分泌の誘導は、スクリーニングアッセイを形成し得る。
【００６２】
（レセプター−リガンド相互作用のインヒビターについてのスクリーニング） レセプター−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、コンビナトリアルライブラリーのいずれかを、そのレセプターに直接結合し得る分子についてスクリーニングし得る。次いで、これらの分子を、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイにおいて、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質および可溶性形態のリガンドを用いて、レセプター−リガンドの相互作用を阻害する能力について試験し得る。このＥＬＩＳＡを使用して、種々の天然産物ライブラリーなどを、阻害性化合物について直接スクリーニングし得る。このレセプターは、ＨＴ２９株のような細胞株をトランスフェクトして次いでスクリーニングアッセイを形成し得る生物学的アッセイ（この場合は細胞傷害性）を形成し得る。
【００６３】
種々の改変および変更は、本発明のポリペプチド、組成物および方法において、本発明の精神または範囲を逸脱することなくなされ得ることは当業者に明らかである。従って、本発明は、それらが添付の請求の範囲（ＰＣＴ上は「請求の範囲」）およびその等価物の範囲内にある限り、本発明の改変および変更を網羅することが意図される。
【００６４】
（ヒトＴＲＡＩＮレセプターの同定）
ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒを、２つのｃＤＮＡ配列からクローニングした。第一の配列（ｈＴｒａｉｎＲ）配列番号７は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｈｕｍａｎｎ成体肺ｃＤＮＡライブラリーからの２つの重複するλｇｔ１０クローン（ＧＪ１５９およびＧＪ１５８）の複合体である。配列番号７におけるその複合配列は、２１８５ヌクレオチド長であり、そして４１７アミノ酸タンパク質（配列番号３）をコードし、これは、シグナル配列、１４０アミノ酸の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびに２２７アミノ酸の細胞内ドメインおよび終止コドンを有する。これは、別の１２００ｂｐを含む。ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒの細胞外ドメインは、３つのＴＮＦレセプター様ドメイン（これは、ＴＮＦ−Ｒと比較してドメイン１を欠失するようである）をコードする。配列番号３における配列は、低親和性神経成長因子（ＬＮＧＦＲ）と１９％同一であり、そしてＴｒａｍｐ／Ｌａｒｄ４／Ｗｓｌ／Ｄｒ３に対して２４％同一である。これらは両方ともＴＮＦファミリーのメンバーである。
【００６５】
ヒトＴＲＡＩＮ−Ｒはまた、λｇｔ１０ ｃＤＮＡ（ＧＪ１５６、７９０ｂｐのサブクローン）の第二の配列サブクローンからクローニングされた。得られた配列を配列番号８に示す。これは、イントロン配列、ヒトＴｒａｉｎＲの分泌形態のカルボキシ末端の３０アミノ酸をコードするエキソン、終止コ ドンおよび３’ＵＴＲを含む。このエキソン配列におけるこの３０アミノ酸は、マウスＣ末端分泌形態（マウスＴｒａｉｎレセプターの短い形態）と１００％相同である。
【００６６】
２つの優勢なメッセージが５ｋｂおよび０．５ｋｂに観察される。
【００６７】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２つのλｇｔ１０クローン（ＧＪ１５９およびＧＪ１５８）の複合体からのヒトＴＲＡＩＮレセプターのヌクレオチド配列を示す。
【図２】 図２は、ヒトＴＲＡＩＮレセプター（上）とマウスＴＲＡＩＮレセプター長（下）の比較を示す。
【図３】 図３は、λｇｔ１０ｃＤＮＡのサブクローンからのヒトＴＲＡＩＮレセプターのヌクレオチド配列を示す。
【図４】 図４は、図１におけるヒトＴＲＡＩＮのヌクレオチド配列に相当するアミノ酸配列を示す。
【図５】 図５は、図３におけるヒトＴＲＡＩＮのヌクレオチド配列に相当するアミノ酸配列を示す。
【配列表】

Claims (11)

1. 腫瘍壊死因子レセプタータンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子は、
   （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列；および
   （ｂ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列；
   からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
2. 請求項１に記載のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子は、ヒトイムノグロブリンＦｃドメインをコードする配列をさらに含む、ＤＮＡ分子。
3. 請求項１もしくは請求項２に記載のＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子。
4. ベクターであって、
   請求項１もしくは請求項２に記載のＤＮＡ分子、または
   請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子
   を含む、ベクター。
5. 宿主細胞であって、請求項１もしくは請求項２に記載のＤＮＡ分子、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子、または請求項４に記載のベクターを用いて遺伝子操作されている、宿主細胞。
6. 請求項１もしくは請求項２に記載のＤＮＡ分子によってコードされた、単離されたポリペプチド。
7. 哺乳動物細胞において請求項６に記載のポリペプチドをインビトロで発現する方法であって、
   （ａ）請求項１もしくは請求項２に記載のＤＮＡ分子を該細胞中に導入する工程；および
   （ｂ）該細胞を、該ポリペプチドが発現されるような条件下で生存させる工程；
   を包含する、方法。
8. 請求項６に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
9. 請求項８に記載の抗体であって、該抗体は、モノクローナル抗体である、抗体。
10. 請求項８または９に記載の抗体を生成するための方法であって、
    非ヒト生物を、請求項６に記載のポリペプチドを用いて免疫する工程
    を包含する、方法。
11. 請求項６に記載のポリペプチドに結合するブロック剤を同定するための方法であって、該方法は、
    （ａ）請求項６に記載のポリペプチドを提供する工程；
    （ｂ）該ポリペプチドに結合するブロック剤を検出するためにスクリーニングする工程；
    を包含する、方法。

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