JP4354445B2 - Dna/キトサン複合体の成形方法 - Google Patents
Dna/キトサン複合体の成形方法 Download PDFInfo
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DNA/キトサン複合体を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内に充填されたDNA/キトサン複合体に緩衝液を供給する工程と、
前記型内の前記緩衝液を含むDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法である。
DNA/キトサン複合体を緩衝液中に投与し、該DNA/キトサン複合体の塊を得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内のDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法である。
DNA/キトサン複合体の成形方法において、
DNA/キトサン複合体の水性スラリーを緩衝液中に投与し、投入状態に応じた形状の固まりを得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を凍結乾燥し、前記投入状態に応じた形状のDNA/キトサン複合体成形物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法である。
DNA/キトサン複合体を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内に充填されたDNA/キトサン複合体に緩衝液を供給する工程と、
前記型内の前記緩衝液を含むDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有する。
DNA/キトサン複合体を緩衝液中に投与し、該DNA/キトサン複合体の塊を得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内のDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有する。
DNA/キトサン複合体の成形方法において、
DNA/キトサン複合体の水性スラリーを緩衝液中に投与し、投入状態に応じた形状の固まりを得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を凍結乾燥し、前記投入状態に応じた形状のDNA/キトサン複合体成形物を得る工程と
を有する。
(a)用いた溶液
・DNA溶液;サケ***由来DNA(300塩基対、ニチロ社製)を蒸留水に溶解する。(5mg/1ml)
・キトサン溶液;キトサン(分子量13万、ニチロ社製)を0.2N HCl 50mlに溶解した。この溶液に0.2N NaOHと蒸留水を徐々に加え、pH5の溶液100mlとした。(5mg/1ml)
(b)キトサン水溶液とDNA水溶液からの合成
撹拌しているキトサン水溶液100mlにDNA水溶液を加え、1時間反応させた。反応後生じた沈殿物を遠心分離した。得られた沈殿物をトリス塩酸緩衝液(10mM、pH7.2)(以下Tris−HCl緩衝液という)60mlで洗浄し、再度遠心分離した。Tris−HCl緩衝液洗浄は2回行った。次に、蒸留水60mlで洗浄した後、遠心分離を行った。蒸留水洗浄は3回行った。得られた白色沈殿物を凍結乾燥した。収量は600mgで、リンの定量よりDNA/キトサン複合体(サンプルA)の分子量比率(モル比)は0.95/1であった。
実施例1で得たDNA/キトサン複合体(サンプルA)を粉砕機等で粉砕し、実施例1で用いたのと同様のリン酸緩衝液で洗浄後、図1で示すように中心部が円形にくり貫かれた孔になっているシリコーンパッキンからなる型(外径20、内径8、厚さ2mm)の孔に入れた。なお、型の底部は、ステンレス板(20×20×1mm)に接着剤で固定されている。ろ紙などでDNA/キトサン複合体の水分を吸い取りながら平らにした後、ナイロンメッシュ(PE24、526μm)で数回押し付けて更に平らにし、同じメッシュで蓋をした。これを同様のリン酸緩衝液に10分間浸した後、メッシュを取り除き、DNA/キトサン複合体複合体の水分をろ紙などで除いた。そしてポリエチレンフィルムとステンレス板で蓋をし、液体窒素に漬けた。引上げてポリエチレンフィルムとステンレス板を除いた後、前述のナイロンメッシュで蓋をして再度液体窒素に漬けた。引上げてナイロンメッシュを除いて得られたディスク状型内のDNA/キトサン複合体を凍結乾燥して、図2の写真に示す歯科医療用などに好適な性状を有するディスク状のDNA/キトサン複合体を得た。
実施例1で得たDNA/キトサン複合体(サンプルA)に水を加えてクリーム状のスラリーとし、シリンジに入れた。実施例2で用いたのと同様のリン酸緩衝液にこのシリンジ先端の針からスラリーを注入すると、即座に注入された形状で形態が維持されたDNA/キトサン複合体が得られた。この場合、ニードルの先端から連続してリン酸緩衝液に注入すると糸状に、また涙滴状にしてリン酸バッファー中に落とし込むとボール状までの形態にすることができた。さらに上記の糸状複合体を数個を積層する要領でモールドに入れ、余剰の水分をろ紙等で吸い取って凍結乾燥すると、モールドに応じた形態に自由に成型することができた。
メインのピークを300bp付近に持つ低分子二本鎖DNA(LdsDNA)1gを脱イオン水で溶解後、最終的に200ml(5mg/ml)となるようにした。一方、モル比でデオキシヌクレオチド(dNMP)に対して1.5倍量となるようにキトサン(分子量13万、ニチロ社製)を測り取り、0.2NHClを用いて溶解後、0.2NNaOHを用いて最終的にpH5.0、5mg/ml溶液となるようにした。その後、LdsDNA溶液とキトサン溶液を混合し、1時間室温で撹拌した後、遠心分離(10000rpm、5分)により沈殿物を回収した。この沈殿物に脱イオン水100mlを添加し、遠心分離(8000rpm、5分)した。この洗浄工程を2回行った。得られた沈殿物を凍結乾燥し、DNA/キトサン複合体として回収した。
実施例4の方法にて回収したDNA/キトサン複合体200mgに脱イオン水1mlを加え均一化させるために乳鉢ですり潰してクリーム状のスラリーを得た。このスラリーを、10mMリン酸緩衝液(10mM Na2HPO4・12H2O、10mM KH2PO4;pH7.4、100mM NaCl及び3mM KClを含む)50ml中に添加し、10分間静置し、緩衝液中に塊を得た。得られた塊を、底面を有する円形の枠内に充填し、余分な水分をキムワイプで除去しながら成型化し、枠内に充填した状態で凍結乾燥してペレットを得た。
実施例5で得たスラリーをシリンジに充填し、実施例5で用いたもとと同様のリン酸バッファー中に糸状に押し出した。得られた糸状の塊をその形状を維持して凍結乾燥することで、糸状の成形物を得た。
2 シリコーン型
3 ナイロンメッシュ
4 型内に充填されたDNA/キトサン複合体
Claims (6)
- DNA/キトサン複合体の成形方法において、
DNA/キトサン複合体を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内に充填されたDNA/キトサン複合体に緩衝液を供給する工程と、
前記型内の前記緩衝液を含むDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法。 - 前記DNA/キトサン複合体が、水性媒体中でDNAとキトサンを反応させて沈殿物として得られたものである請求項1に記載の成形方法。
- DNA/キトサン複合体の成形方法において、
DNA/キトサン複合体を緩衝液中に投与し、該DNA/キトサン複合体の塊を得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を成型用の型内に充填する工程と、
前記型内のDNA/キトサン複合体を該型内に充填した状態で凍結乾燥し、該型の形状に成型されたDNA/キトサン複合体成型物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法。 - 前記DNA/キトサン複合体が、水性媒体中でDNAとキトサンを反応させて沈殿物として得られたものである請求項3に記載の成形方法。
- DNA/キトサン複合体の成形方法において、
DNA/キトサン複合体の水性スラリーを緩衝液中に投与し、投入状態に応じた形状の固まりを得る工程と、
前記該DNA/キトサン複合体の塊を凍結乾燥し、前記投入状態に応じた形状のDNA/キトサン複合体成形物を得る工程と
を有することを特徴とするDNA/キトサン複合体の成形方法。 - 前記DNA/キトサン複合体が、水性媒体中でDNAとキトサンを反応させて沈殿物として得られたものである請求項5に記載の成形方法。
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